本發(fā)明涉及基因工程和代謝工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

谷氨酸棒桿菌是一種非致病性的革蘭氏陽性菌，廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)氨基酸、有機酸、高級醇等工業(yè)產(chǎn)品；同時，谷氨酸棒桿菌無內(nèi)毒素并且胞外無水解酶活性,其能夠分泌正確折疊的有生物活性功能蛋白質(zhì)，所以谷氨酸棒桿菌也是一種表達(dá)外源蛋白的極為有利的宿主。

啟動子是一段控制基因起始轉(zhuǎn)錄的重要DNA序列，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游。而基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平是最終蛋白表達(dá)水平的主要影響因素之一，有研究通過大量的分析證明在控制蛋白表達(dá)水平的序列各種區(qū)域中，啟動子區(qū)域的影響力超過45%，是最重要的序列區(qū)域。因此，一個強效的啟動子通過使攜帶基因序列的mRNA高轉(zhuǎn)錄，從而實現(xiàn)高水平蛋白表達(dá)。

對于谷氨酸棒桿菌而言，人們目前依舊局限于應(yīng)用以cspB、trc或tac為啟動子的表達(dá)載體，其中應(yīng)用tac啟動子的表達(dá)載體的外源蛋白表達(dá)水平較高，但仍然無法滿足人們對外源蛋白日益增長的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種適用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體，其能解決谷氨酸棒桿菌外源蛋白表達(dá)水平低的技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了該表達(dá)載體的應(yīng)用。

一種適用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體，其包含啟動子，其特征在于：所述啟動子的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，或與其互補的核苷酸序列。

一種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其包括谷氨酸棒桿菌和所述表達(dá)載體。

上述表達(dá)載體或外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述表達(dá)載體，包含SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢桿菌的tufA啟動子，經(jīng)實驗證實，該載體的表達(dá)效果超過tac啟動子與保守SD序列在pXMJ19中的經(jīng)典組合，能夠有效提高外源蛋白的表達(dá)水平。

附圖說明

圖1為載體p10-A0的質(zhì)粒圖譜

圖2為本發(fā)明啟動子和tac啟動子構(gòu)建的不同表達(dá)載體蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析圖。

具體實施方式

本發(fā)明中所用到的菌株：枯草芽孢桿菌168、谷氨酸棒桿菌ATCC 13032和大腸桿菌DH5α均購自中國高校微生物資源數(shù)據(jù)平臺。

限制性內(nèi)切酶Hind III、BamH I、EcoR V，T4 DNA連接酶等購自Thermo公司；Bsa I二型內(nèi)切酶、Q5超保真聚合酶購自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司；基因組提取試劑盒購自天根公司；Infusion重組試劑盒購自Clontech公司；氯霉素、卡那霉素等抗生素購自上海生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)或者進(jìn)口分析純。高速冷凍離心機和PCR熱循環(huán)儀，美國ThermoFisher公司；Synergy H4酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；恒溫金屬浴，北京天根公司；Dark Reader，北京達(dá)科為生物公司；核酸和蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司。

本發(fā)明所用載體p19-A0的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，其質(zhì)粒圖譜如圖1所示，其構(gòu)建方法參見：劉秀霞, 趙子豪, 孫楊, 等. 谷氨酸棒桿菌內(nèi)源表達(dá)元件的篩選[J]. 微生物學(xué)通報, 2016-05-24 16:42，載體p19-A0含有egfp報告基因。

1、啟動子的克隆。

包括以下步驟：

a、枯草芽孢桿菌基因組DNA的獲?。和ㄟ^基因組提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA。

b、PCR擴增：

PCR擴增條件為：98 °C 、3 min；98 °C 、15 s，72 °C、 3.25 min，30 個循環(huán)；72 °C 、2 min。反應(yīng)體系為：10×Buffer 5 μl、dNTPs 4 μl (各2.5 mmol/L)、上下游引物各1 μl (0.2 μmol/L)、Q5 DNA聚合酶0.5 μl (2 U/μl)、模板1 μl，加水至50 μl；

