本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及一種提高半纖維素酶、纖維素酶或木質(zhì)纖維素基質(zhì)水解相關(guān)的輔助酶蛋白在重組畢赤酵母中表達(dá)量的方法及其雙質(zhì)粒重組畢赤酵母的構(gòu)建。

背景技術(shù)：

半纖維素酶、纖維素酶和木質(zhì)纖維素基質(zhì)水解相關(guān)的輔助酶都是一類多組分酶蛋白的總稱，能夠共同作用將難以被生物利用的木質(zhì)纖維素水解為利于被生物利用的葡萄糖，因此被認(rèn)為是潛力巨大的酶制劑之一。半纖維素酶和纖維素酶都屬于糖苷水解酶，能夠降解木質(zhì)纖維素的半纖維素酶酶系包括隨機(jī)切割木聚糖主鏈產(chǎn)生木寡糖的β-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶、β-D-1,4外切木糖苷酶和側(cè)鏈水解酶(α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等)。纖維素酶系至少包括三類組分，分別為葡聚糖外切酶(CBH)，葡聚糖內(nèi)切酶(EG)以及β-葡萄糖苷酶(BG)，其中EG作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)，水解β-1,4糖苷鍵，可將線性纖維素多聚物截斷生成大量纖維素小分子；CBH水解1,4-β-D-糖苷鍵，作用于線性纖維素多聚物末端，生成纖維二糖分子；BG則將纖維二糖水解成為葡萄糖。輔助酶主要包括AA9、植物擴(kuò)展蛋白Expansin和膨脹因子Swollenin等。輔助酶不直接參與木質(zhì)纖維素的水解，但在半纖維素酶和纖維素酶水解木質(zhì)纖維素過程中加入輔助蛋白，可以明顯提高其水解效率。在纖維素酶、半纖維素酶和輔助酶相互協(xié)同作用下，可以將地球上最豐富的生物高聚物—纖維素和半纖維素，轉(zhuǎn)化為微生物可以容易利用的葡萄糖，通過發(fā)酵產(chǎn)生生物燃料，用以緩解目前能源短缺問題。

半纖維素酶和纖維素酶來源廣泛，主要來源于可培養(yǎng)的環(huán)境微生物，如黑曲霉、里氏木霉、白腐真菌、類芽孢桿菌和一些厭氧的嗜熱細(xì)菌等。然而，這些自產(chǎn)酶天生具有一定的配比缺陷，就目前工業(yè)應(yīng)用最為廣泛的產(chǎn)纖維素酶真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)而言，其纖維素酶系中缺乏外切酶CBH II和β-葡萄糖苷酶BG，導(dǎo)致其纖維素酶系酶解效率低下。另外，無論是來源于生物的自產(chǎn)酶系還是人工制成的商業(yè)纖維素酶制劑，其中所含蛋白種類多達(dá)八十余種，導(dǎo)致半纖維素酶和纖維素酶核心酶組分的比酶活降低，從而造成木質(zhì)纖維素水解效率低下。更為重要的是，不同木質(zhì)纖維素原料中纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素的比例有顯著差異，且經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素也有半纖維素的殘留，這些因素共同導(dǎo)致了木質(zhì)纖維素水解效率低，酶用量大。所以，纖維素酶制劑的重新設(shè)計(jì)和定制為木質(zhì)纖維素的高效水解、降低纖維素酶成本提供了新的研究思路。于是，利用半纖維素酶組分、纖維素酶組分和輔助酶進(jìn) 行復(fù)配，可以減少酶用量，提高木質(zhì)纖維素的水解效率。因此，基于上述思路，獲得半纖維素酶、纖維素酶和一些輔助酶單酶組分十分關(guān)鍵。

