專利名稱：抗病性轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及賦予植物抗病性的方法和材料。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有賦予抗病性，特別是抗傳染性病原體如病毒的異源核酸的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及制備這些轉(zhuǎn)基因植物的方法和材料。
栽培植物的傳染病造成全世界的食品、飼料和纖維大量減產(chǎn)。這些疾病的控制主要建立在培養(yǎng)實(shí)踐上，包括除去受感染的碎屑、消滅雜草宿主(使用除草劑)、防止載體傳染(使用殺蟲劑)、尋找無(wú)病原體原料(種子或無(wú)性繁殖體)和培育抗病性。大規(guī)模治療被病毒感染的植物的方法不存在。因此，疾病的控制依賴于預(yù)防或延遲感染形成的方法。
上述疾病控制方法中，因?yàn)榕嘤共⌒詫?duì)培育者不需要附加勞動(dòng)或費(fèi)用，因此它通常是最經(jīng)濟(jì)且切實(shí)可行的方法之一。而且，控制抗病性不需要使用除草劑或殺蟲劑消滅雜草宿主和昆蟲載體。因此，宿主抗性是用于控制植物疾病中對(duì)環(huán)境最安全且持久的方法之一。不幸的是，在許多植物-病毒體系中，抗性不易獲得并且不能使用傳統(tǒng)植物育種策略獲得。然而，在分子生物學(xué)和基因工程中的最新進(jìn)展已證實(shí)，將新型抗病因子整合到之前從未存在的植物-病毒體系中是有幫助的。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)已證實(shí)是一種防止植物遭受病毒病的有價(jià)值的策略。例如，Stubbs,G等人的美國(guó)專利US5723750描述了表達(dá)編碼不同病毒種群的野生型和經(jīng)過(guò)修飾的外殼蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因植物。已顯示這些轉(zhuǎn)基因植物具有不同水平的抗相應(yīng)病毒感染抗性。不幸的是，編碼外殼蛋白的異源基因的表達(dá)不賦予廣譜抗病毒感染抗性并對(duì)其它傳染試劑引起的病理無(wú)效。
植物抗致病傳染性的重要機(jī)理為過(guò)敏反應(yīng)(“HR”)。在該HR期間，對(duì)病原體的識(shí)別誘導(dǎo)快速細(xì)胞死亡過(guò)程，該過(guò)程導(dǎo)致圍繞感染部位形成死細(xì)胞區(qū)(壞死)。該HR病灶據(jù)信抑制病原體進(jìn)一步擴(kuò)散并產(chǎn)生激活宿主防御機(jī)理的信號(hào)，并且在許多情況下誘導(dǎo)長(zhǎng)期系統(tǒng)性的抗廣譜病原體的抗性(Ross,1961)。(在本說(shuō)明書后面提供了參考書目。)這種系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)被稱為系統(tǒng)獲得抗性(SAR)并伴隨幾種病理相關(guān)(PR)的蛋白質(zhì)的合成速度增加和水楊酸(SA)的累積增加(Malamy等人，1990；Metraux等人，1990；Ward等人，1991)。
還描述了在感染植物中誘導(dǎo)該HR的方法。例如，Lam,E.等人的US5629470描述了一種通過(guò)用細(xì)菌視蛋白(bO)基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞提供具有對(duì)一種或多種植物病原體的致病性攻擊的抗性增強(qiáng)的高等植物的方法。
鑒于傳染病對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的巨大經(jīng)濟(jì)影響，因此一直存在對(duì)產(chǎn)生致病傳染抗性的轉(zhuǎn)基因植物的需要。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)，用黃瓜花葉病毒屬的2b基因或其活性片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物具有對(duì)致病感染因子如病毒的系統(tǒng)抗性。由該基因編碼的該蛋白質(zhì)激活宿主植物中強(qiáng)的抗病性反應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及用黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的種子和繁殖部分。本發(fā)明還提供了將黃瓜花葉病毒屬2b基因引入植物的方法和載體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了來(lái)自質(zhì)粒pTMV-t2b和pPVX-t2b的嵌合病毒RNA轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)特征和基因組結(jié)構(gòu)。
圖2為顯示該2b基因?qū)χ虏∠嚓P(guān)蛋白質(zhì)在用攜帶該2b基因的煙草花葉病毒感染的煙草植物葉中表達(dá)的影響的Northern印跡雜交。
