本申請是國際申請日為2007年8月11日的國際申請pct/us2007/017774進(jìn)入中國、申請?zhí)枮?00780037989.1的題為“蛋白質(zhì)表達(dá)或阻抑的系統(tǒng)、方法和設(shè)備”的發(fā)明專利申請的分案申請。

與相關(guān)申請的交叉引用

本申請按照35u.s.c§119(e)要求于2006年8月11日提交的美國臨時申請系列號60/837,001的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時申請系列號60/837,001在此引用作為參考。

本發(fā)明涉及誘導(dǎo)和/或阻抑蛋白質(zhì)表達(dá)的系統(tǒng)、方法和設(shè)備。更具體而言，本發(fā)明涉及在質(zhì)體內(nèi)誘導(dǎo)和/或阻抑蛋白質(zhì)表達(dá)的系統(tǒng)、方法和設(shè)備。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)(例如肽、寡肽和多肽)負(fù)責(zé)細(xì)胞的大部分活動，例如催化作用、通訊、防御、移動和轉(zhuǎn)運(yùn)。蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的根本基礎(chǔ)是其氨基酸序列和/或其構(gòu)象。因此，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分應(yīng)該保持基本完整并且處于其生物學(xué)功能性構(gòu)象。蛋白質(zhì)表達(dá)的基因工程技術(shù)的進(jìn)步已致使在各種系統(tǒng)中以維持蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的形式受控表達(dá)天然和外來蛋白質(zhì)的方法的發(fā)展。這種基因工程改造的受控表達(dá)系統(tǒng)可以由于正確折疊的穩(wěn)定蛋白質(zhì)的表達(dá)而導(dǎo)致更高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，其中由于能夠控制蛋白質(zhì)表達(dá)，所以蛋白質(zhì)的失活和降解降低。

盡管眾多不同類型的表達(dá)系統(tǒng)已得到發(fā)展，但在宿主細(xì)胞例如微生物、真核細(xì)胞(包括真菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)的各種細(xì)胞器中，利用核起源的穩(wěn)定性因子來調(diào)節(jié)質(zhì)體中蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)受控表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)以前尚未得到開發(fā)。質(zhì)體是負(fù)責(zé)光合作用的細(xì)胞器，并且通常分類為葉綠體、白色體、造粉體或色質(zhì)體。質(zhì)體可以在這些形式之間分化或再分化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個實施方案中，提供了制備誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)體中蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)的方法。該方法包括步驟為：將第一個核酸引入細(xì)胞核中，其中第一個核酸編碼誘導(dǎo)型啟動子，將第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，其中引入誘導(dǎo)物或去除阻抑物誘導(dǎo)穩(wěn)定性因子的表達(dá)，其中表達(dá)的穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合，該mrna由該穩(wěn)定性因子穩(wěn)定并且由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，其中所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，且其中mrna的表達(dá)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

在另一個說明性實施方案中，提供了制備阻抑細(xì)胞質(zhì)體中質(zhì)體蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)的方法。該方法包括步驟為：將第一個核酸引入細(xì)胞核中，其中第一個核酸編碼阻抑型啟動子，將第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，其中引入阻抑物或去除誘導(dǎo)物阻抑穩(wěn)定性因子的表達(dá)，且其中穩(wěn)定性因子表達(dá)的阻抑導(dǎo)致mrna表達(dá)的阻抑，該mrna由該穩(wěn)定性因子穩(wěn)定并且由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，其中所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，且其中該蛋白質(zhì)的表達(dá)被阻抑。

在另一個說明性方面，提供了在細(xì)胞質(zhì)體中表達(dá)質(zhì)體蛋白質(zhì)的方法。該方法包括步驟為：將細(xì)胞與誘導(dǎo)物接觸，或在導(dǎo)致阻抑物去除的條件下處理細(xì)胞，其中誘導(dǎo)物或阻抑物在核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼誘導(dǎo)型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，表達(dá)該穩(wěn)定性因子，將穩(wěn)定性因子引入質(zhì)體中，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中所述mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，表達(dá)該mrna，并在質(zhì)體中生產(chǎn)該蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，提供了在細(xì)胞質(zhì)體中阻抑質(zhì)體蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。該方法包括步驟為：將細(xì)胞與阻抑物接觸，或在導(dǎo)致誘導(dǎo)物去除的條件下處理細(xì)胞，其中阻抑物或誘導(dǎo)物在細(xì)胞核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼阻抑型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，阻抑該穩(wěn)定性因子的表達(dá)，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中所述mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，阻抑該mrna的表達(dá)，并阻抑該蛋白質(zhì)的表達(dá)。

在另一個實施方案中，提供了在重組宿主細(xì)胞質(zhì)體中表達(dá)質(zhì)體蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括外源性加入的誘導(dǎo)核蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)物，重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞的核包括重組核酸，其中該重組核酸包括與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸的第一個核酸，其中第一個核酸編碼誘導(dǎo)型啟動子，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，和質(zhì)體，該質(zhì)體包括第三個核酸，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，其中所述第三個核酸編碼表達(dá)的質(zhì)體蛋白質(zhì)，其中編碼該質(zhì)體蛋白質(zhì)的mrna的表達(dá)受穩(wěn)定性因子控制。

在另一個實施方案中，提供了在重組宿主細(xì)胞質(zhì)體中阻抑質(zhì)體蛋白質(zhì)表達(dá)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括外源性加入的阻抑核蛋白表達(dá)的阻抑物，重組宿主細(xì)胞，其中重組宿主細(xì)胞的核包括重組核酸，其中該重組核酸包括與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸的第一個核酸，其中第一個核酸編碼阻抑型啟動子，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，和質(zhì)體，該質(zhì)體包括第三個核酸，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，其中所述第三個核酸編碼表達(dá)的質(zhì)體蛋白質(zhì)，且其中編碼該蛋白質(zhì)的mrna的表達(dá)受穩(wěn)定性因子控制。

在另一個實施方案中，提供了通過在細(xì)胞質(zhì)體中表達(dá)質(zhì)體蛋白質(zhì)而刺激氫氣產(chǎn)生的方法。該方法包括步驟為：將細(xì)胞與誘導(dǎo)物接觸，或在導(dǎo)致阻抑物去除的條件下處理細(xì)胞，其中誘導(dǎo)物或阻抑物在核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼誘導(dǎo)型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，表達(dá)該穩(wěn)定性因子，將穩(wěn)定性因子引入質(zhì)體中，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，表達(dá)該mrna，在質(zhì)體中產(chǎn)生該蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生氫氣。

在另一個實施方案中，提供了通過在細(xì)胞質(zhì)體中阻抑質(zhì)體蛋白質(zhì)表達(dá)而抑制氫氣產(chǎn)生的方法。該方法包括步驟為：將細(xì)胞與阻抑物接觸，或在導(dǎo)致誘導(dǎo)物去除的條件下處理細(xì)胞，其中阻抑物或誘導(dǎo)物在細(xì)胞核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼阻抑型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，阻抑該穩(wěn)定性因子的表達(dá)，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，阻抑該mrna的表達(dá)，阻抑所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，并抑制氫氣產(chǎn)生。

在另一個實施方案中，提供了通過在細(xì)胞質(zhì)體中誘導(dǎo)和阻抑質(zhì)體蛋白質(zhì)表達(dá)而刺激氫氣產(chǎn)生的方法。該方法按序包括步驟i)將細(xì)胞與誘導(dǎo)物接觸，或在導(dǎo)致阻抑物去除的條件下處理細(xì)胞以及ii)將細(xì)胞與阻抑物接觸，或在導(dǎo)致誘導(dǎo)物去除的條件下處理細(xì)胞，其中誘導(dǎo)物或阻抑物在核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼誘導(dǎo)型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，按序表達(dá)和阻抑該穩(wěn)定性因子的表達(dá)，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，按序表達(dá)和阻抑該mrna的表達(dá)，在質(zhì)體中產(chǎn)生該蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生氫氣。

在上述任一個實施方案中，將重組核酸引入核之前，第一個核酸可以與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，細(xì)胞可以具有第二或第三個核酸的無效拷貝，或失去第二或第三個核酸的拷貝或同源物，細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或藻類細(xì)胞，質(zhì)體可以選自葉綠體、白色體、造粉體、黃化質(zhì)體、油質(zhì)體和色質(zhì)體，誘導(dǎo)型啟動子可具有與cyc6啟動子至少90％的序列相似性，且第三個核酸可以編碼與psbd基因至少具有至少90％序列相似性的基因。

在上述任一個實施方案中，誘導(dǎo)物或阻抑物可以是化學(xué)藥品或環(huán)境條件，其中化學(xué)藥品可以是銅，且其中環(huán)境條件可以是氧濃度減少到預(yù)先確定的水平，可以將誘導(dǎo)物應(yīng)用和去除多個循環(huán)，其中循環(huán)包括應(yīng)用和去除誘導(dǎo)物，蛋白質(zhì)可以是涉及光合作用或產(chǎn)生氫氣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可選自藥物試劑、工業(yè)酶、涉及葉綠體成熟或降解的酶、以及營養(yǎng)藥，其中藥物試劑選自抗體、疫苗抗原和抗微生物劑、或其他宿主細(xì)胞防御產(chǎn)物，而穩(wěn)定性因子可選自nac2和mbb1。在另一個說明性實施方案中，第二個核酸可以編碼翻譯活化因子，例如tbc2或tca1。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了調(diào)節(jié)質(zhì)體內(nèi)天然或外來基因表達(dá)或阻抑的系統(tǒng)和方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及采用核編碼的葉綠體轉(zhuǎn)錄因子nac2的表達(dá)系統(tǒng)，其中nac2的表達(dá)受cyc6基因的誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)。在另一個實施方案中，通過誘導(dǎo)物(即試劑或環(huán)境條件的變化)例如低水平的氧誘導(dǎo)nac2表達(dá)，引起葉綠體中psbd基因的表達(dá)。在另一個實施方案中，試劑或環(huán)境條件，例如去除誘導(dǎo)cyc6啟動子的銅，也引起psbd基因的表達(dá)。在另一個說明性實施方案中，通過阻抑物(即試劑或環(huán)境條件的變化)例如高水平的氧阻抑nac2基因，導(dǎo)致psbd基因不表達(dá)或表達(dá)降低。在有關(guān)實施方案中，阻抑誘導(dǎo)型cyc6啟動子的試劑或環(huán)境條件的變化也引起psbd基因表達(dá)的降低。

在另一個說明性實施方案中，本發(fā)明涉及外來基因在葉綠體中的誘導(dǎo)型表達(dá)或阻抑，由此以外來基因置換葉綠體中的psbd基因，通過調(diào)節(jié)nac2表達(dá)而促進(jìn)該外來基因在葉綠體中的誘導(dǎo)型表達(dá)或阻抑。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)psbd基因而在葉綠體中產(chǎn)生氫氣的方法，其中psbd基因的調(diào)節(jié)由nac2的表達(dá)或nac2表達(dá)的阻抑實現(xiàn)。在本發(fā)明的這個說明性方面，促進(jìn)nac2基因誘導(dǎo)和阻抑的環(huán)境條件(例如降低氧水平以誘導(dǎo)表達(dá)，以及升高氧水平以阻抑表達(dá))，從而導(dǎo)致psbd基因表達(dá)的擺動性誘導(dǎo)和阻抑，導(dǎo)致光合作用速率的降低，以及結(jié)果氧濃度的降低。在本實施方案中，氧濃度的降低促進(jìn)氫產(chǎn)生。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)nac2和psbd基因表達(dá)的擺動性誘導(dǎo)和阻抑而產(chǎn)生氫氣的方法。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過葉綠體中其他基因例如氫化酶的重組表達(dá)和其他重組或天然蛋白質(zhì)例如磷酸核酮糖激酶的阻抑而增強(qiáng)氫氣生成系統(tǒng)的方法。

在另一個實施方案中，提供產(chǎn)生氫的裝置。該裝置包括配置為在充分氧耗盡環(huán)境中保持細(xì)胞培養(yǎng)物的第一個容器、與第一個容器流體溝通并配置為以預(yù)先確定的速率將培養(yǎng)基抽吸入第一個容器的第一個泵、以及與第一個容器偶聯(lián)并配置為測量細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)氫量的測量設(shè)備。

在該實施方案中，可以把第一個泵配置為以與細(xì)胞培養(yǎng)物生長速度基本相等的速度將一定量的培養(yǎng)基抽吸入第一個容器，第一個泵可以包括蠕動泵，細(xì)胞培養(yǎng)物可以包括cy6nac2.49培養(yǎng)物，測量設(shè)備可以包括質(zhì)譜儀，該裝置可以另外包括與第一個容器偶聯(lián)并且可操作以攪拌細(xì)胞培養(yǎng)物的攪拌設(shè)備，攪拌設(shè)備可以包括磁力攪拌棒，該裝置可以另外包括配置為保持一定量的培養(yǎng)基的第二個容器，其中第一個泵與第二個容器流體偶聯(lián)，并且配置為以預(yù)先確定的速率將培養(yǎng)基從第二個容器抽吸，該裝置可以另外包括與第一個容器流體溝通、并配置為保持來自第一個容器的培養(yǎng)基溢出物的第三個容器，且該裝置可以另外包括過濾器以及與第三個容器和第二個容器流體溝通的第二個泵，配置所述第二個泵以將一定量的培養(yǎng)基從第三個容器經(jīng)過過濾器抽吸入第二個容器。

附圖說明

參考下列附圖更易于理解本發(fā)明，其中：

圖1顯示在需氧和厭氧條件下雷氏衣藻(c.reinhardtii)葉綠體內(nèi)的氫和電子流圖表(來自kruse等人，2005)。

圖2顯示質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意略圖，其中在誘導(dǎo)物的存在下誘導(dǎo)核誘導(dǎo)型啟動子。左陰影線框代表核誘導(dǎo)型啟動子，而右陰影線框代表穩(wěn)定性因子基因。實心框代表穩(wěn)定性因子結(jié)合元件，在本實施方案中位于質(zhì)體mrna的5’非翻譯區(qū)中?？招目虼碛少|(zhì)體天然基因產(chǎn)生的mrna。交叉陰影線框代表質(zhì)體中由外來基因產(chǎn)生的mrna。

圖3顯示質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意略圖，其中在不存在誘導(dǎo)物下阻抑核誘導(dǎo)型啟動子。左陰影線框代表核誘導(dǎo)型啟動子，而右陰影線框代表穩(wěn)定性因子基因。實心框代表穩(wěn)定性因子結(jié)合元件，在本實施方案中位于質(zhì)體mrna的5’非翻譯區(qū)中?？招目虼碛少|(zhì)體天然基因產(chǎn)生的mrna。交叉陰影線框代表質(zhì)體中由外來基因產(chǎn)生的mrna。

圖4顯示質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意略圖，其中在阻抑物的存在下阻抑核阻抑型啟動子。左陰影線框代表核阻抑型啟動子，而右陰影線框代表穩(wěn)定性因子基因。實心框代表穩(wěn)定性因子結(jié)合元件，在本實施方案中位于質(zhì)體mrna的5’非翻譯區(qū)中。空心框代表由質(zhì)體天然基因產(chǎn)生的mrna。交叉陰影線框代表質(zhì)體中由外來基因產(chǎn)生的mrna。

圖5顯示質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意略圖，其中在不存在阻抑物下誘導(dǎo)核阻抑型啟動子。左陰影線框代表核阻抑型啟動子，而右陰影線框代表穩(wěn)定性因子基因。實心框代表穩(wěn)定性因子結(jié)合元件，在本實施方案中位于質(zhì)體mrna的5’非翻譯區(qū)中?？招目虼碛少|(zhì)體天然基因產(chǎn)生的mrna。交叉陰影線框代表質(zhì)體中由外來基因產(chǎn)生的mrna。

圖6顯示衣藻屬(chlamydomonas)葉綠體基因組示意圖，psbd基因位置已示。箭標(biāo)指示psk108插入位點。

圖7顯示產(chǎn)氫裝置流程圖。

圖8顯示產(chǎn)氫裝置。

圖9顯示核表達(dá)載體psl17示意圖，所述載體用于轉(zhuǎn)化核nac2突變體以及引入cyc6啟動子和nac2基因。該圖顯示啟動子、來自hsp70a啟動子的增強(qiáng)子元件以及用于插入cyc6啟動子和nac2基因的限制位點的排列。

圖10顯示cy6nac2(paror)示意圖。

圖11a-c顯示nac2midi基因的基因組序列。起始密碼子是第一個加下劃線的atg。推定的轉(zhuǎn)運(yùn)肽也加以下劃線。

圖12顯示cyc6基因組序列。用于與nac2midi基因產(chǎn)生融合構(gòu)建體的基因組序列加以下劃線。在cyc6nac2構(gòu)建體中產(chǎn)生ndei限制位點的三個堿基對差別也被指出(雙下劃線)。

