本發(fā)明屬于微生物突變的基因工程，及其利用所構(gòu)建的菌株發(fā)酵提高特定化合物產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

聚酮類化合物是由細(xì)菌、真菌、植物以及動物所產(chǎn)生的次生代謝物的一個種類，其形式極其繁多，在天然產(chǎn)物中具有不可替代的作用，新藥開發(fā)潛力和商業(yè)價值巨大。聚酮化合物洋橄欖葉素是一種具有C₂-對稱性的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)二酯類抗生素，在Streptomyces sp.DSM4137、S.melanosporus、S.hygroscopicus var.azalomyceticus和S.violaceoniger(Tu 905)等鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物中均有發(fā)現(xiàn)。洋橄欖葉素具有抗革蘭陽性菌、抗線蟲、抗原生動物、免疫抑制和抗哺乳動物腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)活性。Streptomyces sp.DSM4137中洋橄欖葉素可能的生物合成基因簇已經(jīng)克隆，其生物合成包括聚酮合成和糖組分的合成。

自溶鏈霉菌(Streptomyces autolyticus CGMCC 0516)是我們從西雙版納原始森林的土壤中采集并分離得到的一株放線菌新種(ZL 00134063.8，保藏編號為CCTCC M 2015580)，它能夠通過微生物代謝途徑產(chǎn)生多種抗病毒和抗腫瘤活性化合物，其中包括格爾德霉素和洋橄欖葉素及其衍生物—11-氧-甲基洋橄欖葉素及11,11′-氧-二甲基洋橄欖葉素。但作為代謝產(chǎn)物的格爾德霉素在參與鏈霉菌活性生物合成中影響了洋橄欖葉素及其衍生物的合成，降低了產(chǎn)量，敲除其調(diào)控基因以提高后者的產(chǎn)量是所需亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種能夠大量產(chǎn)生洋橄欖葉素及其衍生物的基因工程方法，它首先旨在提供一種敲除自溶鏈霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法，其次，旨在提供一種利用敲除該基因的菌株發(fā)酵提高洋橄欖葉素及衍生物產(chǎn)量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：

(一)敲除自溶鏈霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法

所述方法是：敲除自溶鏈霉菌(Streptomyces autolyticus)almRIII基因以獲得突變株，該自溶鏈霉菌(Streptomyces autolyticus)保藏編號為CCTCC NO：M 2015580。

進(jìn)一步地，所述的方法包括以下步驟：

(1)采用Red/ET一步PCR法，以質(zhì)粒pHY773為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有與almRIII基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒；PCR擴(kuò)增的引物為：

5′-TATTGGCTGACAGCCAGCCAACGCAGGAGTTACAGCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′和

5′-GGGCCCGTCCCTCACCCATGAGTCACCTCTGAGTGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′；PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱2分鐘，1個循環(huán)；94℃變性45分鐘，62℃復(fù)性45秒，72℃擴(kuò)增2分鐘，31個循環(huán)；72℃擴(kuò)增10分鐘；4℃1小時；

(2)通過電轉(zhuǎn)化把所擴(kuò)增片段導(dǎo)入含pIJ790和almRIII基因粘粒質(zhì)粒的Escherichia coli大腸桿菌中，篩選阿泊拉霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子即為含有插入突變的almRIII基因；

(3)用上述轉(zhuǎn)化子制備含有插入突變的almRIII基因的粘粒質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中；

(4)利用接合轉(zhuǎn)移把含有插入突變的almRIII基因的粘粒質(zhì)粒導(dǎo)入野生型自溶鏈霉菌中，篩選阿泊拉霉素抗性和硫鏈絲菌素敏感的接合轉(zhuǎn)移子，即自溶鏈霉菌almRIII基因敲除突變株。

進(jìn)一步地，所述的方法：采用PCR和Southern雜交驗(yàn)證突變株為敲除almRIII基因的自溶鏈霉菌突變株：

(1)PCR擴(kuò)增制備Southern雜交探針，PCR引物為：5′-GCGAGTTGCGCCGGCGCGGGGTACG-3′和5′-CAGAACCGCGGCGCCGACGGCATC-3′，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱2分鐘，1個循環(huán)；94℃變性45分鐘，62℃復(fù)性45秒，72℃擴(kuò)增2分鐘，31個循環(huán)；72℃擴(kuò)增10分鐘；4℃1小時；

(2)制備自溶鏈霉菌almRIII突變株DNA及野生型菌株的基因組DNA，DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I完全酶切，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，與上述探針進(jìn)行Southern雜交。

(二)利用以上敲除自溶鏈霉菌野生型菌株的almRIII基因提高洋橄欖葉素及衍生物產(chǎn)量的發(fā)酵方法

包括以下步驟：

(1)用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)自溶鏈霉菌almRIII基因突變株的新鮮孢子，接種新鮮孢子至TSB培養(yǎng)基制備發(fā)酵種子液；

