具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物，當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和所述基因組加倍的高粱植物同基因的二倍體高粱植物可育性相同。也提供產(chǎn)生和使用其的方法以及由其產(chǎn)生的產(chǎn)品。NCIMB420522012.09.14
【專利說(shuō)明】具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物及其應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明在它的某些實(shí)施方式中，涉及具有部分加倍（倍增，multiplied)或完全加 倍的基因組的栽培高粱植物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 高粱是眾多禾本種物種的屬。該植物栽培在世界各地較暖的氣候中。這些物種原 產(chǎn)于除了西南太平洋和澳大利亞之外的所有大陸的熱帶和亞熱帶地區(qū)。高粱處于黍亞科 (Panicoideae)及蜀黍族（tribe Andropogoneae)(大須芒草和甘鹿的族）。
[0003] 一個(gè)物種，雙色高梁（Sorghum bicolor) [Mutegi ET AL. 2010〃Ecogeographical distribution of wild, weedy and cultivated Sorghum bicolor (L. )Moench in Kenya:implications for conservation and crop-t0-wild gene flow".Genetic Resources and Crop Evolution57(2) :243 - 253]是重要的世界性農(nóng)作物，用于食物（作 為谷物和用于高粱糖漿或"高粱飴"）、飼料、生產(chǎn)酒精飲料，以及生物燃料。大部分種類耐 旱并耐熱，且是干旱區(qū)域特別重要的，在那些地方，谷物是貧窮者和鄉(xiāng)村人的主食或主食之 一。在很多熱帶地區(qū)，它們組成牧草的重要成分。高粱是美國(guó)種植的第二最重要的谷類-飼 料谷物。由于高粱耐旱和耐熱的能力，對(duì)在邊緣降雨區(qū)域（marginal rainfall areas)運(yùn) 轉(zhuǎn)的農(nóng)場(chǎng)來(lái)說(shuō)是經(jīng)濟(jì)上重要的。畜牧業(yè)和生物能源工業(yè)利用高粱作為能量基質(zhì)從而使得它 成為全能型農(nóng)作物。
[0004] 在世界各地，高粱是第五主要的谷類糧食。因?yàn)樗秃挡⒛蜔?，因此它無(wú)疑地是撒 哈拉以南非洲（sub-Sahelian Africa)的半干旱地區(qū)和印度的干旱中部半島地區(qū)最廣泛地 種植的糧食。同樣地，高粱用于世界的最干燥地區(qū)的人類消耗，從而使得它成為這些地點(diǎn)的 關(guān)鍵性的重要糧食作物。
[0005] 高粱是用于燃料乙醇生產(chǎn)的玉米的極好的替換物，因?yàn)樗阋饲野瑤缀跻粯?的淀粉量?？梢栽谄渲胁荒茉苑N玉米的較干燥和較苛刻的土地中植物高粱。高粱在生物煉 制（biorefineries)中的應(yīng)用的缺點(diǎn)是與玉米相比較低的產(chǎn)量和它的相對(duì)較高的淀粉凝膠 化溫度以及降低的蛋白質(zhì)和淀粉消化吸收率。
[0006] 因此，植物育種家的持續(xù)目標(biāo)是開(kāi)發(fā)農(nóng)學(xué)上有利的穩(wěn)定高產(chǎn)的高粱雜交種。這個(gè) 目標(biāo)的原因是使在使用的土地上生產(chǎn)的谷物的量和為動(dòng)物和人供應(yīng)食物最大化。
[0007] 直到最近，通過(guò)傳統(tǒng)的植物育種方法和改進(jìn)的栽培管理實(shí)踐進(jìn)行了針對(duì)高粱的 關(guān)于農(nóng)學(xué)和質(zhì)量特性的遺傳改良。組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)展使得產(chǎn)生包括高粱在內(nèi)的 所有主要谷類的轉(zhuǎn)基因植物。迄今為止，這種轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是用于將DNA遞送進(jìn)入細(xì)胞的顯 微粒子轟擊裝置（基因槍，microprojectile bombardment devices)的發(fā)展。顯微粒子 轟擊包括谷類轉(zhuǎn)化的兩個(gè)主要的約束條件。這些約束條件是缺乏可用的天然載體如根癌 農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)和當(dāng)將原生質(zhì)體用于轉(zhuǎn)化時(shí)再生植物的困難。顯 微粒子轟擊可以靶向具有高形態(tài)發(fā)生潛能的組織或器官內(nèi)的細(xì)胞。然而，使用顯微粒子 轟擊作為轉(zhuǎn)化載體具有其缺點(diǎn)。具體地，借助于轟擊，經(jīng)常將幾個(gè)拷貝的待轉(zhuǎn)化的基因整 合到靶向基因組內(nèi)。這些整合的拷貝經(jīng)常被重排并突變。此外，由于插入點(diǎn)或方式仍然 不是有效的過(guò)程，轉(zhuǎn)化事件可能是不穩(wěn)定的（Casas et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:11212-11216)。
[0008] 谷物高粱是二倍體，從野青茅（Arundinacea)的野生的非洲禾草高粱開(kāi) 發(fā)而來(lái)(Doggett and Majisul968Disruptive selection in crop development. Heredity(23:1).)。野生的四倍體高粱如約翰遜草（Halepensia)中的約翰遜草（Johnson grass)的成功，以及野生種X栽培種雜交的哥倫布草（黑高粱，S.almum)的成功表明可以 開(kāi)發(fā)有用的四倍體栽培谷物高粱。
[0009] 另外的【背景技術(shù)】包括：
[0010] 美國(guó)專利號(hào)：US 7, 745, 602、US 6, 750, 376、US 5, 811，636、US7, 135, 615、US 7, 541，514、US 7, 638, 680。
[0011] Doggett and Majisu Euphytical972:86-89 ；
[0012] Doggett 1964FertiIity improvement in autotetraploid sorghum: I cultivated autotetraploids, Heredityl9:403 ；
[0013] Doggett1964FertiIity improvement in autotetraploid sorghum:II. Sorghum almum derivatives Heredityl9:543 ；
[0014] Tsvetova et al. 1996ISMN37:66-67。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因組的 栽培高粱植物，當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和所述基因組加倍的高粱植物同基因的 二倍體高粱植物可育性相同（as fertile as)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因 組的高粱植物作為親本祖先的雜種植物。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因 組的雜種高粱植物。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物是雙 色高梁（sorghum bicolor)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了包括具有部分加倍或完全加倍的 基因組的高粱植物的種植田地。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了包括具有部分加倍或完全加倍的 基因組的高粱植物的種子的播種田地。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物是非 轉(zhuǎn)基因的。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，至少在具有所述部分加倍或完全加倍的基因組的所 述栽培高粱植物的第三世代上表現(xiàn)所述可育性（fertility)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有比所述二倍體高粱植物更厚（thicker)的葉片。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有比所述二倍體高粱植物更暗的葉片。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于所述二倍體高粱植物的每植物總谷粒數(shù)比 率（總谷粒數(shù) / 植物比率，total grain number per plant ratio)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于所述二倍體高粱植物的平均粒重（grain weight)〇
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有與所述二倍體高粱植物類似的或較低的植物總長(zhǎng)度 (total plant length)〇
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的每穗谷粒數(shù)（a grain per panicle number)〇
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍 或完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的穗長(zhǎng)度（panicle length)〇
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍 或完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的穗寬度（panicle width)〇
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的莖寬度（Stem width)。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的旗葉長(zhǎng)度（flag leaf length)〇
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的旗葉寬度（flag leaf width)〇
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的葉脈寬度（leaf vein width)〇
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有類似于二倍體高粱植物的單位面積谷物產(chǎn)量（單位面 積谷粒產(chǎn)量，grain yield per area) 〇
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的谷粒尺寸（grain size)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的谷物蛋白質(zhì)含量（谷粒 蛋白質(zhì)含量，grain protein content) 〇
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍或 完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的干物質(zhì)重量（dry matter weight)〇