圖13顯示cy6nac2.49轉(zhuǎn)基因株的生長性質(zhì)。

圖14顯示cy6nac2.49轉(zhuǎn)基因株的蛋白質(zhì)印跡分析。

圖15顯示cy6nac2.49轉(zhuǎn)基因株的氫產(chǎn)生。

圖16顯示psk108載體圖。psk108載體具有側(cè)翼葉綠體dna以將其指導(dǎo)到psbd基因周圍的區(qū)域。

圖17顯示pcg12圖。

圖18顯示葉綠體表達(dá)質(zhì)粒pcg12ibdvflag圖。

圖19顯示葉綠體表達(dá)質(zhì)粒pcg12vp28flag圖。

圖20顯示葉綠體psbddna序列。加下劃線的序列用于驅(qū)動在葉綠體中使用cyc6nac2系統(tǒng)表達(dá)基因。

圖21顯示ind_aada_x轉(zhuǎn)基因株的分離以及在各種培養(yǎng)基上的生長。

圖22顯示從野生型及ind_aada_117分離提取的總rna的rna印跡分析。

圖23顯示從野生型及ind_aada_117提取的總和可溶性(α-nac2)的分析。

圖24顯示誘導(dǎo)三個外來蛋白質(zhì)(dilp、ibvd和vp28)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株的篩選。

圖25顯示使用nac2誘導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)系統(tǒng)的的外來蛋白質(zhì)(dilp)的誘導(dǎo)型產(chǎn)生。

圖26顯示psbdrna、d2和nac2蛋白質(zhì)在cy6nac2.49中的積累。

圖27顯示通過以peta5’utr置換psbd5’utr恢復(fù)在cy6nac2.49中的組成型psii積累。

圖28顯示葉綠體psbd基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。

圖29顯示cy6nac2.49中銅介導(dǎo)的psii合成阻抑的時程。

圖30顯示cy6nac2.49中psii積累的時程。

圖31顯示ind_aada_117轉(zhuǎn)化體中psbd-aada基因表達(dá)由銅耗盡誘導(dǎo)并由銅阻抑。

圖32顯示cy6nac2-49株的氫產(chǎn)生。

具體實施方式

如此處所用的，短語“外來基因”或“外來核酸”(即轉(zhuǎn)基因)指使用重組dna技術(shù)插入到細(xì)胞核酸中的任何核酸，其中外來基因或外來核酸正常不存在于細(xì)胞中的該位置。外來基因或外來核酸可以包括編碼和非編碼核酸序列。外來基因或外來核酸可以包括使用重組dna技術(shù)修飾并再引入細(xì)胞的天然核酸，或者可以包括在細(xì)胞內(nèi)從一個位置移動到另一個位置的天然核酸。

如此處所用的，短語“天然核酸”或“天然基因”指在細(xì)胞中具有其天然序列(包括天然存在的突變)和位置的核酸。

如此處所用的，術(shù)語“誘導(dǎo)型”指能夠受到調(diào)節(jié)從而產(chǎn)生mrna轉(zhuǎn)錄物的啟動子。確定mrna轉(zhuǎn)錄物水平的方法包括rna印跡和實時pcr。

如此處所用的，術(shù)語“表達(dá)”可以指dna轉(zhuǎn)錄為rna或rna翻譯為蛋白質(zhì)。

如此處所用的，短語“穩(wěn)定性因子”指可以表現(xiàn)出活性以增強(qiáng)葉綠體蛋白質(zhì)表達(dá)或活性的核蛋白質(zhì)，所述活性包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后、蛋白質(zhì)靶向和蛋白質(zhì)募集活性。

本發(fā)明涉及為了產(chǎn)生有用產(chǎn)物的目的調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如藻類或植物細(xì)胞)內(nèi)質(zhì)體中基因表達(dá)的系統(tǒng)、方法和設(shè)備。通過以誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子轉(zhuǎn)化細(xì)胞的核基因組而實現(xiàn)質(zhì)體中基因表達(dá)的誘導(dǎo)或阻抑，所述誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子與編碼葉綠體靶向蛋白質(zhì)的基因可操作地連接。葉綠體靶向蛋白質(zhì)與質(zhì)體表達(dá)的mrna的非翻譯區(qū)直接或間接(例如通過輔助蛋白質(zhì))結(jié)合。葉綠體靶向蛋白質(zhì)是質(zhì)體表達(dá)的mrna的穩(wěn)定性和/或翻譯以及由此的質(zhì)體基因表達(dá)所必需的。

在一個實施方案中，核啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，且化合物(例如銅、碳水化合物或蛋白質(zhì))的添加或去除，或環(huán)境條件的變化(例如低氧濃度，或光、溫度或營養(yǎng)狀態(tài)的變化)激活該啟動子，從而導(dǎo)致葉綠體mrna的表達(dá)，以及隨后由該mrna編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在另一個實施方案中，核啟動子是阻抑型啟動子，且化合物(例如銅、碳水化合物或蛋白質(zhì))的添加或去除，或環(huán)境條件的變化(例如高氧濃度，或光、溫度或營養(yǎng)狀態(tài)的變化)阻抑該啟動子，從而導(dǎo)致穩(wěn)定性因子表達(dá)缺乏和葉綠體mrna表達(dá)及隨后由該mrna編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)受到抑制。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及在細(xì)胞質(zhì)體中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。該方法包括步驟為：將細(xì)胞與誘導(dǎo)物接觸，或在導(dǎo)致阻抑物去除的條件下處理細(xì)胞，其中誘導(dǎo)物或阻抑物在核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼誘導(dǎo)型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，表達(dá)該穩(wěn)定性因子，將穩(wěn)定性因子引入質(zhì)體中，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，表達(dá)該mrna，并在質(zhì)體中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

在另一個實施方案中，提供了在細(xì)胞質(zhì)體中阻抑質(zhì)體蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。該方法包括步驟為：將細(xì)胞與阻抑物接觸，或在導(dǎo)致誘導(dǎo)物去除的條件下處理細(xì)胞，其中阻抑物或誘導(dǎo)物在細(xì)胞核中與第一個核酸結(jié)合，其中第一個核酸編碼阻抑型啟動子，其中第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸，且其中第二個核酸編碼穩(wěn)定性因子，阻抑該穩(wěn)定性因子的表達(dá)，其中穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)結(jié)合以穩(wěn)定mrna，其中mrna由第三個核酸轉(zhuǎn)錄，所述第三個核酸是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的，且其中所述第三個核酸編碼蛋白質(zhì)，阻抑該mrna的表達(dá)，并阻抑蛋白質(zhì)的表達(dá)。

在上述實施方案中，蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)體中得到表達(dá)。作為說明，細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或藻類細(xì)胞或含有質(zhì)體的任何細(xì)胞類型。質(zhì)體是經(jīng)常以多拷貝含有質(zhì)體基因組的細(xì)胞器。質(zhì)體見于例如植物和藻類中，并包括葉綠體、白色體、造粉體、黃化質(zhì)體、油質(zhì)體和色質(zhì)體。

在此所述的方法和系統(tǒng)實施方案中，第三個核酸編碼目的蛋白質(zhì)。在一個說明性實施方案中，編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的第三個核酸可以是質(zhì)體天然的或質(zhì)體外來的(即轉(zhuǎn)基因)。在本實施方案中，表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如肽、寡肽或多肽)可以是在誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子控制下表達(dá)的，并包括涉及光合作用的蛋白質(zhì)，例如光合系統(tǒng)i或ii的組分(例如psba和psbd和光合系統(tǒng)ii的d1和d2亞基)，涉及co2固定的蛋白質(zhì)(例如磷酸核酮糖激酶)，氫化酶(例如hyda1和hyda2)以及調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)中任一個的活性的蛋白質(zhì)(例如任何這些蛋白質(zhì)的組裝(例如hydef和hydg))，或任何其他質(zhì)體天然的蛋白質(zhì)。可以在誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子控制下表達(dá)的示范性天然蛋白質(zhì)包括圖1中描述或暗示的涉及調(diào)節(jié)光合作用過程或碳同化過程的任何蛋白質(zhì)、或任何質(zhì)體天然的其他蛋白質(zhì)。在可替代的實施方案中，可以通過調(diào)節(jié)質(zhì)體天然的蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生氨基酸，例如芳族氨基酸，或氨基酸前體，所述質(zhì)體天然的蛋白質(zhì)涉及氨基酸例如芳族氨基酸的合成途徑。

在另一個說明性實施方案中，可以使用在此所述方法、系統(tǒng)和設(shè)備在誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子或兩者的控制下表達(dá)涉及氫氣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在本實施方案中，涉及氫氣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以是在這個或前述段落中所述任何蛋白質(zhì)，或可以是圖1中描述或暗示的涉及調(diào)節(jié)光合作用過程或碳同化過程的任何蛋白質(zhì)。在該實施方案中，可以將誘導(dǎo)物或阻抑物應(yīng)用和去除多個循環(huán)，其中循環(huán)包括應(yīng)用和去除誘導(dǎo)物或阻抑物。

在另一個實施方案中，編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的第三個核酸可以是質(zhì)體外來的(即外來核酸或外來基因)。在該實施方案中，該蛋白質(zhì)可以是藥物試劑、工業(yè)酶、涉及葉綠體成熟或降解的酶或營養(yǎng)藥。在本實施方案中，表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是例如抗體、疫苗抗原(例如在疫苗中使用)、抗微生物劑、或其他宿主細(xì)胞防御產(chǎn)物、生長激素、細(xì)胞因子、例如白細(xì)胞介素或干擾素、胰島素、集落刺激因子、凝固因子、促紅細(xì)胞生成素、生長因子、例如表皮生長因子、促生長素、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子等、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶(pentosanase)、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶、殺蟲蛋白質(zhì)、苯基氨(phenylammonia)裂合酶或其他任何藥物試劑、工業(yè)酶或蛋白質(zhì)營養(yǎng)藥。

在另一個說明性實施方案中，可以在葉綠體中表達(dá)額外的編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸(例如第四個核酸等)，且其可以是質(zhì)體天然的或外來的(即外來核酸或外來基因)。在這些實施方案中，所述額外的核酸的表達(dá)可以由其自己的穩(wěn)定性因子控制，所述穩(wěn)定性因子由核中的額外核酸編碼(即，與第二個核酸類似)，或這些額外的核酸的表達(dá)可以由第二個核酸編碼的穩(wěn)定性因子控制。在一個說明性實施方案中，一個穩(wěn)定性因子與質(zhì)體mrna中穩(wěn)定性因子結(jié)合元件結(jié)合，并刺激第三個核酸以及與第三個核酸可操作地連接的額外核酸(例如第四個核酸等)的表達(dá)。在這些實施方案中，表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是藥物試劑、工業(yè)酶、涉及葉綠體成熟或降解的酶或營養(yǎng)藥。在本實施方案中，表達(dá)蛋白質(zhì)可以是例如抗體、疫苗抗原(例如在疫苗中使用)、抗微生物劑、或其他宿主細(xì)胞防御產(chǎn)物、生長激素、細(xì)胞因子、例如白細(xì)胞介素或干擾素、胰島素、集落刺激因子、凝固因子、促紅細(xì)胞生成素、生長因子、例如表皮生長因子、促生長素、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子等、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶和肌醇六磷酸酶、殺蟲蛋白質(zhì)、苯基氨裂合酶或其他任何藥物試劑、工業(yè)酶或蛋白質(zhì)營養(yǎng)藥。

在表達(dá)的蛋白質(zhì)為用作疫苗的疫苗抗原的實施方案中，表達(dá)的蛋白質(zhì)或其部分可以位于細(xì)胞的細(xì)胞器上或細(xì)胞器中，所述細(xì)胞例如藻類或植物細(xì)胞。如果疫苗抗原至少部分源自病原生物，那么可以例如將藻類裂解，而疫苗抗原可用于在宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)對病原體的免疫應(yīng)答。

在一個實施方案中，將具有疫苗抗原的藻類作為食物施用?？墒┯靡呙绲氖痉缎詣游锇ǖ幌抻诓溉閯游?、鳥類和水產(chǎn)養(yǎng)殖物種。具體而言，可以將該疫苗施用于水生脊椎動物，例如可以是硬骨魚或軟骨魚的所有脊椎動物魚，包括但不限于鮭亞目魚(salmonids)(包括鱒魚、鮭魚和北極鮭(articchar))、鯉魚、鲇魚、鯡(yellowtail)、海鳊和魚(seabass)。這種疫苗也可以施用于有殼的水生動物，包括但不限于蛤、龍蝦、蝦、蟹和牡蠣。示范性送遞方法包括以干粉、正常飲食組分經(jīng)口施用，以及將動物沉浸入含有該疫苗的懸浮液。

對于水生脊椎動物的情況，病原生物的實例包括但不限于沙氏腎桿菌(rennibacteriumsalmoninarum)(鮭魚、鱒魚、紅點鮭(char)和白鮭(whitefish)即鮭亞目魚中細(xì)菌性腎病的病原體)、殺鮭氣單胞菌(aeromonassalmonicida)、嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophila)、弧菌屬(vibrio)物種(包括鰻利斯頓氏菌(v.anguillarum)和奧氏弧菌(v.ordalii))、巴斯德氏菌屬(pasteurella)物種(包括殺魚巴斯德氏菌(p.piscicida))、耶爾森氏菌屬(yersinia)物種、鏈球菌屬(streptococcus)物種、遲鈍愛德華氏菌(edwardsiellatarda)和鯰魚愛德華民菌(edwardsiellaictaluria)、導(dǎo)致鯉魚病毒性出血性敗血癥、傳染性胰壞死、病毒血癥的病毒、傳染性造血器官壞死病毒、斑點叉尾病毒(channelcatfishvirus)、草魚出血性病毒(grasscarphemorrhagicvirus)、野田病毒科(nodaviridae)、例如神經(jīng)壞死病毒(nervousnecrosisvirus)或條紋鲹神經(jīng)壞死病毒(stripedjacknervousnecrosisvirus)、傳染性鮭魚貧血病毒、以及寄生物虹鱒角形蟲(ceratomyxashasta)、多子小瓜蟲(ichthyophthiriusmultifillius)、鮭隱鞭蟲(cryptobiasalmositica)、鮭瘡痂魚虱(lepeophtheirussalmonis)、四膜蟲屬(tetrahymena)物種、車輪蟲屬(trichodina)物種和累枝蟲屬(epistylus)物種，所述病原生物的抗原決定簇可以作為疫苗抗原使用在此所述的方法和系統(tǒng)表達(dá)在細(xì)胞表面。

在藻類內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的實施方案中，藻類可以是例如綠藻。例如，可以使用的藻類包括綠藻門(chlorophyta)如charoides(例如charoides、麗枝藻屬(lamprothamnium)、擬麗藻屬(nitellopsis)和麗藻屬(nitella))、雙星藻目(zynematales)(例如雙星藻屬(zygnema)、新月藻屬(closterium)和梭形鼓藻屬(netrium))、codials(例如刺松藻(codiumfragile)、helimidaopunta和蕨藻屬(caulerpa))、羽藻(bryopsisplumosa)(例如羽藻屬(bryopsis)、假羽藻屬(pseudobryopsis)、bryopsidella、德氏藻屬(derbesis)和拍道藻屬(pedobesia))、琉球傘藻(acetabulariaryukyuensis)(例如琉球傘藻、賴氏海棍藻(halicorynewrightii)、環(huán)蠕藻(neomerisannulata)、cymopoliavanbossei、bornettellaovalis和傘藻(acetabulariacalyculus))、管枝藻目(siphonocladales)(例如法囊藻科(valoniaceae)和棉絮藻科(boodleaceae))、剛毛藻屬(cladophora)(例如anadyomenewritii、剛毛藻屬、蘇氏剛毛藻(cladophorasauteri)和厚孢藻屬(chaetomorpha))、石莼屬(ulva)(例如石莼屬和滸苔屬(fnteromorpha))、絲藻目(ulotrichales)(例如頂管藻科(acrosiphoniaceae)、膠衣科(collinsiellaceae)、礁膜科(monostromaceae)和chlorocystidaceae)、溪菜屬(prasiola)、小球藻屬(chlorella)、綠球燥目(chlorococcales)(例如盤星藻屬(pediastrum)和水網(wǎng)藻屬(hydrodictyon))、以及團(tuán)藻目(volvocales)(例如衣藻屬(chlamydomonus)、實球藻屬(pandorina)、雜球藻屬(pleodorina)和團(tuán)藻屬(volvox))。

