用于在預(yù)選位點修飾植物基因組的方法和手段發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及農(nóng)藝學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了使用胚性愈傷組織在棉花植物的基因組中精確定位的核苷酸序列上引入靶向修飾的方法和手段，該靶向修飾包括插入、缺失或取代。

背景技術(shù)：
在植物基因組中引入靶向修飾的需求（包括控制在植物中外源DNA整合的定位）已變得日益重要，并且為了滿足這一需求，已經(jīng)開發(fā)了若干方法（綜述參見Kumar（庫馬爾）和Fladung（弗拉東），2001,TrendsinPlantScience（《植物科學(xué)趨勢》），6,pp155-159）。這些方法大部分依賴于經(jīng)由雙鏈斷裂誘導(dǎo)（DSBI）酶的表達，在靶向位置初始引入的雙鏈DNA斷裂。經(jīng)由罕見切割內(nèi)切核酸酶（例如I-SceI），通過誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂（DSB），激活靶基因座和/或修復(fù)或供體DNA，已經(jīng)示出出增加若干數(shù)量級的同源重組的頻率（Puchta（普赫塔）等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（美國國家科學(xué)院院刊）），93,pp5055-5060;Chilton（奇爾頓）和Que（秋），PlantPhysiol.（《植物生理學(xué)》），2003;D’Halluin（阿呂安）等人，2008PlantBiotechnol.J.（《植物生物技術(shù)雜志》）6,93-102）。WO96/14408描述了一種編碼酶I-SceI的分離DNA。這種DNA序列可以并入克隆和表達載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因動物中。在基因作圖和基因的定點插入中這些載體可以是有用的。WO00/46386描述了通過I-SceI誘導(dǎo)的雙鏈斷裂，在細(xì)胞中修飾、修復(fù)、減弱和滅活一個基因或其他染色體DNA的方法。還披露了在需要其的個體中治療或預(yù)防遺傳性疾病的方法。進一步披露了嵌合的限制性內(nèi)切酶。WO2005/049842描述了使用罕見分裂“雙鏈斷裂”誘導(dǎo)（DSBI）酶連同改進的I-SceI編碼核苷酸序列改進植物中靶向DNA插入的方法和手段。WO2006/105946描述了用于通過同源重組在植物細(xì)胞和植物中將靶DNA序列精確交換為感興趣的DNA序列的方法，由此可以隨后去除在用于基因取代事件的臨時選擇的同源重組階段期間使用的可選擇的或可篩選的標(biāo)記，而在去除步驟期間不遺留痕跡并且不依靠體外培養(yǎng)，采用其中描述的方法用于通過小孢子特異性表達的DSBI罕見分裂內(nèi)切核酸酶去除選擇的DNA。WO2008/037436描述了WO2006/105946方法和手段的變體，其中通過雙鏈斷裂誘導(dǎo)罕見分裂內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)的選擇的DNA片段的去除步驟處于種系特異啟動子的控制下。該方法的其他實施例依賴在修復(fù)DNA的一端的非同源末端-連接和在另一端的同源重組。WO08/148559描述了WO2008/037436方法的變體，即在真核細(xì)胞中（例如植物細(xì)胞）中通過同源重組用于將靶DNA序列精確交換為感興趣的DNA序列的方法，由此可以隨后去除在用于基因取代事件的臨時選擇的同源重組階段期間使用的可選擇的或可篩選的標(biāo)記，而不遺留痕跡,采用用于去除在直接重復(fù)中側(cè)翼是兩個核苷酸序列的選擇的DNA的方法。WO2003/004659披露了重組系統(tǒng)以及用于從真核生物染色體DNA去除核酸序列的方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因生物（優(yōu)選地植物），包含所述系統(tǒng)或由所述方法產(chǎn)生。WO2006/032426披露了改進的重組系統(tǒng)以及用于從植物基因組中消除標(biāo)記序列的方法。具體地，本發(fā)明基于一種表達盒的用途，該表達盒包括歐芹泛素啟動子，以及可操作地連接到其上的編碼特異DNA-核酸內(nèi)切酶序列的核酸序列。