(2)接種發(fā)酵種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、250rpm發(fā)酵培養(yǎng)；該發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：2％豆粉，0.2％蛋白胨，2％葡萄糖,0.5％可溶性淀粉，0.2％酵母浸膏，0.4％NaCl，0.05％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄，0.2％CaCO₃；

(3)收集發(fā)酵液上清，用乙酸乙酯抽提兩次，經(jīng)硅膠柱層析及半制備HPLC純化，得到洋橄欖葉素及其衍生物的純品。

進(jìn)一步地，所述的發(fā)酵方法是：將步驟(3)純品于45℃減壓蒸干、溶于甲醇，用HPLC分析或/和用質(zhì)譜和¹H、¹³C核磁共振確認(rèn)化合物結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明構(gòu)建的自溶鏈霉菌almRIII基因突變工程菌命名為自溶鏈霉菌TL561(△almRIII)Streptomyces autolyticus TL561(△almRIII)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCC NO：M 2015580，保藏日期：2015年10月8日。

如圖2～3，采用HPLC進(jìn)行分析和洋橄欖葉素及其衍生物結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和¹H、¹³C核磁共振分析確認(rèn)，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所構(gòu)建almRIII基因敲除突變株產(chǎn)洋橄欖葉素及其衍生物的產(chǎn)量為662.3mg/L，與野生型中的242.2mg/L相比，本發(fā)明產(chǎn)量為野生型的2.73倍以上，產(chǎn)量大幅提高。為此，本發(fā)明通過敲除格爾德霉素生物合成基因簇中的調(diào)控基因almRIII改造了自溶鏈霉菌野生型菌株遺傳性質(zhì)，大幅降低了菌株格爾德霉素的產(chǎn)量，同時大幅度提高了洋橄欖葉素及其衍生物的產(chǎn)量，為洋橄欖葉素及其衍生物的生物醫(yī)藥工程創(chuàng)造了嶄新途徑。

附圖說明

圖1為自溶鏈霉菌almRIII基因敲除突變株的構(gòu)建策略。其中，BamH I是酶切的野生型菌株基因組DNA；BamH I是酶切的突變株基因組DNA。

圖2為自溶鏈霉菌almRIII基因敲除突變株的瓊脂糖凝膠分析圖。圖中，1.2kb為野生型擴(kuò)增的結(jié)果，1.9kb為突變株擴(kuò)增的結(jié)果。

圖3為自溶鏈霉菌almRIII基因敲除突變株的Southern雜交分析圖。圖中，0.73kb為野生型雜交的結(jié)果，0.38kb為突變株雜交的結(jié)果。

圖4為野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的自溶鏈霉菌almRIII基因的檢測。其中，I：洋橄欖葉素；II：11-氧-甲基洋橄欖葉素；III：11,11′-氧-二甲基洋橄欖葉素。

圖5為敲除突變株的產(chǎn)物的自溶鏈霉菌almRIII基因的檢測。其中，I：洋橄欖葉素；II：11-氧-甲基洋橄欖葉素；III：11,11′-氧-二甲基洋橄欖葉素。

圖6為洋橄欖葉素的結(jié)構(gòu)式。

圖7為洋橄欖葉素的一個OH被OCH3取代的11-氧-甲基洋橄欖葉素衍生物結(jié)構(gòu)式。

圖8為洋橄欖葉素的兩個OH被OCH3取代的及11,11′-氧-二甲基洋橄欖葉素衍生物結(jié)構(gòu)式。

以下通過具體實(shí)施方式及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中所提到的制備、轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、電泳和Southern雜交等過程，如無特殊說明，則采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法均可實(shí)現(xiàn)，作為與本發(fā)明記載的并列方法不再贅述。

具體實(shí)施方式

(一)敲除自溶鏈霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法

實(shí)施例1：

按照圖1自溶鏈霉菌almRIII基因(SEQ ID NO：1)敲除突變株的構(gòu)建策略：敲除自溶鏈霉菌(Streptomyces autolyticus)△almRIII基因以獲得突變株，該自溶鏈霉菌(Streptomyces autolyticus)保藏編號為CCTCC NO：M 2015580。

實(shí)施例2：

采用Red/ET一步PCR法構(gòu)建almRIII基因的插入突變(圖1)。在此方法中，首先以pHY773為模板，采用PCR擴(kuò)增兩端帶有與almRIII基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒。

PCR擴(kuò)增的引物為：

5′-TATTGGCTGACAGCCAGCCAACGCAGGAGTTACAGCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′(SEQ ID NO：2)和

5′-GGGCCCGTCCCTCACCCATGAGTCACCTCTGAGTGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′(SEQ ID NO：3)，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱2分鐘，1個循環(huán)；94℃變性45分鐘，62℃復(fù)性45秒，72℃擴(kuò)增2分鐘，31個循環(huán)；72℃擴(kuò)增10分鐘；4℃1小時。然后通過電轉(zhuǎn)化把PCR擴(kuò)增片段導(dǎo)入含pIJ790和almRIII基因粘粒質(zhì)粒的大腸桿菌中，篩選阿泊拉霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，獲得含有插入突變的almRIII基因。從上述轉(zhuǎn)化子中制備含有插入突變的almRIII基因的粘粒質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌ET12567/pUZ8002中。利用接合轉(zhuǎn)移把含有插入突變的almRIII基因?qū)胍吧妥匀苕溍咕?，篩選阿泊拉霉素抗性和硫鏈絲菌素敏感的接合轉(zhuǎn)移子，即可能的自溶鏈霉菌almRIII基因敲除突變株。