近些年來，異源表達(dá)酶蛋白基因獲得單酶組分引起了大量研究著的關(guān)注。Pichia pastoris可以實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾作用，如糖基化、二硫鍵形成，使蛋白可以進(jìn)行正確折疊，并獲得有活性的目標(biāo)蛋白，另外，畢赤酵母并不產(chǎn)生內(nèi)源性的與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的酶組分，且胞外蛋白成分并不復(fù)雜，重組畢赤酵母菌發(fā)酵上清液甚至可以不經(jīng)過純化直接作為單酶制劑進(jìn)行使用，因此，以Pichia pastoris作為首選宿主菌，實(shí)現(xiàn)酶(或蛋白)的異源表達(dá)以獲得高濃度和高純度半纖維素酶、纖維素酶和輔助酶等單酶組分，已成為研究熱點(diǎn)。

資料表明，提高外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)量的途徑之一是對外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過密碼子優(yōu)化，不僅能實(shí)現(xiàn)外源基因的成功表達(dá)，同時還能提高目的產(chǎn)物的表達(dá)量。此外，通過篩選高拷貝轉(zhuǎn)化菌株可以實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物高產(chǎn)。另外，體外構(gòu)建多拷貝目的基因的質(zhì)粒(如專利CN 101955958A和CN 104046649A等)，通過同源重組來增加重組畢赤酵母中目的基因的拷貝數(shù)，從而提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明以畢赤酵母作為宿主菌，理性、高效地構(gòu)建出高產(chǎn)半纖維素酶組分—木聚糖酶的重組畢赤酵母菌株，獲取高酶活的木聚糖酶，為工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對國內(nèi)外現(xiàn)有木聚糖酶普遍存在木酶活不高的現(xiàn)狀，能夠提供工業(yè)生產(chǎn)木聚糖酶的基因工程菌很少。本發(fā)明對半纖維素酶中的一個重要組分—木聚糖酶的基因進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)。表達(dá)的木聚糖酶具有較高的活性，對于用于木質(zhì)纖維素物料降解生產(chǎn)可發(fā)酵性單糖的應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用價值。

本發(fā)明的目的是提供一種獲取高酶活木聚糖酶的方法和一種優(yōu)化的木聚糖酶基因，優(yōu)化后的序列GC含量由52％降低為41.77％，優(yōu)化前后序列同源性為76.83％，并構(gòu)建pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC表達(dá)載體，以獲取穩(wěn)定高效的表達(dá)轉(zhuǎn)化子。

本發(fā)明提供的密碼子優(yōu)化后的木聚糖酶(XynC)基因和高產(chǎn)該木聚糖酶的雙質(zhì)粒重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的具體步驟如下：

1、木聚糖酶基因的優(yōu)化：

本發(fā)明對一種源于黑曲霉的木聚糖糖酶(XynC)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明利用Gene Designer(DNA2.0,Menlo Park)并基于畢赤酵母密碼子偏好性對SEQ ID NO.1進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的核苷酸序列，命名為AxynC，序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明提供的木聚糖酶分子量35.5kDa，密碼子優(yōu)化前后木聚糖酶XynC氨基酸序列無變化，其序列如SEQ ID NO.3所示。

2、表達(dá)載體的構(gòu)建：

以質(zhì)粒pPIC9K和pPICZαA作為載體，將優(yōu)化后的木聚糖酶基因AxynC插入啟動子AOX1下游，5’端酶切位點(diǎn)為EcoR I，3’端酶切位點(diǎn)為Not I，構(gòu)建pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC表達(dá)載體。

3、高酶活菌株的構(gòu)建及篩選：

利用兩步電擊轉(zhuǎn)化法，構(gòu)建高產(chǎn)木聚糖酶的重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，即以Sac I作為pPIC9K-AxynC表達(dá)載體線性化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)表達(dá)載體線性化，通過電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，利用G418抗性篩選高酶活菌株。以高酶活菌株作為宿主進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)化，即將Sac I酶線性化的pPICZαA-AxynC電擊轉(zhuǎn)化以上高酶活菌株，利用高通量初篩，搖瓶酶活復(fù)曬法獲得高產(chǎn)木聚糖酶的重組畢赤酵母菌株。

4、優(yōu)化產(chǎn)酶條件：

以BMMY作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH值、誘導(dǎo)劑(甲醇)量、培養(yǎng)溫度和溶氧(搖床轉(zhuǎn)數(shù))，實(shí)現(xiàn)XynC穩(wěn)定高效產(chǎn)酶。