WO2009/006297披露了用于改變單子葉植物細(xì)胞和單子葉植物的基因組的方法和組合物，涉及使用雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑以改變單子葉植物或植物細(xì)胞基因組序列，該序列包括用于雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑的識別序列。WO2004/006667描述了經(jīng)由體細(xì)胞胚發(fā)生的棉花的再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的改進方法。WO2005/103271描述了經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA接合至懸浮液-培養(yǎng)的細(xì)胞或愈傷組織用于高效植物轉(zhuǎn)化的方法，采用過濾器的膜作為用于T-DNA供體和受體的共培養(yǎng)的多孔固體支持物。WO2008/112633涉及外植體材料的切除，該外植體材料包括來自棉花種子的分生組織。披露了用于轉(zhuǎn)化植物的組織制備、儲存、轉(zhuǎn)化和選擇或鑒別的方法，以及由此種方法產(chǎn)生的可轉(zhuǎn)化的分生組織和植物、以及用于組織制備的設(shè)備（apparati）。使用DSBI酶的基因組工程方法已經(jīng)在植物，像煙草（參見例如Puchta（普赫塔）等人），1996;Townsend（湯森）等人，Nature（《自然》）459:442-445,2009）和玉米（參見例如WO2009/006297，Shukla（舒克拉）等人，Nature（《自然》）459:437-441,2009）中施用。然而，仍然存在對開發(fā)用于植物的靶向基因組修飾的方法的需求，這些植物在組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化中更頑固，例如棉花。本發(fā)明通過提供這種方法提供了一種本領(lǐng)域內(nèi)的貢獻，該方法使用棉花胚性愈傷組織用于單獨或與一種修復(fù)DNA組合引入內(nèi)切核酸酶，這一修復(fù)DNA將用作用于雙鏈DNA斷裂修復(fù)的模板。發(fā)明概述在第一實施例中，本發(fā)明提供了一種用于在預(yù)定義位點修飾棉花植物細(xì)胞基因組的方法，該方法包括以下步驟a.在所述預(yù)定義位點或其附近誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂是通過向所述細(xì)胞引入罕見分裂內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)，該酶在所述預(yù)定義位點或其附近識別一個識別序列；b.選擇一種植物細(xì)胞，其中所述雙鏈DNA斷裂已經(jīng)被修復(fù)，導(dǎo)致了在基因組中所述預(yù)選位點的修飾，其中所述修飾選自i.至少一個核苷酸的取代；ii.至少一個核苷酸的缺失；iii.至少一個核苷酸的插入；或者iv.i.-iii.的任何組合；其特征在于所述細(xì)胞包括在胚性愈傷組織中在一個實施例中，可以通過將編碼所述內(nèi)切核酸酶的DNA分子遞送至所述細(xì)胞中，將該內(nèi)切核酸酶引入所述細(xì)胞。在另一個實施例中，先于步驟b.，將一種外源修復(fù)DNA分子遞送至所述細(xì)胞中，所述外源修復(fù)DNA分子被用作用于修復(fù)所述雙鏈DNA斷裂的模板。在一個特定實施例中，該胚性愈傷組織誘導(dǎo)自下胚軸的外植體。胚性愈傷組織可以在包括活性炭的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)。在所述內(nèi)切核酸酶的所述引入之前、之中和之后，可以在沒有激素的培養(yǎng)基中孵育胚性愈傷組織。在所述內(nèi)切核酸酶的所述引入之前和之后，還可以在固體培養(yǎng)基上孵育愈傷組織。另外，在內(nèi)切核酸酶的所述引入之中或之后，可以在非選擇性培養(yǎng)基上孵育胚性愈傷組織1至4天。在一個實施例中，通過粒子轟擊將內(nèi)切核酸酶編碼DNA和/或外源修復(fù)DNA遞送至胚性愈傷組織的細(xì)胞中。可以用約0.5pmol外源修復(fù)DNA和/或約0.5pmol內(nèi)切核酸酶編碼DNA實施轟擊。