實(shí)施例3：

采用Southern雜交驗(yàn)證自溶鏈霉菌almRIII敲除突變株。

首先通過PCR擴(kuò)增制備Southern雜交探針，PCR引物為：5′-GCGAGTTGCGCCGGCGCGGGGTACG-3′(SEQ ID NO：4)和5′-CAGAACCGCGGCGCCGACGGCATC-3′(SEQ ID NO：5)，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱2分鐘，1個循環(huán)；94℃變性45分鐘，62℃復(fù)性45秒，72℃擴(kuò)增2分鐘，31個循環(huán)；72℃擴(kuò)增10分鐘；4℃1小時。然后制備自溶鏈霉菌almRIII突變株及野生型菌株的基因組DNA，DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I完全酶切，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以上述探針進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證自溶鏈霉菌almRIII敲除突變株，結(jié)果如圖2～3。

(二)自溶鏈霉菌野生型菌株及almRIII基因敲除突變株發(fā)酵產(chǎn)物的檢測

實(shí)施例4：

自溶鏈霉菌野生型菌株及almRIII基因敲除突變株的新鮮孢子分別接種至50mL TSB液體培養(yǎng)基中，于28℃、200rpm培養(yǎng)36小時制備發(fā)酵種子液，然后以1％的接種量接種0.5mL種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基中，該發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：

2％豆粉，0.2％蛋白胨，2％葡萄糖,0.5％可溶性淀粉，0.2％酵母浸膏，0.4％NaCl，0.05％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄，0.2％CaCO₃。

于28℃、250rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天。

發(fā)酵液3500×rpm離心，30分鐘，取上清，用乙酸乙酯抽提兩次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。然后通過正向硅膠進(jìn)行劃段，用純氯仿，氯仿/甲醇40:1；20:1；15:1；9:1四種比例及純甲醇梯度洗脫。在獲得出峰時間為24.4min，26.6min及28.4min樣品的粗樣后，首先通過凝膠柱，根據(jù)分子量大小的不同，將其它的化合物先去除掉，隨后使用反向硅膠柱，用乙腈/水(7:3；8:2；9:1)三種比例及純乙腈進(jìn)行洗脫，將這三個化合物分開。將含有這3個化合物的組分利用半制備HPLC，以乙腈/水(7:3；8:2；9:1)及純乙腈，流速3ml/min進(jìn)行制備，最后得到這三個化合物的純品。

實(shí)施例5：

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃減壓蒸干后溶于適量甲醇，并采用HPLC進(jìn)行分析(圖5)。洋橄欖葉素及其衍生物結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和¹H、¹³C核磁共振分析確認(rèn)(圖6～8)。所構(gòu)建almRIII基因敲除突變株產(chǎn)洋橄欖葉素及其衍生物的產(chǎn)量為662.3mg/L，與野生型中的242.2mg/L相比大幅提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南大學(xué)

<120> 敲除自溶鏈霉菌野生型菌株的almRIII基因、發(fā)酵提高洋橄欖葉素及衍生物

產(chǎn)量的方法

<130> 說明書

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 自溶鏈霉菌 (Streptomyces autolyticus)

<400> 1

atggtccccc gaagcccgtc ggtcaatgag gagttgcgcc gccgatccca agtccgtctg 60

ctggacgcga cggtcgagct gatcggcgag cacggctatg aggcgaccac cctcgccgat 120

atcgccgacc gggccggagc ggcccgcggc ctggtctcgt actacttccc gggcaagcgg 180

cagctgctcc agacggccgt ccaccggctg atgcacatgg agctggcccg ggggctcgag 240

cgggagccgc gtccggaggg cgagggcgcc gggcgggagc tgctggcgcg ggcgatcgac 300

gcgatcctcg ggctggcccg ggaccggccg cggctgatgc gcacgcatat ggccgggatc 360

ctcacggccg agggcttcat ccagtgcccc gagcagcagc ggctggccgg tctgctgcgg 420

gacaccgtca cgcggtacgg ctcggaggac cccgagaccg actaccggct gctgcgcgcc 480

ctgctgatgg gcgcggtggt cgcggtgctg ctgccgggcg cgccgatgcc gcccgagcgg 540

ctgcgggcgg agctgttcca ccgctatgga ctggactggg agcttggact cccgccgggc 600

gaggagccgc ccgacgggag tcgatga 627

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tattggctga cagccagcca acgcaggagt tacagcatga ttccggggat ccgtcga 57

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggcccgtcc ctcacccatg agtcacctct gagtgctcat gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人共序列

<400> 4

gcgagttgcg ccggcgcggg gtacg 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagaaccgcg gcgccgacgg catc 24