本發(fā)明有益效果：

1、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶(XynC)基因密碼子優(yōu)化，宿主菌為畢赤酵母菌，優(yōu)化后降低了GC含量，由52％降低為41.77％，利用RNA二級結(jié)構(gòu)折疊軟件RNAstructure對優(yōu)化后的核苷酸序列實(shí)現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)折疊，并調(diào)整堿基序列，使起始密碼子端堿基呈開環(huán)結(jié)構(gòu)，利于核糖體結(jié)合和木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)。

2、本發(fā)明在重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的過程中，利用兩步電擊轉(zhuǎn)化法(或雙質(zhì)粒)，能有效提高目的基因在重組畢赤酵母中的拷貝數(shù)，與一步電擊轉(zhuǎn)化法(或單質(zhì)粒)相比，避免了多次篩選的繁瑣，兩步電擊轉(zhuǎn)化法能更理性、更高效地獲得高產(chǎn)重組畢赤酵母。

3、本發(fā)明構(gòu)建了含醇氧型啟動AOX1的pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC的雙質(zhì)粒(或雙抗性)重組菌株，以甲醇作為誘導(dǎo)劑，控制甲醇添加量，大幅度提高重組目的蛋白表達(dá)量。

附圖說明

圖1：木聚糖酶(XynC)基因優(yōu)化前后序列的對比圖。

圖2：構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC的過程示意圖。

圖3：表達(dá)載體pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC核酸電泳檢測：

1、4號泳道是利用限制性內(nèi)切酶Sac I單酶切后所得條帶；

2、3號泳道是利用限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I雙酶切后所得條帶。

圖4：雙質(zhì)粒重組畢赤酵母構(gòu)建和篩選過程。

圖5：雙質(zhì)粒重組畢赤酵母和單質(zhì)粒高酶活菌株產(chǎn)酶能力對比圖。

圖6：雙質(zhì)粒菌株發(fā)酵上清液中重組木聚糖酶AxynC的SDS-PAGE電泳圖譜。

圖7：雙質(zhì)粒菌株在搖瓶水平最適產(chǎn)酶條件下酶活變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的方法作進(jìn)一步說明。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。

實(shí)施例1：木聚糖酶(XynC)基因密碼子優(yōu)化

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank中檢索黑曲霉Aspergillus niger木聚糖酶基因序列(登錄號：KJ601783)，根據(jù)下述方法進(jìn)行密碼子優(yōu)化：

(1)采用軟件GeneDesigner 2.0，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對XynC的密碼子(SEQ ID NO.1)進(jìn)行初步替換；并計(jì)算GC含量，再根據(jù)GC含量進(jìn)一步調(diào)整，使其值介于40～50％。分析調(diào)整后基因序列中mRNA隱蔽剪接位點(diǎn)和密碼子的分布量，借助該軟件可直觀辨析密碼子前后改變量。

(2)采用RNAStructure 3.2對mRNA二級結(jié)構(gòu)的起始密碼子端進(jìn)行預(yù)測和自由能進(jìn)行分析，選擇自由能較低和起始密碼子端呈開環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，最后獲得優(yōu)化后的序列SEQ ID NO.2，命名為AxynC。

(3)采用全基因合成方法獲取優(yōu)化后的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)。

木聚糖酶基因優(yōu)化前后序列比對如附圖1所示。

實(shí)施例2：重組表達(dá)載體pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC的構(gòu)建

表達(dá)載體pPIC9K、pPICZαA用EcoR I和Not I雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。純化后，合成的目的基因分別和載體pPIC9K、pPICZαA采用T₄DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用菌落PCR鑒定獲取目的載體pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有目的載體的大腸桿菌12～16h，按照質(zhì)粒提取手冊提取目的載體。表達(dá)載體pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC的構(gòu)建和驗(yàn)證如圖2和圖3所示。