在轟擊之前胚性愈傷組織可以在包括0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培養(yǎng)基中孵育約2至約20小時。另外，在所述內(nèi)切核酸酶的所述引入之中或之后，可以在非選擇性培養(yǎng)基（包括0.2M甘露醇）上孵育胚性愈傷組織1至4天。在一個實施例中，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將內(nèi)切核酸酶編碼DNA和/或外源修復(fù)DNA遞送至胚性愈傷組織的細(xì)胞中。可以通過將愈傷組織與一種或多種土壤農(nóng)桿菌屬菌株（包括這一種或多種DNA分子）在包括100μM乙酰丁香酮和/或100mg/lL-半胱氨酸的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)來實施農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化后，愈傷組織可以在包括250mg/L或125mg/Ltriacillin的培養(yǎng)基上進行孵育。在一個具體實施例中，外源修復(fù)DNA包括至少一個側(cè)翼核苷酸序列，該側(cè)翼核苷酸序列與所述預(yù)定義位點的上游或下游DNA區(qū)域具有充分同源性，以允許與所述上游或下游DNA區(qū)域重組。該外源修復(fù)DNA可以包括兩個位于所述外源DNA相反端的側(cè)翼核苷酸序列，一個所述側(cè)翼核苷酸序列與所述預(yù)定義位點的上游DNA區(qū)域具有充分同源性，另一個側(cè)翼核苷酸序列與所述預(yù)定義位點的下游序列具有充分同源性，以允許所述側(cè)翼核苷酸序列與所述上游和下游DNA區(qū)域之間的重組。外源修復(fù)DNA還可以包括一個可選擇性標(biāo)記基因和/或一個感興趣的植物可表達基因。感興趣的植物可表達基因可以選自下組：除草劑耐受性基因，昆蟲抗性基因，疾病抗性基因，非生物逆境抗性基因，涉及油類生物合成、糖類生物合成的酶，涉及纖維強度或纖維長度的酶，涉及次生代謝生物合成的酶。在另一個實施例中，外源DNA由兩個側(cè)翼核苷酸序列組成，一個所述側(cè)翼核苷酸序列與所述預(yù)定義位點的上游DNA區(qū)域具有充分同源性，另一個側(cè)翼核苷酸序列與所述預(yù)定義位點的下游序列具有充分同源性，以允許所述側(cè)翼核苷酸序列與所述上游和下游DNA區(qū)域之間的重組。仍在另一個實施例中，預(yù)選位點側(cè)翼是兩個具有充分同源性的區(qū)域，用于彼此重組。本發(fā)明進一步提供了用于在預(yù)定義位點修飾棉花植物細(xì)胞基因組的方法，該方法使用如以上描述的胚性愈傷組織，其中所述棉花植物細(xì)胞進一步再生成棉花植物。由此生成的棉花植物可以進一步與另一植物進行雜交。還提供了一種棉花植物細(xì)胞，該細(xì)胞包括在該基因組預(yù)定義位點的一個修飾，通過如以上描述的任何方法獲得，連同提供了一種棉花植物或那個植物的纖維或種子或繁殖材料，包括在該基因組的預(yù)定義位點的一個修飾。本發(fā)明進一步涉及生長如以上描述的棉花植物的方法，進一步包括向所述植物或基質(zhì)施用一種化學(xué)品的步驟，其中所述植物是長成的，連同涉及一種用于生產(chǎn)包括在該基因組的預(yù)定義位點的修飾的植物的方法，包括將一種基本上由如以上描述的植物細(xì)胞組成的植物或如以上描述的植物與另一植物或與它自己雜交，以及可任選地收獲的種子的步驟。附圖說明圖1：通過至少一側(cè)的同源重組的靶向插入/取代的示意圖。剪刀表明對于DSBI酶（I-SceI）的識別位點，模塊箭頭代表啟動子，箭頭P3和P4代表引物，交叉和點交叉代表靶構(gòu)建體pTCV117和修復(fù)DNApTIB323之間的潛在同源重組。潮霉素抗性（hygR）和草甘膦敏感性（glyphS）選擇后，可以發(fā)生兩個事件組；（II）（II），賦予潮霉素抗性的修復(fù)DNA在隨機位點被整合進入基因組中并且將位于靶基因座的EPSPS基因通過在第一（左邊）I-SceI位點的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)從35S啟動子的雙向控制移除，在這種情況下，用引物P3xP4的PCR擴增并不生成PCR產(chǎn)物，亦或（I），將位于靶基因座的EPSPS基因通過與修復(fù)DNA的3’EPSPS片段的同源重組截短，由此潮霉素抗性基因并入在靶基因座，并且由此在另一端不同情況可能取決于使用的I-SceI位點（條紋圖所指明），在這種情況下，允許引物P3和P4之間的區(qū)域擴增。