一般可用于在此申請中所述實施方案的任一種中的示范性藻類包括衣藻屬物種，具體為雷氏衣藻(chlamydomonasreinhardtii)、小球藻屬物種和團(tuán)藻屬物種。雷氏衣藻，單細(xì)胞真核綠藻特別有利。可從例如chlamydomonasgeneticstockcenter，dukeuniversity(durham，northcarolina)獲得衣藻屬株?？梢詮腸hlamydomonasgeneticstockcenter容易地獲得雷氏衣藻營養(yǎng)缺陷型突變體(與野生型不同之處在于需要一種或多種營養(yǎng)補(bǔ)充物而生長的突變體)，而且這種突變體可以通過轉(zhuǎn)化dna(即引入到細(xì)胞中的外源dna)而遺傳互補(bǔ)，這促進(jìn)選擇含有所需轉(zhuǎn)基因的藻類。在其他實施方案中可以使用無能力藻類(disabledalgae)。無能力藻類是經(jīng)過基因工程改造的，從而使其不能增殖，除非它們處于非常特殊的受控制條件下(即，此種株將不在野生條件下生長或轉(zhuǎn)移其基因)。在該公開內(nèi)容上下文背景下，將這種藻類稱為“無能力的”。使用這種無能力株抑制或限制用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因藻類向環(huán)境中的傳播。

適用于在此所述的方法和系統(tǒng)中的示范性植物包括培養(yǎng)的植物細(xì)胞(原生質(zhì)體和愈傷組織細(xì)胞)以及整個植物(單細(xì)胞和多細(xì)胞植物)。在各種實施方案中，植物細(xì)胞(即，培養(yǎng)的植物細(xì)胞或整個植物的細(xì)胞)可以來自包括燕麥、小麥、黑麥、大麥、稻、紅花、玉蜀黍、豆科植物、例如苜蓿、大豆、番茄、甜菜和馬鈴薯植物的植物。其他有用的植物可以是例如產(chǎn)生果實的植物，例如產(chǎn)生蘋果、梨、櫻桃、葡萄、柑橘類果實、菠蘿和香蕉的植物，和樹木，例如落葉松。其他合適的植物包括油椰、茶、可可和咖啡灌木、煙草、棉花、亞麻、向日葵、牧草、草料谷類、飼料植物、以及花生和小扁豆植物。其他有用的植物包括鼠耳芥屬(arabidosis)、肥皂草屬(saponaria)、浮萍(leminacea)、蕨類植物、蘚類和苔類。在本實施方案中，通常用于植物基因工程中的載體可用于將本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。

在此公開的方法和系統(tǒng)中，將第一個和第二個核酸引入細(xì)胞中(例如藻類或植物細(xì)胞)。在本實施方案中，第一個核酸編碼誘導(dǎo)型、阻抑型、或既誘導(dǎo)型又阻抑型的啟動子，且第二個核酸編碼調(diào)節(jié)質(zhì)體mrna表達(dá)的穩(wěn)定性因子(即nac2或mbb1)。在另一個說明性實施方案中，第二個核酸可以編碼翻譯活化因子，例如tbc2或tca1。

誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子控制穩(wěn)定性因子的表達(dá)。在各種實施方案中，取決于使用的核啟動子，可以使用任何合適類型的誘導(dǎo)物或阻抑物(例如化學(xué)藥品或改變的環(huán)境條件)。適用于在此公開的方法和系統(tǒng)的示范性啟動子是cyc6啟動子(見圖12)?？梢允褂闷渌魏魏线m的啟動子，包括與cyc6啟動子序列具有序列相似性的啟動子，例如與cyc6啟動子具有60％、70％、80％、85％、90％、95％或98％的序列相似性。也可以使用在嚴(yán)格雜交條件下能夠與cyc6啟動子互補(bǔ)物雜交的序列?？梢允褂玫钠渌线m的誘導(dǎo)型或阻抑型啟動子包括對諸如環(huán)境條件(例如缺氧、熱、干旱或光)、化學(xué)藥品、營養(yǎng)物、激素、病原體、傷害、食植動物(herbivory)、發(fā)育階段和組織類型的因子應(yīng)答的啟動子。此種啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。啟動子可以對多于一個因子應(yīng)答，且單個因子可以激活或阻抑多于一個啟動子。

除了cyc6之外，衣藻屬內(nèi)的其他誘導(dǎo)型啟動子包括co2誘導(dǎo)的質(zhì)膜蛋白質(zhì)基因的啟動子(genbank添加號u31976)、受鐵的可用性嚴(yán)格控制的fea1基因的啟動子(sasaki等人，1998；rubinelli等人，2002)以及在銨和谷氨酸存在下負(fù)阻抑并且在銨缺乏的培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)的nitl基因的啟動子(fernández1989)。高等植物中誘導(dǎo)型啟動子的實例包括核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亞基的光誘導(dǎo)型啟動子、查耳酮合酶基因的紫外線(u-v)誘導(dǎo)型啟動子、查耳酮合酶基因的香豆酸誘導(dǎo)型啟動子、醇脫氫酶基因的低氧誘導(dǎo)型啟動子、以及煙草、番茄、黃瓜和鼠耳芥(arabadopsis)的發(fā)病誘導(dǎo)的啟動子(pr-1-14)。

在誘導(dǎo)型和/或阻抑型啟動子的控制下表達(dá)穩(wěn)定性因子，并將其引入質(zhì)體中，穩(wěn)定性因子在質(zhì)體中與mrna非翻譯區(qū)直接或間接(例如，通過輔助蛋白質(zhì))結(jié)合以穩(wěn)定該mrna。在各種實施方案中，mrna非翻譯區(qū)可以在mrna的5’或3’末端。從編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)的第三個核酸轉(zhuǎn)錄該mrna。在另一個說明性實施方案中，可以從額外的核酸轉(zhuǎn)錄mrna，所述額外核酸與第三個核酸可操作地連接或不與第三個核酸連接，且由其自己的穩(wěn)定性因子控制。由此在穩(wěn)定性因子控制下在質(zhì)體中產(chǎn)生表達(dá)的蛋白質(zhì)，所述穩(wěn)定性因子的表達(dá)由誘導(dǎo)型和/或阻抑型核啟動子控制。

在一個示范性方面，穩(wěn)定性因子不僅可以在mrna的5’或3’末端或兩處直接或間接與該mrna非翻譯區(qū)結(jié)合，而且也可以與mrna的編碼區(qū)直接或間接結(jié)合。在另一個示范性方面，穩(wěn)定性因子可以直接或間接與mrna結(jié)合，例如，通過與復(fù)合體中的其他輔助蛋白質(zhì)結(jié)合，其中所述其他蛋白質(zhì)與mrna非翻譯和/或編碼區(qū)直接或間接結(jié)合。

在一個實施方案中，使用例如整合或重組(例如同源重組或其他類型的重組)將第一個和第二個核酸整合到核dna中。在另一個實施方案中，使用引入細(xì)胞中的表達(dá)載體表達(dá)第一個和第二個核酸。在本實施方案中，載體中的第一個和第二個核酸插入片段不與核dna重組，而是使用存在于載體中的調(diào)節(jié)序列自主表達(dá)編碼穩(wěn)定性因子的第二個核酸，所述調(diào)節(jié)序列包括由第一個核酸編碼的誘導(dǎo)型和/或阻抑型啟動子?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何合適的載體，包括這里在實施例1-4中所述的載體。

在這些實施方案每一個中，第一個核酸與第二個核酸可操作地連接以形成重組核酸。在此所述的示范性重組核酸是與nac2編碼序列(即第二個核酸)可操作地連接的cyc6啟動子(即第一個核酸)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的克隆方法將第一個核酸和第二個核酸彼此可操作地連接，包括用限制酶消化核酸、并用連接酶將第一個和第二個核酸相互連接并連接到消化的載體末端的方法。此種克隆方法描述于例如sambrook等人，“molecularcloning：alaboratorymanual”，第三版，coldspringharborlaboratorypress，(2001)，在此引用作為參考，或s.surzycki，“basictechniquesinmolecularbiology，”springer-verlag(2000)，在此引用作為參考。

在第二個核酸在第一個核酸編碼的啟動子控制下自主表達(dá)的實施方案中，表達(dá)載體(即載體插入構(gòu)建體)一般包含轉(zhuǎn)錄終止予以終止第二個核酸中存在的編碼序列的轉(zhuǎn)錄，并可以含有其他5’和3’調(diào)節(jié)序列。轉(zhuǎn)錄終止子一般存在于第二個核酸中，但是可以整合到載體中。

在第一個和第二個核酸穩(wěn)定整合到核dna中的實施方案中，轉(zhuǎn)錄終止子一般存在于第二個核酸中，但是可以是部分核dna序列。額外的5’和3’調(diào)節(jié)序列可以存在于第一個或第二個核酸中、載體中、和/或核dna中，例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件和涉及mrna穩(wěn)定化的序列。在本實施方案中，載體也可以含有核靶向序列，其促進(jìn)重組核酸向核dna中的整合。在一個實施方案中，核可以具有第二個核酸的無效拷貝，或可以失去第二個核酸的拷貝或同源物。

在此描述的各種實施方案中，用于自主表達(dá)穩(wěn)定性因子或?qū)⒅亟M核酸整合到核dna中的載體具有細(xì)菌復(fù)制起點，用于復(fù)制載體構(gòu)建體以進(jìn)行所需載體的大規(guī)模制備以用于克隆，其中的所需載體含有或不含插入的重組核酸(即可操作地連接的第一個和第二個核酸)。載體通常也具有用于插入dna片段的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(例如多克隆位點)以及用于選擇轉(zhuǎn)化體的選擇性遺傳標(biāo)記。選擇性標(biāo)記可以是例如aada基因或nptii的標(biāo)記，其允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞在補(bǔ)充抗生素的培養(yǎng)基上生長(goldschmidt-clermont，nucl.acidsres.，第19卷，第4083-4089頁(1991))。天然基因(arg7、nitl)和外來基因(ble、aphviii、aada、nptii)選擇性標(biāo)記均被開發(fā)為核轉(zhuǎn)化的報道基因。

通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)將含有重組核酸(即，包括第一個和第二個核酸的插入片段)的載體引入細(xì)胞(例如藻類或植物細(xì)胞)。示范性轉(zhuǎn)化方法包括電穿孔、玻璃珠介導(dǎo)的dna送遞、使用聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈等。

在一個實施方案中，為了轉(zhuǎn)化藻類，在轉(zhuǎn)化前使用自溶素分解細(xì)胞壁，所述自溶素是在交配期間釋放并降解細(xì)胞壁的酶。在備選實施方案中，已產(chǎn)生缺乏細(xì)胞壁合成能力的突變株(例如cw15cw10)，并將其用于有效轉(zhuǎn)化。

在一個說明性方面，可以通過pcr和dna印跡檢測轉(zhuǎn)化體。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他程序，例如添加抗生素、添加銅、抗體檢測(例如elisa和蛋白質(zhì)印跡)和測序。此種程序的選擇取決于所用的構(gòu)建體。

如果要在質(zhì)體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，那么一般如上文關(guān)于第一個和第二個核酸的討論可以將第三個核酸整合到載體中，且制備和復(fù)制所述載體構(gòu)建體。作為說明，可以使用生物射彈實現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其中含有轉(zhuǎn)基因的載體在被惰性氣體(例如氦)加速的金或鎢微粒上被引入細(xì)胞。該方法可以對細(xì)胞引起較小損傷。在相關(guān)說明性實施方案中，可以將待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪平板在選擇性固體瓊脂培養(yǎng)基上，且可以通過用氦氣或火藥將包被dna的鎢珠加速而將其送遞到質(zhì)體中。使用該技術(shù)，可以實現(xiàn)重組dna向質(zhì)體中的有效送遞。

在一個實施方案中，可以依靠編碼細(xì)菌氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因(adenyltransferase)(aada)的異源dna的表達(dá)檢測第三個核酸在質(zhì)體dna中的整合。該實施方案使得應(yīng)用抗生素壯觀霉素或鏈霉素選擇轉(zhuǎn)化體的方法成為可能。使用此報道構(gòu)建體，可能特異性地插入、破壞、修飾、突變或缺失質(zhì)體中任何非必需基因或順式作用元件。

在另一個說明性實施方案中，可以使用以同源葉綠體靶向序列為側(cè)翼的轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化葉綠體，其中同源葉綠體靶向序列促進(jìn)轉(zhuǎn)基因向葉綠體dna的整合。在一個實施方案中，通過載體側(cè)翼葉綠體序列與其葉綠體基因組中的同源序列之間的兩個同源重組事件，可以發(fā)生轉(zhuǎn)基因的整合。在一個實施方案中，葉綠體可以具有第三個核酸的無效拷貝，或可以失去第三個核酸的拷貝或同源物。

使核酸變成外來的示范性核酸修飾包括但不限于修飾核酸以實現(xiàn)密碼子最優(yōu)化、將核酸連接到其他基因的5’或3’非翻譯區(qū)、向核酸添加啟動子或終止序列、連接用于同源重組的序列、以及向核酸添加例如基因表達(dá)、靶向或穩(wěn)定所需的其他元件。另外的修飾包括將核酸與其他天然或轉(zhuǎn)基因的核酸融合以形成融合蛋白質(zhì)。

圖2-5顯示了在本發(fā)明范圍內(nèi)的質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的示范性示意略圖。圖1顯示質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的示意略圖，其中核誘導(dǎo)型啟動子在誘導(dǎo)物的存在下得到誘導(dǎo)。在本實施方案中，誘導(dǎo)物(例如環(huán)境條件例如低氧水平)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)穩(wěn)定性因子表達(dá)的啟動子，且穩(wěn)定性因子得到表達(dá)。翻譯后，穩(wěn)定性因子靶向質(zhì)體，它在質(zhì)體中與特定mrna結(jié)合，這取決于表達(dá)的穩(wěn)定性因子，而且mrna和其編碼的蛋白質(zhì)得到表達(dá)。

圖3顯示示例性質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的示意略圖，其中核誘導(dǎo)型啟動子在不存在誘導(dǎo)物時得到阻抑。在本實施方案中，不存在誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)型啟動子未被激活，且穩(wěn)定性因子不表達(dá)。沒有穩(wěn)定性因子，質(zhì)體中的mrna降解或不得到翻譯，且蛋白質(zhì)不表達(dá)。

圖4顯示示例性質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的示意略圖，其中核阻抑型啟動子在阻抑物(例如培養(yǎng)基中的預(yù)先確定的銅水平)的存在下受到阻抑。在本實施方案中，在阻抑物的存在下，阻抑型啟動子未被激活，且穩(wěn)定性因子不表達(dá)。沒有穩(wěn)定性因子，質(zhì)體中的mrna降解或不得到翻譯，且蛋白質(zhì)不表達(dá)。

圖5顯示示例性質(zhì)體基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的示意略圖，其中核阻抑型啟動子在不存在阻抑物(例如培養(yǎng)基中降低的銅水平或培養(yǎng)基中不存在銅)時得到誘導(dǎo)。在本實施方案中，不存在阻抑物時，調(diào)節(jié)穩(wěn)定性因子表達(dá)的核啟動子得到誘導(dǎo)，且穩(wěn)定性因子表達(dá)。翻譯后，穩(wěn)定性因子靶向質(zhì)體，它在質(zhì)體中與特定mrna結(jié)合，這取決于表達(dá)的穩(wěn)定性因子，而且mrna和其編碼的蛋白質(zhì)得到表達(dá)。

在需要分離和純化使用在此所述方法和系統(tǒng)獲得的表達(dá)的蛋白質(zhì)的實施方案中，可以將蛋白質(zhì)表達(dá)，然后使用常規(guī)技術(shù)純化。例如，可以以約40％純、約50％純、約60％純、約70-80％純、約90％純、約95％純、或約98％純的形式獲得蛋白質(zhì)。對于從細(xì)胞純化，可以將裂解物進(jìn)行例如硫酸銨沉淀、繼之為deae瓊脂糖柱層析。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他常規(guī)技術(shù)，例如凝膠過濾、離子交換層析、deae瓊脂糖柱層析、親和層析(例如使用下文實施例2中所述的flag標(biāo)記的系統(tǒng))、溶劑-溶劑萃取、超濾和hplc。備選地，可能不要求純化步驟，因為蛋白質(zhì)可能以如此高的濃度存在以致于蛋白質(zhì)在裂解物中是基本純的(例如70-80％純)?？梢酝ㄟ^例如超濾和切向流過濾的技術(shù)而濃縮表達(dá)的蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，可以通過例如超聲處理、熱或化學(xué)處理裂解細(xì)胞，且將勻漿離心去除細(xì)胞碎片。上清液于是可以根據(jù)需要經(jīng)歷硫酸銨沉淀和另外的分級分離技術(shù)，例如凝膠過濾、離子交換層析、deae瓊脂糖柱層析、親和層析、溶劑-溶劑萃取、超濾和hplc，以純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，用于從培養(yǎng)基或細(xì)胞純化表達(dá)的蛋白質(zhì)的上述純化方法是非限制性的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何純化技術(shù)都可用于純化表達(dá)的蛋白質(zhì)，如果需要這種技術(shù)以獲得充分純的蛋白質(zhì)的話。