發(fā)明詳述黃瓜花葉病毒(CMV)屬于稱為黃瓜花葉病毒的病毒屬，該屬還包括番茄無(wú)子病毒(TAV)。黃瓜花葉病毒屬含有編碼以下5個(gè)基因的三聯(lián)單鏈RNA基因組1a、2a、2b、3a和外殼蛋白。該2b基因的鑒定和功能分析已描述在以前出版物中(Ding等人，1994；1995；1996)。已證實(shí)，這些黃瓜花葉病毒屬編碼的該2b基因?qū)ο到y(tǒng)性病毒擴(kuò)散和毒力確定都是重要的。在SEQ ID NO.1中提供了該2b基因的核糖核苷酸序列。
已公開了，當(dāng)該2b基因由黃瓜花葉病毒屬的基因組單獨(dú)地表達(dá)時(shí)，當(dāng)受到致病病毒感染時(shí)它在許多植物種中激活強(qiáng)的抗性反應(yīng)。這些反應(yīng)包括誘導(dǎo)致病相關(guān)蛋白質(zhì)并形成消除侵入病原體的壞死斑。因此，一方面，本發(fā)明涉及用可操縱地與啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)所述植物被致病生物體感染時(shí)該啟動(dòng)子能夠影響所述基因在所述植物中表達(dá)。用于生產(chǎn)抗病性植物的黃瓜花葉病毒屬2b基因優(yōu)選為SEQ IDNO.1的核酸在嚴(yán)格條件下與其雜交的基因。
在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供了使植物抗傳染性病原體引起的疾病的方法，該方法包括用操縱地與植物活性啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化該植物，當(dāng)所述植物被致病生物體感染時(shí)該啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)所述基因在所述植物中表達(dá)。在另一方面，本發(fā)明提供了含有可操縱地與植物活性啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段的表達(dá)載體。
突變分析已證實(shí)，該2b基因引起該抗性反應(yīng)。已顯示該基因中的點(diǎn)突變使其失去功能并廢止該基因激活該抗性反應(yīng)的能力。此外，盡管可以在不失活情況下將編碼這4個(gè)C-端氨基酸的密碼子除去，但是已發(fā)現(xiàn)該基因的C-端26個(gè)氨基酸和45個(gè)氨基酸序列對(duì)其抗病功能是必不可少的。將編碼番茄無(wú)子病毒2b基因的C-端26個(gè)氨基酸和C-端45個(gè)氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)移到無(wú)活性黃瓜花葉病毒2b基因的相應(yīng)區(qū)域不能產(chǎn)生活性嵌合基因；因此，該蛋白質(zhì)的N-端部分還顯示含有一個(gè)或多個(gè)對(duì)抗性激活必不可少的結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的常規(guī)基因圖譜實(shí)驗(yàn)將證實(shí)該2b基因的活性結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明涉及含有該2b基因活性片段的轉(zhuǎn)基因植物和載體。
可以使用常規(guī)載體和步驟將該2b基因或其活性片段(下文的“2b基因”)引入植物。通常，這些技術(shù)涉及將該2b基因插入含有用于轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的編碼序列和一個(gè)或多個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物的標(biāo)記序列所必需的元件的表達(dá)載體中。
在本領(lǐng)域中已知大量植物活性的啟動(dòng)子，并且可以將它們用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明公開的核酸序列的表達(dá)?？梢允褂媒M成型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒的nos啟動(dòng)子或35S啟動(dòng)子；然而，組成型表達(dá)可能對(duì)轉(zhuǎn)基因植物有害。因此，優(yōu)選可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，特別是病原體可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如致病相關(guān)蛋白質(zhì)啟動(dòng)子。
一旦將該2b基因克隆到表達(dá)載體中，可以使用常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟將其導(dǎo)入植物細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”意指包含來(lái)自包括未分化組織如愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物、以及植物種子、花粉或植物胚的植物的任意細(xì)胞。適宜轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織、原生質(zhì)體、下胚軸、子葉、角質(zhì)鱗片、苗端、根、未成熟胚、花粉和花藥。