圖2：通過非同源末端連接的靶向插入/取代的示意圖。潮霉素抗性的選擇可以導(dǎo)致修復(fù)DNApTIB236隨機整合進入該基因組，由此用引物P3XP4和P1xP2的PCR擴增并不生成PCR產(chǎn)物，亦或?qū)е拢↖-III），取決于所使用的I-SceI位點，在DSBI位點的修復(fù)DNA的插入（I和III）或者由修復(fù)DNA引起的BAR基因的取代，(II)，導(dǎo)致了用不同長度的引物P3xP4和P1xP2的PCR產(chǎn)物。本發(fā)明不同實施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在棉花中經(jīng)由雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)，靶向基因組修飾可以通過使用胚性愈傷組織有效地實施，用于引入雙鏈斷裂誘導(dǎo)（DSBI）酶，例如通過引入一種編碼這種酶的DNA分子和酶，并且可任選地一種作為用于雙鏈DNA斷裂修復(fù)的模板發(fā)揮功能的DNA分子，例如經(jīng)由直接DNA轉(zhuǎn)移方法（粒子轟擊）或經(jīng)由土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA遞送。使用這些遞送程序進入胚性愈傷組織，靶向插入、取代和缺失可以在棉花植物的核基因組中，在雙鏈斷裂誘導(dǎo)的位點附近實施。如在此使用，罕見分裂內(nèi)切核酸酶是能夠在具體核苷酸序列（稱為“識別位點”或“識別序列”）誘導(dǎo)DNA斷裂的酶，即它們是位點特異性內(nèi)切核酸酶。它們是“罕見分裂”的，在某種意義上是由于它們的特異性、通常長的識別位點（約12-40nt），它們具有非常低頻率的分裂，即使在更大的植物基因組中，例如它們在靶基因組中切割低于20x、低于10x、低于5x或僅一次。罕見分裂雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)（DSBI）酶是罕見分裂內(nèi)切核酸酶，該酶在它們的識別位點誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂（DSB）。尋靶內(nèi)切核酸酶，有時也稱為大范圍核酸酶，構(gòu)成了此類罕見分裂內(nèi)切核酸酶家族。它們可以由內(nèi)含子、獨立基因或插入序列編碼，并且呈現(xiàn)了將它們和更經(jīng)典的限制性內(nèi)切酶（通常來自細(xì)菌限制修飾II型系統(tǒng)）區(qū)分的顯著結(jié)構(gòu)和功能特性。它們的識別位點具有與大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識別位點的特征性二重對稱形成對比的一般不對稱性（generalasymmetry）。若干由內(nèi)含子或內(nèi)含肽編碼的尋靶內(nèi)切核酸酶已經(jīng)示出促進它們對應(yīng)的遺傳元件尋靶進入等位基因的無內(nèi)含子的或無內(nèi)含肽位點。通過在無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽等位基因中制造一種位點特異性雙鏈斷裂，這些核酸酶產(chǎn)生了引起重組的末端，這些末端參與基因轉(zhuǎn)換過程，該過程復(fù)制了編碼序列并且導(dǎo)致了內(nèi)含子或插入序列在DNA水平的插入。一種良好表征的標(biāo)記的尋靶內(nèi)切核酸酶是I-SceI。I-SceI是一種位點特異性內(nèi)切核酸酶，是造成釀酒酵母中位于線粒體中內(nèi)含子移動的原因。該酶是由21SrRNA基因可任選的內(nèi)含子ScLSU.1編碼的并且在產(chǎn)生具有3’OH突出端的4bp交錯切口的內(nèi)含子插入位點引發(fā)雙鏈DNA斷裂。I-SceI內(nèi)切核酸酶的識別位點擴大到18bp的非對稱序列（Colleaux（科萊阿克斯）等人1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美國國家科學(xué)院院刊》85:6022-6026）。I-SceI的氨基酸序列以及線粒體I-SceI基因的通用密碼等效物已經(jīng)由例如WO96/14408提供。WO96/14408進一步披露了多個I-SceI蛋白突變體，這些突變體仍然是功能性的。