本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，更特別地，涉及mdmax2基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用，以及用于得到對鹽脅迫具有增強抗性的植物的質(zhì)粒載體和方法。

背景技術(shù)：

蘋果是世界上重要的經(jīng)濟作物，用以提供水果和木材(wang等，2015)。蘋果的種植和產(chǎn)量經(jīng)常受到各種外界環(huán)境因素的制約，如光，溫度，營養(yǎng)等。許多基因能夠響應(yīng)外界環(huán)境進而調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育(xiong等，2002；todaka等，2015)。因此，我們有必要研究脅迫誘導基因的功能，從而提高植物抗性。

土壤鹽漬化和干旱已成為限制作物生產(chǎn)力和質(zhì)量的重要因素(zhu,2007)。土壤鹽漬化導致離子和滲透脅迫(tian等，2015)；干旱脅迫導致可利用水的減少(sequera-mutiozabal.,2016)。到目前為止，一系列的信號途徑被證明參與脅迫響應(yīng)過程，如第二信使，mapks信號途徑等。在這些反應(yīng)策略中，脫落酸(aba)在響應(yīng)環(huán)境刺激中扮演重要角色。氣孔的開張在植物響應(yīng)鹽和干旱中受aba誘導。當植物遇到鹽和干旱脅迫時，aba誘導氣孔關(guān)閉保持水分。(yamaguchi-shinozaki和shinozaki,2006).

獨角金內(nèi)酯是一種新型的植物激素(wall等，1972)。它們主要在根系中合成，通過類胡蘿卜途徑合成(matusova等，2005)。最近的研究表明，獨角金內(nèi)酯調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個方面，比如抑制腋芽分枝(lazar等，2006；umehara等，2008)，根際寄生、共生互動(cook等，1966；akiyama等，2005)，鹽和干旱脅迫響應(yīng)(vanha等，2014)，根系發(fā)育(koltai等，2010；kapulnik等，2011)。如今，越來越多的研究專注于獨角金內(nèi)酯介導的地上部分分枝和根系發(fā)育(gomez-roldan等，2008；umehara等，2008；kapulnik等，2011；rasmussen等，2012；sun等，2014；2016)。在獨角金內(nèi)酯信號過程中，四個主要基因協(xié)同調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，包括max1,max3/ccd7,max4/ccd8和max2。其中，max1、max3和max4在獨角金內(nèi)酯合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用(turnbull等，2002；leyser,2003；booker等，2004)，max2編碼一個富含亮氨酸的f-box蛋白(stirnberg等，2002)。參與獨角金內(nèi)酯信號的傳導，擬南芥max2突變體表現(xiàn)出對獨角金內(nèi)酯不敏感的表型(kyozuka等，2009；ruyter-spira等，2013)。

max2參與許多重要的生物學過程，其在獨角金內(nèi)酯介導的地上部分分枝和根系發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用(bennett等，2006；nelson等，2011；mayzlish-gati等，2012)。迄今為止，max2在擬南芥和水稻，豌豆等植物中已經(jīng)研究較多，在蘋果中還未見報道。

我們在研究過程中克隆了蘋果max2基因，研究了mdmax2響應(yīng)多種激素信號和脅迫響應(yīng)，過量表達mdmax2提高了轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷和轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽和抗旱能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

我們在研究過程中克隆了蘋果max2基因，研究了mdmax2響應(yīng)多種激素信號和脅迫響應(yīng)，過量表達mdmax2提高了轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷和轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽和抗旱能力。

基于以上研究，本發(fā)明提供了mdmax2基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。

本發(fā)還提供了一種用于得到抗逆性增強的植物的質(zhì)粒載體，其含mdmax2基因表達框和篩選標記，所述mdmax2基因表達框由包含在植物中組成型表達的強啟動子和由所述強啟動子控制表達的mdmax2基因，所述mdmax2基因表達的蛋白序列如seqidno:1所示。

進一步地，所述mdmax2基因的序列如seqidno:2所示。

進一步地，所述植物是擬南芥、蘋果、桃、梨、楊樹、小麥、玉米或水稻。

優(yōu)選地，所述質(zhì)粒載體由所述mdmax2基因順著camv35s啟動子的轉(zhuǎn)錄方向插入到pri101質(zhì)粒的pstⅰ和bamhⅰ之間得到。

進一步地，其特征在于，所述抗逆性為抗鹽脅迫性和抗旱性。

本發(fā)明還提供了一種用于得到抗逆性增強的植物的方法，其包括以下步驟：將權(quán)利要求1-5中任一項所述的質(zhì)粒載體導入植物細胞中，篩選攜帶有所述質(zhì)粒載體的植物細胞，并將其培育成植株，即得到所述對鹽脅迫具有增強抗性的植物。