用于轉(zhuǎn)化植物的一種技術(shù)是通過(guò)將這些植物的組織與用含有本發(fā)明的2b基因的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種物接觸。通常該步驟涉及用細(xì)菌懸浮液接種植物組織并在沒有抗生素的再生培養(yǎng)基上在25-28℃下將該組織培養(yǎng)48-72小時(shí)。
可以優(yōu)選使用來(lái)自農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。這些細(xì)菌的適宜種包括根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌。由于根癌農(nóng)桿菌(例如菌株LBA4404或EHA105)的眾所周知的轉(zhuǎn)化植物的能力，因此它特別有用。
用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一方法涉及將惰性或生物活性顆粒推入植物細(xì)胞中。該技術(shù)公開在授予Sanford等人的美國(guó)專利US4945050、5036006和5100792中，將它們加入本文作為參考。通常，該步驟涉及在有效地穿透細(xì)胞外表面并摻入其內(nèi)部的條件下將惰性或生物活性顆粒推入細(xì)胞中。當(dāng)使用惰性顆粒時(shí)，可以通過(guò)用含有2b基因的載體包被該顆粒將該載體導(dǎo)入該細(xì)胞中。還可以將生物活性顆粒(例如干酵母細(xì)胞、干細(xì)菌或噬菌體，各自含有經(jīng)尋找待引入的DNA)推入植物細(xì)胞組織中。
轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一方法是電穿孔法。該方法涉及將原生質(zhì)體和所需DNA混合并通過(guò)電脈沖在細(xì)胞膜上形成孔，從而將該DNA引入這些細(xì)胞中，因此轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。該方法目前具有高的再現(xiàn)性并且已通過(guò)該方法將不同基因引入單子葉植物，特別是水稻中(Toriyama等人，1988,Shimamoto等人，1989和Rhodes等人，1988)。
一種與電穿孔法相似的方法，它是將所需基因和原生質(zhì)體混合并用聚乙二醇(“PEG”)處理該混合物，從而將該基因引入這些原生質(zhì)體中。該方法與電穿孔法的不同之處在于使用PEG代替電脈沖(ZhangW.等人，1988,Datta等人，1990和Christou等人，1991)。
其它方法包括1)用核酸培養(yǎng)種子或胚(Topfer R.等人，1989,Ledoux等人，1974)、2)花粉管處理(Luo等人，1988)、3)脂質(zhì)體法(Caboche,1990)和4)顯微注射法(Neuhaus G.等人，1987)。
可以使用由經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物的已知方法制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。通常，可以將外植體、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物暴露于適宜化學(xué)環(huán)境(例如細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素)中，這樣該新生長(zhǎng)的細(xì)胞可以分化并產(chǎn)生胚，然后這些胚再生成根和莖。
在單子葉植物("monocots")和雙子葉植物("dicots")中，如玉米、小麥、水稻、粟、燕麥、大麥、高粱、向日葵、甘薯、苜蓿、甜菜、芥子、番茄、胡椒、大豆、煙草、甜瓜、南瓜、馬鈴薯、花生、豌豆、棉花或可可中，該2b基因在增強(qiáng)對(duì)致病病原體的抗性中都是有用的。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不將其限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1(載體構(gòu)建)