PCT申請PCT/EP04/013122（通過引用結(jié)合在此）提供了I-SceI的合成核苷酸序列突變體，這些突變體在植物中已經(jīng)被優(yōu)化表達。此類合成I-SceI編碼區(qū)域的核苷酸序列列舉在UIPAC密碼中，在SEQIDNo1中。UIPAC密碼的符號具有它們的通用含義，例如N=A或C或G或T；R=A或G；Y=C或T；B=C或G或T（不是A）；V=A或C或G（不是T）；D=A或G或T（不是C）；H=A或C或T（不是G）；K=G或T；M=A或C；S=G或C；W=A或T。其他罕見分裂DSBI酶以及它們對應(yīng)的識別位點的列表提供在WO03/004659（17頁至20頁）的表I中（通過引用結(jié)合在此）。這些包括I-SceI、I-ChuI、I-DmoI、I-CreI、I-CsmI、PI-FliI、Pt-MtuI、I-CeuI、I-SceII、I-SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI-MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI-TagI、PI-ThyI、PI-TkoI或PI-TspI。此外，對設(shè)計定制的罕見分裂內(nèi)切核酸酶（基本上識別任何選擇的核苷酸序列），方法是可用的。簡言之，可以使用雜合體制備嵌合限制性內(nèi)切酶，該雜合體是設(shè)計用于識別特異核苷酸序列的鋅指結(jié)構(gòu)域和來自天然限制性內(nèi)切酶（例如FokI）的非特異性DNA-切割結(jié)構(gòu)域之間的雜合體。此類酶通常是指鋅指內(nèi)切核酸酶（ZFE）。此類方法已經(jīng)描述于例如WO03/080809、WO94/18313或WO95/09233中并且描述在Isalan（艾莎蘭）等人，2001,NatureBiotechnology（《自然生物技術(shù)》）19,656-660;Liu（劉）等人，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美國國家科學(xué)院院刊》）94,5525-5530中。通過從突變體文庫中進行選擇來生產(chǎn)定制罕見分裂內(nèi)切核酸酶或大范圍核酸酶的另一種方式描述于WO2004/067736中。具有改變的序列特異性和DNA結(jié)合親和性的定制大范圍核酸酶也可以通過如描述于WO2007/047859中的合理設(shè)計來獲得。定制設(shè)計罕見分裂內(nèi)切核酸酶的另一個實例包括所謂的TALE核酸酶，該酶基于來自融合至例如FOKI的催化結(jié)構(gòu)域的細(xì)菌屬黃單胞菌屬的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）。這些TALE的DNA結(jié)合特異性是由串聯(lián)排列的34/35-氨基酸重復(fù)單元的重復(fù)可變雙殘基（RVD）限定的，這些氨基酸重復(fù)單元可以被修飾以識別特異靶序列（Christian（克里斯蒂安）等人，2010,Genetics（《遺傳學(xué)》）186:757–761、WO11/072246、WO10/079430和WO11/146121）。此類定制設(shè)計的罕見分裂內(nèi)切核酸酶還可以稱為非天然發(fā)生的內(nèi)切核酸酶。由于該重新設(shè)計的大范圍核酸酶衍生自天然發(fā)生的內(nèi)切核酸酶，所以可用的潛在識別位點不是完全隨機的，而是似乎與最初由天然發(fā)生的內(nèi)切核酸酶（重新設(shè)計的大范圍核酸酶基于該天然發(fā)生的內(nèi)切核酸酶）識別的核苷酸序列具有一些程度的相似性。如Gao（高）等人（2010,ThePlantJournal（《植物雜志》），pp1-11）所闡述的，用來修飾I-CreI的DNA-結(jié)合特征的基于結(jié)構(gòu)的蛋白設(shè)計方法是基于I-CreI-DNA共晶體結(jié)構(gòu)的視覺檢查，該共晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了大量氨基酸取代的預(yù)測，這些氨基酸取代在它的識別位點中的具體位置改變了I-CreI堿基偏好性。單個氨基酸取代在實驗上進行評估，并且在堿基偏好中賦予所希望變化的那些取代添加至可以被“混合和匹配”的突變數(shù)據(jù)庫中，以產(chǎn)生識別高度多樣化DNA位點的I-CreI衍生物。