進一步地，所述方法包括以下步驟：

1)用所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404，得到攜帶有所述質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌lba4404；

2)用所述攜帶有所述質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌lba4404轉(zhuǎn)化所述植物細胞并培養(yǎng)，通過所述質(zhì)粒載體中的篩選標記篩選被所述轉(zhuǎn)化的植物細胞；

3)通過組織培養(yǎng)將篩選得到的所述被轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株，即得到所述抗逆性增強的植物。

進一步地，所述植物是擬南芥、蘋果、桃、梨、楊樹、小麥、玉米或水稻。

進一步地，所述植物細胞為愈傷組織細胞或胚性細胞。

利用強啟動子(花椰菜花葉病毒35s啟動子)驅(qū)動原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將mdmax2基因的超量表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥和蘋果愈傷中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷?？剐詫嶒灲Y(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥和愈傷抗鹽和抗旱能力顯著提高，說明mdmax2基因在植株抗逆中發(fā)揮重要作用。通過上述質(zhì)粒載體和方法，可得到抗逆性明顯增強的植物，也為進一步研究mdmax2的功能奠定了基礎(chǔ)，使其作為植物抗逆性分子改良的候選基因。

附圖說明

圖1為150mmnacl處理7天后轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1,mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)表型觀察；

圖2為150mmnacl處理7天后轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1、mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)的存活率柱狀統(tǒng)計圖；

圖3為150mmnacl處理7天后轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1、mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)的電解質(zhì)滲透率柱狀統(tǒng)計圖；

圖4為150mmnacl處理7天后轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1、mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)的脯氨酸含量柱狀統(tǒng)計圖；

圖5為野生型(wt)和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織(mdmax2-gusandmdmax2-gfp)生長在含有不同濃度nacl的培養(yǎng)基(0,100,200mm)培養(yǎng)10天的表型觀察；

圖6為野生型(wt)和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織(mdmax2-gus和mdmax2-gfp)nacl處理10天后的鮮重柱狀統(tǒng)計圖；

圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1、mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)干旱處理10天復水3天后的表型觀察；

圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1、mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)干旱處理10天復水3天后的存活率柱狀統(tǒng)計圖；

圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1,mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)干旱處理10天復水3天后的鮮重柱狀統(tǒng)計圖；

圖10為轉(zhuǎn)基因擬南芥(mdmax2-l1,mdmax2-l2和mdmax2-l3)以及野生型擬南芥(col-0)干旱處理10天復水3天后的葉綠素含量柱狀統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例和附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

基于蘋果愈傷組織是單細胞組織，具有繁殖能力強、離體培養(yǎng)再生能力強、遺傳轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，是蘋果研究領(lǐng)域普遍的研究材料。

1.對蘋果中mdmax2基因的研究

發(fā)明人檢測了mdmax2基因在嘎啦蘋果中無脅迫條件下和高鹽濃度下的表達情況，發(fā)現(xiàn)mdmax2基因在高鹽濃度下的上調(diào)表達，暗示mdmax2基因可能蘋果的鹽脅迫抗性有關(guān)。

2.蘋果中mdmax2基因的克隆以及表達載體的構(gòu)建

1)發(fā)明人通過使用引物1：5’-ctcactctcactcattccctc-3’(seqidno:3)和引物2：5’-ctcgtacattgttcctctccg-3’(seqidno:4)，通過rt-pcr從嘎啦蘋果擴增得到mdmax2基因片段，pcr反應(yīng)程序：94℃預變性5分鐘；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒，進行32個循環(huán)；72℃充分延伸10分鐘。

pcr反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物進行回收、pmd18-t載體連接、轉(zhuǎn)化，并進行測序，得到該基因的基因序列如seqidno:2所示，基因表達產(chǎn)物的氨基酸序列如seqidno:1所示，測序正確的單克隆，堿法提取pmd18-t-mdmax2的質(zhì)粒dna，-20℃保存，用于后續(xù)功能驗證實驗。；

2)使用引物3：5’-ctgcagctcactctcactcattccctc-3’(seqidno:5，下劃線標示pstⅰ酶切位點)和引物4：5’-ggatccctcgtacattgttcctctccg-3’(seqidno:6，下劃線標示bamhⅰ酶切位點)，從上述質(zhì)粒pcr擴增得到帶有pstⅰ和bamhⅰ酶切位點的mdmax2基因片段；

