本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

crispr/cas9技術(shù)是自2013年興起的一種高效簡(jiǎn)便的基因組編輯技術(shù)，目前已在動(dòng)物、模式植物中得到廣泛應(yīng)用。它主要是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，由于其可用于對(duì)dna進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并且可以同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)，同時(shí)編輯多個(gè)基因，較常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法具有明顯優(yōu)勢(shì)，且沉默效果更加徹底，因此越來越多的研究人員對(duì)其產(chǎn)生了濃厚興趣。此外，在常用的基因組編輯技術(shù)中，crispr/cas9相對(duì)于zfn和talen技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、制備成本低的巨大優(yōu)勢(shì)，使其在常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室即可使用。

目前，應(yīng)用于動(dòng)物上的crispr/cas9載體已經(jīng)有大量的報(bào)道，而應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體則相對(duì)較少，特別是能夠進(jìn)行多位點(diǎn)編輯的載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了能夠應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體的構(gòu)建方法，由其獲得的載體不僅能夠作用于單個(gè)靶位點(diǎn)，而且能夠同時(shí)作用于兩個(gè)靶位點(diǎn)。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體的構(gòu)建方法，其包括：

s1：靶序列退火復(fù)性：根據(jù)選定的靶序列，合成互補(bǔ)的oligodna，將合成的oligodna序列進(jìn)行退火復(fù)性獲得dna雙鏈序列，并稀釋；

s2：psg載體的酶切：采用限制性內(nèi)切酶bbsi酶切psg載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)超薄產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收；

s3：連接和轉(zhuǎn)化：配置連接體系，將s1獲得的稀釋后的dna雙鏈序列與s2獲得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，將獲得的全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中；

s4：重組質(zhì)粒的鑒定和提?。悍謩e挑單菌落于lb/amp液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，分別以m13fwd和oligo-r為引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，將驗(yàn)證正確的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，得到重組質(zhì)粒；

s5：重組資料和pcc質(zhì)粒的雙酶切：將得到的重組質(zhì)粒和pcc質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標(biāo)片段；

s6：連接、轉(zhuǎn)化和鑒定：配置連接體系，將s5獲得的酶切回收目標(biāo)片段進(jìn)行連接反應(yīng)，將獲得的全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中，挑單菌落于lb/kan液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液pcr鑒定，將陽性菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即獲得構(gòu)建好的crispr/cas9載體。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述psg載體的構(gòu)建包括：

以px330質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增sgrna片段，回收該片段，標(biāo)記為sgrna1，引物序列為seqidno.1所示的sg1-f和seqidno.2所示的sg1-r；

使用ecori-hf和xbai分別雙酶切puc19和sgrna1，回收目的片段后按1：7的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒psg1，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒；

以psg1質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增sgrna片段，回收該片段，標(biāo)記為sgrna，引物序列為seqidno.3所示的sg2-f和seqidno.4所示的sg2-r；

使用ecori-hf和xbai雙酶切puc19，使用bsai酶切sgrna，回收目的片段后按1：7的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒psg，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒。

進(jìn)一步，所述pcc載體的構(gòu)建包括：

以px330質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增hspcas9片段，其中引物cas-f：cas-r1：cas-r2＝1.5：0.2：1.3，回收該片段，標(biāo)記為hspcas9，cas-f的序列如seqidno.5所示，cas-r1的序列如seqidno.6所示，cas-r2的序列如seqidno.7所示；

使用ncoi-hf和bsteii-hf分別雙酶切pcambia1302和hspcas9，回收目的片段后按1：5的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pcc1，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒；

以pcambia1302質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增camv35enhancedpromoter片段，回收該片段，標(biāo)記為camv-ep，引物序列為seqidno.8所示的camv-ep-f和seqidno.9所示的camv-ep-r；

使用hindiii和ncoi分別雙酶切pcc1和camv-ep，回收目的片段后按1：5的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pcc，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒。

進(jìn)一步，在步驟s1中，合成一對(duì)互補(bǔ)的oligodna，即序列為seqidno.10所示的oligo-f和序列為seqidno.11所示的oligo-r。

進(jìn)一步，在步驟s1中，合成兩對(duì)互補(bǔ)的oligodna，分別為序列為seqidno.12所示的oligo1-f，序列為seqidno.13所示的oligo1-r，序列為seqidno.14所示的oligo2-f及序列為seqidno.15所示的oligo2-r。