可以使用多種技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞(例如藻類或植物細(xì)胞)以促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)。用于細(xì)胞(包括藻類和植物細(xì)胞)的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域所公知，并且一般補(bǔ)加碳源(例如葡萄糖或乙酸鹽)。例如，如下所述，以有利于產(chǎn)生氫氣為例，可以使用用于產(chǎn)生氫氣的培養(yǎng)系統(tǒng)和設(shè)備培養(yǎng)細(xì)胞以維持所需密度。

如上文所詳細(xì)討論的，在此所述的方法和系統(tǒng)可用于產(chǎn)生氫。因此，在另一個實施方案中提供了產(chǎn)生氫的裝置。該裝置包括配置為在充分氧耗盡環(huán)境中保持細(xì)胞培養(yǎng)物的第一個容器、與第一個容器流體溝通并配置為以預(yù)先確定的速率將培養(yǎng)基抽吸入第一個容器的第一個泵、以及與第一個容器偶聯(lián)并配置為測量細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)氫量的測量設(shè)備。

圖7說明可用于一些實施方案中產(chǎn)生氫的裝置10。裝置10包括新鮮培養(yǎng)基儲存容器12、泵14、反應(yīng)系統(tǒng)16和溢出容器18。新鮮培養(yǎng)基儲存容器12可以具體化為能夠在充分密封環(huán)境下儲存一定量培養(yǎng)基的任何類型的容器，所述培養(yǎng)基例如tap(乙酸鹽)或hsm(基本)。在一些實施方案中，將一定量的氣體24(例如氬氣)通過導(dǎo)管26抽吸入新鮮培養(yǎng)基儲存容器12以清除容器12的氧，以從而形成其中充分氧耗盡的環(huán)境。導(dǎo)管26可以具體化為能夠促進(jìn)流體(例如氣體)傳遞進(jìn)入新鮮培養(yǎng)基儲存容器中的任何類型的管、線、或其他導(dǎo)管。

泵14通過導(dǎo)管28與新鮮培養(yǎng)基儲存容器12流體偶聯(lián)，并通過導(dǎo)管30與反應(yīng)系統(tǒng)16流體偶聯(lián)。導(dǎo)管28(以及導(dǎo)管26，如果包括的話)與容器12偶聯(lián)，從而保持新鮮培養(yǎng)基儲存容器12的充分密封環(huán)境。導(dǎo)管28、30可以具體化為能夠通過泵14提供的抽吸作用促進(jìn)流體傳遞的任何類型的管、線或其他導(dǎo)管。泵14可以具體化為能夠以預(yù)先確定速率將一定量培養(yǎng)基從新鮮培養(yǎng)基儲存容器12抽吸入反應(yīng)系統(tǒng)16、而與新鮮培養(yǎng)基無不利相互作用的任何類型的泵。例如，在一個特定實施方案中，泵14具體化為蠕動泵，從而降低了抽吸過程中損害培養(yǎng)基的潛能。

反應(yīng)系統(tǒng)16包括反應(yīng)容器20和攪拌設(shè)備22。反應(yīng)容器20與新鮮培養(yǎng)基儲存容器12基本相似，并且可以具體化為能夠在充分密封的環(huán)境下儲存一定量培養(yǎng)基和藻類培養(yǎng)物或其他類型宿主細(xì)胞的任何類型的容器。將新鮮培養(yǎng)基通過導(dǎo)管28、30和泵14從新鮮培養(yǎng)基儲存容器12抽吸至反應(yīng)容器16。因為新鮮培養(yǎng)基儲存在充分氧耗盡的環(huán)境中，所以將氧非有意地引入反應(yīng)容器16的可能性被降低。導(dǎo)管30與反應(yīng)容器20偶聯(lián)，從而維持反應(yīng)容器12的充分密封環(huán)境。

攪拌設(shè)備22與反應(yīng)容器20可操作地偶聯(lián)，并且可以具體化為能夠維持儲存于反應(yīng)容器20中的培養(yǎng)物處于攪拌狀態(tài)的任何類型的設(shè)備。例如，攪拌設(shè)備22可以具體化為自動攪拌設(shè)備例如磁力攪拌棒組合等。

導(dǎo)管32從反應(yīng)容器20將任何培養(yǎng)物溢出物排出到溢流容器18中。溢流容器18可以與容器12、20基本相似，并可以具體化為能夠在其中儲存一定量培養(yǎng)物的任何類型的容器。導(dǎo)管32與導(dǎo)管28、30基本相似，并可以具體化為能夠促進(jìn)流體從反應(yīng)容器20向溢流容器18傳遞的任何類型的管、線或其他導(dǎo)管。與導(dǎo)管30類似，導(dǎo)管28與反應(yīng)容器20連接，從而維持反應(yīng)容器20的充分密封環(huán)境。導(dǎo)管30可以與反應(yīng)容器20在某一位置偶聯(lián)，從而通過將部分培養(yǎng)物排出到溢流容器18中，反應(yīng)容器20中含有的培養(yǎng)物水平保持在預(yù)先確定的水平(或之內(nèi))。

在一些實施方案中，測量設(shè)備34可以通過通訊線路36與反應(yīng)容器20偶聯(lián)，從而可以測量容器20中培養(yǎng)物產(chǎn)生的氫或其他氣體量。測量設(shè)備34可以具體化為能夠測量目的氣體量的任何類型的設(shè)備。在一個具體實施方案中，測量設(shè)備34具體化為質(zhì)譜儀，但是在其他實施方案中，可以使用其他類型的測量設(shè)備。通訊線路36可以是能夠促進(jìn)與測量設(shè)備24數(shù)據(jù)通訊的任何類型的通訊線路，例如任何數(shù)目的電線、電纜、光纖電纜、管、導(dǎo)管等。在一個具體實施方案中，通訊線路36包括置于反應(yīng)容器20中的電極部分。電極部分可以是例如銀電極。

在一些實施方案中，裝置10可以包括過濾系統(tǒng)40和第二個泵38。過濾系統(tǒng)40通過導(dǎo)管42與溢流容器18偶聯(lián)，并通過導(dǎo)管44與泵38偶聯(lián)。泵38通過導(dǎo)管46與新鮮培養(yǎng)基儲存容器12偶聯(lián)。導(dǎo)管42、44、46與導(dǎo)管28、30、32基本類似，并且可以具體化為能夠促進(jìn)流體傳遞的任何類型的管、線或其他導(dǎo)管。泵38可以與泵14類似，并且可以具體化為能夠以預(yù)先確定的速度將一定量的“用過的(spent)”培養(yǎng)物從溢流容器18抽吸到反應(yīng)新鮮培養(yǎng)基儲存容器12、而與新鮮培養(yǎng)基不具有不利相互作用的泵。例如，在一個具體實施方案中，泵38具體化為蠕動泵。過濾系統(tǒng)40可以具體化為任何數(shù)目和類型的過濾器，并且相互連接，其能夠過濾儲存在溢流容器18中的培養(yǎng)物。

在操作中，配置泵14以以預(yù)先確定的速度將新鮮培養(yǎng)基從新鮮培養(yǎng)基儲存容器12抽吸入反應(yīng)系統(tǒng)16的反應(yīng)容器20。在一個具體實施方案中，配置泵14以以基本等于反應(yīng)容器20中儲存的藻類細(xì)胞生長速度的速率將新鮮培養(yǎng)基抽吸入反應(yīng)容器20。如上文所詳細(xì)討論的，因為藻類或其他宿主細(xì)胞類型在充分氧耗盡環(huán)境中儲存在反應(yīng)容器20中，所需基因表達(dá)在藻類或其他宿主細(xì)胞類型中得到誘導(dǎo)，從而增加氫產(chǎn)生。在從新鮮培養(yǎng)基儲存容器12引入新鮮培養(yǎng)基時，如上所述，因為這種新鮮培養(yǎng)基在容器12中也儲存在充分氧耗盡環(huán)境中，所以反應(yīng)容器20的充分氧耗盡環(huán)境得到維持。備選的，在其他實施方案中，儲存在反應(yīng)容器20中的藻類或其他宿主細(xì)胞類型可以自我誘導(dǎo)。無論怎樣，應(yīng)當(dāng)理解裝置10是單相裝置。即，儲存在反應(yīng)容器20中的藻類或另一種宿主細(xì)胞類型在相同容器中增殖并得到誘導(dǎo)。

在將新鮮培養(yǎng)基引入反應(yīng)容器20中時，配置攪拌設(shè)備22以將反應(yīng)容器中儲存的培養(yǎng)物保持在連續(xù)攪拌狀態(tài)。另外，由于引入新鮮培養(yǎng)基，所以將部分現(xiàn)存培養(yǎng)物從反應(yīng)容器去除到溢流容器18中。以這種方式，反應(yīng)容器20中含有的藻類或另一種宿主細(xì)胞類型的量保持在基本恒定的值。在包括泵38和過濾系統(tǒng)40的實施方案中，泵38從溢流容器取出一定量的“用過的”培養(yǎng)物，并將該培養(yǎng)基在過濾系統(tǒng)40過濾以去除其中含有的任何藻類或其他宿主細(xì)胞類型之后，再引入新鮮培養(yǎng)基儲存容器。

參照圖8，在一個具體實施方案中，產(chǎn)氫裝置50包括新鮮培養(yǎng)基儲存容器52、蠕動泵54、反應(yīng)系統(tǒng)56和溢流容器62。新鮮培養(yǎng)基儲存容器52與新鮮培養(yǎng)基儲存容器12基本類似，且說明性地具體化為0.25升容器。一定量的新鮮培養(yǎng)基64說明性地具體化為例如tap(乙酸鹽)或hsm(基本)儲存在容器52中。帽66與容器52偶聯(lián)從而將容器52的內(nèi)腔68與外部環(huán)境基本密封。導(dǎo)管70與帽66偶聯(lián)，并且含有置于容器52的內(nèi)腔68中的末端部分72。將一定量的氬氣74通過導(dǎo)管70引入內(nèi)腔68中，從而基本清除內(nèi)腔的氧。

蠕動泵54通過導(dǎo)管76與新鮮培養(yǎng)基儲存容器52偶聯(lián)，并通過導(dǎo)管78與反應(yīng)系統(tǒng)56偶聯(lián)。蠕動泵54說明性地具體化為型號ip4蠕動泵，其可以通過商業(yè)途徑從瑞士ismatecofglattburg獲得。配置泵54以以預(yù)先確定的速度將一定量的新鮮培養(yǎng)基從新鮮培養(yǎng)基儲存容器52抽吸入反應(yīng)系統(tǒng)56，所述預(yù)先確定的速度基本等于反應(yīng)系統(tǒng)56中儲存的藻類培養(yǎng)物或另一種宿主細(xì)胞類型的生長速度。

反應(yīng)系統(tǒng)56包括反應(yīng)容器88(說明性地具體為0.25升容器)和磁力攪拌棒系統(tǒng)90，配置該磁力攪拌棒系統(tǒng)90以連續(xù)攪拌儲存于反應(yīng)容器88中的一定量的培養(yǎng)基和藻類培養(yǎng)物94或另一個宿主細(xì)胞類型。磁力攪拌棒系統(tǒng)90說明性地具體化為型號km02磁力攪拌棒，其可以通過商業(yè)途徑從瑞士日內(nèi)瓦milian獲得。帽92與反應(yīng)容器88偶聯(lián)，從而將容器88的內(nèi)腔94與外部環(huán)境充分密封。導(dǎo)管78與帽92偶聯(lián)，并且含有位于反應(yīng)容器88內(nèi)腔94中的末端部分96。

質(zhì)譜儀100也通過通訊線路102與反應(yīng)容器88偶聯(lián)。質(zhì)譜儀100說明性地具體化為型號mm8-80質(zhì)譜儀，其可以通過商業(yè)途徑從英國vginstrumentsofcheshire獲得。通訊線路102含有位于容器88內(nèi)腔94中的電極104。配置質(zhì)譜儀100以測量反應(yīng)容器88中儲存的培養(yǎng)基和藻類培養(yǎng)物或另一個宿主細(xì)胞類型的產(chǎn)氫量(以及在一些實施方案中的氧量)。

另外，導(dǎo)管106與帽92偶聯(lián)，并含有位于容器88內(nèi)腔94中的末端部分108。導(dǎo)管106的遠(yuǎn)端110位于溢流容器62內(nèi)腔中。這樣放置導(dǎo)管106從而將一定量的培養(yǎng)基和藻類培養(yǎng)物或另一個宿主細(xì)胞類型從反應(yīng)容器88取出，速度基本等于反應(yīng)容器88中儲存的藻類或另一個宿主細(xì)胞類型的細(xì)胞生長速度。

上述描述適用于在此所述所有方法和系統(tǒng)。下列實施例僅為了說明目的，而無意限制在附加權(quán)利要求中定義的本發(fā)明范圍。本文件中引用的參考文獻(xiàn)在此明確引用作為參考。

實施例1

天然基因的誘導(dǎo)型質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有在cyc6啟動子控制下的nac2基因的載體?？寺》椒枋鲇诶鐂ambrook等人，“molecularcloning：alaboratorymanual”，第三版，coldspringharborlaboratorypress，(2001)中，在此引用作為參考，或s.surzycki，“basictechniquesinmolecularbiology，”springer-verlag(2000)，在此引用作為參考。

為了將nac2基因置于cyc6啟動子元件的控制下，使用對cyc6啟動子元件和nac2基因組dna特異的四個寡核苷酸，通過重疊序列延伸pcr產(chǎn)生包含與psbd編碼序列融合的cyc6啟動子的嵌合dna片段。產(chǎn)生的pcr片段由與nac2基因組序列的833個堿基對的片段符合讀框地融合的cyc6啟動子序列的428個堿基對的片段組成。將該pcr片段亞克隆并測序。然后使用獨特的限制位點xbai和aatii將pcr片段克隆到pnac2(midi)質(zhì)粒中。質(zhì)粒pnac2(midi)含有nac2的5.1kb嵌合midi-基因，該基因以前由boudreau等人(2000)描述，在此引用作為參考。該基因由與3’cdna序列融合的nac2的5’基因組序列組成，且導(dǎo)致得到編碼整個nac2蛋白質(zhì)的可讀框(orf)，所述nac2蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)c末端用三ha表位進(jìn)行標(biāo)記。用xbai和aatii消化pnac2(midi)。然后將pcr片段定向連接到質(zhì)粒中。產(chǎn)生的質(zhì)粒pcy6nac2(midi)含有與nac2midi基因符合讀框地融合的cyc6啟動子序列的428個堿基對片段。

最后，使用psl17多克隆位點中的獨特限制位點(即ecori和xbai；見圖9)將5.8kb的cyc6nac2轉(zhuǎn)基因克隆到psl17質(zhì)粒中。psl17含有aphvii盒，其為克隆賦予抗生素巴龍霉素抗性及多克隆位點。使用產(chǎn)生的10.8kb質(zhì)粒pcy6nac2(paror)(見圖10)轉(zhuǎn)化nac2-26突變細(xì)胞。在圖11和12中分別提供了用于構(gòu)建載體的nac2和cyc6序列。

通過電穿孔將pcy6nac2(paror)載體引入nac2無效突變體nac2-26。藻類和植物轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并描述于例如sambrook等人，“molecularcloning：alaboratorymanual”，第三版，coldspringharborlaboratorypress，(2001)中，在此引用作為參考。

為了分離含有cyc6誘導(dǎo)型nac2基因的轉(zhuǎn)基因衣藻屬株，將nac2-26細(xì)胞首先用自溶素處理，然后通過電穿孔用pcyc6nac2(paror)轉(zhuǎn)化。將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體鋪平板在補(bǔ)加了抗生素巴龍霉素(20μg/ml)的tap培養(yǎng)基上。針對在補(bǔ)加了150μm鎳(ii)(cyc6轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物)的基本培養(yǎng)基和缺乏銅的基本培養(yǎng)基(hsm-cu⁺²；見圖13)上的光-自養(yǎng)生長的能力篩選巴龍霉素抗性集落。然后對光-自養(yǎng)株測試在缺乏誘導(dǎo)物的基本培養(yǎng)基(hsm)上生長的能力/無能力。