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有部分加倍 或完全加倍的基因組的高粱植物具有至少類似于二倍體高粱植物的花粉粒尺寸（pollen grain size)〇
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，通過(guò)下列中的至少一個(gè)確定所述可育性：
[0041] 每植物種子數(shù)；
[0042] 配子可育性試驗(yàn)；和
[0043] 乙酸胭脂紅花粉染色。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，植物是四倍體。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，植物是六倍體。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，植物能夠與四倍體高粱雜交（cross-breeding)。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因組的 高粱植物的植物部分。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因組的 高粱植物或它的植物部分的加工產(chǎn)品。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，加工產(chǎn)品選自由食物、飼料、建筑材料和生物燃料組 成的組。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，所述食物或飼料選自由面包、餅干、曲奇、蛋糕、甜 點(diǎn)、小吃、早餐谷物食品、面粉、粥、糖楽、甜的調(diào)味品、湯、爆米花（popped kernels)、蒸粗麥 粉和酒精飲料組成的組。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了從具有部分加倍或完全加倍的基因組 的高粱植物的植物或植物部分產(chǎn)生的膳食（粉，meal)。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，植物部分是種子。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因組的 高粱植物的分離的可再生的細(xì)胞。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在培養(yǎng)中，細(xì)胞表現(xiàn)至少3次傳代的基因組穩(wěn)定性。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，細(xì)胞來(lái)自分生組織（meristem)、花粉、葉、根、根尖、 花藥、雌蕊、花、種子或莖。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了包括可再生的細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了產(chǎn)生高粱植物種子的方法，包括使具 有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物自交或雜交。
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了使用植物育種技術(shù)開(kāi)發(fā)雜種植物的方 法，方法包括使用具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物作為用于自交和/或雜交 的育種材料的來(lái)源。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生高粱植物膳食（粉，meal)的 方法，方法包括：
[0060] (a)收獲具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物的谷物或植物部分；和
[0061] (b)加工所述谷物以產(chǎn)生高粱膳食（高粱粉）。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生具有部分加倍或完全加倍的 基因組的高粱植物種子的方法，方法包括在瞬時(shí)施加的磁場(chǎng)下使高粱植物種子與G2/M細(xì) 胞周期抑制劑接觸，從而產(chǎn)生具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物種子。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，所述G2/M細(xì)胞周期抑制劑包括微管聚合抑制劑。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，所述微管聚合抑制劑選自由秋水仙堿、諾考達(dá)唑、黃 草消（二苯基胺，oryzaline)、氟樂(lè)靈（trifluraline)和長(zhǎng)春花堿硫酸鹽組成的組。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，方法進(jìn)一步包括在與所述G2/M細(xì)胞周期抑制劑的 所述接觸之前，使種子經(jīng)受引發(fā)步驟（預(yù)激步驟，priming step)。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，所述引發(fā)步驟包括超聲處理所述種子。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基 因組的栽培高粱植物的代表性的種子的樣品，當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和基 因組加倍的高粱植物同基因的二倍高粱植物可育性相同，其中在布達(dá)佩斯條約下以 NCMB42052 (J-EP-D4)將樣品保藏于 NCMB。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基 因組的栽培高粱植物的代表性的種子的樣品，當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和基 因組加倍的高粱植物同基因的二倍高粱植物可育性相同，其中在布達(dá)佩斯條約下以 NCMB42052 (J-EP-D4)將具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物的樣品保藏于 NCMB。
[0069] 除非另外限定，此處使用的所有的技術(shù)的和/或科學(xué)的術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明從屬的 本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的意義。盡管類似于或等同于此處描述的那些的方法和 材料可用于本發(fā)明的實(shí)施方式的實(shí)踐或測(cè)試，但是下面描述典型的方法和/或材料。在沖 突的情況下，以專利說(shuō)明書（包括定義）為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅是說(shuō)明性的且不 意在是必須為限制性的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0070] 此處參考附圖，僅通過(guò)實(shí)例描述本發(fā)明的某些實(shí)施方式?，F(xiàn)在詳細(xì)地具體參考附 圖，強(qiáng)調(diào)的是顯示的細(xì)節(jié)是通過(guò)實(shí)例的方式并且用于說(shuō)明性的討論本發(fā)明的實(shí)施方式的目 的。關(guān)于這點(diǎn)，用附圖進(jìn)行的描述使得如何實(shí)踐本發(fā)明的實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以是顯而易見(jiàn)的。
[0071] 在圖中：
[0072] 圖1是示出與同基因的二倍體對(duì)照"AD"系相比的第三代（世代，generation) (D3) 四倍體高粱種子"Ad (26) 6D3"的照片。1000粒種子重量（種子千粒重，IOOOseeds weight) 高于同基因的二倍體對(duì)照87. 5%。
[0073] 圖2是示出與同基因的二倍體對(duì)照"AD"系相比的第三代（D3,記為"A、e、h和j"） 四倍體高粱植物的照片。
[0074] 圖3是示出二倍體高粱"Ad"系的FACS分析的圖。PI-A的左側(cè)峰值是75 (每一個(gè) 刻度標(biāo)記15個(gè)單元）。右側(cè)峰代表細(xì)胞周期。
[0075] 圖4是示出四倍體高粱種子"A"系的FACS分析結(jié)果的圖。PI-A峰的值是150,其 證實(shí)DNA的量是對(duì)照的兩倍（每一個(gè)刻度標(biāo)記15個(gè)單位）。由于它的高值，細(xì)胞周期的峰 缺失，其偏出了刻度。
[0076] 圖5是為了測(cè)試對(duì)照系和基因組加倍的（genomically multiplied)系的DNA含 量而進(jìn)行的FACS的圖形表示。
[0077] 圖6A-圖6B是示出RM系對(duì)照相對(duì)于（versus)根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式另外 產(chǎn)生的同基因的四倍體系的谷粒尺寸的照片。
[0078] 圖7A-圖7B是示出SSR系對(duì)照相對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式另外產(chǎn)生的同 基因的四倍體系的谷粒尺寸的照片。
[0079] 圖8A-圖8B是來(lái)自二倍體系、ER對(duì)照（圖8A)和誘導(dǎo)的基因組加倍的系ER6 (EP? 系，圖8B)的花粉粒的顯微鏡圖像。

【具體實(shí)施方式】
[0080] 本發(fā)明在其某些實(shí)施方式中涉及具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱 植物和其應(yīng)用。
[0081] 在詳細(xì)地解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之前，應(yīng)該明白，在它的應(yīng)用中，本發(fā)明 不一定限于下面描述中闡明的或通過(guò)實(shí)施例例證的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠以不同的方式實(shí)踐或 實(shí)施其他實(shí)施方式。
[0082] 植物育種家的持續(xù)目標(biāo)是開(kāi)發(fā)農(nóng)學(xué)上有利的穩(wěn)定高產(chǎn)的高粱雜交種。這個(gè)目標(biāo)的 原因是使在所使用的土地上生產(chǎn)的谷物的量和為動(dòng)物和人類供應(yīng)食物最大化。
[0083] 以往數(shù)十年已經(jīng)將表明誘導(dǎo)型多倍體用于增加高粱產(chǎn)量。然而，迄今為止，僅為少 數(shù)表現(xiàn)出差的可育性的高粱物種成功實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)型多倍體。