進(jìn)一步，在步驟s1中，將所述合成的oligodna序列進(jìn)行退火復(fù)性的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性5min，每30s降溫1℃，降溫至25℃，并于4℃保存；在所述步驟s2中，psg載體的酶切的反應(yīng)體系為100μl，37℃反應(yīng)過夜，65℃反應(yīng)20min。

進(jìn)一步，在所述步驟s4中，所得到的重組質(zhì)粒為psg-cz；在所述步驟s5中，將得到的psg-cz重組質(zhì)粒、pcc質(zhì)粒分別采用ecori-hf和xbai進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h后，65℃反應(yīng)20min得到所述酶切產(chǎn)物。

進(jìn)一步，在所述步驟s4中，所得到的重組質(zhì)粒為psg-cz1和psg-cz2；所述步驟s5中，將得到的psg-cz1重組質(zhì)粒采用ecori-hf和kpni進(jìn)行雙酶切，psg-cz2重組質(zhì)粒采用xbai和kpni進(jìn)行雙酶切；或?qū)⒌玫降膒sg-cz1重組質(zhì)粒采用ecori-hf和bamhi進(jìn)行雙酶切，psg-cz2重組質(zhì)粒采用xbai和bamhi進(jìn)行雙酶切；并將pcc質(zhì)粒采用ecori-hf和xbai進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h后，65℃反應(yīng)20min，得到所述酶切產(chǎn)物。

進(jìn)一步，在所述步驟s6中，所述菌液pcr鑒定以m13rev和oligo-r為引物。

進(jìn)一步，在所述步驟s6中，所述菌液pcr鑒定以oligo1-f和oligo2-r為引物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體的構(gòu)建方法可獲得應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體，可用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，該載體不僅能夠作用于單個(gè)靶位點(diǎn)，而且能夠同時(shí)作用于兩個(gè)靶位點(diǎn)。

附圖說明

圖1為psg載體的圖譜；

圖2為pcc載體的圖譜；

圖3為本發(fā)明提供的應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體的構(gòu)建方法的流程圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體，該載體不僅能夠作用于單個(gè)靶位點(diǎn)，而且能夠同時(shí)作用于兩個(gè)靶位點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，該crispr/cas9載體由兩個(gè)基本載體psg和pcc組成，構(gòu)建方法具體包含以下內(nèi)容：

1.psg載體的構(gòu)建：

1)以px330質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增sgrna片段，回收該片段，標(biāo)記為sgrna1，引物序列如下：

(seqidno.1)sg1-f:

ggaattcatagtttcccatgattccttcatatttgc(下劃線標(biāo)記的為ecori酶切位點(diǎn))；

(seqidno.2)sg1-r:

tacctctagagccatttgtctgc(下劃線標(biāo)記的為xbai酶切位點(diǎn))；

2)使用ecori-hf和xbai分別雙酶切puc19和sgrna1，回收目的片段后按1：7的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒psg1，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒；

3)以psg1質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增sgrna片段，回收該片段，標(biāo)記為sgrna，引物序列如下：

(seqidno.3)sg2-f:

atatatggtctcaaattggatccggtaccgaattcatagtttcccatgattcct(下劃線標(biāo)記的為bsai、bamhi、kpni、ecori酶切位點(diǎn))；

(seqidno.4)sg2-r:

atatatggtctcactagggatccggtaccctctagagccatttgtctgcagaatt(下劃線標(biāo)記的為bsai、bamhi、kpni、xbai酶切位點(diǎn))；

4)使用ecori-hf和xbai雙酶切puc19，使用bsai酶切sgrna，回收目的片段后按1：7的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒psg，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒，psg載體的圖譜如圖1所示，psg載體的部分序列如下所示(seqidno.16)：

其中分別是m13fwd和m13rev引物序列，“____”是hu6promoter序列，是guide序列，是sgrnascaffold序列，是hu6terminator序列。

2.pcc載體的構(gòu)建

5)以px330質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增hspcas9片段，其中引物cas-f：cas-r1：cas-r2＝1.5：0.2：1.3，回收該片段，標(biāo)記為hspcas9，引物序列如下：