近年來(lái)已開發(fā)出幾個(gè)基于植物RNA病毒的有效植物表達(dá)系統(tǒng)。將基于煙草花葉病毒(TMV)(US5589367)和馬鈴薯病毒X(PVX；Chapman等人，1992)的載體用于表達(dá)黃瓜花葉病毒屬的2b基因的這些工作。圖1顯示了構(gòu)建的嵌合病毒(TMV-t2b和PVX-t2b)的結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)由pQCD2qt(Ding等人，1996)PCR擴(kuò)增TAV ORF 2b編碼序列(RNA2中核苷酸2447-2734)制備TAV(SEQ ID NO.1，編碼95個(gè)氨基酸)的2b基因的編碼序列。將該序列插入TMV和PVX基因組中各自外殼蛋白(CP)基因的上游。在稱為pTMV-30B的TMV載體的PmeI位點(diǎn)平端克隆該P(yáng)CR片段，從而獲得TMV-t2b(圖1)。在TMV-t2b中的TAV插入片段作為AgeⅠ-XhoⅠ片段被切下(參見圖1)，并且該片段被末端補(bǔ)平并克隆成ClaⅠ-消化且末端補(bǔ)平的pPC2S(基于馬鈴薯病毒X的表達(dá)載體(Chapman等人，1992))，從而生產(chǎn)PVX-t2b。通過(guò)非依賴性啟動(dòng)子(圖1中箭頭標(biāo)記為1和3)控制該2b基因表達(dá)，這些啟動(dòng)子僅被TMV或PVX編碼的各自RNA依賴型RNA聚合酶識(shí)別。
使用TMV或PVX的2b表達(dá)衍生物(TMV-t2b和PVX-t2b)感染植物，并將該2b基因的功能作用表示為野生型和其2b表達(dá)衍生物之間在誘導(dǎo)植物反應(yīng)中的差異。
實(shí)施例2(在煙草Samsun中的抗性)TMV-t2b在Samsun(nn)煙草植物中誘導(dǎo)典型的過(guò)敏反應(yīng)(HR)。如所述(Chapman等人，1992)在有帽模擬物(NEB)的情況下使用T7RNA聚合酶(Promega)在體外將質(zhì)粒pTMV-30B、pPC2S及其衍生物線性化并轉(zhuǎn)錄。加帽RNA轉(zhuǎn)錄物經(jīng)機(jī)械接種到茂盛生長(zhǎng)的煙草Samsun(nn)的葉上。將這些植物在Conviron生長(zhǎng)室(24℃恒定，75％濕度和16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)中培養(yǎng)。在接種約4天后在所接種的葉上出現(xiàn)局部壞死斑，一直進(jìn)行觀察(5周)，植物的剩余部分沒有癥狀。通過(guò)Northern印跡分析沒有檢測(cè)出病毒RNA在未接種葉上部累積，因此進(jìn)一步證實(shí)了TMV-t2b沒有擴(kuò)散到Samsun(nn)植物系統(tǒng)。而且，用于致病相關(guān)(PR)蛋白質(zhì)1(PR-1)、PR-3和PR-5的mRNA的轉(zhuǎn)錄在接種葉中經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)。參見圖2，為用TMV-t2b或TMV攻擊的植物葉的Northern印跡。使用PR-1a cDNA作為探針(通過(guò)由基于Comelissen,B.J.等人公開的序列的煙草植物的PCR擴(kuò)增獲得(1987))進(jìn)行Northern印跡雜交。第5天(道1)、第7天(道2)、第10天(道3)和第13天(道4)從植物提取的所有RNA顯示PR-1的表達(dá)增加。道5和6用野生型TMV感染；然而，道5的煙草基因型為nn，而道6的為NN。
這些結(jié)果顯示出，Samsun(nn)煙草植物對(duì)TMV-t2b有抗性，并且通過(guò)TMV-t2b的攻擊接種誘導(dǎo)HR的形態(tài)學(xué)標(biāo)記(局部壞死斑)和分子標(biāo)記(PR蛋白質(zhì)誘導(dǎo))都表達(dá)在這些植物中。
已知，煙草Samsun(nn)不含對(duì)TMV特異性的抗性基因，并且這在本研究中得到證實(shí)當(dāng)單獨(dú)用載體TMV-30B感染時(shí)，這些煙草植物形成系統(tǒng)性花葉癥狀并且觀察不到PR基因的誘導(dǎo)。因此，得出結(jié)論煙草植物對(duì)TMV-t2b攻擊的抗性反應(yīng)是由于來(lái)自TMV基因組的TAV 2b基因的順式表達(dá)。
實(shí)施例3(證明2b基因引起抗性)構(gòu)建兩個(gè)TMV-t2b突變體，各含有點(diǎn)突變以破壞讀框2b。預(yù)期TMV-tΔ2b1(SEQ ID NO.2)不翻譯感染植物中的任意2b蛋白質(zhì)。然而，在用TMV-tΔ2b2(SEQ ID NO.3)感染的植物中，希望表達(dá)失去C-端52個(gè)氨基酸殘基的截短的2b蛋白質(zhì)。在經(jīng)過(guò)接種的葉中TMV-tΔ2b1和TMV-tΔ2b2都不誘導(dǎo)局部壞死斑，也不誘導(dǎo)PR蛋白質(zhì)的mRNA的轉(zhuǎn)錄。因此，TAV 2b蛋白質(zhì)起抗性反應(yīng)激活劑的作用。插入的TAV核苷酸序列本身在引起HR中不起作用。此外，看出TAV 2b蛋白質(zhì)的C-端52氨基酸序列對(duì)該活性(參見下面)是必不可少的。
實(shí)施例4(抗性激活結(jié)構(gòu)域的測(cè)定)
通過(guò)黃瓜花葉病毒(CMV)的Q菌株編碼的2b基因(SEQ ID NO.4)經(jīng)過(guò)相似改造以由TMV基因組表達(dá)。系統(tǒng)性感染Samsun煙草植物的稱為TMV-q2b的衍生物在接種葉上不誘導(dǎo)壞死斑，也不誘導(dǎo)用于PR蛋白質(zhì)的mRNA的轉(zhuǎn)錄。這說(shuō)明，與TAV 2b蛋白質(zhì)相反，該CMV2b蛋白質(zhì)對(duì)抗性激活無(wú)活性。