理論上，使用現(xiàn)有的突變數(shù)據(jù)庫可獲得的組合多樣性足以在隨機DNA序列中約每1000bp靶向工程化的內(nèi)切核酸酶。重新設(shè)計的大范圍核酸酶可以基于用作支架的天然發(fā)生的大范圍核酸酶I-CreI。I-CreI是一種在Chlamydomonasrheinhardti的葉綠體中發(fā)現(xiàn)的尋靶內(nèi)切核酸酶（Thompson（湯普森）等人1992，Gene（《基因》）119，247-251。此內(nèi)切核酸酶是一種在23SrRNA基因中識別假回文序列22bpDNA位點的二聚體，并且產(chǎn)生了一種用于內(nèi)含子引入的雙鏈DNA斷裂。I-CreI是攜帶單一LAGLIDADG基序的內(nèi)切核酸酶組的成員。LAGLIDADG酶包含一個或兩個該共有基序的拷貝。單一基序酶，例如I-CreI，作為二聚體發(fā)揮功能，然而雙基序酶是具有兩個分離結(jié)構(gòu)域的單體。因此，當(dāng)衍生自I-CreI支架的重新設(shè)計的大范圍核酸酶用來識別一種22bp的感興趣的核苷酸序列時，設(shè)計了兩個單體單元，每個識別該22bp識別位點的一部分，這兩個單體單元需要一致行動以在該22bp識別位點誘導(dǎo)雙鏈斷裂（WO2007/047859）。可以通過將兩個單體單元連接進入一個單鏈大范圍核酸酶來達到一致行動，或者也可以通過促進二聚體的形成來達到，例如，如描述于WO2007/047859中。此類特別設(shè)計的大范圍核酸酶的實例描述于例如EP10005926.0和EP10005941.9中（未公開）。因此，對于此類二聚內(nèi)切核酸酶的一致行動，需要亞基二聚化以能夠在基因組中的預(yù)選位點誘導(dǎo)雙鏈斷裂。增強的一致行動也可以通過將這兩個單體單元連接進入一個單鏈大范圍核酸酶來達到，或者也可以通過促進異二聚體的形成來達到，例如，如在WO2007/047859中描述。用于將DNA遞送至細(xì)胞/組織中的不同方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括：如美國專利號5,384,253中所說明的電穿孔；如美國專利號5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中所說明的微粒轟擊（基因槍）；如美國專利號5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301中所說明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；如美國專利號5,508,184中所說明的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔、化學(xué)輔助轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（參見，例如，A.Deshayes（德莎耶絲）等人，（1985）EMBOJ.4:2731-7），碳纖維、碳化硅纖維或硼酸鋁纖維（通常稱為晶須）（參見，例如，J.Brisibe（布里斯比）,Exp.Bot.（《實驗植物學(xué)》）51(343):187-196（2000）；Dunwell（唐威爾）（1999）MethodsMol.Biol.（《分子生物學(xué)方法》）111:375-82；和美國專利號5,464,765），微量注射（參見，例如，TJ.Reich（賴希）等人，（1986）Biotechnology（《生物技術(shù)》）4:1001-1004）和病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（參見，例如，S.B.Gelvin（格爾文），（2005）NatBiotechnol.（《自然生物技術(shù)》）23:684-5），用異源外源DNA粘附粒子的植物細(xì)胞轟擊，彈道質(zhì)點加速度，氣溶膠束轉(zhuǎn)化（美國專利申請?zhí)?0010026941；美國專利號4,945,050；國際公開號WO91/00915；美國專利申請?zhí)?002015066，WO01/038514；全部通過引用結(jié)合在此），Lec1轉(zhuǎn)化、PEG轉(zhuǎn)化、和用來轉(zhuǎn)移DNA的不同其他非粒子直接介導(dǎo)方法。