(seqidno.5)cas-f:

catgccatggactataaggaccacgacggagact(下劃線標(biāo)記的為ncoi酶切位點(diǎn))；

(seqidno.6)cas-r1:

gaccttccgcttcttctttggctttttcttttttgcctggccggcct；

(seqidno.7)cas-r2:

cagggtcaccttaaccgaccttccgcttcttctttggct(下劃線標(biāo)記的分別為bsteii酶切位點(diǎn)和sv40核定位信號(hào)序列)；

6)使用ncoi-hf和bsteii-hf分別雙酶切pcambia1302和hspcas9，回收目的片段后按1：5的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pcc1，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒；

7)以pcambia1302質(zhì)粒為模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase擴(kuò)增camv35enhancedpromoter片段，回收該片段，標(biāo)記為camv-ep，引物序列如下：

(seqidno.8)camv-ep-f:

cccaagcttttgcgtattggctagagcagcttg(下劃線標(biāo)記的為hindiii酶切位點(diǎn))；

(seqidno.9)camv-ep-r:

catgccatggctcattgccccccgggatct(下劃線標(biāo)記的為ncoi酶切位點(diǎn))；

8)使用hindiii和ncoi分別雙酶切pcc1和camv-ep，回收目的片段后按1：5的摩爾比進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pcc，測(cè)序，保留序列完全正確的陽性質(zhì)粒，pcc載體的圖譜如圖2所示。

具體地，crispr/cas9載體的構(gòu)建方法如圖3所示，包括：

s1：靶序列退火復(fù)性：根據(jù)選定的靶序列，合成互補(bǔ)的oligodna，將合成的oligodna序列進(jìn)行退火復(fù)性獲得dna雙鏈序列，并稀釋；

s2：psg載體的酶切：采用限制性內(nèi)切酶bbsi酶切psg載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)超薄產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收；

s3：連接和轉(zhuǎn)化：配置連接體系，將s1獲得的稀釋后的dna雙鏈序列與s2獲得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，將獲得的全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中；

s4：重組質(zhì)粒的鑒定和提?。悍謩e挑單菌落于lb/amp液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，分別以m13fwd和oligo-r為引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，將驗(yàn)證正確的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，得到重組質(zhì)粒；

s5：重組資料和pcc質(zhì)粒的雙酶切：將得到的重組質(zhì)粒和pcc質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標(biāo)片段；

s6：連接、轉(zhuǎn)化和鑒定：配置連接體系，將s5獲得的酶切回收目標(biāo)片段進(jìn)行連接反應(yīng)，將獲得的全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中，挑單菌落于lb/kan液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液pcr鑒定，將陽性菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即獲得構(gòu)建好的crispr/cas9載體。

實(shí)施方式1

本實(shí)施方式提供了作用于單個(gè)位點(diǎn)的crispr/cas9載體制備過程：

(1)靶序列退火復(fù)性。根據(jù)選定的靶序列，合成一對(duì)互補(bǔ)的oligodna，序列為：oligo-f(seqidno.10):caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn，oligo-r(seqidno.11)：aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn。將合成的oligo序列按照表1進(jìn)行退火復(fù)性，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性5min，1℃/30s降溫至25℃，4℃保存。將得到的dna雙鏈序列稀釋至0.1μm。

表1靶序列退火復(fù)性的反應(yīng)體系

(2)psg質(zhì)粒的酶切。采用限制性內(nèi)切酶bbsi酶切psg載體，反應(yīng)體系100μl，如表2所示，37℃反應(yīng)過夜，65℃反應(yīng)20min，酶切產(chǎn)物經(jīng)超薄產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收，并使用核酸蛋白儀測(cè)定濃度。

表2bbsi酶切psg載體的反應(yīng)體系

(3)連接和轉(zhuǎn)化。按照表3配置連接體系，16℃反應(yīng)30min后4℃反應(yīng)過夜；將全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中。

表3復(fù)性產(chǎn)物與psg酶切片段的連接反應(yīng)體系

(4)重組質(zhì)粒的鑒定和提取。挑單菌落于800μl的lb/amp液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。以m13fwd和oligo-r為引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，將驗(yàn)證正確的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，得到重組質(zhì)粒psg-cz。

(5)psg-cz和pcc質(zhì)粒的雙酶切。將得到的psg-cz重組質(zhì)粒、pcc質(zhì)粒分別采用ecori-hf和xbai進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h后65℃反應(yīng)20min；酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標(biāo)片段，并用核酸蛋白儀測(cè)定濃度。