為了定位對(duì)抗性激活重要的結(jié)構(gòu)域，將TMV-t2b編碼的TAV 2b蛋白質(zhì)逐漸從C-端被CMV 2b蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等價(jià)的區(qū)域所替換。傳染性測(cè)定顯示，替換TAV 2b蛋白質(zhì)的C-端4個(gè)氨基酸保留其HR觸發(fā)活性。但是，TAV 2b蛋白質(zhì)的C端替換26個(gè)或45個(gè)氨基酸，其觸發(fā)HR的能力消失。這說(shuō)明，盡管在不失去活性的情況下可以將編碼4個(gè)C-端氨基酸的密碼子除去，但是TAB 2b蛋白質(zhì)的C-端26個(gè)氨基酸對(duì)在煙草植物中的抗性激活是必不可少的。將編碼番茄無(wú)子病毒2b基因的C-端26個(gè)氨基酸和C-端45個(gè)氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)移到無(wú)活性黃瓜花葉病毒2b基因的相應(yīng)區(qū)域不產(chǎn)生活性嵌合基因；因此，該蛋白質(zhì)的N-端部分也顯示含有一個(gè)或多個(gè)對(duì)抗性激活必不可少的結(jié)構(gòu)域。
實(shí)施例5(在其它植物種中的抗性)因?yàn)镹icotiana benthamiana和Physalis floridana植物與該Samsun煙草的相似之處在于它們都對(duì)TMV敏感，并且被感染的植物不產(chǎn)生HR。感染性測(cè)定顯示，用TMV-t2b的攻擊接種在Nicotianabenthamiana和Physalis floridana植物的接種葉中都誘導(dǎo)典型局部壞死斑，同時(shí)植物未感染部分保持無(wú)癥狀。這些結(jié)果暗示，TAV 2b基因還能夠激活這些植物種對(duì)TMV的抗性。TAV 2b基因能夠在2個(gè)屬的三個(gè)不同植物種中激活對(duì)TMV的抗性的事實(shí)暗示，它在廣泛宿主種中起相似作用。
實(shí)施例6(對(duì)馬鈴薯病毒X的抗性)Samsun(nn)和Xanthi-nc(NN)煙草(N.tabacum)植物對(duì)馬鈴薯病毒X(PVX)和來(lái)自以PVX為基礎(chǔ)的載體(pPC2S)的RNA轉(zhuǎn)錄物都完全敏感(Chapman等人，1992)。但是，用PVX-t2b轉(zhuǎn)錄物接種在兩種煙草品種的葉中都誘導(dǎo)HR。通過(guò)PVX-t2b感染誘導(dǎo)的壞死斑與通過(guò)TMV-t2b在Samsun(nn)植物上誘導(dǎo)的大致相同。此外，Northern印跡分析顯示，在用PVX-t2b攻擊的植物中還誘導(dǎo)PR基因的轉(zhuǎn)錄，但在用PVX或單獨(dú)用PVX載體攻擊的植物中不誘導(dǎo)PR基因的轉(zhuǎn)錄。因此，來(lái)自PVX基因組的TAV 2b基因順式表達(dá)還能夠在不含對(duì)PVX特異的抗性基因的煙草植物中觸發(fā)抗性反應(yīng)。
TMV和PVX是不同病毒屬的不同植物RNA病毒，這兩個(gè)病毒的編碼蛋白質(zhì)具有最小序列相似性。因此，不太可能TAV 2b基因的抗性激活需要與由兩個(gè)病毒載體編碼的任意蛋白質(zhì)特異性相互作用。這些結(jié)果暗示了一種可能性，TAV 2b基因?qū)⒖梢约せ顚?duì)廣泛植物病原體的抗性機(jī)理。
野生型TAV(Ding等人，1994)和CMV/TAV嵌合CMV-qt(Ding等人，1996)都編碼TAV 2b基因，它在被感染的植物中以高水平表達(dá)(Shi等人，1997)。以前還顯示，用于該工作的所有三個(gè)植物種對(duì)TAV和CMV-qt完全敏感(Ding等人，1996)。這暗示，這些植物種不含識(shí)別TAV 2b基因的抗性基因。該結(jié)果說(shuō)明，TAV 2b基因的抗性激活活性在這些植物種中不是組成型的，它可能需要例如用某些毒性病原體(例如TMV和PVX)感染的誘導(dǎo)事件。這種屬性將該TAV 2b基因與已知通過(guò)植物病原體編碼的無(wú)毒性基因區(qū)別開來(lái)。
參考文獻(xiàn)Caboche(1990).植物生理學(xué)79:173-176Chapman,S.,Kavanagh,T.和Baulcombe,D.(1992)作為植物中基因表達(dá)載體的馬鈴薯病毒X植物雜志，2,549-557Christou等人(1991)生物/技術(shù)9:957-962Cornelissen,B.J.等人(1987)從PR-1組編碼致病相關(guān)蛋白質(zhì)的煙草基因的結(jié)構(gòu)核酸研究，15,6799-6811Datta等人(1990)生物/技術(shù)8:736-740Ding,SW.、Anderson,BJ.、Haase,HR.和Symons,RH.(1994)由黃瓜花葉病毒基因組編碼的新型重疊基因病毒學(xué)，198,593-601Ding,SW.、Li,W X.和Symons,RH.(1995)由植物RNA病毒編碼的天然存在的雜交基因促進(jìn)病毒長(zhǎng)距離移動(dòng)EMBO J.,14,5762-5772Ding,SW.