本發(fā)明涉及植物體內(nèi)基因沉默技術(shù)，特別是涉及通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)來同時沉默植物體內(nèi)的2個目的基因技術(shù)。

背景技術(shù)：

人們經(jīng)常需要分析植物中基因的功能，有時候是某單個基因的功能，有時候是要同時分析2個或2個以上的基因的功能，這就需要同時敲除2個或2個以上的基因，通常需要先通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得單個基因缺失的突變體，然后在通過遺傳雜交篩選雙基因缺失的突變體。但在篩選雙基因缺失的突變體的過程中，耗費的時間周期長，成本高，工作量非常大，操作復(fù)雜，成功率較低。并且有時候同時敲除雙基因時會造成植物致死，使得我們不能進(jìn)一步來研究基因的功能。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virusinducedgenesilencing,vigs)是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,ptgs)現(xiàn)象，可引起植物內(nèi)源mrna序列特異性降解。當(dāng)攜帶植物功能基因cdna的病毒侵染植物體后可以誘導(dǎo)植物體觸動rna降解機制，使植物體同源基因的mrna被降解，從而可以通過植物表型或生理生化指標(biāo)上的變化來反映該基因的功能。

利用vigs研究植物基因組功能具有以下優(yōu)勢：1)周期性短、成本較低、構(gòu)建簡易，一般基因在3周以內(nèi)都能達(dá)到沉默的效果；2)不需要遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物即可抑制基因表達(dá)，在當(dāng)代就可以觀察基因沉默表型；3)克服基因家族功能冗余的缺點；4)快速比較不同物種之間的基因功能。因此，vigs是植物中分析基因功能非?？焖賹嵱玫募夹g(shù)。已有大量的報道表明vigs可以應(yīng)用在植物體內(nèi)沉默單個基因，如已成功在本生煙中沉默單個基因nbpds、nbics1、nbnpr1、nbsabp2等。然而利用vigs同時沉默2個基因還很少報道。鑒于利用vigs研究植物基因組功能具有多重優(yōu)勢，因此本研究通過借助vigs技術(shù)來發(fā)明一種同時沉默2個植物中目的基因的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種同時沉默煙草植物中2個目的基因的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種同時沉默煙草植物中2個目的基因的方法，包括如下步驟：

(1)分別采用nbsabp2和nbnac1基因的特異引物，通過rt-pcr在本生煙中分別擴(kuò)增出nbsabp2基因片段和nbnac1基因片段；分別回收擴(kuò)增的nbsabp2和nbnac1基因片段；所述nbsabp2基因的特異引物為nbsabp2-f和nbsabp2-r，其序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示；nbnac1基因的特異引物是nbnac1-f和nbnac1-r，其序列分別如seqidno.3和seqidno.4所示；

(2)以回收的nbsabp2和nbnac1基因片段為共同模板，利用nbsabp2-f和nbnac1-r為引物，擴(kuò)增(nbsabp2+nbnac1)；回收(nbsabp2+nbnac1)片段；

(3)將回收的(nbsabp2+nbnac1)片段與載體連接；

(4)將上述的連接產(chǎn)物通過熱激的方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得p(nbsabp2+nbnac1)重組質(zhì)粒，

(5)利用菌液pcr和質(zhì)粒pcr來對p(nbsabp2+nbnac1)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

(6)將(nbsabp2+nbnac1)克隆到ptrv2(可從biovector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心購買)載體上，構(gòu)建病毒重組質(zhì)粒ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)；

(7)將構(gòu)建的病毒重組質(zhì)粒ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv2260中。

(8)通過利用菌液pcr和質(zhì)粒pcr來對ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

(9)將ptrv1(可從biovector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心購買)的農(nóng)桿菌和帶有目的片段ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)農(nóng)桿菌按照1:1的比例混合；用無針頭的1ml無菌注射器將混合農(nóng)桿菌懸浮液注入本生煙煙草下位葉片中；

(10)從侵染了12天的農(nóng)桿菌的本生煙中提取總rna。通過熒光定量pcr的方法檢測nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)。結(jié)果表明nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)顯著降低。