實(shí)施例3：兩步電擊轉(zhuǎn)化法構(gòu)建高產(chǎn)木聚糖酶的重組畢赤酵母及菌株的篩選

采用Sac I對pPIC9K-AxynC進(jìn)行線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液體涂布RDB固體培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)3天。挑取生長正常的菌落轉(zhuǎn)接到含有不同濃度(1、2、4和6mg/mL)遺傳霉素G418的YPD平板上，挑取高濃度平板上能正常生長的菌落。將上述獲取的菌落分別接種于30mL BMMY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，220rpm培養(yǎng)4天，每24h補(bǔ)加甲醇，使其終濃度為0.5％，培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集上清液，以櫸木木聚糖 為底物測定酶活，其中酶活力最高的為16號菌(命名為P.pastoris GS115/pPIC9K-AxynC#16)。以Sac I對pPICZαA-AxynC進(jìn)行線性化，電擊轉(zhuǎn)化重組畢赤酵母16號菌感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含有博萊霉素(100ug/mL)的YPDS固體培養(yǎng)基，挑取平板上的單菌落分別接種到裝有500ul BMMY培養(yǎng)基的48深孔板(5mL/孔)進(jìn)行高通量篩選，按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行初步篩選，對產(chǎn)酶能力較好的菌株(4株)進(jìn)行搖瓶酶活復(fù)曬，其活力最高的為29號雙質(zhì)粒菌株(命名為P.pastoris GS115/pPIC9K/pPICZαA-AxynC#29)，具體構(gòu)建流程如附圖圖4所示。雙質(zhì)粒菌株29號菌和16號菌產(chǎn)酶能力比較，酶活提高了34％，如附圖中圖5所示。29號菌產(chǎn)木聚糖酶的SDS-PAGE驗(yàn)證如圖6所示。

實(shí)施例4：重組木聚糖酶(AxynC)活性測定

木聚糖酶活性由DNS法測定。反應(yīng)體系為0.5％的櫸木木聚糖480μL(用pH5.0的50mM的檸檬酸緩沖液配制而成)和適當(dāng)稀釋的酶夜20μL，于50℃水浴保溫10min，保溫結(jié)束后立即加入0.5mL DNS溶液終止反應(yīng)。于沸水中水浴7min顯色。冷卻至室溫，吸取200μL于比色皿中，加入1.8mL去離子水，混勻后于540nm處測定吸光度值。對照組樣品，以20μL pH5.0的50mM的檸檬酸緩沖液取代酶液。酶活定義：在50℃，pH5.0反應(yīng)體系中，該重組木聚糖酶水解櫸木木聚糖每分鐘釋放1μmoL所需的酶量即為一個酶活力單位U。實(shí)施例中所有酶活測定，每個樣品均取3個平行樣。

實(shí)施例5：高活性重組木聚糖酶(AxynC)的制備

通過發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，優(yōu)化條件主要包括發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH、甲醇濃度、培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)數(shù)(即溶氧)。結(jié)果表明，該重組畢赤酵母按如下方法培養(yǎng)可獲得高酶活的木聚糖酶：將雙質(zhì)粒菌株29號菌單菌落接種于250mL裝有30mL BMGY培養(yǎng)基的三角瓶中，220rpm，30℃培養(yǎng)28h，使OD₆₀₀介于8～10。菌液于超凈臺上收集于無菌的50mL離心管中，5000×g離心5min，收集菌體。棄上清液，將菌體全部轉(zhuǎn)接到裝液量為50mL BMMY培養(yǎng)基(初始pH5.5)的500mL三角瓶中，250rpm，28℃，培養(yǎng)基中添加甲醇，使其終濃度為1.5％，培養(yǎng)至240h。每24h取0.5mL樣品，測定生物量(OD₆₀₀)，于4000×g離心5min，收集上清液。以山毛櫸木聚糖作為底物測定酶活和Braford法測定蛋白含量。優(yōu)化結(jié)果如附圖中圖7所示，誘導(dǎo)表達(dá)240h，最高酶活410U/mL，蛋白含量0.37mg/mL，比酶活1105U/mg。注：搖瓶誘導(dǎo)產(chǎn)酶未優(yōu)化前實(shí)驗(yàn)條件：單菌落接種到BMMY培養(yǎng)基(初始pH6.0)，添加甲醇終濃度為0.5％，220rpm，30℃培養(yǎng)240h，其余培養(yǎng)條件不變。