(6)連接、轉(zhuǎn)化和鑒定。按照表4配置連接體系，16℃反應(yīng)30min后4℃反應(yīng)過夜；將全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中；挑單菌落于800μl的lb/kan液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)；以m13rev和oligo-r為引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，將陽性菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，-20℃保存。該質(zhì)粒即為構(gòu)建好的作用于單個(gè)位點(diǎn)的crispr/cas9載體，可用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

表4酶切回收片段的連接反應(yīng)體系

實(shí)施方式2

本實(shí)施方式提供了作用于兩個(gè)位點(diǎn)的crispr/cas9載體制備過程：

(1)靶序列退火復(fù)性。根據(jù)選定的靶序列，合成兩對(duì)互補(bǔ)的oligodna，序列為：

oligo1-f(seqidno.12):caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；

oligo1-r(seqidno.13)：aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；

oligo2-f(seqidno.14):caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；

oligo2-r(seqidno.15)：aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；

將合成的oligo序列分別按照表5進(jìn)行退火復(fù)性，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性5min，1℃/30s降溫至25℃，4℃保存；將得到的dna雙鏈序列稀釋至0.1μm。

表5靶序列退火復(fù)性的反應(yīng)體系

(2)psg質(zhì)粒的酶切。采用限制性內(nèi)切酶bbsi酶切psg載體，反應(yīng)體系100μl(表6)，37℃反應(yīng)過夜，65℃反應(yīng)20min，酶切產(chǎn)物經(jīng)超薄產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收，并使用核酸蛋白儀測(cè)定濃度。

表6bbsi酶切psg載體的反應(yīng)體系

(3)連接和轉(zhuǎn)化。按照表7分別配置連接體系，16℃反應(yīng)30min后4℃反應(yīng)過夜。將全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中。

表7復(fù)性產(chǎn)物與psg酶切片段的連接反應(yīng)體系

(4)重組質(zhì)粒的鑒定和提取。分別挑單菌落于800μl的lb/amp液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)；分別以m13fwd和oligo-r為引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，將驗(yàn)證正確的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒的提取，得到重組質(zhì)粒psg-cz1和psg-cz2。

(5)psg-cz1、psg-cz2和pcc質(zhì)粒的雙酶切。將得到的psg-cz1重組質(zhì)粒采用ecori-hf和kpni進(jìn)行雙酶切，psg-cz2重組質(zhì)粒采用xbai和kpni進(jìn)行雙酶切；或?qū)⒌玫降膒sg-cz1重組質(zhì)粒采用ecori-hf和bamhi進(jìn)行雙酶切，psg-cz2重組質(zhì)粒采用xbai和bamhi進(jìn)行雙酶切；將pcc質(zhì)粒采用ecori-hf和xbai進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h后65℃反應(yīng)20min。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒分別回收目標(biāo)片段，并用核酸蛋白儀測(cè)定濃度。

(6)連接、轉(zhuǎn)化和鑒定。按照表8配置連接體系，16℃反應(yīng)30min后4℃反應(yīng)過夜；將全部連接產(chǎn)物采用熱激發(fā)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌jm109中；挑單菌落于800μl的lb/kan液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)；以oligo1-f和oligo2-r為引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，將陽性菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的lb/kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，-20℃保存。該質(zhì)粒即為構(gòu)建好的作用于兩個(gè)位點(diǎn)的crispr/cas9載體，可用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

表8酶切回收片段的連接反應(yīng)體系

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種應(yīng)用于植物上的crispr/cas9載體的構(gòu)建方法

<130>2017

<160>16

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggaattcatagtttcccatgattccttcatatttgc36

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tacctctagagccatttgtctgc23

<210>3

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atatatggtctcaaattggatccggtaccgaattcatagtttcccatgattcct54

<210>4

<211>55

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atatatggtctcactagggatccggtaccctctagagccatttgtctgcagaatt55

<210>5

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

catgccatggactataaggaccacgacggagact34

<210>6

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gaccttccgcttcttctttggctttttcttttttgcctggccggcct47

<210>7

<211>39

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<213>人工序列

<400>7

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<222>(5)..(24)

<223>nisa,c,g,ort

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<222>(5)..(24)

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