3)將上述片段經(jīng)pstⅰ和bamhⅰ雙酶切后連接到同樣經(jīng)pstⅰ和bamhⅰ雙酶切的pcambia1300質(zhì)粒載體上，篩選正確的陽性克隆，得到mdmax2基因表達質(zhì)粒載體。

3.mdmax2基因表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化lb4404

通過電轉(zhuǎn)法將mdmax2基因表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入lb4404農(nóng)桿菌中，進行選擇培養(yǎng)，并通過pcr和測序驗證帶有正確的mdmax2基因表達質(zhì)粒載體的lb4404農(nóng)桿菌。

4.轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

1)將獲得的擬南芥種子，分別用70％酒精消毒3min，4％次氯酸鈉消毒8-10min(期間多次搖晃)，滅菌水沖洗5次，吸干水。播種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上(直接鋪于表面)，光培養(yǎng)(25-28℃，16h長日照/8h短日照，10d)，至小苗長出。移栽到基質(zhì)培養(yǎng)到開花；

2)挑取農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于10mlyep液體培養(yǎng)基(含50mg/l潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至od600為06-0.8(約48h)；取其中l(wèi)ml菌液加入20mlyep液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至od600為06-0.8(約5h)。離心收集菌體，用侵染液(含0.05g/ml蔗糖、0.03-0.05％silweet)懸浮稀釋20倍，備用；

3)將擬南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果莢，50mg·l^-1hyg抗性篩選后，pcr檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過連續(xù)3代篩選得到t3代純合體，收取種子，進行表型分析。

4)利用篩選培養(yǎng)基(含100mg/l潮霉素)篩選抗潮霉素陽性的候選轉(zhuǎn)基因株系，共獲得3個35s:mdmax2陽性株系(l1、l2和l3)；為進一步鑒定轉(zhuǎn)基因株系，在進行繼代培養(yǎng)時，每株系各取0.1g左右的組培苗，提取相應(yīng)的rna，反轉(zhuǎn)錄并進行定量pcr檢測，以確定這些株系中mdmax2基因的表達水平。結(jié)果顯示，mdpin1基因在l1、l2及l(fā)3中過量表達。

5.轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的獲得

1)挑取農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于10mlyep液體培養(yǎng)基(含50mg/l潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至od600為06-0.8(約48h)；取其中1ml菌液加入20mlyep液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至od600為06-0.8(約5h)。離心收集菌體，ddh2o稀釋，配制侵染液；

2)取生長狀態(tài)良好的野生型蘋果愈傷組織。將愈傷組織置于侵染液中靜置孵育30min。吸收紙吸干后，預培養(yǎng)1天；

3)將預培養(yǎng)1天后的蘋果愈傷平鋪到選擇性培養(yǎng)基(100mg·l^-1hyg)上培養(yǎng)1-2月；

4)通過基因檢測篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織。

6.轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的抗逆性分析

1)mdmax2提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽性

為了研究mdmax2在植物鹽脅迫響應(yīng)中的作用mdmax2轉(zhuǎn)基因擬南芥用來進行一些抗性試驗。

兩周的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥用nacl溶液噴施7天。鹽處理7天后，野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出明顯的差異，轉(zhuǎn)基因擬南芥仍然能生長，而野生型已經(jīng)枯萎(圖1)，并且存活率明顯好于野生型(圖2)。轉(zhuǎn)基因擬南芥電解質(zhì)滲透率低于野生型(圖3)。如圖4所示,轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸含量高于野生型.以上結(jié)果說明，mdmax2提高擬南芥抗鹽能力。

2)mdmax2提高轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織抗鹽性

轉(zhuǎn)基因愈傷(mdmax2-gus、35s::mdmax2-gfp)被用來進行抗鹽處理試驗。10天的野生型和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織在含有不同濃度nacl的培養(yǎng)基上(0,100,200mm)繼代培養(yǎng)10天。如圖5所示，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的大小明顯大于野生型，測量得到的愈傷組織的鮮重，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因蘋果的愈傷組織的鮮重明顯高于野生型(圖6)，說明mdmax2提高轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷抗鹽能力。

3)mdmax2提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性

為了檢測mdmax2轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱能力，2周的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥持續(xù)干旱處理7天。結(jié)果顯示，野生型擬南芥枯萎程度較轉(zhuǎn)基因擬南芥更嚴重(圖7)，更高的死亡率(圖8)；另外，轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重(圖9)和葉綠素含量高于野生型(10)。說明mdmax2提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱能力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>山東農(nóng)業(yè)大學

<120>mdmax2基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>720

<212>prt

<213>嘎啦蘋果

<400>1

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<213>嘎啦蘋果

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<213>人工序列

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