使用這個方式，分離轉(zhuǎn)基因株cy6nac2.49(見圖13)。該株能夠在hsm-cu⁺²上光自養(yǎng)生長，但是不能在補(bǔ)加了銅的hsm上光養(yǎng)生長。產(chǎn)生的株cy6nac2.49以兩種方式生長，包括1)在缺乏銅的培養(yǎng)基上光自養(yǎng)生長或2)在細(xì)胞缺乏psii復(fù)合體的情況下當(dāng)生長培養(yǎng)基中存在氧和銅時，厭氧生長培養(yǎng)物(見圖1)。因此，在轉(zhuǎn)基因株cy6nac2.49中，通過核啟動子控制光合氧的產(chǎn)生，其中核啟動子對低氧作出反應(yīng)。

另外，在非誘導(dǎo)條件下生長的cy6nac2.49的密封培養(yǎng)物將迅速變得厭氧，因為光合氧未被釋放但線粒體呼吸的氧消耗卻保持恒定。在cy6nac2.49的密封培養(yǎng)物中，存在反饋抑制環(huán)，其中低氧誘導(dǎo)光合氧產(chǎn)生，光合氧產(chǎn)生然后再阻抑psii合成及光合氧的放出。

事實上，這正是當(dāng)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)cy6nac2.49的密封照明培養(yǎng)物時所觀察到的。最初，培養(yǎng)物氧含量以大氣水平存在，然后氧被迅速消耗，導(dǎo)致厭氧(anaerobis)并誘導(dǎo)氫放出。一段時間段的厭氧生長后，容器內(nèi)培養(yǎng)物氧返回到大氣水平的2倍，從而抑制氫放出(數(shù)據(jù)未顯示)。在常規(guī)密封容器內(nèi)，僅僅觀察到氧消耗和氫產(chǎn)生的一個循環(huán)，可能是因為當(dāng)減少的碳被線粒體呼吸消耗而光合氧產(chǎn)生保持恒定時，氧消耗停止。

測試野生型nac2-26(cy6nac2.49的親本株)和cy6nac2.49細(xì)胞在完全(tap)培養(yǎng)基、補(bǔ)加了抗生素巴龍霉素的完全培養(yǎng)基(tap+paro)、基本培養(yǎng)基(hsm)和缺乏銅的基本培養(yǎng)基(hsm-cu⁺²)上的生長能力(圖10)。圖14顯示對在非誘導(dǎo)(tap)和誘導(dǎo)條件(tap-cu⁺²和tap-o2)下生長的野生型和cy6nac2.49細(xì)胞的全細(xì)胞提取物進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析。以識別α-hyda、α-d2和α-rbcl的抗體探測蛋白質(zhì)印跡，其中識別α-hyda的抗體作為厭氧生活的對照。

圖15顯示測量氫放出的實驗結(jié)果。將cy6nac2.49細(xì)胞密封在照明容器中，在其中可以使用質(zhì)譜儀測量在培養(yǎng)基中的溶解氣體(氧-虛線，氫-實線)，然后通過向生長培養(yǎng)基添加銅由誘導(dǎo)改變?yōu)榉钦T導(dǎo)條件(tap-cu⁺²到tap)。在液相測量h2濃度，并表示為毫巴(mbar)。

常規(guī)密封容器不足以維持使用轉(zhuǎn)基因株cy6nac2.49的氫產(chǎn)生，所以設(shè)計密封的無氧系統(tǒng)，以以恒定速度向生長的cy6nac2.49培養(yǎng)物提供新鮮的氧耗盡培養(yǎng)基，以將其維持在指數(shù)生長期(見圖7和8)。假定將培養(yǎng)物保持在指數(shù)生長期將導(dǎo)致氧消耗/氫產(chǎn)生/氧產(chǎn)生循環(huán)的確立。當(dāng)在該系統(tǒng)中培養(yǎng)cy6nac2.49細(xì)胞時，我們觀察到在培養(yǎng)物開始低氧后不久氫放出的誘導(dǎo)。伴隨著容器中氧的輕微升高，psii復(fù)合體的合成得到誘導(dǎo)。不同于常規(guī)的密封容器，釋放的光合氧不抑制氫產(chǎn)生，估計是因為光合氧產(chǎn)生從不超過線粒體呼吸的氧消耗。在該系統(tǒng)中，氫產(chǎn)生直接與光能關(guān)聯(lián)，且從而代表了氫產(chǎn)生的直接生物光解方法。使用此無氧系統(tǒng)，我們獲得了氫放出達(dá)到氣相的約0.5％的恒定速度。

氧作為光合作用的副產(chǎn)物放出。結(jié)果，使用光能維持藻類氫放出(有時也被認(rèn)為是生物光解的過程)的中心挑戰(zhàn)是克服氫化酶的氧靈敏度。與本發(fā)明人開發(fā)的直接生物光解方法形成對比，間接生物光解方法(或兩階段光合作用和氫產(chǎn)生)應(yīng)用光合氧和氫產(chǎn)生的空間和時間分離以克服氫化酶的氧靈敏度(benemann1996；melis2000)。第一階段涉及正常的生氧光合作用：氧的釋放、co2的固定以及生物量的累積。在第二個階段，通過消耗重要的營養(yǎng)物例如硫，生氧光合作用被生理性抑制。因為生氧光合作用速率在硫饑餓約22小時后劇烈降低，所以密封的培養(yǎng)物由于線粒體呼吸引起的氧的凈消耗而變得厭氧(melis2000)。一旦確立厭氧菌(anaerobia)，氫化酶途徑就得到誘導(dǎo)，且利用電子放出氫，所述電子主要衍生自水的剩余光氧化，但是也來自內(nèi)源性底物例如蛋白質(zhì)和淀粉的分解代謝(ghirardi2000)。

無氧系統(tǒng)(直接生物光解方法)和間接生物光解方法之間的區(qū)別揭示了使用無氧系統(tǒng)的幾個重要優(yōu)勢。首先，無氧系統(tǒng)固有的是，僅僅因為氧和氫產(chǎn)生發(fā)生在單獨的照明密封容器中，氫產(chǎn)生能力增加50％。兩階段光合作用和氫產(chǎn)生方法或間接生物光解意味著氧和氫產(chǎn)生階段在空間和/或時間上的分離，且結(jié)果是需要兩個容器，其中一個容器在氫產(chǎn)生期間不使用，損失50％的生產(chǎn)能力。第二，兩階段光合作用和氫產(chǎn)生方法依賴于硫的生理性耗盡以抑制生氧光合作用。嚴(yán)重的硫饑餓對多種細(xì)胞過程具有廣泛作用。催化氫釋放的氫化酶含有fe-s簇，其組裝是其功能所必需的(posewitz等人，(2004))。另外，硫耗盡負(fù)面影響其他重要的葉綠體復(fù)合體例如psi，所述葉綠體復(fù)合體對于氫放出是重要的。顯然，硫的生理性耗盡嚴(yán)重影響氫放出機(jī)制的重要部分。相反，無氧系統(tǒng)不依賴于重要的微量營養(yǎng)物的耗盡來誘導(dǎo)氫產(chǎn)生。事實上，氫產(chǎn)生發(fā)生在最佳生理條件下(完全培養(yǎng)基中的指數(shù)生長培養(yǎng)物)。

最后，使用例如藻類大規(guī)模產(chǎn)氫的主要障礙是為大的密集培養(yǎng)物提供光能。在大的密集的藻類培養(yǎng)物中，集光復(fù)合體中的大量葉綠素可以阻止光能到達(dá)容器中央的細(xì)胞。在我們的直接生物光解方法中，氫產(chǎn)生發(fā)生在可為最大光吸收和氫產(chǎn)生確立最佳細(xì)胞密度的系統(tǒng)中。

實施例2

外來基因的誘導(dǎo)型質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)

葉綠體轉(zhuǎn)化載體。質(zhì)粒psk108含有葉綠體dna的3kb片段，該片段包含psbd基因和5’側(cè)翼序列以將其指導(dǎo)至psbd基因周圍區(qū)域(圖16)。該構(gòu)建體也含有插入psbd基因上游的aada盒?？梢允褂胮sk108的ncoi和sphi位點將轉(zhuǎn)基因符合讀框地插入。一旦連接，新載體就將含有轉(zhuǎn)基因(加上3bps)，其中atpa的5’末端驅(qū)動其表達(dá)且rbcl的3’序列作為終止子。atpa啟動子驅(qū)動編碼葉綠體atp產(chǎn)生性質(zhì)子泵的基因的表達(dá)，并從而不受制于d1修復(fù)機(jī)制。

將三個flag標(biāo)記的外來基因wvp28、dilp和ibvd個別地亞克隆到葉綠體轉(zhuǎn)化和表達(dá)載體pcg12中(圖17)。該載體整合到atpb葉綠體基因座的下游。轉(zhuǎn)基因由atpa啟動子驅(qū)動，并且攜帶psbd的5’utr的穩(wěn)定性因子結(jié)合位點(圖18和19)。

將這些載體與p228載體共轉(zhuǎn)化入cyc6/nac2誘導(dǎo)型株，其中p228載體攜帶衣藻屬16srrna基因，并且將賦予壯觀霉素抗性(cyc6啟動子為控制啟動子，且nac2為穩(wěn)定性因子)。

實施例3

hyda1、hydef和hydg基因在雷氏衣藻葉綠體中的超表達(dá)

將要測試氫化酶是否可在雷氏衣藻中超表達(dá)以及這是否導(dǎo)致增強(qiáng)的氫產(chǎn)生。近來實驗已顯示，hydef、hydg和hyda1在大腸桿菌(e.coli)中的共表達(dá)足以產(chǎn)生活性fe氫化酶(posewitz等人，(2004))。蛋白質(zhì)在雷氏衣藻的核區(qū)室中的超表達(dá)鮮有成功，主要是因為轉(zhuǎn)基因經(jīng)常被沉默。因此，將使用生物射彈轉(zhuǎn)化在葉綠體區(qū)室中表達(dá)這些基因。使用該策略具有幾個優(yōu)點。首先，基因沉默不發(fā)生在葉綠體中。第二，各個質(zhì)體基因以80拷貝存在于雷氏衣藻中。第三，最近的實驗已顯示，如果這些基因由葉綠體啟動子、5’和3’utr驅(qū)動，而且如果使用偏倚的葉綠體密碼子選擇重新合成編碼序列，那么外來蛋白質(zhì)確實可能達(dá)到在葉綠體中的高表達(dá)水平(mayfield等人.(2001))。葉綠體基因有強(qiáng)的at偏倚。

考慮雷氏衣藻葉綠體密碼子選擇，首先重新構(gòu)建hyda1、hydef和hydg的各個編碼序列。這將通過使用公開的方法而實現(xiàn)，所述方法已成功用于合成在葉綠體中表達(dá)的外來基因。例如，我們最近在雷氏衣藻葉綠體中成功超表達(dá)了兩個病毒蛋白質(zhì)(見下文)。轉(zhuǎn)基因?qū)⒉迦肴~綠體反向重復(fù)序列中，從而將其拷貝數(shù)增加兩倍。將使用cyc6nac2株作為宿主株。該株含有核nac2突變以及由cyc6啟動子驅(qū)動的nac2基因，該啟動子由銅耗盡或厭氧條件誘導(dǎo)。

這時尚未知hydalp、hydefp和hydgp蛋白質(zhì)中哪一個蛋白質(zhì)對于氫產(chǎn)生是限制性的。為了檢測這一點，首先使用生物射彈轉(zhuǎn)化將與psbd啟動子和5’utr融合的這三個基因中的每一個個別地插入葉綠體反向重復(fù)序列中以進(jìn)行超表達(dá)。一種可能性是將基因插入在16s和23srrna基因之間的間隔區(qū)內(nèi)的核糖體操縱子，該策略已被成功地應(yīng)用于高等植物葉綠體內(nèi)的高表達(dá)。因為轉(zhuǎn)基因處于psbd5’utr的控制下，所述psbd5’utr通過nac2由cyc6啟動子驅(qū)動，所以該轉(zhuǎn)基因?qū)H在厭氧條件下表達(dá)。將通過rna印跡雜交或?qū)崟rrt-pcr監(jiān)控表達(dá)。對于三個測試基因中的每一個，將通過在由管連接至充滿水的倒置滴定管的封閉瓶中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、并且通過從取代的水的體積直接測量氣體體積而測定氫產(chǎn)生，如zhang和melis(2002)所述。如果氫產(chǎn)生相對于cyc6nac2對照增加，那么這將提示超表達(dá)的蛋白質(zhì)是限制性的。如果這些實驗揭示多于一個這些蛋白質(zhì)對于氫產(chǎn)生是限制性的，則使用相同的策略將兩個蛋白質(zhì)均表達(dá)。有可能這三個蛋白質(zhì)在野生型細(xì)胞中的表達(dá)是經(jīng)過調(diào)整的，從而每個蛋白質(zhì)都需要超表達(dá)以增加氫產(chǎn)生的產(chǎn)量。在此情況下，將需要這三個蛋白質(zhì)的超表達(dá)。多基因的表達(dá)已在高等植物葉綠體中實現(xiàn)(quesada-vargas等人.(2005))。如果用psbd5’utr表達(dá)不夠，那么將測試其他強(qiáng)葉綠體啟動子-5’utr例如psba、atpa和核糖體啟動子。

實施例4

影響氫產(chǎn)生的基因的表達(dá)

除上述之外，將使用在質(zhì)體中表達(dá)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)型和/或阻抑型系統(tǒng)對其他幾個基因測試增加的氫產(chǎn)生。兩個實例是氧不靈敏氫化酶或縮小觸角大小(antennasize)(melias等人，(2004)；ghirardi等人，(2005))。簡而言之，前者涉及為了降低的氧靈敏度而克隆和表征來自衣藻屬和其他生物的天然及誘變的氫化酶基因。后者即觸角縮小(antennareduction)的目的是減少由藻類細(xì)胞捕獲的光子量，從而光可以更深入地穿透到光反應(yīng)器中，因此更易于被正常受遮蔽的細(xì)胞利用。藻類細(xì)胞對捕獲但不利用光是非常有效的，從而浪費高達(dá)80％的吸收的光子。通過dna插入誘變已鑒定了調(diào)節(jié)觸角大小(antennasize)的基因。突變體tlal的psii和psi觸角大小為野生型株的50％和65％。最后，已鑒定了據(jù)具有推測增加的呼吸速率的突變株，其從而降低用于抑制氫化酶的可利用的氧水平(krause等人，(2005))。將該基因插入cy6nac2.49轉(zhuǎn)基因株，并評價其對于該株增加氫產(chǎn)生的貢獻(xiàn)。

氫產(chǎn)生的一個重要的限制性因素是與calvin-benson循環(huán)的競爭。增強(qiáng)到氫化酶的電子流的一種可能性是通過降低參與calvin-benson循環(huán)的酶量來降低calvin-benson循環(huán)活性。例如，可以利用磷酸核酮糖激酶(prk)，因為存在prk活性缺陷的兩個衣藻屬突變體f60和ac214。將prk基因與誘導(dǎo)型cyc6啟動子融合，并將該構(gòu)建體插入f60。該策略的優(yōu)點是，psii和calvin-benson循環(huán)將在不存在銅(或氧)時一起起作用，從而允許儲存還原力。兩個基因都將在銅(或氧)的存在下關(guān)閉。因此，在氫化酶受誘導(dǎo)的條件下，電子流將從calvin-benson循環(huán)轉(zhuǎn)移到氫化酶，而氫產(chǎn)生將得到增強(qiáng)。

在另一個說明性實施方案中，將要篩選prk溫度敏感性突變體。在該方法中，可以在限制性溫度下將calvin-benson循環(huán)關(guān)閉，而將電子轉(zhuǎn)移到氫化酶。將用pcr產(chǎn)生的誘變prk基因文庫轉(zhuǎn)化prk突變體。將在許可溫度下(24℃)在基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。將集落在基本培養(yǎng)基上影印鋪板，并將在限制性溫度(32℃)下培養(yǎng)，且鑒定不能生長的突變體。為了驗證prk基因攜帶突變，將該基因通過pcr擴(kuò)增并測序。也將可能通過熒光篩選突變體，因為calvin循環(huán)的封閉可能增加這樣突變體的熒光產(chǎn)量。