所述nbsabp2和nbnac1基因的特異引物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行設(shè)計，本發(fā)明中推薦使用如下：所述nbsabp2基因的特異引物nbsabp2-f和nbsabp2-r，其序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示；所述nbnac1基因的特異引物nbnac1-f和nbnac1-r，其序列分別如seqidno.3和seqidno.4所示。

采用本發(fā)明的方法，結(jié)果表明nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)顯著降低。實現(xiàn)了同時沉默煙草植物中2個目的基因。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例一種同時沉默煙草植物中2個目的基因的方法的流程框圖。

圖2為本發(fā)明實施例中通過熒光定量pcr的方法檢測nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清晰，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例一

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供了一種同時沉默煙草植物中2個目的基因的方法，包括如下步驟：

1.分別設(shè)計nbsabp2和nbnac1基因的特異引物，注意設(shè)計引物時應(yīng)擴(kuò)增靠近基因3′區(qū)域的片段，引物如下：

nbsabp2-f(seqidno.1)：5′-actcttcctttgttttag-3′

nbsabp2-r(seqidno.2)：

5′-atcgattgtggccgcggtggatgggcaatctccaagaga-3′

nbnac1-f(seqidno.3)：

5′-tctcttggagattgcccatccaccgcggccacaatcgat-3′

nbnac1-r(seqidno.4)：5′-ttagtaaggtttctgcatg-3′

值得注意的是為了將nbsabp2和nbnac1基因連接在一起，我們將采用重疊pcr來將它們連接在一起。因此我們在設(shè)計引物時要做一些改變，仔細(xì)觀察上面的引物可以發(fā)現(xiàn)nbsabp2-r和nbnac1-f這兩條引物要比另外兩條引物長很多，那是因為我們在設(shè)計引物的時候在nbsabp2-r的3′端加入了20個nbnac1基因5′端的序列，在nbnac1-f的5′端加入19個nbsabp2基因3′端的序列。

2.選取本生煙較嫩葉片為材料，提取本生煙植物的總rna。cdna的合成參照invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行，以oligo(dt)18為通用引物，在37℃合成cdna第一條鏈。以nbsabp2-f和nbsabp2-r為引物從本生煙中克隆出nbsabp2基因的部分片段，以nbnac1-f和nbnac1-r為引物從本生煙中克隆出nbnac1基因的部分片段，通過rt-pcr在本生煙中分別擴(kuò)增出大約420bp的nbsabp2基因片段和大約300bp的nbnac1基因片段。

3.利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)分別回收擴(kuò)增的nbsabp2和nbnac1基因片段。

4.以回收的nbsabp2和nbnac1基因片段為共同模板，nbsabp2-f和nbnac1-r為引物，擴(kuò)增(nbsabp2+nbnac1)，這樣我們就利用重疊pcr的方法將(nbsabp2+nbnac1)拼接起來了。

5.利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)回收(nbsabp2+nbnac1)片段。

6.按照定向中間載體試劑盒(invitrogen)操作說明書將回收的(nbsabp2+nbnac1)片段與載體連接。在1.5mlep管中依次加入以下成分，具體如下：

然后輕輕混勻，在室溫條件下反應(yīng)1h。

7.轉(zhuǎn)化大腸桿菌

將上述的連接產(chǎn)物(2-4μl)在無菌條件下加入到裝有100μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的ep管中，并輕輕搖勻，冰上放置30min；

在42℃條件下水浴中熱激60-90s，熱激完將ep管放置于冰上冷卻3～5min；

然后向ep管中加入300-500μl的液體lb培養(yǎng)基，并將其放入搖床中在37℃條件振蕩培養(yǎng)lh左右。

將上述的菌液涂布于含有50mg/l壯觀霉素的固體lb培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，37℃條件下進(jìn)行過夜培養(yǎng)，大約12-16h。

