利用球孢白僵菌BbP4-ATPase基因提高植物對黃萎病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，設(shè)及利用基因工程技術(shù)提高植物抗病 性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃萎病嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，全球每年因黃萎病引起的損失達數(shù)十億美元 (Pegg et al. ,2002)。報道稱馬鈴馨因感染黃萎病年產(chǎn)量減少50% W上，通常情況下可W 引起 10-15%的減產(chǎn)(Powelson et al.，1993;Rowe et al.，1987,2002);生菜種植區(qū)，黃萎 病引起的損失非常容易達到100% (Subbarao et al. , 1997) ;Levinet(2003)等研究發(fā)現(xiàn)， 油橄攬因黃萎病引起的減產(chǎn)可W達到70% W上；黃萎病也是多數(shù)植棉國家的棉花主要病 害，比如，澳大利亞、己西、保加利亞、中國、希臘、秘魯、±耳其、烏干達、美國和烏茲別克斯 坦等國家，可W造成30%W上棉花的減產(chǎn)(Bolek et曰1.，2005)，發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)或年份減 產(chǎn)可W達到100%。黃萎病是制約我國棉花生產(chǎn)的一種主要病害，目前我國各棉區(qū)的發(fā)病面 積已占植棉總面積的50% W上，每年損失皮棉7.5-10萬噸，直接經(jīng)濟損失16-20億元（肖松 華等，2006)。在我國棉花黃萎病重病地塊逐年增多，危害逐年加重，已成為當(dāng)前實現(xiàn)棉花高 產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素。黃萎病不僅引起作物大量減產(chǎn)和產(chǎn)品品質(zhì)降低，其致病菌產(chǎn)生的 毒素也能危害人類的健康。
[000引黃萎病主要是由大麗枝菌Ver t i C i 11 i um dah 1 iae K1 eb和黑白輪枝菌 Verticillium a化oatrum侵染引起的一種±傳維管束病害。病原菌一旦侵入植物體內(nèi)，便 沒有有效的防治方法。黃萎病菌寄主范圍廣，可W侵染包括所有雙子葉植物在內(nèi)的200多種 植物，病原菌能W微菌核的形式在±壤中存活20年左右化losterman et日1.,2009)，除 2001年Kawchuk等從番茄中克隆得到1個針對茄屬黃萎病菌的抗病基因 VeW外，幾乎沒有克 隆到來自其他植物的抗病基因，對Ve抗病基因的機制研究表明該基因只對黃萎病菌的部分 小種具有抗性(Fradin et al. ,2009)。早期的研究認(rèn)為，植物感染黃萎病后，其導(dǎo)管被抱 子、菌絲W及病原菌通過植物細胞形成的膠狀物等堵塞而致萎黨壞死(Agrios，2005)，但 是，隨后的研究表明，導(dǎo)管堵塞不是黃萎病萎黨的主要原因，隨著研究的不斷深入，人們認(rèn) 識到黃萎病菌產(chǎn)生的毒素是導(dǎo)致植物萎黨的重要因素(化adin et al. ,2006)。還有一些學(xué) 者認(rèn)為，維管束的堵塞也是基于毒素的誘導(dǎo)效應(yīng)(陳旭升等，1998)。
[0004]實踐證明，利用抗病品種是防治黃萎病危害的唯一經(jīng)濟有效的途徑。傳統(tǒng)育種方 法雖然能利用作物本身或親緣種的抗性基因選育抗病品種，但存在著可利用的抗性品種 資源少，選育時間長，耗資大等缺點；施用化學(xué)藥劑不僅難W有效防治黃萎病而且污染環(huán) 境。隨著植物基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展W及對植物和病原物相互作用的深入了解使得將外 源抗性基因?qū)胫参飦硖岣呖共⌒猿蔀橐粭l有效途徑。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可W打破傳統(tǒng)育種 中的種間不親和現(xiàn)象，消除雜交障礙，極大地拓寬了抗性基因的來源和應(yīng)用(Grover and Gowthama,2003)。
[0005] 利用外源抗病基因產(chǎn)物抑制黃萎病菌在植株體內(nèi)的生長和繁殖可W提高植物對 黃萎病的抗性，另一方面，基于黃萎病菌毒素的致病機理，提高植物對黃萎病菌毒素的解毒 能力，也是提高植物對黃萎病抗性的有效方法之一。但是，絕大數(shù)研究者主要利用前一種方 法達到提高植物抗性的目的，尚未見成功利用外源基因的表達產(chǎn)物解毒病原菌產(chǎn)生的毒素 來提高對黃萎病抗性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供球抱白僵菌抓P4-ATPase基因在提高植物對黃萎病抗 性中的用途，通過將球抱白僵菌抓P4-ATPase基因整合進入目標(biāo)植物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，并使 得所述抓P4-ATPase基因在植物中表達而提高植物對黃萎病的抗性。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種提高植物對黃萎病抗性的方法，通過在目標(biāo)植 物體內(nèi)表達外源基因而提高所述植物對黃萎病的抗性，所述外源基因為球抱白僵菌化P4- ATF*ase 基因。