、Shi,BJ.、Li,WX.和Symons,RH.(1996)種間雜交RNA病毒比任一親本病毒的毒性大得多Proc.Nat＇l Acad.Sci.USA,93,7470-7474Ludoux等人，(1974)自然，249:17-21Kumagai,MH.、Turpen,TH.、Weinezettl,N.、Della-CioppaG.、Turpen,AM.、Donson,J.、Hilf,ME.、Grantham,GL.、Dawson,WO.、Chow,TP.、Piatak,M.和Grill,LK.(1993)在轉(zhuǎn)染植物中通過(guò)RNA病毒載體快速、高水平地表達(dá)生物活性畸變天花粉蛋白Proc.Nat′l Acad.Sci.USA,90,427-430Malamy,J.、Henning,J.和Klessig,D.F.(1992)在對(duì)煙草花葉病毒感染的抗性反應(yīng)期間水楊酸和其共軛物的溫度依賴性誘導(dǎo)植物細(xì)胞，4,359-366Metraux,J.P、Singer,H.、Rayals,J.、Ward,E.、Wyss-Benz,M.、Gaudin,J.、Raschdorf,K.、Schmid,E.、Blum,W.和Inverardi,B.(1990)在黃瓜中在系統(tǒng)獲得性抗性出現(xiàn)時(shí)水揚(yáng)酸增加科學(xué)，250,1004-1006Rhodes等人，(1981)科學(xué)，240,204-207Ross,A.F.(1961)通過(guò)在植物中局部病毒感染誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性病毒學(xué),14,340-358Shi,BJ.、Ding,SW.和Symons,RH.(1997)由黃瓜花葉病毒屬編碼的重疊基因的體內(nèi)表達(dá)普通病毒學(xué)雜志，78,237-241Shimamoto等人，(1989)自然，338:274-277Topfer R.等人，(1989)植物細(xì)胞，1,133-139Toriyama等人，(1988)生物/技術(shù)6:1072-1074Ward,E.R.、Uknes,S.J.、Williams,S.C.、Dincher,S.S.、Widerhold,D.L.、Alexander,D.C.、Ahl-Goy,P.、Metraux,J-P.和Ryals,J.A.(1991)響應(yīng)誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性的試劑的協(xié)同基因活性植物細(xì)胞，3,1085-1094Zhang W.等人，(1988)遺傳學(xué)理論和應(yīng)用，76,835-840
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人丁守偉(ⅱ)發(fā)明名稱抗病性轉(zhuǎn)基因植物(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)通信地址(A)收信人Rothwell,Figg,Ernst & Kurz(B)街道555 Thirteenth Street,N.W.,Suite 701 East(C)城市華盛頓(D)州DC(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編20004(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0,Version #1.30(ⅵ)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Figg,Edward A.
(B)登記號(hào)27195(C)索引/摘要號(hào)2248-108(ⅸ)通訊信息(A)電話202-783-6040(B)傳真202-783-6031(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度328個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物體番茄無(wú)子病毒(ⅶ)即時(shí)來(lái)源(B)克隆pTMV-30B(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ACCGTTAAGA AGAAGAAGAA TGGCAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAACA AAGGCGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度328個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸
(A)說(shuō)明/desc=“合成DNA”(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物體番茄無(wú)子病毒(ⅶ)即時(shí)來(lái)源(B)克隆pTAVd2b1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:ACCGTTAAGA AGAAGTAGAA TGTAAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAACA AAGGCGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度328個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc=“合成DNA”(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物體番茄無(wú)子病毒(ⅶ)即時(shí)來(lái)源
(B)克隆pTAVd2b2(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ACCGTTAAGA AGAAGTAGAA TGTAAAGCAT CGAGATCCCT CTACACGAGA TCATTCGAAA 60GTTGGAACGG ATGAATCAAA AGAAACAAGC ACAGAGGAAA CGACACAAAC TGAACCGCAA 120GGAGCGGGGT CACAAAAGTC CAAGTGAATA AAGGTGATCG GAGTTATGGC ACGCGCGTCA 180AGTTGAACTT TCTGCCATTA ATTCCGATAA TTCTTCAGAT GAGGGTACCA CTCTGTGTCG 240CTTTGACACA TTTGGTTCCA AGTCTGATGC TATTTGTGAT CGCTCTGACT GGTGTCTCGA 300TCAATGATTT CCGACCCTTC GTCGTCCG 328(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度504個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(A)生物體黃瓜花葉病毒(ⅶ)即時(shí)來(lái)源(B)克隆pCMV2b(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GATCCATGGA TGTGTTGACA GTAGTGGTGT CGACCGCCGA CCTCCACTTA GCCAATTTGC 60AGGAGGTGAA ACGTCGAAGA CGAAGGTCTC ACGTCAGAAA CCGGCGAGCG AGGGGTTACA 120AAAGTCCCAG CGAGAGAGCG CGATCTATAG CGAGACTTTT CCAGATGTTA CCATTCCACG 180GAGTAGATCC CGTGGATTGG TTTCCTGATG TCGTTCGCTC TCCGTCCGTT ACCAGCCTTG 240TTTCTTATGA ATCTTTTGAT GATACTGATT GGTTTGCTGG TAACGAATGG GCCGAAGGGT 300CGTTTTGATT TCCGACCCTT CGTCGTCCGA AGACGTTAAA CTACGCTCTC TTTATTGCGA 360GTGCTGAGTT GGTAGTTTGC TCTAAACTAT CTGAAGTCGC TAAATCCATT ACTGGTTGCG 420AACGGGTTGT CCATCCAGCT TACGGCTAAA ATGGTCAGTC ATGCCCCAAA GGCATGCCGA 480CACCCTACAG GGTTGTCGAG GTAC 50權(quán)利要求
1．一種用可操縱地與啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)所述植物被致病生物體感染時(shí)該啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)所述基因在所述植物中的表達(dá)。
2．權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因?yàn)镾EQ ID NO.1的核酸在嚴(yán)格條件下與其雜交的基因。
3．權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因基本上具有SEQ ID NO.1的序列。
4．權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物用所述黃瓜花葉病毒屬2b基因的活性片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
5．權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質(zhì)的至少26個(gè)C-端氨基酸的核酸序列。
6．權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質(zhì)的至少45個(gè)C-端氨基酸的核酸序列。
7．權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述片段不含編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質(zhì)的4個(gè)C-端氨基酸的氨基酸。