本發(fā)明的tufA啟動子（以下簡稱為PtufA）的引物：

tufA-F：5‘- TTTTGAAGCTTCTGGTTACGAAGAAGTGCCGAAGAG -3’

tufA-R：5‘-CGCCCTTGCTCACCATTCTAAAATCCTCCTTAAGAGCTTT -3’；

上述引物5’端分別引入同源臂序列“TTTTGAAGCTTCTGGT”和“CGCCCTTGCTCACCA”，使得擴增后的兩條序列與Bsa I酶切線性化后的載體p19-A0兩端序列一致，在體外同源重組酶的幫助下，能夠發(fā)生同源重組，從而使啟動子與報告基因egfp無縫連接，構(gòu)建出含有啟動子得EGFP表達(dá)質(zhì)粒。

2、表達(dá)載體的構(gòu)建。

含有PtufA的質(zhì)粒的構(gòu)建，包括以下步驟：

a、通過II型內(nèi)切酶Bsa I切割載體p19-A0獲得線性質(zhì)粒；

b、通過Infusion重組試劑盒將啟動子與線性質(zhì)粒在反應(yīng)液中發(fā)生同源重組；

c、將同源重組后獲得的反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，即可構(gòu)建出含有NtufA的表達(dá)質(zhì)粒，簡稱為ptufA。

傳統(tǒng)方法使用的酶切位點如EcoR I、BamH I等會干擾啟動子的正確測定，而本發(fā)明所使用的載體p19-A0避免了這些額外序列的存在和對結(jié)果的干擾。

含有tac啟動子（簡稱為Ptac）的陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建，包括以下步驟：

a、克隆如SEQ ID NO:2所示的谷氨酸棒桿菌保守SD序列和egfp基因片段，所需的引物為：

SD-EGFP-F: 5‘- CCCAAGCTTAAAGGAGGACAACTAATGGTGAGCAAGGGCG -3’

SD-EGFP-R: 5‘-CCCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’

PCR擴增條件與“1、啟動子的克隆”中PCR擴增條件相同；

兩條引物的“AAGCTT”“GGATCC”分代表構(gòu)建這一陽性對照質(zhì)粒所需引入的酶切位點，分別為Hind III和BamH I。

b、Hind III和BamH I雙酶切，

c、T4連接。

酶切與連接均按照商品酶試劑的說明書指導(dǎo)進(jìn)行。

谷氨酸棒桿菌保守SD序列和egfp基因片段與質(zhì)粒pXMJ19上的Ptac組合，構(gòu)建組成型表達(dá)的陽性對照質(zhì)粒（簡稱為pTAC），這一經(jīng)典的陽性對照代表了的谷氨酸棒桿菌高效表達(dá)重組蛋白的水平。

3、轉(zhuǎn)化。

包括以下步驟：

a、通過質(zhì)粒提取試劑盒分別提取ptufA、pTAC；

b、轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC 13032。

具體方法為：

（1）谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

將在培養(yǎng)基平板上火化后的谷氨酸棒桿菌挑取接種至BHI培養(yǎng)基中，于30°C、230 rpm條件下過夜培養(yǎng)，將菌液轉(zhuǎn)接至含有3%甘氨酸、0.1%Tween 80和0.5%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，控制其初始OD₆₀₀為0.3，于30°C、230 rpm條件下培養(yǎng)4-6 h，至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.9。再將菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，冰上放置15 min。以下操作均在低溫，無菌條件下進(jìn)行。

4°C、4000 rpm離心5min，去上清，收集菌體，用預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，懸浮式用移液槍小心的吹打。重復(fù)上述離心，去上清步驟3次，用1.5 ml 10%甘油重懸細(xì)胞，分裝至1.5ml 離心管中，每管裝100 μl，保存于-80°C備用。