在另一個實施方案中，循環(huán)電子流代表電子從氫化酶轉(zhuǎn)移的另一條路線，且我們將使用在狀態(tài)1被封閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)移缺陷突變體。狀態(tài)轉(zhuǎn)移涉及psii(lhcii)和psi的觸角之間光激發(fā)能的再平衡，所述再平衡是在允許最佳光合作用產(chǎn)量的改變的光條件下，通過lhcii的可動部分從psii向psi可逆性取代而實現(xiàn)的。在狀態(tài)1，lhcii的可動部分與psii結(jié)合，而在狀態(tài)2中，其與psi結(jié)合。而且，在衣藻屬中，狀態(tài)1最喜好線性電子流，而狀態(tài)2導(dǎo)致循環(huán)電子流(finazzi等人，2002)。因此，在狀態(tài)1封閉的突變體中沒有循環(huán)電子流。將已知在狀態(tài)1被封閉的stt7突變體(depège等人，2003)與含有cyc6-nac2和cyc6-prk構(gòu)建體的nac2-26雜交，且無論這在psii活性受阻抑時是否導(dǎo)致氫產(chǎn)生的改進(jìn)，都對其進(jìn)行測定。備選的，一旦可獲得溫度敏感性prk突變體，就將該突變體與nac2-26stt7cyc6-nac2株雜交。在上述條件下對這些株測試氫產(chǎn)生。

也將分析除了狀態(tài)轉(zhuǎn)移缺陷的stt7外的其他突變體。格外關(guān)注對這些突變體的分析，因為光合作用和線粒體電子流調(diào)節(jié)中的改變可以間接導(dǎo)致狀態(tài)轉(zhuǎn)移中的變化，所述調(diào)節(jié)中的改變可能改變線粒體呼吸相對于光合作用氧放出的比率。有報告稱與wt細(xì)胞相比，這類突變已增加了氫產(chǎn)生(kruse等人，2005)。

實施例5

外來基因的誘導(dǎo)型質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)

將選擇標(biāo)記基因aada用于誘導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)?？梢詫⑵湟詎ac2依賴的方式表達(dá)，易于使用抗生素壯觀霉素篩選，而且已知其具有高比活性。即使是低aada表達(dá)也導(dǎo)致一些抗生素抗性，并從而為ind41_18(下述)中cy6nac2調(diào)節(jié)的“緊密性(tightness)”提供了測量。已構(gòu)建葉綠體整合載體，該載體攜帶驅(qū)動aada基因表達(dá)的psbd啟動子和5’utr。

nac2-26突變株以前已經(jīng)得到描述(kuchka等人，emboj.7，319-324；nickelsen等人，emboj.13，3182-3191)。cyc6nac2.49株含有轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因由與nac2midi-基因融合的cyc6啟動子組成，其中nac2midi-基因插入nac2-26突變體的核基因組中(δnac2：：cy6pronac2)。用含有peta啟動子和5’utr的675片段置換psbd啟動子和5’utr，從cy6nac2.49產(chǎn)生ind41(δnac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd)。除了在ind41-18株中將aada盒從葉綠體dna完全切除、且該株因此對壯觀霉素敏感之外，ind41-18與ind41株相關(guān)(δnac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd[spc^s])。ind_aada_117來自ind41-18，并且含有由psbd啟動子和5’utr驅(qū)動的aada盒，所述psbd啟動子和5’utr插入atpb基因下游(δnac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd：：5’psbd-aada)。

ind_aada轉(zhuǎn)基因株的篩選

通過用pcg12葉綠體整合載體生物射彈轉(zhuǎn)化銅饑餓的ind41_18細(xì)胞，實現(xiàn)5’psbd-aada盒向ind41_18細(xì)胞葉綠體基因組中的整合(圖21)。在含有100μg/ml壯觀霉素的銅耗盡tap培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。挑取轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的集落，并在補(bǔ)加了100μg/ml壯觀霉素的tap-cu⁺²培養(yǎng)基上再鋪平板三次以保證5’psbd-aada盒的完全分離。

圖21顯示該實驗中使用的pcg12載體示意圖示。使用psbd5′utr表達(dá)載體中的aada盒。野生型、ind41_18和ind_aada_x轉(zhuǎn)基因株的生長也有顯示。將這些株連續(xù)稀釋，然后點樣于固體tap、銅耗盡的tap培養(yǎng)基(tap-cu⁺²)、補(bǔ)加100-1000μg/ml壯觀霉素的tap(tap-cu⁺²+spc)、以及補(bǔ)加100-1000μg/ml壯觀霉素的tap-cu⁺²(tap-cu⁺²+spc)上，并在100μem^-2s^-1的光強(qiáng)度下培養(yǎng)7-10天。

通過在tap+spc100和tap-cu⁺²+spc100固體瓊脂培養(yǎng)基上影印鋪板推定的誘導(dǎo)型aada轉(zhuǎn)基因系而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化體篩選。所有測試的集落在兩種培養(yǎng)基上均生長的同樣好，指示在這些株中cyc6nac2轉(zhuǎn)基因的啟動子控制的缺失(圖21a)。然而，在測試高難度壯觀霉素時，當(dāng)在生長培養(yǎng)基中補(bǔ)加銅時，85％的測試株對壯觀霉素敏感，但是在培養(yǎng)基中省去銅時卻非如此(圖21b)。選擇幾個這些株，命名為ind_aada，用于進(jìn)一步表征。這些株的基因型為nac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd：：5psbd-aada。

ind_aada轉(zhuǎn)基因株的生長分析

從最初的篩選過程保留的幾個誘導(dǎo)型株的生長分析通過連續(xù)稀釋，然后將野生型、ind41_18和ind_aada細(xì)胞點樣在補(bǔ)加一系列壯觀霉素濃度(0、100、250、500、750、1000、2000μg/ml)的tap、tap-cu⁺²、hsm、hsm-cu⁺²和固體瓊脂培養(yǎng)基中任一個上來實現(xiàn)(圖21b)。在以這種方式測試的11個株中，一個株即ind_aada_36能夠在補(bǔ)加＞500μg/ml壯觀霉素的tap培養(yǎng)基上生長。另一方面，11個株中的6個能夠在低壯觀霉素濃度的銅耗盡的tap培養(yǎng)基上生長，但是在壯觀霉素濃度高于250μg/ml時不能生長(圖21b)。命名為ind_aada_117的一個株在tap+250μg/ml壯觀霉素上培養(yǎng)時對壯觀霉素敏感，但是在銅耗盡的tap培養(yǎng)基上，能夠在所有測試的壯觀霉素濃度下生長。

從ind_aada_117提取的總rna的rna印跡分析

為了了解ind_aada_117中aada表達(dá)的誘導(dǎo)，從在非誘導(dǎo)(tap)或誘導(dǎo)條件(tap-cu⁺²，tap-cu⁺²+spc，tap-o2，hsm-cu⁺²)下培養(yǎng)的ind_aada_117細(xì)胞中分離總rna。對這些樣品的rna印跡分析(northernanalysis)揭示，psbd轉(zhuǎn)錄物累積到與親本株ind41_18所述相同的水平，或接近野生型psbdrna的25％。如預(yù)期的，ind_aada_117的psbdrna大于野生型psbd轉(zhuǎn)錄物，提示真正的psbd基因(從親本株ind41_18繼承的特征)不再存在于該株中(圖22)。重要的是，在誘導(dǎo)cyc6轉(zhuǎn)錄的所有培養(yǎng)物中均觀察到aada轉(zhuǎn)錄物的累積(圖22)。在tap培養(yǎng)的ind_aada_117培養(yǎng)物中存在少量aadarna，證實了ind_aada株的“泄漏”表型(圖22)。令人驚訝的是，aada轉(zhuǎn)錄物在ind_aada_117的厭氧生長培養(yǎng)物中比在銅饑餓培養(yǎng)物中更加豐富，這是未由關(guān)于psbd/d2表達(dá)與“祖本(grand-parental)”株cy6nac2.49共享的特征(圖22)。在圖22所示測定中，從在tap、tap-cu⁺²、tap-cu+2+spctap-o2+spc、hsm-cu⁺²和hsm-cu⁺²+spc液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的野生型和ind_aada_117細(xì)胞中提取總rna。探針示于圖22左側(cè)。

ind_aada_117蛋白質(zhì)提取物分析

使用對幾個重要的葉綠體編碼蛋白質(zhì)特異的抗血清通過免疫印跡分析從ind_aada_117細(xì)胞提取的總蛋白質(zhì)。在檢查的所有ind_aada_117培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)d2蛋白質(zhì)水平約為野生型水平的約25％，低于累積50％d2蛋白質(zhì)的親本株ind4118(圖23)。另一方面，在大多數(shù)測試的ind_aada_117蛋白質(zhì)提取物中觀察到d1和cp47蛋白質(zhì)累積的完全恢復(fù)，而且在這種情況下，估計d2蛋白質(zhì)累積降低了75％。因此，令人驚訝的是，d1和cp47累積不受d2蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)。使用從多種條件下培養(yǎng)的ind_aada_117制備的可溶性提取物確定ind_aada_117中的nac2蛋白質(zhì)累積。盡管在tap培養(yǎng)的ind_aada_117培養(yǎng)物中檢測到少量nac2，但在厭氧和銅饑餓的ind_aada_117可溶性提取物中觀察到cyc6nac2的誘導(dǎo)(圖23)。在cyc6轉(zhuǎn)錄受到阻抑的條件下，tap培養(yǎng)物中存在痕量nac2，證明ind_aada株中該系統(tǒng)的輕微“泄漏”(圖23)。因此，最初所觀察到的tap培養(yǎng)基上培養(yǎng)的ind_aada轉(zhuǎn)基因株能夠在低濃度壯觀霉素存在下生長，是因為cyc6nac2的的一些泄漏。在圖23中，從tap、tap-cu⁺²、tap-cu+2+spctap-o2+spc、hsm-cu⁺²和hsm-cu⁺²+spc液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的野生型和ind_aada_117細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)，并且將總蛋白質(zhì)大小分級分離并固定在pvdf膜上。探針示于圖23左側(cè)。

ind_aada_117的aada測定

通過測量其活性而間接估計aada的量(表1)。該測定基于aada酶將atp分子的腺嘌呤部分轉(zhuǎn)移到壯觀霉素、從而給壯觀霉素分子添加正電荷的能力。帶正電荷的壯觀霉素分子可以結(jié)合攜帶負(fù)電荷的磷酸纖維素膜。因此，如果在壯觀霉素和α³²p-標(biāo)記的datp存在下溫育表達(dá)aada的衣藻屬粗提取物，那么經(jīng)過將反應(yīng)物點樣并洗去非特異性產(chǎn)物后，存在于磷酸纖維素膜上的放射性的量為aada酶活性提供了相對測量。使用在tap、tap-cu⁺²、tap-cu⁺²+spc的任一種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ind_aada_117細(xì)胞粗提取物，以測量該轉(zhuǎn)基因株與親本株和在野生型背景上表達(dá)傳統(tǒng)aada盒的其他株相比的aada活性。幾個獨立測定的組合結(jié)果示于表1。在ind41_18中沒有檢測到aada活性，從而證明該盒從此株中的去除是完全的。另一方面，在表達(dá)傳統(tǒng)aada盒的野生型株及在tap-cu⁺²和tap-o2中培養(yǎng)的ind_aada_117中，aada活性均與以前報導(dǎo)的表達(dá)aada的轉(zhuǎn)基因株類似(表1)。tap培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ind_aada_117的粗提取物中也存在微弱但卻顯著的aada活性。該結(jié)果證實非誘導(dǎo)的ind_aada_117中存在少量的aada活性，盡管該活性僅為ind_aada_117誘導(dǎo)的培養(yǎng)物活性的部分。

使用cy6nac2葉綠體誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)篩選能夠誘導(dǎo)aada基因表達(dá)的株，持續(xù)導(dǎo)致具有“泄漏”表型的株的恢復(fù)。因為證實cyc6nac2轉(zhuǎn)基因在親本株中受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，所以經(jīng)過推理，認(rèn)為ind_aada中cyc6nac2轉(zhuǎn)基因的脫阻抑是經(jīng)受得住篩選程序的先決條件。對于此觀察的一個可能的解釋是，用于篩選程序各步驟中的銅耗盡培養(yǎng)基中，包括用于以pcg12生物射彈轉(zhuǎn)化ind41_18的培養(yǎng)基，最初有很少量的銅污染。如果的確是這種情況，則可以預(yù)測直到銅污染降低到低于2x10⁶離子/細(xì)胞的時候，將發(fā)生cyc6轉(zhuǎn)錄的瞬時阻抑，而且作為結(jié)果，僅僅那些脫阻抑cyc6nac2的轉(zhuǎn)化體將經(jīng)受得住以pcg12質(zhì)粒的最初轉(zhuǎn)化。換句話說，假設(shè)cyc6nac2轉(zhuǎn)錄的阻抑足夠長以負(fù)面影響細(xì)胞在補(bǔ)加壯觀霉素的培養(yǎng)基中的存活；經(jīng)受得住最初轉(zhuǎn)化中的所有集落均由單個細(xì)胞產(chǎn)生，所述單個細(xì)胞不分裂，除非cyc6nac2已脫阻抑。培養(yǎng)基污染被看作是不可避免的，因為已充分記錄到即使微小濃度的銅也阻抑cyc6的轉(zhuǎn)錄。實際上，設(shè)計用于研究cy6nac2.49中銅介導(dǎo)的阻抑動力學(xué)的實驗揭示，將銅饑餓的cy6nac2.49細(xì)胞重懸于銅耗盡培養(yǎng)基中，瞬時阻抑了cyc6nac2轉(zhuǎn)錄，并將真正cyc6基因座的轉(zhuǎn)錄阻抑了1至2個分裂周期。

然而，ind_aad_117轉(zhuǎn)基因株顯示，可能基于核編碼的nac2蛋白質(zhì)為衣藻屬設(shè)計誘導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因ind41_18株可用于誘導(dǎo)任何由整合到葉綠體基因組中的psbd5’utr驅(qū)動的嵌合基因的表達(dá)，前提是psbd5’utr能夠驅(qū)動目的基因的表達(dá)。

對于表1中的測定，在誘導(dǎo)和阻抑條件下測定ind41_aada-117中氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的活性。測定wt-aada、ind41_18和ind41_aada-117株提取物的aada活性和總蛋白質(zhì)含量。將活性顯示為每μg蛋白質(zhì)摻合的cpm。獨立實驗數(shù)顯示于括號中。

表1

vp28_flag、ibvd_flag和dilp_flag的誘導(dǎo)型表達(dá)

為了測試是否能夠?qū)⒃诖怂龅恼T導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于產(chǎn)生外來蛋白質(zhì)，選擇三個不同的外來蛋白質(zhì)用于使用5’psbd驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因的異源表達(dá)：vp28、dilp和ibvd。使用ibvd(或vp2)產(chǎn)生疫苗，用于在家禽中控制傳染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus，ibdv)(mundt1995)。經(jīng)證明，作為亞基疫苗喂飼時，斑節(jié)對蝦(penaeusmonodon)白斑病綜合征病毒主要結(jié)構(gòu)包膜蛋白的23kd片段vp28保護(hù)蝦免受感染(witteveldt2004)。

stefansurzycki博士(indianauniversity，bloomington)作為禮物提供了具有對雷氏衣藻葉綠體遺傳機(jī)制最優(yōu)化的密碼子偏倚的三個flag標(biāo)記的外來基因vp28、dilp和ibvd，將其個別地亞克隆到葉綠體轉(zhuǎn)化和表達(dá)載體pcg12中，從而psbd的5’utr驅(qū)動以rbcl3’utr為終止子的外來蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖24a)。因為這些新構(gòu)建體缺乏選擇標(biāo)記，所以轉(zhuǎn)化體的形成需要與攜帶選擇標(biāo)記的另一個葉綠體整合載體共轉(zhuǎn)化(圖24a)。

圖24a顯示用于誘導(dǎo)果蠅屬(drosophila)胰島素樣肽表達(dá)的實驗中使用的pcg12_dilp載體的示意圖。黑色框代表dilp編碼序列。箭標(biāo)代表psbd基因的5’前導(dǎo)序列。星號顯示3ha-11表位的插入。圖24b中顯示了以識別flag表位的抗體探測的、使用從ind_vp28(左上)、ind_ibvd(右上)或ind_dilp(下圖)提取的總蛋白質(zhì)的免疫印跡。蛋白質(zhì)的預(yù)測分子量為vp28-23kd、ibvd-49kd、以及dilp-12kd，且以星號指示。

將這些載體與攜帶ycfl基因和側(cè)翼葉綠體序列以及賦予壯觀霉素抗性的aada盒的py1_int載體共轉(zhuǎn)化入ind41_18株。在用壯觀霉素改善的tap板上選擇之后，使用pcr以擴(kuò)增外來基因的寡核苷酸對推定的轉(zhuǎn)化株測試該基因的存在。在通過pcr就轉(zhuǎn)基因共插入測試的10個集落中，七個為vp28和dilp陽性，且五個為ibvd基因存在陽性。將這些系命名為indvp28_x、inddilp_x和indibvd_x，并且具有nac2.cyc6pronac2：：5’peta-psbd：：5’psbd-vp28/dilp/ibvd基因型。