[0084] 現(xiàn)在，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了用于在高粱中誘導(dǎo)的基因組加倍的新的步驟，產(chǎn)生基因上 穩(wěn)定的和可育（至少與和同基因的二倍體植物相同（祖先植物））的植物。誘導(dǎo)型多倍體 植物沒(méi)有不期望的基因組突變，并且特征是較暗、較厚的葉片和較大的種子。此外，多倍體 植物示出在每植物產(chǎn)量、活力、可育性和生物量方面的增加。為此，本發(fā)明的某些實(shí)施方式 的高粱植物被認(rèn)為是比具有二倍體基因組的同基因的祖先植物更高的活力和產(chǎn)量的植物 (參考下面的表2-表4)。這些新的性狀可有助于較好的氣候適應(yīng)性和對(duì)生物和非生物逆 境較高的耐受性。此外，由于雜種優(yōu)勢(shì)表達(dá)，具有本發(fā)明的誘導(dǎo)型多倍體植物的雜交高粱種 子作為祖先親本可以增加全球性高粱產(chǎn)量。此外，與基因組加倍之后來(lái)自早期世代（例如， 第一、第二、第三或第四代）的同基因四倍體祖先植物相比，本發(fā)明的某些實(shí)施方式的誘導(dǎo) 型多倍體植物表現(xiàn)出相似的或較好的可育性，消除對(duì)進(jìn)一步育種以改善可育性的需要。 [0085] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培 高粱植物，當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和所述基因組加倍的高粱植物同基因的二倍 高粱植物可育性相同。
[0086] 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"高粱"是指屬于禾本科家族的蜀黍族的高粱屬。這些禾本種 的特征是以穗的形式的花序和谷粒，成對(duì)生長(zhǎng)（borne in pairs)的小穗和廣泛地側(cè)根。 [0087] 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"同基因的（等基因的，isogenic) "是指具有基本上完全相同 的基因型（例如，在個(gè)體之間不超過(guò)1個(gè)基因是不同的）的兩個(gè)個(gè)體植物（或它們的部分， 例如，種子，細(xì)胞）。
[0088] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，本發(fā)明的高粱物種（Sorghum sp.)是栽培高粱。如此處使 用的，術(shù)語(yǔ)"栽培"是指由人類人工選擇的馴化的高粱物種。本發(fā)明的某些實(shí)施方式的高粱 物種（用于基因組加倍的遺傳來(lái)源）本質(zhì)上是二倍體的（η = 10)并且主要是自花授粉的。 [0089] 根據(jù)本發(fā)明可使用下列高粱物種。
[0090] 黑高梁（Sorghum almum)
[0091] 闊葉高梁（Sorghum amplum)
[0092] 狹葉高梁（Sorghum angustum)
[0093] 蘆華狀高梁（Sorghum arundinaceum)
[0094] 短柄高梁（Sorghum brachypodum)
[0095] 球莖高梁（Sorghum bulbosum)
[0096] 緬甸高梁（Sorghum burmahi cum)
[0097] Sorghum ecarinatum
[0098] Sorghum exstans
[0099] Sorghum grande
[0100] 中間高梁（Sorghum interjectum)
[0101] Sorghum intrans
[0102] 疏花高梁（Sorghum laxiflorum)
[0103] Sorghum leiocladum
[0104] Sorghum macrospermum
[0105] Sorghum matarankense
[0106] 光高梁（Sorghum nitidum)
[0107] 羽高梁（Sorghum plumosum)
[0108] 擬高梁（Sorghum propinquum)
[0109] 紫色高梁（Sorghum purpureosericeum)
[0110] Sorghum stipoideum
[0111] Sorghum timorense
[0112] 糖毛高梁（Sorghum trichocladum)
[0113] 多色高梁（Sorghum versicolor)
[0114] Sorghum verticiliflorum
[0115] 掃帚高梁（Sorghum vulgare var. technicum)-帚高梁（Broomcorn)
[0116] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，栽培高粱是雙色高粱（Sorghum bicolOT)，也稱為，雙色高 粱（L.)屬，買羅高梁（milo)或買羅高梁蜀黍（milo-maize)、dura、大稷（great millet)、 幾內(nèi)亞蜀黍（guinea corn)、卡菲爾蜀黍（kafir corn)、mtama，和蜀黍（jowar)，用于這個(gè)物 種的其他參考包括栽培高粱，經(jīng)常單獨(dú)地稱為高粱。根據(jù)具體的實(shí)施方式，雙色高粱的類型 是甜型（sweet-type)高粱（如以AD系舉例說(shuō)明）、谷物型（grain-type)高粱（如以RM和 ER系舉例說(shuō)明）或青C：型（silage-type)(如以AT系舉例說(shuō)明）。
[0117] 雙色高粱是主要的栽培高粱物種。這些物種起源于北部非洲并且可以在旱境土 壤中生長(zhǎng)并且耐受持續(xù)的干旱。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)了較矮并且較容易收獲的品種（變異體， variety)，叢生的雙色高粱以可達(dá)到超過(guò)四米高。谷粒（果仁（kernel)或種子）小，直徑 達(dá)到約3-4_。典型地，種子是球形的，但是可以是不同的形狀和大??；顏色從白色至紅和 褐色變化，并且包括淡黃色至深紫-褐色（FA01995a, Sorghum and millets in human nut rition:Chapterl:Introduction.，其整體通過(guò)引用結(jié)合于此）。認(rèn)識(shí)到高粱的不同類型包 括紅高粱、甜高粱、禾草高粱和帚高粱，根據(jù)本教導(dǎo)預(yù)期所有這些。根據(jù)具體的實(shí)施方式，高 粱是紅高粱或甜高粱。
[0118] 在下文列出某些非限制性的商業(yè)品種的實(shí)例。
[0119] " Saccal ine"
[0120] 很可能從美國(guó)引入澳大利亞，但是認(rèn)為起源于納塔爾（Natal)。每株植物具有五 至六個(gè)莖的、高的、直立的一年生植物；髓質(zhì)實(shí)心（pith solid)，多汁并且甘甜。種子紅褐 色，橢圓形，約39 000粒/kg。葉片茂盛但是相當(dāng)早期即枯萎，并且與cv. Sugar drip或 cv. White African相比，該作物表現(xiàn)出稍微多梗（stemmy)外觀。晚熟，在澳大利亞，在諱 度27-30° S處80天開(kāi)花而在緯度23-24° S處65天開(kāi)花。其產(chǎn)生巨大的草料產(chǎn)量（50 000-70000kg/ha綠色物質(zhì)），成熟美味的；它成為極好的青飼料。
[0121] "Sumac"
[0122] 從美國(guó)引入澳大利亞，其反過(guò)來(lái)從非洲獲得它。比"Saccaline"稍矮，具有矮的、 緊湊的穗和豐滿的紅褐色種子。它的成熟期約與cv.'Saccaline'相同。因?yàn)樗母叨容^ 低，它是比' Saccaline'稍微更容易收獲的青飼料。
[0123] " Sugardrip，'
[0124] 從美國(guó)引入澳大利亞。類似于"Saccaline"，但是比其多葉。莖是多汁的并且非常 甜。種子是棕色的并且小，頂部圓形的而底部尖形的（而不是橢圓形的，如"Saccaline"）。 它是晚熟的，開(kāi)花在"Saccaline"之后五至七天。它直立良好并且不像"Saccaline"和 "Sumac"那樣易倒伏。
[0125] "White African"
[0126] 從美國(guó)引入澳大利亞，但是源自納塔爾。比" Saccal ine "更厚、更高且具有較強(qiáng)壯 的莖，它分蘗較少，并且它的葉片間隔更寬。種子白色，約40 000粒/kg。萌發(fā)趨向低。晚 熟，抗倒伏，比其他栽培品種更耐葉片疾病。它很好的進(jìn)入冬季，但是它的汁不是那么甜。用 于青貯飼料非常好。
[0127] "Early Orange"
[0128] 由格拉夫頓農(nóng)業(yè)研究站（Grafton Agricultural Research Station)從來(lái)自美國(guó) 的稱為"Kansas Orange"的品種開(kāi)發(fā)。類似于cv.Saccaline，具有稍微更強(qiáng)壯的莖（但是 不如"White African"或"Tracy"強(qiáng)壯）。穗中等緊湊；種子黃褐色,橢圓體，約40 000粒 /kg。早熟型，適于晚播。在它的汁中具有比"Saccaline"更高的糖含量。
[0129] "Tracy"
[0130] 在美國(guó)密西西比州開(kāi)發(fā)用于制糖；引入新南威爾士州和昆士蘭。在外表上，類似 于"Saccaline"，但是與它的高度相比，葉片生長(zhǎng)相當(dāng)稀疏。穗小、直立、并且為圓柱形。 種子黑紅棕色并且比"Saccaline"的種子更暗；約40 000粒/kg。它是晚熟的，開(kāi)花在 "Saccaline"之后兩周（約與"White African"同時(shí)）。它耐倒伏。莖是美味和多汁的，具 有高的糖含量；它們保留它們的多汁性進(jìn)入冬季。耐葉片疾病。
[0131] "植物"是指完整植物或其部分（例如，種子、莖、果實(shí)、葉片、花、組織等等），加工 的或未加工的[例如，種子、膳食、干組織、塊（cake)等]、可再生的組織培養(yǎng)或由其分離的 細(xì)胞。
[0132] 根據(jù)某些實(shí)施方式，此處使用的術(shù)語(yǔ)植物也指作為至少一個(gè)它的祖先的具有一個(gè) 誘導(dǎo)型多倍體植物的雜種，如下文進(jìn)一步定義和解釋的。
[0133] 如此處使用的，"部分加倍或完全加倍的基因組"是指至少增加一個(gè)染色體（2n = 或大于21)，或至少一個(gè)完整的染色體組（η = 10)其產(chǎn)生三倍體植物（3n = 30)，或基因組 的完全加倍，其產(chǎn)生四倍體植物（4N)或更多倍體。
[0134] 此處也將本發(fā)明的基因組加倍的植物稱為"誘導(dǎo)型多倍體"植物。
[0135] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是3N。
[0136] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是4N。
[0137] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是5N。
[0138] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是6N。
[0139] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是7N。
[0140] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是8N。
[0141] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是9N。
[0142] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是10N。
[0143] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是11N。
[0144] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物是12N。
[0145] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，誘導(dǎo)型多倍體植物不是基因組加倍的單倍體植物。
[0146] 如提到的，當(dāng)在相同的（完全相同的）條件下生長(zhǎng)并且在相同的（完全相同 的）發(fā)育階段時(shí)，誘導(dǎo)型多倍體至少是與和基因組加倍的高粱同基因的二倍體高粱祖先 植物可育性相同的（例如，90%或更高）。根據(jù)具體的實(shí)施方式，已經(jīng)在基因組加倍后3 世代之后獲得了這樣的可育性水平，但是也可能已經(jīng)在過(guò)程中表現(xiàn)，如在基因組加倍后 的第一或第二世代上。這與現(xiàn)有技術(shù)同源四倍體高粱形成鮮明對(duì)比，其中只在輪回選擇 (recurrent selection)之后觀察到更高的可育性水平（參考，例如，Doggett and Majisu 1972Euphytica21:86-89)。