根據(jù)本發(fā)明所述的用于靶基因組修飾的棉花細(xì)胞的靶向基因組修飾在胚性愈傷組織，優(yōu)選脆弱愈傷組織上實施。術(shù)語“愈傷組織”或“胚性愈傷組織”是指作為植物組織培養(yǎng)的結(jié)果，主要是產(chǎn)生的胚性細(xì)胞和細(xì)胞群的無組織團塊。脆弱愈傷組織是指具有脆弱質(zhì)地的愈傷組織，它具有形成嫩枝和根并最終再生成完整植物的潛力。此類愈傷組織可以進一步區(qū)別在于鸚鵡綠/乳脂色、液體培養(yǎng)基中容易分散的細(xì)胞團、以及一種結(jié)節(jié)狀形狀。因此，如在此使用，“包括在胚性愈傷組織中的植物細(xì)胞”是指作為愈傷組織細(xì)胞本身的細(xì)胞，即作為愈傷組織的一部分的細(xì)胞。愈傷組織可以是再生自/誘導(dǎo)自不同組織的外植體，例如下胚軸、子葉、不成熟的合子胚，葉、花藥、花瓣、胚珠、根、和分生組織、莖細(xì)胞和葉柄。在本發(fā)明的一個實施例中，外植體取自下胚軸或子葉。在一個實施例中，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)通過將外植體在包括活性炭的培養(yǎng)基中孵育2至4個月，優(yōu)選4個月，或者至少直至已經(jīng)在暗光條件下形成胚性愈傷組織來實施。在一個實施例中，在愈傷組織再生、DNA轉(zhuǎn)移和隨后的選擇和再生的整個過程期間，靠不存在激素的培養(yǎng)基供養(yǎng)愈傷組織。如在此使用，激素是指植物激素，例如植物生長激素（例如2.4-D）和細(xì)胞分裂素（例如Kin）。在一個實施例中，在整個過程期間靠固體培養(yǎng)基供養(yǎng)細(xì)胞。在另一個實施例中，DNA遞送后，靠非選擇性培養(yǎng)基（例如不包含選擇性化合物的培養(yǎng)基）供養(yǎng)愈傷組織1-4天，優(yōu)選3天。該非選擇性培養(yǎng)基可以包括M100基質(zhì)組分。在非選擇性培養(yǎng)基上1-4天后，愈傷組織可以轉(zhuǎn)移至可以包括M100基質(zhì)組分和選擇性化合物的培養(yǎng)基上。如果將包括賦予對選擇性化合物耐受性的可選擇性標(biāo)記基因的修復(fù)DNA共遞送，那么轉(zhuǎn)化后使用選擇性化合物允許靶向重組事件的富集。胚性愈傷組織進行選擇后，胚誘導(dǎo)和胚生芽可以發(fā)生在可以包括M104基質(zhì)組分和活性炭的選擇性培養(yǎng)基上。進一步胚發(fā)育可以發(fā)生在可以包括M702基質(zhì)組分的非選擇性基質(zhì)上并且植物再生可以發(fā)生在包括M700基質(zhì)組分的培養(yǎng)基上。不同基質(zhì)組分在以下描述。如在此使用，DNA遞送是指將一個或多個DNA分子引入細(xì)胞中。這涉及兩個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，其中引入的DNA分子穩(wěn)定地整合進入宿主細(xì)胞的基因組，連同細(xì)胞中那一種或多種分子的瞬時存在。將清楚的是，為了實施本發(fā)明的方法，并不要求細(xì)胞變?yōu)橛镁幋a內(nèi)切核酸酶的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，而是內(nèi)切核酸酶的瞬時表達可能已經(jīng)足以誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。用于將DNA遞送至細(xì)胞/組織中的不同方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括：如美國專利號5,384,253中所說明的電穿孔；如美國專利號5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中所說明的微粒轟擊（基因槍）；如美國專利號5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301中所說明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；如美國專利號5,508,184中所說明的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電穿孔、化學(xué)輔助轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（參見，例如，A.Deshayes（德莎耶絲...