[0008] 更具體地，本發(fā)明的方法，包括下述步驟：
[0009] 將球抱白僵菌化P4-ATPase基因整合進入目標(biāo)植物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，并使得所述 抓P4-ATPase基因在植物中表達。
[0010] 優(yōu)選地，所述的方法，包括下述步驟：
[0011] 1)構(gòu)建含有來自球抱白僵菌抓P4-ATPase基因的重組植物表達載體；
[0012] 2)將所述重組植物表達載體導(dǎo)入目標(biāo)植物中，使得球抱白僵菌化P4-ATPase基因 在目標(biāo)植物中組成型表達；
[0013] 3)獲得具有提高的抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因植物。
[0014] 優(yōu)選地，所述球抱白僵菌抓口4-4了口曰36基因的核巧酸序列如569 10^.15所示。
[0015] 本發(fā)明的方法可W適用于的目標(biāo)植物優(yōu)選為番茄、煙草或棉花。
[0016] 本發(fā)明方法中，步驟1)中的重組植物表達載體具有如圖8所示的結(jié)構(gòu)。
[0017]
[0018] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種具有黃萎病抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括 W下步驟：
[0019] i)獲得球抱白僵菌化P4-ATPase基因，并將其可操作地插入植物表達載體中，構(gòu)建 植物表達載體；
[0020] i i)用步驟i)獲得的植物表達載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；
[0021] iii)用步驟ii)獲得的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0022] 本發(fā)明的目的是運樣實現(xiàn)的：一種提高植物對黃萎病病抗性的方法，是將含有來 自球抱白僵菌的P類ATP酶基因的重組植物表達載體分別導(dǎo)入目標(biāo)植物中，實現(xiàn)運些基因在 植物中的組成型表達，提高轉(zhuǎn)基因植物對黃萎病菌毒素的解毒能力，進而獲得抗黃萎病的 轉(zhuǎn)基因植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物對黃萎病的抗性優(yōu)于目標(biāo)植物。
[0023] 具體地，本發(fā)明利用球抱白僵菌化P4-ATPase提高植物對黃萎病抗性的方法，包括 如下的步驟：
[0024] 1)獲得球抱白僵菌化P4-ATPase基因：引入BamHI和Spel酶切位點設(shè)計引物，然后 W球抱白僵菌cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物即為添加酶切位點的抓P4-ATPase基因序 列；
[00巧]2)構(gòu)建組成型表達化P4-ATPase基因的植物表達載體:將擴增獲得的抓P4-ATPase 基因序列插入植物表達載體pLGN-35S-Nos，構(gòu)建一個新的植物表達載體，命名為PLGN-35S- 抓P4-ATPase;
[0026] 3)植物的遺傳轉(zhuǎn)化：利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將上述步驟2)獲得的化GN-35S- 化P4-ATPase植物表達載體整合入植物基因組，實現(xiàn)抓P4-ATPase基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的組 成型表達，提高轉(zhuǎn)基因植物對黃萎病的抗性；
[0027] 4)抗黃萎病的化P4-ATPase轉(zhuǎn)基因植株的獲得:將上述步驟3)獲得的轉(zhuǎn)基因植物 進一步進行繁殖、分子鑒定和抗病鑒定，獲得對黃萎病抗性提高的化P4-ATPase轉(zhuǎn)基因植 株。
[0028] 進一步，組成型表達的PLGN-35S-化P4-ATPase植物表達載體構(gòu)建的步驟包括:獲 得球抱白僵菌的cDNA后，設(shè)計上游引物：5'-CGGGATCCATGGCTGGACGACCTCCTGG(BamHI)~3'， 下游引物5 ' -GACTAGTCTATTGCGGACGCGAGCTGG (Spe I) -3 ' 進行 PCR擴增，擴增產(chǎn)物和 i)LGN- 35S-NOS載體質(zhì)粒分別進行BamHI和Spel雙酶切，并分別回收酶切后的大片段，再利用連接 酶將回收片段進行連接，構(gòu)建一個新的植物表達載體，命名為PLGN-35S-抓P4-ATPase，W實 現(xiàn)抓P4-ATPase基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的組成型表達。
[0029] 本發(fā)明所提供的提高植物對黃萎病抗性的方法，是將來自球抱白僵菌的BbP4- ATTase基因分別轉(zhuǎn)入煙草、番茄和棉花細胞中，實現(xiàn)運些基因在轉(zhuǎn)基因植株中的組成型表 達，利用外源基因編碼的P4類ATP酶解毒黃萎病菌在植物體內(nèi)產(chǎn)生的毒素，提高轉(zhuǎn)基因植物 對黃萎病菌毒素的解毒能力，進而提高轉(zhuǎn)基因植物對黃萎病的抗病性。