[0147] 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"可育性（可育，fertile)"是指有性繁殖的能力?？捎帽绢I(lǐng) 域熟知的方法分析可育性?？商娲?，將可育性定義為結(jié)籽的能力?？煞治鱿铝袇?shù)以確 定可育性：種子（谷粒）的數(shù)量；可通過(guò)如在蔗糖基質(zhì)上花粉萌發(fā)確定的配子可育性；以及 可替代地或另外地通過(guò)乙酸胭脂紅染色，從而將可育的花粉染色。
[0148] 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定的"或"基因組穩(wěn)定性"是指經(jīng)過(guò)幾個(gè)世代（例如，3，5 或10)，染色體或染色體拷貝的數(shù)目保持穩(wěn)定，同時(shí)植物在至少下列參數(shù)方面不表現(xiàn)實(shí)質(zhì)性 下降：產(chǎn)量（例如，總種子重量/每植物或總的種子重量/面積單位）、可育性、生物量、活 力。
[0149] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，將穩(wěn)定性定義為產(chǎn)生純種的后代，保持品種強(qiáng)壯并始終如 〇
[0150] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，基因組加倍的植物與來(lái)源植物（即，二倍體栽培高粱植 物）是同基因的?；蚪M加倍的植物在性質(zhì)上（in quality)而不在數(shù)量上與二倍體植物 具有基本上相同的基因組組成。
[0151] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，在完整植物的培養(yǎng)或在完整植物的世代中表現(xiàn)至少2、3、5、 10或更多次傳代的基因組穩(wěn)定性。
[0152] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，成熟的基因組加倍的植物具有與在相同的條件下生 長(zhǎng)的它的同基因的二倍體祖先至少約相同的種子數(shù)（+/-10% );可替代地或另外地，基因 組加倍的植物具有通過(guò)乙酸胭脂紅染色的至少90%可育的花粉；并且可替代地或另外，至 少90%的種子在蔗糖上萌發(fā)。根據(jù)本教導(dǎo)產(chǎn)生的四倍體植物具有比同基因的祖先植物高至 少5 %、10 %、15 %、20 %或25 %的總產(chǎn)量/植物。例如，在相同的條件下并且在相同的發(fā)育 階段，比同基因的二倍體植物高5-10 %、1-10 %、10-20 %、10-100 %或50-150 %的產(chǎn)量。典 型的實(shí)施方式是，比在相同的條件下生長(zhǎng)的并且在相同的發(fā)育階段的同基因的二倍體植物 高10-50%的產(chǎn)量。根據(jù)具體的實(shí)施方式，用下列公式測(cè)量產(chǎn)量：
[0153] 每植物產(chǎn)量=總谷粒數(shù)/植物X粒重
[0154] 典型地，當(dāng)兩者都是在相同的發(fā)育階段和兩者在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)時(shí)，與它 的同基因祖先相比（在下文中，"二倍體祖先高粱植物"例如，"AD系"）進(jìn)行用于表征本發(fā) 明的基因組加倍的植物的特性（性狀，trait)(例如，可育性、產(chǎn)量、生物量和活力）完成的 比較分析。
[0155] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因的祖先植物的穗數(shù)。根據(jù)具體的實(shí)施方 式，穗數(shù)為高出（higher by)2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚至超過(guò)15%或 20% (例如，2-20%或10-20%)。根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少 類似于相同的發(fā)育階段并且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的穗 長(zhǎng)度。根據(jù)具體的實(shí)施方式，穗長(zhǎng)度為高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚 至超過(guò)15%或20% (例如，2-20%或10-30%，參見(jiàn)表7)。
[0156] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的穗寬度。根據(jù)具體的實(shí)施方 式，穗寬度為高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚至超過(guò)15%或20%(例 如，2-20%或 10-30%，參見(jiàn)表 8)。
[0157] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的莖寬度。根據(jù)具體的實(shí)施方 式，莖寬度為高出 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%或甚至 100% (例如，10-70%、10-50%，參見(jiàn)表 9)。
[0158] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的旗葉長(zhǎng)度。根據(jù)具體的實(shí)施方 式,旗葉長(zhǎng)度為高出 5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或甚至 100% (例如，10-50%、10-20%，參見(jiàn)表 10)。
[0159] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的旗葉寬度。根據(jù)具體的實(shí)施方 式，旗葉寬度為高出 5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或甚至 100% (例如，10-60%、10-20%，參見(jiàn)表 11)。
[0160] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的葉脈寬度。根據(jù)具體的實(shí)施方 式，葉脈寬度高出 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%或甚至 100% (例如，10-70%、10-50%，參見(jiàn)表 12)。
[0161] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的花粉粒尺寸（花粉粒大小、花 粉粒粒徑）。根據(jù)具體的實(shí)施方式，花粉粒尺寸為高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%(例如，10-70%、 10-50 %，參見(jiàn)圖 8A-圖 8B)。
[0162] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的每植物總粒重（參見(jiàn)表3)。根 據(jù)具體的實(shí)施方式，每植物總粒重高出Oiigherby)至少L 45倍、L 4-2倍或L 5-1. 75倍。
[0163] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的粒重（參見(jiàn)表2)。根據(jù)具體 的實(shí)施方式，粒重高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚至超過(guò)15%、20%或 50%。
[0164] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的谷粒尺寸（體積）。根據(jù)具體 的實(shí)施方式，谷粒尺寸高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚至15%、20%或 50%。
[0165] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的干物質(zhì)重量。根據(jù)具體的實(shí)施 方式，干物質(zhì)重量高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚至超過(guò)15%、20%或 50%。
[0166] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的每植物總谷粒數(shù)（參見(jiàn)表3)。 根據(jù)具體的實(shí)施方式，每植物總谷粒數(shù)高出1〇%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50 %或甚至超過(guò)80 %或90 %。
[0167] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的每穗總谷粒數(shù)（參見(jiàn)表6)。根 據(jù)具體的實(shí)施方式，每穗總谷粒數(shù)比相同的發(fā)育階段并且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的同基 因祖先的高出 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或甚至超過(guò) 80%或 90% (10-50%或 10-30% )。
[0168] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的谷物蛋白質(zhì)含量。根據(jù)具體的 實(shí)施方式，谷物蛋白質(zhì)含量比相同的發(fā)育階段并且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的同基因祖先 的高出或低出約0-20%。
[0169] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的每生長(zhǎng)面積谷物產(chǎn)量。根據(jù) 具體的實(shí)施方式，每生長(zhǎng)面積谷物產(chǎn)量高出10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、 50 % 或甚至超過(guò) 80 %、90 %、100 %、200 %、250 %、300 %、400 % 或 500 %。根據(jù)具體的實(shí)施 方式，每生長(zhǎng)面積谷物產(chǎn)量比相同的發(fā)育階段并且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的同基因祖先 植物的高出 〇· 1-5、0· 3-5、0· 4-2. 5、1-5、2-3 或 2-2. 5 倍。
[0170] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的每植物谷物產(chǎn)量。根據(jù)具體的 實(shí)施方式，每植物谷物產(chǎn)量高出5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或 甚至超過(guò)80 %、90 %、100 %、200 %、250 %、300 %、400 %或500 %。根據(jù)具體的實(shí)施方式，每 植物谷物產(chǎn)量比相同的發(fā)育階段并且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的同基因祖先植物的高出 0· 1-5 倍、0· 3-5 倍、0· 4-2. 5 倍、1-5 倍、2-3 倍或 2-2. 5 倍。