8．權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述2b基因的表達(dá)是由病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制的。
9．權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，其中病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子為PR蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子。
10．一種賦予植物抗感染性病原體引起的疾病的抗性的方法，包括用可操縱地與啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物，當(dāng)所述植物被致病生物體感染時(shí)該啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)所述基因在所述植物中的表達(dá)。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因?yàn)镾EQID NO.1的核酸在嚴(yán)格條件下與其雜交的基因。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述黃瓜花葉病毒屬2b基因基本上具有SEQ ID NO.1的序列。
13．權(quán)利要求10的方法，其中所述植物用所述黃瓜花葉病毒屬2b基因的活性片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質(zhì)的至少26個(gè)C-端氨基酸的核酸序列。
15．權(quán)利要求13的方法，其中所述片段包括編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質(zhì)的至少45個(gè)C-端氨基酸的核酸序列。
16．權(quán)利要求13的方法，其中所述片段不含編碼黃瓜花葉病毒屬2b基因所編碼的蛋白質(zhì)的4個(gè)C-端氨基酸的氨基酸。
17．權(quán)利要求10的方法，其中所述2b基因的表達(dá)是由病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制的。
18．權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
19．權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8或9的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖部分。
20．權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，為玉米、小麥、水稻、粟、燕麥、大麥、高粱、向日葵、甘薯、苜蓿、甜菜、芥子、番茄、胡椒、大豆、煙草、甜瓜、南瓜、馬鈴薯、花生、豌豆、棉花或可可。
21．一種表達(dá)載體，含有可操縱地與植物活性啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段。
22．權(quán)利要求21的表達(dá)載體，其中黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段的表達(dá)是由病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制的。
23．權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其中所述病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子為PR蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子。
全文摘要
用黃瓜花葉病毒屬2b基因或其活性片段轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對(duì)感染性病原體如病毒引起的疾病的抗性。該2b基因的表達(dá)引起過(guò)敏反應(yīng)活化并在不能對(duì)某些病原體有該反應(yīng)的植物中表達(dá)致病性相關(guān)蛋白質(zhì)。用包含可操縱地與植物活性啟動(dòng)子連接的黃瓜花葉病毒屬2b基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化各類植物使這些植物能抗致病性感染。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1301308SQ9881416
公開日2001年6月27日 申請(qǐng)日期1998年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月12日
發(fā)明者丁守偉 申請(qǐng)人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院