對于葉綠體基因組中插入外來基因測試為陽性的集落，也在銅饑餓誘導(dǎo)基因后用抗體使用免疫印跡分析測試蛋白質(zhì)生產(chǎn)。在用該方法測試的22個轉(zhuǎn)基因系中，由于23kd蛋白質(zhì)在來自indvp28的提取物中得到誘導(dǎo)，所以8個中的8個看起來累積vp28蛋白質(zhì)，所述23kd蛋白質(zhì)既不在野生型中、也不再非誘導(dǎo)對照中存在(圖24b-左上)。當(dāng)這些細(xì)胞得到誘導(dǎo)時，從在分析的6個inddilp株中的4個中提取的總蛋白質(zhì)也累積了＞25kd的蛋白質(zhì)(圖24b-下圖)。用這種方法測定到50kd蛋白質(zhì)在7個indibvd株的三個中累積(圖24b-右上)。

圖25基于從inddilp株提取的總蛋白質(zhì)的免疫印跡顯示，dilp_flag的表達(dá)在最初的篩選實驗中得到誘導(dǎo)。在補(bǔ)加50μg/ml壯觀霉素的tap(ui)或tap-cu⁺²(i)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)inddilp株，并且在15％sds-page凝膠上大小分級分離。然后將得到的免疫印跡與識別flag表位的抗體溫育。從表達(dá)flag標(biāo)記的alb3.1蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因株提取的總蛋白質(zhì)用作實驗中檢測flag表位的陽性對照。星號指示插入pcg12_dilp載體的dilp_flag肽的預(yù)測大小。

當(dāng)cyc6轉(zhuǎn)錄相對于誘導(dǎo)受到阻抑時，通過比較從這些株提取的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步表征提取自三個inddilp系的的蛋白質(zhì)，所述系顯示表達(dá)dilp蛋白質(zhì)。在測試的四個inddilp株中，兩個似乎正確誘導(dǎo)作為12kd蛋白質(zhì)的dilp_flag的生產(chǎn)。因此，在此開發(fā)的葉綠體誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)dilp的表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)特別引人注意，因為以前在雷氏衣藻葉綠體中以組成型方式表達(dá)dilp蛋白質(zhì)的嘗試從未導(dǎo)致高水平表達(dá)(stefansurzycki，私人通信)。因此，誘導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)系統(tǒng)可以提供外來蛋白質(zhì)、尤其是那些抵抗組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)型表達(dá)的商業(yè)相關(guān)工具。

實施例6

影響氫產(chǎn)生的基因的表達(dá)

株和培養(yǎng)基

nac2-26突變株以前已有描述(kuchka等人，emboj.7，319-324；nickelsen等人，emboj.13，3182-3191)。cyc6nac2.49株含有由與nac2midi-基因融合的cyc6啟動子組成的轉(zhuǎn)基因，所述nac2midi-基因插入nac2-26突變體的核基因組中(δnac2：：cy6pronac2)。通過用含有peta啟動子和5’utr的675片段取代psbd啟動子和5’utr，由cy6nac2.49衍生ind41(δnac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd)。除了在ind41-18株中aada盒被完全從葉綠體dna切除、且該株因此對壯觀霉素敏感之外，ind41-18與ind41株相關(guān)(δnac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd[spc^s])。ind_aada_117由ind41-18衍生，并且含有受插入到atpb基因下游的psbd啟動子和5’utr驅(qū)動的aada盒(δnac2：：cy6pronac2：：5’peta-psbd：：5’psbd-aada)。所有株均于25℃暗淡光下維持在補(bǔ)加1.5％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的tap(tris-乙酸鹽-磷酸鹽)上。在采用銅補(bǔ)加或銅缺乏(-cu⁺²)固體瓊脂和液體tap和hsm培養(yǎng)基的實驗中，依照quinn和merchant(methodsinenzymol.297，263-279)制備培養(yǎng)基。需要時，給tap和tap-cu⁺²培養(yǎng)基補(bǔ)加100μg/ml壯觀霉素(sigma-aldrich)或20μg/ml巴龍霉素(sigma-aldrich)。在使細(xì)胞除盡氧的實驗中，用n2氣以150rpm/分鐘攪拌和持續(xù)光照(20μe/m^-1s^-2)使液體培養(yǎng)基起泡。使用血細(xì)胞計數(shù)器確定細(xì)胞密度。

質(zhì)粒構(gòu)建

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)操作并分析所有質(zhì)粒構(gòu)建體。使用bigdye終止子測序試劑盒(appliedbiosystems，lajolla，ca)和abiprism377自動測序機(jī)器(abi)執(zhí)行構(gòu)建體的測序。用于在大腸桿菌中克隆的細(xì)菌宿主是dh10b(amershambiosciences)。所有寡核苷酸均訂購自microsynthgmbh(balgach，ch)。

衣藻屬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

基本按照shimogawara等人genetics148，1821-8所述通過電穿孔實施雷氏衣藻株nac2-26的核轉(zhuǎn)化。

葉綠素和氧放出速率測量

使用附著于x型光源的clark型氧電極在25℃確定氧放出和呼吸速率(hansatechinstrumentsltd.，norfolk，uk)。

氫測量和計算

如下實施n2、o2、h2和co2的所有液相和氣相測量。使用可密封的恒溫clarks型容器進(jìn)行溶解氣體的連續(xù)監(jiān)控，其中在連續(xù)攪拌和使用纖維光學(xué)照明裝置(型號kl1500，schott，mainz，德國)持續(xù)照明下，通過聚丙烯膜將其中氣體注入質(zhì)譜分光光度計離子源(型號mm880；vginstruments，cheshine，英國)。在cy6nac2轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄受阻抑的實驗中，將12μm銅加入容器中的生長培養(yǎng)基(tap-cu⁺²至tap)。通過向離子源直接注射空氣和純氫氣樣品，實現(xiàn)所有氣相時間點之前的質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)。

aada活性測定

除了使用³²p標(biāo)記的datp替代在起初實驗中使用的放射標(biāo)記的ratp外，基本按照goldschmidt-clermont，nucleicacidsres19，4083-9中所述，在wt、ind41-18和ind_aada_117株上進(jìn)行aada活性測定。

質(zhì)粒構(gòu)建-prs1_rcy_aada構(gòu)建

使用質(zhì)粒pks-108#14構(gòu)建質(zhì)粒prs1_rcy_aada，pks-108#14質(zhì)粒含有雷氏衣藻葉綠體dnaecorir3片段，其中aada盒插入相對于psbdatg起始密碼子的-263堿基對的位置。為了用peta5’utr取代psbd5’utr，使用重疊序列延伸pcr以寡核苷酸rs1、rs2、rs3和rs4產(chǎn)生943bp的嵌合dna片段，該dna片段包含與psbd編碼序列融合的peta5’utr(表2)。將得到的pcr產(chǎn)物用pvuii/clai限制性內(nèi)切核酸酶消化，并連接到用相同酶消化的質(zhì)粒pks-108#14中，以產(chǎn)生prs1質(zhì)粒。葉綠體誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的設(shè)計涉及要求兩個不同選擇標(biāo)記的兩個連續(xù)的葉綠體轉(zhuǎn)化。可選擇地，可能使用修飾的aada盒循環(huán)利用aada，所述修飾的aada盒側(cè)接483bp的同向重復(fù)，從而允許在去除選擇壓后通過同源重組有效去除該盒。通過首先用clai和sphi切割prs1，然后用t4dna聚合酶填補(bǔ)產(chǎn)生的6.3kb質(zhì)粒的5’和3’末端，實現(xiàn)可循環(huán)利用的aada盒向prs1內(nèi)的克隆。這導(dǎo)致與aada編碼序列融合的atpa啟動子5’utr從prs1質(zhì)粒切除，但是并沒有去除rbcl的3’序列。通過首先用saci和kpni限制性內(nèi)切核酸酶將可循環(huán)利用的aada盒從pks-483-aada-483質(zhì)粒切除，并用t4dna聚合酶和pnk激酶將兩個末端平端化，實現(xiàn)可循環(huán)利用的盒向prs1δaada中的插入。完成2.8kb可循環(huán)利用的aada盒的向prs1δaada中的平端連接，以產(chǎn)生prs1_rcy_aada(圖27)。

pcy6nac2(paror)的構(gòu)建

為了用與nac2編碼序列符合讀框地融合的428bp的cyc6啟動子序列構(gòu)建質(zhì)粒，采用nac2的5.1kb嵌合midi-基因。簡而言之，質(zhì)粒pks(-)nac2(midi)含有3.0kb的5’nac2基因組序列，該序列在nac2編碼序列內(nèi)的sfri限制位點結(jié)束，所述5’nac2基因組序列與1.96kb的sfr1/xhoi片段融合，所述sfr1/xhoi片段含有用3ha、6his和9myc表位進(jìn)行標(biāo)記的3’cdna序列，所述表位正好在終止密碼子的上游與nac2編碼序列符合讀框地引入。為了將nac2基因置于cyc6啟動子控制下，使用對cyc6啟動子元件和nac2基因組dna特異的4種寡核苷酸，通過重疊序列延伸pcr，產(chǎn)生包含與nac2編碼序列融合的cyc6啟動子的嵌合dna片段。產(chǎn)生的pcr片段由與833bp的基因組nac2片段符合讀框地融合的428bp的cyc6啟動子片段組成。然后使用pks(-)nac2(midi)的獨特限制位點xbai和aatii，將pcr片段克隆到pnac2(midi)質(zhì)粒中。最后，使用psl17的獨特位點ecori和xbai，將5.8kb的cyc6nac2轉(zhuǎn)基因克隆到psl17質(zhì)粒中。該質(zhì)粒含有賦予巴龍霉素抗性的aphvii盒。將產(chǎn)生的10.8kb質(zhì)粒pcy6nac2(paror)用于轉(zhuǎn)化nac2-26突變細(xì)胞。

衣藻屬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

在tap培養(yǎng)基中培養(yǎng)nac2-26細(xì)胞，并在對數(shù)中期(2-4x10⁶細(xì)胞/ml)收獲，并用配子自溶素處理，然后重懸在tap+40mm蔗糖培養(yǎng)基中。對于每次電穿孔，將10⁸個經(jīng)過處理的細(xì)胞與2.5線性化pcyc6nac2(paror)或psl17質(zhì)粒dna(以確定電穿孔效率)、加上50μg鮭精dna溫育，然后使用biorad(sic)在0.2ml電穿孔杯(biorad，usa)中通過電穿孔轉(zhuǎn)化，所述biorad(sic)設(shè)定為0.75kv、25μf及無阻抗(biorad，usa)。在1ml新鮮tap、40mm蔗糖、0.4％peg-8000、20％淀粉培養(yǎng)基中將經(jīng)過處理的細(xì)胞回收10分鐘，并鋪平板在補(bǔ)加抗生素巴龍霉素(20μg/ml)的tap培養(yǎng)基上。就在強(qiáng)光下(45μem^-2s^-1)，于25℃在缺乏銅的基本培養(yǎng)基(hsm-cu⁺²)中光-自養(yǎng)生長能力篩選巴龍霉素抗性集落。然后對光-自養(yǎng)株測試在基本培養(yǎng)基(hsm)上生長的能力/無能力。

用氦驅(qū)動基因槍實施衣藻屬的葉綠體生物射彈轉(zhuǎn)化。將10⁸個tap培養(yǎng)的cy6nac2.49鋪平板在補(bǔ)加100μg/ml壯觀霉素的固體瓊脂tap(tap+spc100)上，并用包被1μgprs1_rcy_aada質(zhì)粒dna的鎢粒子轟擊。在暗淡光(5μem^-2s^-1)中2周后，挑取單個集落，并在tap+spec100培養(yǎng)基上再克隆4次，然后在暗淡光(5μem^-2s^-1)中于25℃培養(yǎng)，以確保這些株關(guān)于選擇標(biāo)記是同質(zhì)的。為了測試光-自養(yǎng)生長，將細(xì)胞鋪平板在固體hsm培養(yǎng)基上，并于25℃在中等光(45μem^-2s^-1)中培養(yǎng)。對于轉(zhuǎn)化ind41_18的情況，將10⁸個tap-cu⁺²細(xì)胞鋪平板在補(bǔ)加100μg/ml壯觀霉素的固體tap-cu⁺²培養(yǎng)基(tap-cu⁺²+spc100)上，并用包被1μgpcg12質(zhì)粒dna的鎢粒子轟擊。在暗淡光(5μem^-2s^-1)中兩周后，挑取單個集落，并在tap-cu⁺²+spc100培養(yǎng)基上再鋪平板3次，且在暗淡光(5μem^-2s^-1)中于25℃培養(yǎng)。

生長分析

為了wt、nac2-26、cy6nac2.49株的生長分析，將細(xì)胞在tap-cu⁺²培養(yǎng)基中培養(yǎng)到2-4x10⁶細(xì)胞/ml的密度，然后稀釋到1x10⁶細(xì)胞/ml的密度，隨后為10倍連續(xù)稀釋，從而估計最后的稀釋物在鋪平板時含有100個細(xì)胞。然后在合適的固體瓊脂板上將各個稀釋物的10ul等分試樣點樣，并于25℃在強(qiáng)光下培養(yǎng)10天。對于ind41和ind41-18株的情況，將10³個細(xì)胞鋪平板在合適的培養(yǎng)基上，并于25℃在連續(xù)照明(100μem^-2s^-1)下培養(yǎng)10天。對于誘導(dǎo)型aada轉(zhuǎn)基因系的生長分析實施實驗。簡而言之，在tap-cu⁺²或tap液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)wt、ind41-18和ind_aada轉(zhuǎn)基因系，然后向新鮮tap-cu⁺²或tap液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移3次。將tap和tap-cu⁺²生長培養(yǎng)物的連續(xù)稀釋物鋪平板在補(bǔ)加漸增濃度壯觀霉素(0-1000μg/ml)的tap培養(yǎng)基或tap-cu⁺²固體瓊脂板上，并于25℃在連續(xù)照明(100μem^-1s^-2)下培養(yǎng)10天。

熒光瞬變(fluorescencetransient)

實施熒光瞬變。在暗適應(yīng)5分鐘后，用植物效率分析儀(plantefficiencyanalyzer)(pea，hansatechinstruments，uk)分析黑暗中生長于tap瓊脂上的細(xì)胞。

rna分析

使用rnaplantminirna提取試劑盒，根據(jù)制造商說明書(qiagenghmb，德國)從wt、nac2-26、cy6nac2.49、ind41_18和ind_aada_117株分離總rna。對于在時程實驗期間取得的rna的情況中，將10⁸個細(xì)胞在3000g離心，并根據(jù)制造商說明書使用rnaeasyrna保護(hù)溶液(ambion，usa)處理。

實施rna印跡分析。在1xmops緩沖液中，將rna(2μg)在1.2％瓊脂糖-4％甲醛凝膠中電泳，然后在20xssc緩沖液中轉(zhuǎn)移到hybondn+尼龍膜(amersham，usa)上，并使用stratalinker交聯(lián)烤箱紫外線交聯(lián)到膜上。在改良的church’s雜交溶液(0.5m磷酸鹽緩沖液(ph7.2)、7％sds(w/v)、10mmedta)中于65℃進(jìn)行膜的預(yù)雜交和雜交。通過用acci和styi消化質(zhì)粒pks-108#14分離psbd的380bpdna片段以用作探針，并使用隨機(jī)引發(fā)技術(shù)用[α³²p]datp進(jìn)行標(biāo)記。使用隨機(jī)引發(fā)技術(shù)，用[α³²p]dctp標(biāo)記cyc6cdna的685bpdna片段。通過消化pcg12質(zhì)粒分離aada編碼序列的804ncoi/sphi片段以用作探針，并使用隨機(jī)引發(fā)技術(shù)用[α³²p]datp進(jìn)行標(biāo)記。通過用ecorv和hpaii消化pcg12分離atpb的693bp的片段用作探針，并通過隨機(jī)引發(fā)用[α³²p]datp進(jìn)行標(biāo)記。雜交后，用高嚴(yán)格性洗滌緩沖液[0.1％sds，0.1％ssc]在65℃將膜洗滌10分鐘。

蛋自質(zhì)分析

通過將3x10⁶個細(xì)胞收集在1.5mleppendorf管中，并將沉淀重懸在sigma蛋白酶抑制劑混合物的2x溶液(sigma-aldrech，usa)中，隨后在37℃于等體積細(xì)胞裂解緩沖液(100mmtris-hclph6.8，4％sds)中裂解30分鐘，制備wt、nac2-26、cy6nac2.49、ind41_18和ind_aada_117衣藻屬株總蛋白質(zhì)提取物。將樣品于10,0000g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞碎片，并將上清用作總蛋白質(zhì)提取物。為了確定蛋白質(zhì)濃度，使用bradford方法(bio-rad蛋白質(zhì)測定(bio-radproteinassay)，biorad，usa)測定5ul上清液。