[0171] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是至少類似于相同的發(fā)育階段并 且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物的花粉可育性（參見(jiàn)表4)。根據(jù) 具體的實(shí)施方式，花粉可育性與二倍體同基因祖先80%、90%、95%或甚至100%相同。
[0172] 有趣地是，本發(fā)明的植物特征是與相同的發(fā)育階段并且在相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng) 的二倍體高粱同基因祖先植物的類似的或甚至更高的地面上植物長(zhǎng)度。根據(jù)具體的實(shí)施方 式，植物長(zhǎng)度高出2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或甚至20%。
[0173] 本發(fā)明的植物的特征是比與其同基因的二倍體栽培高粱植物的生物量、產(chǎn)量、谷 物產(chǎn)量、每生長(zhǎng)面積谷物產(chǎn)量、谷物蛋白質(zhì)含量、粒重、干草產(chǎn)量、種子成形、染色體數(shù)、基因 組組成、百分比油、活力、耐蟲(chóng)性、抗藥性、耐旱性和抗逆性中的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè) 或所有的更1?。
[0174] 應(yīng)該明白，盡管誘導(dǎo)型多倍體植物的某個(gè)特性相對(duì)于同基因的祖先可能是較差 (inferior)的，但其他（多個(gè)特性）可能是較優(yōu)（superior)的，從而提供整體上更優(yōu)的表 型。
[0175] 例如，誘導(dǎo)型多倍體系或雜交種可具有相對(duì)于同基因的祖先較差的種子重量，但 是具有相對(duì)于同基因的祖先較優(yōu)的種子重量/植物或種子重量/生長(zhǎng)面積。
[0176] 同樣地，誘導(dǎo)型多倍體系或雜交種可具有相對(duì)于同基因的祖先較差的種子重量， 但是具有相對(duì)于同基因的祖先較優(yōu)的蛋白質(zhì)含量。
[0177] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更厚的葉片。
[0178] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更暗的葉片。
[0179] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更高的每穗種子數(shù)。
[0180] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更長(zhǎng)的穗長(zhǎng)度。
[0181] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更寬的穗寬度。
[0182] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更寬的莖寬度。
[0183] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更長(zhǎng)的旗葉長(zhǎng)度。
[0184] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更寬的旗葉寬度。
[0185] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，基因組加倍的植物的特征是比相同的發(fā)育階段并且在相同 的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的二倍體高粱同基因祖先植物更寬的葉脈寬度。
[0186] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，植物是非轉(zhuǎn)基因的。
[0187] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，例如，通過(guò)表達(dá)賦予用于栽培的農(nóng)學(xué)上有益的特性如抗蟲(chóng) 性或形態(tài)特性的異源（heterologous)基因，植物是轉(zhuǎn)基因的。例如，親本植物或誘導(dǎo)型多 倍體植物可以表達(dá)與改進(jìn)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或疾病耐受性相關(guān)的轉(zhuǎn)基因。例如，顯示高粱中的幾 丁質(zhì)酶和脫乙酰幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)賦予對(duì)炭疽病的抵抗（Kosambo-Ayoo et al.2011Af. J. BiotechnologylO:3659-3670)〇
[0188] 在高粱中表達(dá)外源多核苷酸的方法是本領(lǐng)域中熟知的。這些方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化和顯微粒子轟擊法。根據(jù)具體的實(shí)施方式，通過(guò)基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化進(jìn)行高粱轉(zhuǎn)化，具 有范圍為從 2. 1% -4. 5%的高轉(zhuǎn)化效率（Gao et al.，2005Plant Biotechnol J. 2005Nov ; 3(6) :591-9;和Zhao Methods Mol Biol. 2006 ;343:233-44·)<^?ι?·&8?ι&η1--ι·等人（2005) Plant Cell Rep. 24(9) :513-22報(bào)道了通過(guò)顯微粒子轟擊法芽尖（shoot apices)并產(chǎn)生轉(zhuǎn) 基因植物成功恢復(fù)的轉(zhuǎn)基因高粱植物，具有1. 5%的轉(zhuǎn)化頻率。
[0189] 如下面描述的，可用改進(jìn)的秋水仙堿化（colchicination)的方法產(chǎn)生本發(fā)明的 基因組加倍的植物種子。
[0190] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生具有部分加倍或完全加倍的基因組的 高粱植物或植物部分（例如，種子）的方法，該方法包括在瞬時(shí)施加的磁場(chǎng)下，使高粱植物 或它的部分（例如，種子）與G2/M細(xì)胞周期抑制劑接觸，從而產(chǎn)生具有部分加倍或完全加 倍的基因組的高粱。典型地，在加倍之前的高粱植物或它的部分（例如，種子）是二倍體且 不是單倍體或雙-單倍體。
[0191] 在處理之前，使種子在NaCl = KNO3的存在下經(jīng)受引發(fā)步驟。典型地，這個(gè)步驟持續(xù) 12-48小時(shí)。典型地，當(dāng)根的長(zhǎng)度達(dá)到Icm時(shí)終止處理。
[0192] 為了改進(jìn)種子與處理溶液的滲透性，在與G2/M周期抑制劑接觸之前，使種子經(jīng)受 超聲處理（例如，40-50KHzl0至20min)。
[0193] 潮濕的種子可較好響應(yīng)處理并因此在處理的開(kāi)始時(shí)，將種子浸在水溶液（例如， 蒸餾水）中。
[0194] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，整個(gè)處理在黑暗中且在室溫（約22°C )或較低的溫度[例 如，用于超聲（US)階段]下進(jìn)行。
[0195] 因此，根據(jù)具體的實(shí)施方式，使種子在室溫下浸在水中并隨后使其在蒸餾水中經(jīng) 受US處理。
[0196] 一旦滲透，將種子放置在含有處理溶液的容器內(nèi)，并且接通磁場(chǎng)。
[0197] 典型地，G2/M周期抑制劑包括微管聚合抑制劑。
[0198] 微管周期抑制劑的實(shí)例包括但不限于：秋水仙堿、秋水仙胺、氟樂(lè)靈、黃草消 (oryzalin)、苯并咪唑氨基甲酸鹽（酯）（例如，諾考達(dá)唑、思考達(dá)唑（oncodazole)、甲苯咪 唑、R17934、MBC)、0-異丙基N-苯基氨基甲酸鹽（酯）、氯異丙基N-苯基氨基甲酸鹽（酯）、 甲基胺草磷、紫杉酚、長(zhǎng)春花堿（vinblastine)、灰黃霉素、咖啡因、二-ANS、美登素、長(zhǎng)春堿 (vinbalstine)、長(zhǎng)春花堿硫酸鹽和足葉草毒素。
[0199] G2/M抑制劑包括在處理溶液中，其可包含另外的活性成分如抗氧化劑。下面列出 可按照本教導(dǎo)使用的處理溶液的具體實(shí)例。
[0200] 值得注意的，可在處理溶液中使用下列范圍的微管聚合抑制劑和抗氧化劑。
[0201] 微管聚合抑制劑-〇. 1 %長(zhǎng)春花堿硫酸鹽、0. 1-0. 5mg/ml秋水仙堿、0. 5%諾考達(dá) 唑、0. 002-0. 005%黃草消或 0. 002-0. 005%氟樂(lè)靈。
[0202] 抗氧化劑-25-100ug/ml花青色素3-0-b-吡喃葡萄糖苷、10+1(Γ4Μ黃芩黃素、 KT6-Kr4M槲皮黃銅或5-10mM奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox)。
[0203] 可將DNA保護(hù)劑如組蛋白加入到溶液中。
[0204] 處理溶液可進(jìn)一步包含DMSO和洗滌劑。
[0205] 如提到的，在用包含G2/M周期抑制劑的處理溶液處理高粱時(shí)，使植物進(jìn)一步經(jīng)受 至少1000高斯的磁場(chǎng)（例如，1550高斯）約2hr。將種子放置在磁場(chǎng)腔中，如在實(shí)例1中 描述的。在指示的時(shí)間之后，從磁場(chǎng)移除種子。在處理期間，溫度不超過(guò)24°C。
[0206] -旦從磁場(chǎng)去除種子，用G2/M周期抑制劑使它們經(jīng)受第二輪的處理。最后，仔細(xì) 地洗滌種子以提高發(fā)芽率且在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)床上播種?？蛇x地，幼苗在Acadain TM(Acadian AgriTech)和Giberllon的存在下生長(zhǎng)（當(dāng)用長(zhǎng)春花堿作為G2/M周期抑制劑處理時(shí)，使用 后者）。
[0207] 用上述教導(dǎo)，本發(fā)明人建立了基因組加倍的高粱植物。
[0208] -旦建立，可有性地或如可通過(guò)用組織培養(yǎng)技術(shù)無(wú)性地繁殖本發(fā)明的植物。
[0209] 如此處使用的，短語(yǔ)"組織培養(yǎng)"是指由其可以產(chǎn)生高粱禾草的植物細(xì)胞或植物部 分，包括植物原生質(zhì)體、植物愈傷（plant cali)、植物塊和植物中完整無(wú)缺的植物細(xì)胞，或 植物的部分，如種子、葉片、莖、花粉、根、根尖、花藥、胚珠、花瓣、花、胚、纖維和圓莢。
[0210] 根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在培養(yǎng)中，培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)至少2、3、4、5、7、9或10 代的基因組穩(wěn)定性。
[0211] 產(chǎn)生植物組織培養(yǎng)物和從組織培養(yǎng)再生植物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。例 如，通過(guò) Vasil. ,1984. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I，II，III，Laboratory Procedures and Their Applications,Academic Press, New York ；Green et al. ,1987. Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press, New York ； Weissbach and Weissbach. 1989. Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press ；Gelvin et al.，1990,Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers ；Evans et al.，1983,Handbook of Plant Cell Culture, MacMillian Publishing Company，New York;和 Klee et al·，1987. Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467 486闡明這樣的技術(shù)。