（2）谷氨酸棒桿菌感受態(tài)的電擊轉(zhuǎn)化

將感受態(tài)細(xì)胞從-80°C冰箱中去除，至于冰上融化，添加10μl重組質(zhì)粒后輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.1 cm電擊杯中，于1.8 kv，200 Ω，25 μF條件下電擊細(xì)胞。電擊后立即加入含1.85%腦心浸出液的9.2%山梨醇的LB液體培養(yǎng)基1 ml，混勻，轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，于46°C水浴6 min，30°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。然后將菌液濃縮后涂布于含有1.85%腦心浸出液的9.2%山梨醇的LB固體培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)48h。

4、啟動子的活性測定。

包括以下步驟：

a、培養(yǎng)，將“2、表達(dá)載體的構(gòu)建”中構(gòu)建的含有ptufA或pTAC的谷氨酸棒桿菌分別接種到2 ml 含有10 mg/L氯霉素的腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基中，30 °C、230 r/min培養(yǎng)過夜，然后按照1:100的比例稀釋轉(zhuǎn)接到新的2 ml BHI培養(yǎng)基中，使用高通量24孔深孔培養(yǎng)板，在相同的條件下培養(yǎng)24小時；

b、菌體收集，將培養(yǎng)好的菌液迅速置于冰上預(yù)冷，離心收集菌體，用PBS緩沖液清洗兩次，重懸；

c、EGFP表達(dá)量測定：單位菌體的EGFP表達(dá)量定義為熒光測量值F與樣品的OD₆₀₀的比值，使用多功能酶標(biāo)儀測量OD₆₀₀和熒光強度，其結(jié)果如下表所示。

5、應(yīng)用PtufA啟動子在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)淀粉酶。

a、淀粉酶表達(dá)載體的構(gòu)建

按照相同方法將啟動子PtufA插入淀粉酶探測載體p19-B0中，淀粉酶探測載體p19-B0與綠色熒光蛋白探測載體p19-A0的區(qū)別僅在于報告基因更換為淀粉酶基因。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)谷氨酸棒桿菌中。

b、 酶活測定方法：取1％，pH6.0可溶性淀粉溶液50 μl，于60℃下水浴預(yù)熱5 min后，加入粗酶液250 μl精確反應(yīng)5 min后，加入450 μl 二硝基水楊酸（DNS），沸水浴反應(yīng)5分鐘，加水稀釋20倍后用分光光度計在540 nm處測定吸光值，計算產(chǎn)生的還原糖量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參見：史永昶、姜涌明. 五種α-淀粉酶測活方法的比較研究[J]. 微生物學(xué)通報, 1996-06-14 6:23酶活定義：一個淀粉酶單位相當(dāng)于在60℃、pH6.0條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需酶量。酶活計算公式為：（5.1159╳OD₅₄₀ -0.0353）╳稀釋倍數(shù)÷5

經(jīng)過淀粉酶活力的檢測，帶有啟動子PtufA序列的淀粉酶基因表達(dá)載體在谷氨酸棒桿菌中的活力是33.6U/ml，而不帶有啟動子序列的對照載體沒有檢測到淀粉酶活力活力。

上述實驗結(jié)果證明：

PtufA與蛋白編碼序列直接相連后即可啟動蛋白表達(dá)，并且可以在不添加任何化學(xué)誘導(dǎo)劑或者物理誘導(dǎo)條件的情況下組成型表達(dá)重組蛋白；

在綠色熒光蛋白報告基因的評測下，本發(fā)明的含有PtufA的載體的蛋白表達(dá)水平明顯超過Ptac與保守SD序列在pXMJ19中的經(jīng)典組合的蛋白表達(dá)水平。

通過SDS-PAGE分析，含有不同載體的谷氨酸棒桿菌的EGFP蛋白表達(dá)測試結(jié)果如圖2所示。其中，含有ptufA的谷氨酸棒桿菌所對應(yīng)的EGFP蛋白條帶顏色深于含有pTAC的谷氨酸棒桿菌所對應(yīng)的EGFP蛋白條帶顏色，亦印證了PtufA的蛋白表達(dá)水平高于Ptac的蛋白表達(dá)水平。

此外，經(jīng)淀粉酶基因的表達(dá)驗證，證明PtufA也適用于其他基因在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)。