對于免疫印跡分析，在12％sds聚丙烯酰胺凝膠上分離20μg總蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到protran0.45μm硝酸纖維素膜(schleicher和schuell)。當(dāng)采用nac2抗體時，將80μg蛋白質(zhì)上樣于8％聚丙烯酰胺凝膠上。在tris緩沖鹽溶液(含有5％脫脂乳粉和0.1％tween-20)(tbs-t)中將膜封閉。對于第一抗體反應(yīng)，如下在tbs-t中稀釋：d2抗體，1∶10,000稀釋；d1抗體，1∶10,000；nac2抗體，1∶10,000；psaa抗體，1∶10,000；atpb抗體，1∶10,000；核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-全(holo)抗體，1∶50,000。在室溫下實施1小時溫育。隨后，將膜在含有1％脫脂乳粉的tbs-t中洗滌5次，進(jìn)行5分鐘。對于第二抗體反應(yīng)，在室溫下將膜與連接過氧化物酶的抗兔igg(在含有1％脫脂乳的tbs中)溫育1小時，所述igg的最終抗體稀度為1∶10,000。將膜在tbs中洗滌5次，進(jìn)行5分鐘，并通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)信號。

銅介導(dǎo)的阻抑及時程實驗

為了隨時間推移追蹤cy6nac2.49轉(zhuǎn)基因株中銅介導(dǎo)的cy6nac2阻抑，將cy6nac2.49細(xì)胞在tap-cu+2培養(yǎng)基中培養(yǎng)到4x10⁶細(xì)胞/ml的密度，在新鮮tap-cu+2培養(yǎng)基中稀釋到5x10⁵細(xì)胞/ml的密度，然后分為兩個獨立培養(yǎng)物，其中一個保持未處理，而另一個在生長培養(yǎng)基中添加銅至終濃度6μm。然后每8小時從各個培養(yǎng)物取時間點，進(jìn)行40小時。將兩個獨立樣品用于fv/fm測量，并在所示時間點確定各培養(yǎng)物的平均值。

除了在tap培養(yǎng)基中培養(yǎng)cy6nac2.49的預(yù)培養(yǎng)物(pre-culture)，而且在tap-cu⁺²培養(yǎng)基中以5x10⁵細(xì)胞/ml濃度稀釋之前將細(xì)胞在銅耗盡培養(yǎng)基中洗滌兩次之外，如銅介導(dǎo)的阻抑實驗所述進(jìn)行測試cy6nac2.49的銅介導(dǎo)的誘導(dǎo)的實驗。為了開始時程實驗，將細(xì)胞分為兩個單獨的培養(yǎng)物，并且向其中之一中加入銅至終濃度6μm。

氫測量

在硫除盡下將cy6nac2.49株的氫產(chǎn)生與野生型的作比較。在圖32中所用的cy6nac2.49培養(yǎng)物中，一個周期過程中產(chǎn)生了20μmolh2/l，相當(dāng)于1mmolh2mol^-1chls^-1的最大速率。這些速率在實驗之間有變化，并在有些情況下達(dá)到3.1mmolh2mol^-1chls^-1。在允許光合作用的條件下(cu除盡培養(yǎng)基)，cy6nac2.49細(xì)胞中的氧放出凈速率為23mmolo2mol^-1chls^-1。該速率為野生型細(xì)胞的1.5-2倍。因此，氫產(chǎn)生的最大速率在凈氧產(chǎn)生速率的4％到13％之間變化。對于經(jīng)歷硫饑餓100小時的培養(yǎng)物的情況，可以估計平均值為4mmolh2mol^-1chls^-1。如果人們將由cy6nac2.49細(xì)胞在一個周期中產(chǎn)生的20μmolh2/l與硫饑餓野生型培養(yǎng)物在100小時過程中產(chǎn)生的4mmolh2/l比較，顯而易見的是，為了獲得類似的氫產(chǎn)生，cy6nac2.49系統(tǒng)仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)，無論是每循環(huán)更高的效率，還是循環(huán)的緊密束縛(closeenchainment)?；蚋脑煲略鍖僖愿倪M(jìn)氫產(chǎn)生在理論上是可能的，例如通過使用阻斷在狀態(tài)1、不能進(jìn)行循環(huán)電子流的狀態(tài)轉(zhuǎn)移突變體，或通過用cyc6啟動子驅(qū)動calvin-benson酶之一。在該方法中，在psii活性和氫產(chǎn)生相期間電子競爭降低的同時，碳同化也將降低。

表2.寡核苷酸列表

對于衣藻屬，不存在天然的誘導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)是通過利用核編碼的葉綠體nac2蛋白質(zhì)的性質(zhì)而開發(fā)的。該蛋白質(zhì)是psbdmrna加工和穩(wěn)定累積所需的，所述psbdmrna編碼psii的d2反應(yīng)中心多肽。nac2的靶位點包含在74個核苷酸的psbd5’utr中。該5’utr與另一個編碼序列的融合使得該基因的表達(dá)依賴于nac2。nac2編碼序列已與細(xì)胞色素c6基因的cyc6啟動子融合，所述細(xì)胞色素c6基因的表達(dá)由銅耗盡、厭氧生活以及添加鎳而誘導(dǎo)，但是在充分供應(yīng)銅的條件下抑制。因為nac2對psbd5’utr的特異性，原則上，可通過將其編碼序列與psbd5’utr融合，將該系統(tǒng)用于任何葉綠體基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。

如上所述，將cyc6-nac2構(gòu)建體插入含有aphviii基因的質(zhì)粒中，所述aphviii基因賦予巴龍霉素抗性(圖28a)。使用巴龍霉素抗性用于進(jìn)行選擇，將該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化衣藻屬nac2-26突變體。在測試的55個轉(zhuǎn)化體中，兩個顯示銅對nac2表達(dá)的正確控制。上文討論了這些轉(zhuǎn)化體之一cy6nac2.49、wt以及nac2-26突變體的生長特性(圖28b)。如所預(yù)期的，所有這三個株在含有或不含有銅的tap培養(yǎng)基上生長，而且轉(zhuǎn)化體也在巴龍霉素的存在下生長，因為它們含有選擇標(biāo)記aphviii。僅wt細(xì)胞在含有銅的基本培養(yǎng)基上生長。然而，cy6nac2.49株的生長在缺乏銅的基本培養(yǎng)基上恢復(fù)。也可以通過添加鎳而恢復(fù)生長，因為cyc6啟動子由該金屬誘導(dǎo)。在不同生長條件下通過rna印跡雜交確定psbd表達(dá)水平(圖28c)。如所預(yù)期的，psbdrna在nac2-26突變株中不可檢測。與cy6nac2.49株形成對比，psbd的表達(dá)在cyc6表達(dá)之后，并在不存在銅或在厭氧條件下誘導(dǎo)(圖28c)。使用d2抗血清通過免疫印跡檢查psbd產(chǎn)物d2的水平(圖28d)。在所有條件下，d2蛋白質(zhì)在培養(yǎng)在tap板上的nac2-26細(xì)胞中都不可檢測。然而在cy6nac2.49中，當(dāng)細(xì)胞在不存在銅或在厭氧條件下時，它累積到野生型水平的20％(圖26)。在基本培養(yǎng)基上，d2的誘導(dǎo)稍低。如所預(yù)期的，其他psii蛋白質(zhì)例如cp47遵循與d2類似的模式，因為已知這些蛋白質(zhì)在d2蛋白質(zhì)不存在時是不穩(wěn)定的。相反，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶蛋白質(zhì)水平(rbcl)不受nac2-26影響(圖28d)。

為了評定在抑制nac2合成后將細(xì)胞耗盡psii所需的時間，首先將cy6nac2.49細(xì)胞在銅耗盡tap培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在這些條件下，psii合成并累積。將培養(yǎng)物分成兩半，一個培養(yǎng)物維持在銅除盡下，而將銅加入另一個培養(yǎng)物。在各個時間點確定細(xì)胞密度和fv/fm比(可變/最大熒光)的時程，所述時程提供對psii量子產(chǎn)額的估計(圖29a)。在銅的存在下，fv/fm比在32小時內(nèi)降低到最小值。在此時間段期間，在兩種條件下，細(xì)胞都分裂了3-4倍，并達(dá)到穩(wěn)定期。在各個時間制備細(xì)胞提取物用于rna和蛋白質(zhì)分析。cyc6和psbdrna水平在添加銅后8小時顯著降低并從那以后不可檢測(圖29b)。其他葉綠體rna(atpb、rrna)在這些條件下穩(wěn)定。免疫印跡揭示d2量在添加銅后減少，與其mrna的降低相比存在滯后(圖29c)，且另一個psii核心蛋白質(zhì)d1也降低。如所預(yù)期的，也觀察到nac2的降低。相反，來自psi(psaa)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的葉綠體蛋白質(zhì)穩(wěn)定(圖29c)。

在相反實驗中，將在銅存在下培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到缺乏銅的tap培養(yǎng)基，并確定細(xì)胞密度和fv/fm的時程。fv/fm僅在25小時的滯后之后開始增加，推測所述25小時的滯后是耗盡內(nèi)部細(xì)胞銅儲備所需的時間(圖30a)。通過rna印跡分析和蛋白質(zhì)免疫印跡測定不同時間點細(xì)胞提取物的rna和蛋白質(zhì)(圖30b，c)。盡管16小時后可以檢測到cyc6rna，psbdrna累積和psii活性延遲，推測是由于psbdmrna累積和d2合成需要nac2閾水平的事實。

與psii無關(guān)的葉綠體基因的誘導(dǎo)型表達(dá)

盡管nac2系統(tǒng)可用于以可逆方式耗盡psii，但我們測試了是否可以將其擴(kuò)展到任何其他葉綠體基因。這在理論上是可能的，因為nac2蛋白質(zhì)特異性作用于psbd5’utr，并且可以驅(qū)動嵌合psbd5’utr報道基因。因此它應(yīng)該足夠與目的基因的psbd啟動子和5’utr融合。然而，在那些條件下，由于nac2-26突變導(dǎo)致喪失psbdrna，psii不再累積。為了避免這種情況，將peta啟動子和5’utr與psbd編碼序列融合，并將該構(gòu)建體引入p108-14葉綠體轉(zhuǎn)化載體的改良形式中。在該載體中，可循環(huán)利用的aada盒插入到psbd基因上游，所述psbd基因由peta啟動子盒5’utr驅(qū)動(圖27a)。使用aada盒作為選擇標(biāo)記，通過生物射彈轉(zhuǎn)化將該dna插入葉綠體基因組。在該方法中，用peta-psbd構(gòu)建體取代內(nèi)源性psbd基因，且因此其轉(zhuǎn)錄物的累積不再依賴于nac2。將轉(zhuǎn)化體在壯觀霉素板上重復(fù)劃線三次，并通過dna印跡和pcr分析測試同質(zhì)性(homoplasmicity)，且轉(zhuǎn)化體之一ind41得到選擇。所用的aada盒側(cè)接兩個重復(fù)序列。為了允許該盒的切除，將同質(zhì)轉(zhuǎn)化體ind41重復(fù)鋪平板在缺乏壯觀霉素的培養(yǎng)基上。以這種方法獲得對壯觀霉素敏感的ind41_18株，因為它缺乏aada盒。在不同培養(yǎng)基上測試ind41、ind41_18和cy6nac2.49的生長性質(zhì)(圖27b)。ind41在壯觀霉素存在下如期生長，與對抗生素敏感的ind41_18形成對比。此外，ind41和ind41_18都在含有或不含銅的hsm基本培養(yǎng)基上生長。rna印跡分析揭示ind41_18中嵌合peta-psbdrna在所有條件下累積，這不依賴于cyc6rna水平(圖27c)。psbdrna較大，因為peta5’utr的大小超過psbd5’utr的大小。免疫印跡分析揭示d2和d1蛋白質(zhì)在所有測試的條件下都累積到相同水平，尤其當(dāng)nac2不表達(dá)時(圖27d)。

接下來，通過使用cg12載體轉(zhuǎn)化將與psbd啟動子和5’utr融合的aada盒引入該株(圖31a)。在含有漸增量的壯觀霉素、含有或不含銅的tap板上測試轉(zhuǎn)化體ind_aada-117和ind41_18的生長(圖31b)。所有株在銅不存在(圖31b)或存在下生長。如所預(yù)期的，ind_aada-117僅在不存在銅時在250μg/ml或更高濃度的壯觀霉素板上生長。在含有100μg/ml壯觀霉素的板上，也在銅存在時觀察到微弱生長。rna印跡分析揭示aadarna僅在cyc6啟動子的誘導(dǎo)條件下累積(圖31c)。d2、d1、cp47和rbcl的蛋白質(zhì)水平很大程度上不受影響，但是僅在誘導(dǎo)條件下檢測到nac2(圖31d)。因為缺乏可靠的aada抗體，所以通過測量氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶活性測定該蛋白質(zhì)的量。在nac2表達(dá)的條件下，該活性顯著升高(表3)。

表3.誘導(dǎo)和阻抑條件下ind41_aada-117中的氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶活性。

如上所述，對wt-aada、ind41_18和ind41_aada-117株提取物測定aada活性和總蛋白質(zhì)含量。將活性表示為與每μg蛋白質(zhì)摻合的cpm。獨立測量數(shù)顯示于括號中。

誘導(dǎo)型葉綠體基因表達(dá)系統(tǒng)可用于觸發(fā)氫產(chǎn)生。

衣藻屬能夠在厭氧條件下在光中誘導(dǎo)氫化酶并產(chǎn)氫。因此，對于誘導(dǎo)型nac2系統(tǒng)是否可用于關(guān)閉psii活性和o2放出進(jìn)行了測試，由此呼吸作用將導(dǎo)致適于誘導(dǎo)氫產(chǎn)生的厭氧條件。在缺乏銅的tap培養(yǎng)基上培養(yǎng)cy6nac2.49細(xì)胞至2x10⁶細(xì)胞/ml的濃度。加入銅并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到與質(zhì)譜儀連接并以白光照明(250μem^-2s^-1)的室內(nèi)。在該系統(tǒng)中，室底部用聚丙烯膜密封，該膜允許溶解的氣體直接擴(kuò)散到質(zhì)譜儀的離子源。在該方法中，可以在不連續(xù)的時間間隔測量o2和h2的豐度。因為該室是封閉的，而且因為銅阻抑psii合成，所以o2放出減少。在200分鐘時間段內(nèi)，o2被呼吸作用消耗。達(dá)到了導(dǎo)致活性氫化酶合成和h2產(chǎn)生的厭氧狀態(tài)(圖32a)。氫產(chǎn)生的最大速率在1到3.1mmolh2mol^-1chlsec^-1范圍內(nèi)變化，比在硫饑餓細(xì)胞中獲得的略低，并且持續(xù)時間短得多(約1.5小時對3-4天)。

cyc6啟動子的有趣的特點是，即使存在銅時，它也在厭氧條件下得到誘導(dǎo)。因此預(yù)期一旦已達(dá)到厭氧條件而cy6nac2.49細(xì)胞中的氫化酶得到誘導(dǎo)，nac2合成就重新開始，psii得到合成，且氧水平升高，由此滅活氫化酶并阻斷氫產(chǎn)生。這些觀察到了。在厭氧氫產(chǎn)生階段，伴隨o2放出及氫化酶失活的psii合成開啟，從而氫水平保持恒定(圖32a)。作為對照，不添加銅檢查相同的細(xì)胞培養(yǎng)物。在這些條件下，沒有像在銅處理細(xì)胞中觀察到的那樣伴隨o2的恒定產(chǎn)生和co2的逐漸降低而產(chǎn)生氫(圖32b)。因為預(yù)期cyc6啟動子在充分供應(yīng)銅的培養(yǎng)基中在需氧條件下被關(guān)閉，所以將預(yù)期新的氫產(chǎn)生循環(huán)。為了測試該可能性，在密封容器中將進(jìn)一步的cy6nac2.49細(xì)胞在缺乏銅的tap培養(yǎng)基中培養(yǎng)50小時，并用質(zhì)譜分析法實施氫和氧的測量。該結(jié)果提示發(fā)生了氫和氧產(chǎn)生的兩個連續(xù)階段。

盡管已參照某些優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，在在本發(fā)明范圍和精神內(nèi)存在變化和修改，如下列權(quán)利要求中所述并定義。