[0212] 可從選自由種子、葉片、莖、花粉、根、根尖、花藥、胚珠、花瓣、花和胚組成的組的組 織的細(xì)胞或原生質(zhì)體產(chǎn)生組織培養(yǎng)物。
[0213] 應(yīng)該明白，本發(fā)明的植物也可以與其他高粱植物一起用于植物育種（S卩，自交育 種和雜交育種），如與栽培高粱或野生高粱一起以產(chǎn)生新的雜種植物或植物系，其表現(xiàn)本發(fā) 明的高粱植物的至少某些特性。
[0214] 從使這些中的任何一種與另外的植物雜交產(chǎn)生的植物可用于系譜育種（pedigree breeding)、轉(zhuǎn)化和/或回交以產(chǎn)生另外的栽培品種，其表現(xiàn)本發(fā)明的基因組加倍的植物的 特征和任何其他期望的特性。采用本領(lǐng)域熟知的分子或生物化學(xué)方案的篩選技術(shù)可用于確 保，在每一個(gè)育種世代中保存尋求的重要的商業(yè)特征。
[0215] 回交的目標(biāo)是改變或替代輪回親本系（recurrent parental line)中的單個(gè)特性 或特征。為了完成這點(diǎn)，用來(lái)自非循環(huán)系的期望的基因取代或補(bǔ)充循環(huán)親本系的單個(gè)基因， 同時(shí)基本上保留所有剩余的期望的基因，和因此保留原始系的期望的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)的組 成。具體的非循環(huán)親本的選擇將取決于回交的目的。一個(gè)主要的目的是將某些商業(yè)上期望 的、農(nóng)學(xué)上重要的特性加到植物中。精確的回交方案將取決于被改變的或添加的特征或特 性，以確定適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方案。盡管當(dāng)被轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時(shí)回交方法被簡(jiǎn)化，但是 也可轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在這種情況下，引入后代的檢測(cè)以確定是否已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)移期望 的特征可能是必要的。同樣地，可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的多種建立的轉(zhuǎn)化方法中中任 一項(xiàng)將轉(zhuǎn)基因引入到植物中，如上述描述的。
[0216] 使用本教導(dǎo)，本發(fā)明人能夠產(chǎn)生許多植物新品種，其是誘導(dǎo)型多倍體。已經(jīng)于2012 年9月14日在NCMB42052之下，在布達(dá)佩斯條約之下將代表性的種子的樣品保藏于NCMB Ltd.(英國(guó)國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心）。NCMB42052相當(dāng)于誘導(dǎo)型多倍體J-EP-D4(基 因組加倍的AD系）。
[0217] 應(yīng)該明白，本發(fā)明的植物或雜交植物可以被遺傳修飾，如，以引入感興趣的特性， 例如，對(duì)脅迫（例如，生物的或非生物的）增加的耐受。
[0218] 因此，本發(fā)明提供新的基因組加倍的植物、雜交種、具有作為根據(jù)上述教導(dǎo)基因組 加倍的高粱作為親代祖先的雜交種和栽培品系（cultivars)，以及用于產(chǎn)生其的種子和組 織培養(yǎng)物。
[0219] 本發(fā)明的植物能夠自交育種或與二倍體或四倍體高粱進(jìn)行雜交育種。
[0220] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供具有如此處描述的基因組加倍的植物作為親本祖先的雜 交植物。
[0221] 例如，父本（male parent)可以是基因組加倍的植物而母本可以是二倍體高粱 (4狀2吣。可替代地，可以雜交相同（例如，4狀416狀6的或不同（例如，6狀4吣倍性 的兩種誘導(dǎo)的基因組加倍的植物。
[0222] 根據(jù)具體的實(shí)施方式，本發(fā)明提供了具有部分加倍或完全加倍的基因組的雜交高 粱植物。
[0223] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括至少10%、20%、50%或100%的本發(fā)明的植物或雜交 植物的種子的種子袋。
[0224] 本發(fā)明進(jìn)一步提供包括本發(fā)明的任何植物（或種子）或雜交植物（或種子）的栽 種或播種田地。
[0225] 將本發(fā)明的谷物加工成用作食物或飼料（例如，家禽和家畜飼料）中的補(bǔ)充品的 膳食。
[0226] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)高粱膳食的方法，方法包括收獲本發(fā)明的植物或雜 交植物的谷物；和加工谷物以產(chǎn)生膳食。
[0227] 在下文進(jìn)一步描述根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式預(yù)期的植物、它的部分和加工產(chǎn)品 的具體的應(yīng)用。
[0228] 高粱谷物通常被用作用于牲畜飼料的玉米替換物，因?yàn)樗鼈兊臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常相 似。也種植禾草高粱用于牧草和干草。
[0229] 已經(jīng)開(kāi)發(fā)了通常種植用于飼料的某些雜交植物以阻止鳥(niǎo)類，并且因此含有高濃度 的鞣酸類和酚類化合物，其引起對(duì)另外的加工以使得谷物能夠被牛消化的需要。這樣的雜 交植物可以是基因組加倍的受試者或可用于雜交種產(chǎn)生。
[0230] 本發(fā)明的某些實(shí)施方式的高粱可用于產(chǎn)生食物如粥、面包、蒸粗麥粉、高粱面粉、 糖漿、用于釀造的麥芽粉、餅干和蛋糕（FA01995b ;USGC2008)。脫殼的高粱提供大米的日漸 增長(zhǎng)的可替換物（FA01995b)。
[0231] 粑克日面包（Bhakri)，多種通常由高粱做成的未發(fā)酵面包，是印度的很多部分，如 馬哈拉施特拉邦和北部卡納塔克邦的主食。
[0232] 高粱膳食可以作為非常類似于半流質(zhì)食物（pap)的硬的粥食用。在北部梭托族中 被叫做馬貝萊（mabele)而在英國(guó)被叫做褐粥（brown porridge)?？膳cmaswi (酸奶）和 merogo (煮沸的綠葉蔬菜的混合物，非常類似于羽衣甘藍(lán)綠葉蔬菜或菠菜）一起供應(yīng)粥。
[0233] 可以生產(chǎn)高粱糖漿并且可用作甜味調(diào)味品，通常用于餅干、玉米面包、薄煎餅、熱 的谷類食品或烘豆。也可將其用作楓糖漿替代品。甜高粱糖漿可作為糖蜜類原料銷售。
[0234] 將未碾磨的谷物煮熟以制作蒸粗麥粉、粥、湯類和蛋糕。
[0235] 本發(fā)明的某些實(shí)施方式的高粱可用于多種培養(yǎng)以產(chǎn)生酒精飲料。
[0236] 在中國(guó)，高粱是用于生產(chǎn)蒸餾的酒水如茅臺(tái)酒和高粱酒的最重要的原料。
[0237] 在南部非洲，高粱被用于產(chǎn)生啤酒，包括吉尼斯黑啤酒（Guinness)的當(dāng)?shù)匕姹尽?釀造高粱啤酒的步驟是：麥芽制造、打漿、（可選地，酸處理）和酒精發(fā)酵。
[0238] 高粱產(chǎn)品可作為"無(wú)谷（無(wú)麩質(zhì)）蛋白"銷售。
[0239] 高粱也用作日用品和建筑材料。某些種類的高粱用于茅草屋頂、圍墻、籃筐、刷子 和掃帚，并且莖桿可用作燃料。高粱秸桿（莖桿纖維）也可做成用于房屋建筑的極好的壁 紙（建筑用紙板，wall board)，以及生物可降解的包裝。它不累積靜電，因此，它可被用于 用于靈敏性電子設(shè)備的包裝材料。
[0240] 本發(fā)明的某些實(shí)施方式的高粱也可用于產(chǎn)生生物燃料。應(yīng)該明白，在某些情況下， 以高粱汁液為基礎(chǔ)的（sorghum-sap-based)乙醇具有以玉米為基礎(chǔ)的乙醇4倍的能量產(chǎn) 額；它與甘蔗在同等水平（on par with)。汁液可用于乙醇而谷物用于如上述描述的食物。
[0241] 期望將在成熟自本申請(qǐng)的專利的存活期間開(kāi)發(fā)很多相關(guān)的高粱品種、高粱產(chǎn)品和 應(yīng)用并且此處提供的術(shù)語(yǔ)的范疇意在先驗(yàn)地（a priori)包括所有的這些新技術(shù)。
[0242] 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"約"指的是± 10 %。
[0243] 術(shù)語(yǔ)"包含（comprises) "、"包含有（comprising) "、"包括（includes) "、"包括有 (including) "、"具有（having) "和它們的變化意味著"包括但不限于"。
[0244] 術(shù)語(yǔ)"由…組成"意味著"包括但限于"。
[0245] 術(shù)語(yǔ)"基本上由…組成"意味著，組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括另外的成分、步驟和/ 或部分，只要另外的成分、步驟和/或部分不實(shí)質(zhì)地改變所要求的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基 本的和新的特征。
[0246] 如此處使用的，單數(shù)形式"一個(gè)（a)"、"一種（an)"和"該（the)"包括復(fù)數(shù)指代，除 非上下文另外明確地指出。例如，術(shù)語(yǔ)"化合物"或"至少一種化合物"可以包括多種化合 物，包含其混合物。
[0247] 遍及本申請(qǐng)，本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式可存在于范圍格式中。應(yīng)該明白，范圍格式的 描述僅僅為了方便和簡(jiǎn)潔且不應(yīng)該解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍的不可轉(zhuǎn)變的限制。因此，范圍 的描述應(yīng)該被認(rèn)為具有具體地公開(kāi)的所有可能的子范圍，以及那個(gè)范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例 如，如從1至6的范圍描述應(yīng)該被認(rèn)為具有具體地公開(kāi)的子范圍如從1至3、從1至4、從1 至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)字，例如，1、2、3、4、5和6。該 應(yīng)用與范圍的寬度無(wú)關(guān)。
[0248] 每當(dāng)此處指示數(shù)值范圍時(shí)，它意味著，包括指示的范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)字（分 數(shù)或整數(shù)的）。此處可替代地使用短語(yǔ)"范圍在第一指示數(shù)和第二指示數(shù)之間"和"范圍為 從第一指示數(shù)至第二指示數(shù)"且意味著包括第一指示數(shù)和第二指示數(shù)以及之間的所有的分 數(shù)和整數(shù)。