8.重組質(zhì)粒的鑒定

挑取以上培養(yǎng)的單菌落，在無菌條件下接種于含有50mg/l壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)12-16h。培養(yǎng)結(jié)束后可以通過菌液pcr檢測，來鑒定該(nbsabp2+nbnac1)片段是否成功連接到載體上。為了進(jìn)一步驗證，可以從菌液中提取質(zhì)粒來進(jìn)行質(zhì)粒pcr檢測，質(zhì)粒的提取方法可以參照質(zhì)粒提取試劑盒的操作說明書的步驟進(jìn)行。

9.病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照lrclonase^tmiienzymemix操作說明書將上述(nbsabp2+nbnac1)序列片段克隆到ptrv2載體(可從biovector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心購買)上。

在1.5mlep管中依次加入以下成分，具體如下表。

混勻后室溫靜置5min。

加入2-3μllrclonase^tmiienzymemix到樣品中，并輕輕震蕩混勻。

室溫(25℃)條件下反應(yīng)1-2h。

加入1μlproteinasek溶液到樣品中，并輕輕震蕩混勻，37℃水浴條件下放置10min，終止反應(yīng)。

10.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv2260

將1μl的重組質(zhì)粒加入到裝有50μl的農(nóng)桿菌gv2260感受態(tài)細(xì)胞的ep管中，輕輕混勻，冰上放置30min。

將ep管放入液氮中冷凍1min后，立即放在37℃水浴鍋中水浴3-5min。

然后向ep管中加入400μllb液體培養(yǎng)基，放入搖床中，控溫28℃，轉(zhuǎn)速220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)4～5h。

將菌液涂布在含有四種抗生素(amp、strep、kana、rif)的lb固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2天，進(jìn)行篩選。獲得ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)的重組菌落。

11.重組質(zhì)粒的pcr鑒定

挑取單菌落放置4mllb液體培養(yǎng)基中，控溫28℃，轉(zhuǎn)速220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)。菌液用于菌液pcr檢測。此外，還收集菌體，按質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒pcr鑒定。

12.農(nóng)桿菌侵染

分別挑取ptrv1(可從biovector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心購買)、ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)的重組菌落接入5mllb液體培養(yǎng)基，并加入相應(yīng)的抗生素，控溫28℃，轉(zhuǎn)速220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)。

然后將活化的菌液接入到上述抗性相同的50mllb液體培養(yǎng)基，另外再加入10mm2-n-嗎啉基乙磺酸(mes)和20μm乙酰丁香酮(as)，控溫28℃，轉(zhuǎn)速220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)。

在3000rpm的條件下離心10min收集農(nóng)桿菌菌體，用侵染緩沖液(10mmmgcl2，10mmmes，和200μmas)懸浮菌體，在600nm波長下調(diào)節(jié)od600值至0.8左右，室溫靜置3h左右。

將ptrv1的農(nóng)桿菌和ptrv2-(nbsabp2+nbnac1)農(nóng)桿菌按照1:1的比例混合。用無針頭的1ml無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液注入本生煙煙草下位葉片中。

13.熒光定量pcr檢測nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)

為了避免載體上連接的基因片段的干擾，我們在設(shè)計引物時選擇靠近基因5’端的序列來設(shè)計。引物如下：

nbsabp2-f′(seqidno.5)：5′-caggccataaggttac-3′

nbsabp2-r′(seqidno.6)：5′-tatcaggcatgaaagc-3′

nbnac1-f′(seqidno.7)：5′-acagaaatcagcagcaa-3′

nbnac1-r′(seqidno.8)：5′-aatcatcaagcctcaagt-3′

從侵染了12天的農(nóng)桿菌的本生煙中提取總rna。通過熒光定量pcr的方法檢測nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)。如圖2結(jié)果表明nbsabp2和nbnac1基因的表達(dá)顯著降低。

sequencelisting

<110>揚州大學(xué)

<120>一種同時沉默煙草植物中2個目的基因的方法

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

actcttcctttgttttag18

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atcgattgtggccgcggtggatgggcaatctccaagaga39

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tctcttggagattgcccatccaccgcggccacaatcgat39

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttagtaaggtttctgcatg19

<210>5

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

caggccataaggttac16

<210>6

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tatcaggcatgaaagc16

<210>7

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

acagaaatcagcagcaa17

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aatcatcaagcctcaagt18