[0249] 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)"方法"是指用于完成給定的任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和方案， 包括但不限于，由化學(xué)、藥物學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè)者已知的，或容易地從 已知的方式、手段、技術(shù)和方案發(fā)展來(lái)的那些方式、手段、技術(shù)和方案。
[0250] 應(yīng)該明白，也可在單一實(shí)施方式中組合地提供為了清楚起見(jiàn)而在單獨(dú)的實(shí)施方式 中描述的本發(fā)明的某些特征。相反地，也可分別地或以任何適當(dāng)?shù)膩喗M合或在本發(fā)明的任 何其他描述的實(shí)施方式中適當(dāng)?shù)奶峁榱撕?jiǎn)潔起見(jiàn)而在單個(gè)的實(shí)施方式中描述的本發(fā)明 的多個(gè)特征。在多個(gè)實(shí)施方式中描述的某些特征不應(yīng)被認(rèn)為是那些實(shí)施方式的必要特征， 除非在沒(méi)有那些要素的情況下該實(shí)施方式不起作用。
[0251] 在下列實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)上文描述的和下面權(quán)利要求中所要求保護(hù)的的本發(fā)明的多 個(gè)實(shí)施方式和方面實(shí)驗(yàn)性支持。
[0252] 實(shí)施例
[0253] 現(xiàn)在參考下列實(shí)施例，連同上面的描述，其以非限制性方式說(shuō)明本發(fā)明的一些實(shí) 施方式。
[0254] 通常，此處使用的命名法和本發(fā)明中用的實(shí)驗(yàn)室方案包括分子生物學(xué)、生物化學(xué)、 微生物學(xué)的和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中充分地解釋這樣的技術(shù)。參見(jiàn)，例如，Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al. , (1989) ;〃Current Protocols in Molecular Biology^Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994) ；Ausubel et al.，''Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)； Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning", John WiIey&Sons, New York (1988) ；ffatson et al.，''Recombinant DNA〃，Scientific American Books, New York ； Birren et al. (eds)''Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);如在美國(guó)專利號(hào) US 4,666,828; 舊 4,683,202 山54,801，531山55，192,659 和舊 5,272,057 中闡明的方法； "Cell Biology:A Laboratory Handbook"，Volumes I-III Cellis,J.E.,ed. (1994)； "Current Protocols in Immunology^Volumes I-III Coligan J. E. , ed. (1994)； Stites et al. (eds)，''Basic and Clinical Immunology"（8th Edition), Appleton&La nge, Norwalk, CT (1994) ；Mishell and Shiigi (eds)，''Selected Methods in Cellular Immunology〃，W.H. Freeman and Co. ,New York(1980);在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中全面地描述 可用的免疫測(cè)定，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)US 3,791，932;US 3,839，153;US 3,850,752; US 3,850,578；US 3, 853, 987 ；US 3,867,517；US 3, 879, 262 ；US 3, 901, 654 ；US 3, 935, 074；US 3, 984, 533 ；US 3, 996, 345 ；US 4, 034, 074 ；US 4, 098, 876 ；US 4,879,219； 舊5,011，771和舊5,281，521;"0118〇1111。16〇衍(16 5711讓6818"6&^，]\1.了.，6(1· (1984) ;"Nucleic Acid Hybridization"Hames，B.D·，and Higgins S.J.，eds. (1985); ''Transcription and Tran si at ion ^Hames, B. D. , and Higgins S. J. , Eds. (1984) ;〃Animal Cell Culture^Freshney, R. I.,ed. (1986) ,Immobilized Cells and Enzymes^IRL Press, (1986) ;"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal，B·，（1984)和 "Methods in Enzymology〃Vol. 1-317,Academic Press ;〃PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications^, Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak et al.，''Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press (1996);其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。遍及該文件提供其他 一般引用。相信它們中的方案是本領(lǐng)域熟知的并且提供它們?yōu)榱碎喿x者的方便。其中包括 的所有的信息通過(guò)引用結(jié)合于此。
[0255] 實(shí)施例1
[0256] 多種遺傳背景的多倍體高粱棺物的產(chǎn)牛和定件（GENERATION ANDQUALIFICATI0N)
[0257] 材料和方法
[0258] 高粱系
[0259] 所檢查的系是雙色高粱（S. bicolor)的系。雙色高粱是高粱的栽培品種，它的 野生近緣種組成植物學(xué)屬高粱。雙色高粱通常被叫做高粱，并且也被稱為durra、蜀黍 (jowari)或買羅高粱（milo)，是為了它的谷物而栽培的禾本科物種，其用于動(dòng)物和人類兩 者的食物（11?"、10"、"冊(cè)"系），和用于青貯飼料類型（此處被稱為"551?"系）。
[0260] 基因組加倍方案
[0261] 在基因組加倍之前，用打氣的l:lNaCl:KN03,8ds/m的溶液處理雙色高粱（L) Moench的種子（此處稱為"AD系"、"ER對(duì)照"、"RM對(duì)照"或" ST對(duì)照"）48小時(shí)。然后，用 自來(lái)水洗滌種子并允許風(fēng)干24小時(shí)。對(duì)于基因組加倍方案，使種子在22°C下在充滿水的容 器中浸泡2小時(shí)，轉(zhuǎn)移到干凈的網(wǎng)袋中且在22°C的溫度下，插到蒸餾水充滿的超聲波浴中。 其后，在低于24°C的溫度下，進(jìn)行超聲處理15分鐘。在22°C，將袋子放置到含有pH = 6的 處理溶液的容器中，處理溶液包含0. 5% DMS0、5滴/L TritonXIOO、微管聚合抑制劑、抗氧 化劑、50 μ g/ml組蛋白。
[0262] 值得注意的是下列范圍的微管聚合抑制劑和抗氧化劑可用于處理溶液：
[0263] 微管聚合抑制劑-0. 1%長(zhǎng)春花堿硫酸鹽、0· 1-0. 5mg/ml秋水仙堿、0· 002-0. 005% 氟樂(lè)靈。
[0264] 抗氣化劑-25-50 U g/ml花青色素3_0_b-吡喃葡萄糖苷，10_6_1〇1黃芩黃素、 KT6-Kr4M槲皮黃銅或5-10mM奎諾二甲基丙烯酸酯。
[0265] 在磁場(chǎng)腔（參見(jiàn)，下文的"磁場(chǎng)腔"部分）內(nèi)的容器的2小時(shí)孵育之后，從袋子中移 除種子并且放置在塑料盤上的紙巾床的頂端，用第二層紙巾覆蓋且在22°C下浸泡在處理溶 液中另外的36小時(shí)（整個(gè)孵育期紙巾床保持潮濕）。收集種子且在干凈的容器中用水（pH =7)洗滌。所有的階段均在黑暗中進(jìn)行。
[0266] 此后，將處理過(guò)的種子放置在含有補(bǔ)充有35ppm的20:20:20微量元素肥料（Micro Elements Fertilizer)的土壤的幼苗托盤中，并且用22-25°C的白天溫度范圍、12-14°C 的夜晚范圍和40%的最低濕度移到苗圃。當(dāng)用長(zhǎng)春花堿時(shí)，立即在播種之后應(yīng)用1.5% GIBERLL0N。在接下來(lái)的3周，包括用ACADIAN?每周兩次的處理。
[0267] 磁場(chǎng)腔（腔室）
[0268] 磁場(chǎng)腔由彼此距離Ilcm的兩個(gè)磁鐵板組成。由兩個(gè)磁鐵產(chǎn)生的磁場(chǎng)是在它的中 心溶液（central solution)中具有1550高斯的最小強(qiáng)度的圈形磁場(chǎng)（如在材料和方法中 的"基因組加倍方案"下描述的），且將浴盆插入到磁場(chǎng)腔中。
[0269] 使用流式細(xì)胞術(shù)的倍性檢查
[0270] 由葉片制備用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞核樣品。在由9. 15g MgCl2、8. 8g檸檬酸鈉、 4. 19g3-[嗎啉代]丙烷磺酸、Iml Triton X-100、2L 8g山梨醇/升組成的切片緩沖液中， 用刀片切碎每個(gè)樣品（Icm2)。通過(guò)23 μ m尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾產(chǎn)生的漿體并且添加碘化丙啶（PI) 至0. 2mg/L的最終濃度。在冰上存儲(chǔ)染色的樣品并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0271] 流式細(xì)胞分析儀是 FACSCalibur (BD Biosciences ltd.)。
[0272] 育種者選擇
[0273] 基因組加倍方案（參見(jiàn)在材料和方法章節(jié)下的"基因組加倍方案"）應(yīng)用在上述 描述的遺傳背景的雙色高粱上。根據(jù)它們?cè)谔镩g的表型選擇高倍性植物。包括多個(gè)參數(shù) 的表型分析包括有葉片顏色、葉片厚度、種子顏色、種子大小。此后，F(xiàn)ACS分析證實(shí)植物和 它們的后代是穩(wěn)定的高倍性的植物。植物如下自交；在小穗成熟之前（在柱頭是可授性 (receptive)的之前），遮蓋母本的花序?；ㄐ虻恼谏w確保了授粉是自花授粉?；ㄊ谴菩弁?體的（雄性和雌性）。自發(fā)地發(fā)生授粉。在成熟后收獲種子。
[0274] 可育性檢驗(yàn)
[0275] 從新開(kāi)放的高粱花采集花粉。使花粉在含有20%蔗糖、3. 9mM CaCl2和4. 65mM硼 酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)。將花粉放置在顯微鏡載玻片上的萌發(fā)培養(yǎng)基中。在具有濾紙（mist filter paper)的有蓋培養(yǎng)皿中孵育載玻片。使用顯微鏡記錄萌發(fā)。從開(kāi)始檢測(cè)3小時(shí)和5 小時(shí)的花粉萌發(fā)。
[0276] 花粉粒尺寸分析
[0277] 輕輕地研磨來(lái)自二倍體系、ER對(duì)照和誘導(dǎo)的四倍體EP-系（ER6)的高粱花粉 粒并放置在玻璃載片上以檢查花粉大小。在室溫下用1%乙酸胭脂紅的液滴染色花粉 粒[Jahier et al. , 1996Chevre, R. Delourme, F. Eber, A. M. Tanguy. 1996. Techniques of plant cytogenetics. L. Anantharaman, Science Publishers, Lebanon, NH. ;10g 月因月旨紅 IL 乙酸水（45%乙酸）]。此后，將玻璃蓋玻片輕輕地放置在玻璃載玻片上。乙酸胭脂紅混合 物均勻地展開(kāi)。在復(fù)合顯微鏡下檢查玻璃載玻片且X200放大。
[0278] 益果
[0279] 通過(guò)使雄性雙色高粱的種子經(jīng)受如上述描述的基因組加倍方案產(chǎn)生了四倍體高 粱雄性植物。將加倍的種子稱為D1。將種子放置在含有補(bǔ)充有肥料的土壤的幼苗托盤上并 且使用上述指示的白天-夜晚溫度范圍和如上述描述的最小的濕度移到苗圃。
[0280] Dl植物自交以產(chǎn)生穩(wěn)定的四倍性D2植物。如下面表1，以及圖3、圖4和圖5示出 的，通過(guò)FACS分析證實(shí)多倍體植物的基因組穩(wěn)定性。
[0281] 分別地從植物收集花序。
[0282] 播種D2的后代并通過(guò)FACS分析進(jìn)行分析。所有的家族被證實(shí)為四倍體（表1以 及圖3和圖4)。
[0283] 通過(guò)D2植物的自交產(chǎn)生D3植物。通過(guò)FACS分析確定D3高粱種子的多倍性（表 1和表5,圖3、圖4和圖5)。
[0284] 對(duì)AD-系證明的現(xiàn)有結(jié)果顯示，與同基因的二倍體對(duì)照相比，多倍體高粱植物較 暗，它們的葉片較厚并且它們的種子較大（圖2)。與對(duì)照同基因的二倍體"AD"系相比，發(fā) 現(xiàn)D3四倍體高粱種子在形狀和大小上較大（圖1)。
[0285] 選擇AD系的八個(gè)D3家族用于進(jìn)一步的檢查，包括收獲產(chǎn)量和每植物花粉可育性 (表1，表3-表5,圖1-圖4)。
[0286] 與對(duì)照同基因二倍體植物相比，多倍體植物的作物產(chǎn)量（每植物總的種子重量） 增加平均L 5倍（表4)。
[0287] 本結(jié)果證明，多倍體植物具有與對(duì)照植物相等的花粉可育性（表5)。
[0288] 表1 :如由FACS分析證明的高粱種子的多倍性
[0289]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物，當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng) 時(shí)，至少與和所述基因組加倍的高粱植物同基因的二倍體高粱植物可育性相同。
2. -種具有權(quán)利要求1所述的植物作為親本祖先的雜種植物。
3. -種具有部分加倍或完全加倍的基因組的雜種高粱植物。
4. 權(quán)利要求1、2或3所述的植物，是雙色高粱（Sorghum bicolor)。
5. -種包括權(quán)利要求1、2、3或4所述的植物的種植田地。
6. -種包括權(quán)利要求1、2、3或4所述的植物的種子的播種田地。
7. 權(quán)利要求1、2、3或4所述的植物，是非轉(zhuǎn)基因的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物，其中，至少在所述具有部分加倍或完全加倍的基因 組的所述栽培高粱植物的第三世代上表現(xiàn)所述可育性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有比所述二倍體 1?梁植物更厚的葉片。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有比所述二倍體 高粱植物更暗的葉片。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的每植物總谷粒數(shù)比率。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的平均粒重。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有與所述二倍體 高粱植物類似的或較低的植物總長(zhǎng)度。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的每穗谷粒數(shù)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的穗長(zhǎng)度。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的穗寬度。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的莖寬度。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的旗葉長(zhǎng)度。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的旗葉寬度。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的葉脈寬度。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有類似于所述二 倍體高粱植物的單位面積谷物產(chǎn)量。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的谷粒尺寸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的谷物蛋白質(zhì)含量。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的干物質(zhì)重量。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，在相同的發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件下，具有至少類似于所 述二倍體高粱植物的花粉粒尺寸。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中，通過(guò)以下中的至少一項(xiàng)確定所述可育性： 每植物種子數(shù)； 配子可育性實(shí)驗(yàn)；和 乙酸胭脂紅花粉染色。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，是四倍體。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，是六倍體。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，能夠與四倍體高粱雜交育種。
30. -種權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的高粱植物的植物部分。
31. -種權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的植物或植物部分的加工產(chǎn)品。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的加工產(chǎn)品，選自由食品、飼料、建筑材料和生物燃料組成的 組。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的加工產(chǎn)品，其中，所述食品或飼料選自由面包、餅干、曲奇、 蛋糕、甜點(diǎn)、小吃、早餐谷物食品、面粉、粥、糖漿、甜的調(diào)味品、湯、爆米花、蒸粗麥粉和酒精 飲料組成的組。
34. -種從權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的植物或植物部分產(chǎn)生的膳食。
35. 權(quán)利要求30所述的植物部分，是種子。
36. -種權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的高粱植物的分離的可再生細(xì)胞。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，在培養(yǎng)中表現(xiàn)至少3次傳代的基因組穩(wěn)定性。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的細(xì)胞，來(lái)自分生組織、花粉、葉、根、根尖、花藥、雌蕊、花、種 子或莖。
39. -種包括權(quán)利要求36或38所述的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。
40. -種生產(chǎn)高粱植物種子的方法，包括使權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的植物自交或 雜父。
41. 一種使用植物育種技術(shù)開(kāi)發(fā)雜種植物的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-29所 述的植物作為用于自交育種和/或雜交育種的育種材料的來(lái)源。
42. -種生產(chǎn)高粱植物膳食的方法，所述方法包括： (a) 收獲權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的高粱植物或植物部分的谷粒；和 (b) 加工所述谷粒以生產(chǎn)所述高粱膳食。
43. -種產(chǎn)生具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物種子的方法，所述方法包 括在瞬時(shí)施加的磁場(chǎng)下使所述高粱植物種子與G2/M細(xì)胞周期抑制劑接觸，從而產(chǎn)生所述 具有部分加倍或完全加倍的基因組的高粱植物種子。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述G2/M細(xì)胞周期抑制劑包括微管聚合抑制 劑。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述微管聚合抑制劑選自由秋水仙堿、諾考達(dá) 唑、二苯基胺、氟樂(lè)靈和長(zhǎng)春花堿硫酸鹽組成的組。
46. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，進(jìn)一步包括在與所述G2/M細(xì)胞周期抑制劑的所述接 觸之前，使所述種子經(jīng)受引發(fā)步驟。
47. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述引發(fā)步驟包括超聲處理所述種子。
48. -種具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物的代表性的種子的樣品， 當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和所述基因組加倍的高粱植物同基因的二倍體高粱植物 可育性相同，其中所述樣品在布達(dá)佩斯條約下以NCMB42052(J-EP-D4)保藏于NCMB。
49. 一種具有部分加倍或完全加倍的基因組的栽培高粱植物的代表性的種子的樣品， 當(dāng)在相同的條件下生長(zhǎng)時(shí)，至少與和所述基因組加倍的高粱植物同基因的二倍體高粱植物 可育性相同，其中具有所述部分加倍或完全加倍的基因組的所述栽培高粱植物的所述樣品 在布達(dá)佩斯條約下以NCMB42052(J-EP-D4)保藏于NCMB。
【文檔編號(hào)】A01H5/10GK104270939SQ201280070796
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月28日
【發(fā)明者】阿米特·阿維多夫, 艾塔瑪·盧波, 利拉赫·羅特姆 申請(qǐng)人:凱伊瑪生物農(nóng)業(yè)科技有限公司