[0030] 本發(fā)明結(jié)合球抱白僵菌抓P4-ATPase突變體對環(huán)抱菌素 A(CsA)敏感的特性，同時， CsA是一種由11個氨基酸組成的親脂疏水性環(huán)膚，所W也結(jié)合了 CsA和黃萎病菌毒素部分結(jié) 構(gòu)的相似性，W及黃萎病菌致病機理的特性，創(chuàng)造性地提出利用球抱白僵菌化P4-ATPase基 因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)組成型表達，提高轉(zhuǎn)基因植物對黃萎病菌毒素的解毒能力，進而提高轉(zhuǎn) 基因植物對黃萎病的抗性的策略。
[0031] 本發(fā)明主要是利用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對黃萎菌毒素的解毒能力提高植物抗病性，更進一 步的W相同的方式利用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物提高植物對真菌毒素的解毒能力也是本發(fā)明的保護范 圍。同時本發(fā)明中設(shè)及的植物表達載體，轉(zhuǎn)化細胞等也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明獲得的化P4-ATPase轉(zhuǎn)基因煙草，To代幼苗利用傷根灌菌液法接種高毒力 L2-1菌株30d，病情指數(shù)為34.87，較野生型對照分別降低40.78。接種30d，38個抓P4-ATPase 轉(zhuǎn)化子中還有9個轉(zhuǎn)化子沒有出現(xiàn)病癥。BbP4-ATPase轉(zhuǎn)基因棉花Τι代幼苗，利用浸根接種 法接種V991落葉型黃萎病菌株20d，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹∏橹笖?shù)達到了 82.24JbP4-TAPase轉(zhuǎn)基 因棉花有2個株系的病情指數(shù)低于10,分別為8.33和4.55。利用本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因番茄To 代幼苗植株利用傷根灌菌液法接種高毒力L2-1菌株，非轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)達到78.33， 化P4-ATPase轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)為44.44,較野生型對照降低33.89。研究結(jié)果表明，利 用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因棉花、煙草和番茄可W顯著提轉(zhuǎn)基因植物對黃萎病的抗病性。 說明，本發(fā)明提供的提高植物對黃萎病抗性的方法效果顯著。該方法不僅適用于棉花、煙草 和番茄，所有能受黃萎病菌侵染的植物均可利用該方法提高對黃萎病的抗性。
[0033] 本發(fā)明提供的方法主要是利用對病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，因而不具 有病原菌小種抗性的特點。因此，可w廣泛應(yīng)用于提高不同病原菌生理小種的抗性，不存在 小種專一性抗性的特點。
【附圖說明】
[0034] 圖1為CsA敏感型球抱白僵菌突變體的篩選
[0035] WT:球抱白僵菌野生型菌株化0062; Con化〇1:球抱白僵菌T-DNA隨機插入轉(zhuǎn)化子； Mu 129和Mu 134: CsA敏感型球抱白僵菌T-DNA隨機插入轉(zhuǎn)化子;CZA:察氏固體培養(yǎng)基;CsA:環(huán) 抱菌素 A;標(biāo)尺= lcm。
[0036] 圖2為抓P4-ATPase同源重組載體圖
[0037] Bar:草下麟除草劑(phosphinothricin)抗性基因；PtrpC:來源于構(gòu)巢曲霉的真菌 組成性啟動子；TtrpC:構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶基因的終止子；BbP4-ATTase LB:BbP4- AT化se基因5 '側(cè)翼序列;BbP4-ATPase RB:BbP4-ATPase基因3 '側(cè)翼序列;KanR:卡那霉素抗 性基因。
[0038] 圖3為抓P4-ATPase同源重組載體質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果
[0039] M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Markerl5，l :NcoI/BamHI酶切片段。
[0040] 用 NcoI/BamHI 酶切地 2-m3P4-ATPaseLB-bar-m3P4-ATPaseRB 質(zhì)粒載體，獲得的目 的片段為2肺。
[0041 ] 圖4為抓P4-ATPase基因破壞突變體PCR驗證結(jié)果
[0042] M:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) Markerl5; 1 :pK2-BbP4-ATPaseLB-bar-m3P4-ATPaseRB 質(zhì)粒；2: 化P4-ATPase基因破壞突變體Δ化P4-ATPase; 3:異源重組轉(zhuǎn)化子;4:球抱白僵菌野生型菌 株抓0062。
[0043] 圖5為抓P4-ATPase基因破壞突變體的表型
[0044] WT:球抱白僵菌野生型菌株化0062 ;Mul29: CsA敏感型球抱白僵菌T-DNA隨機插入 轉(zhuǎn)化子；Δ抓P4-ATPase:化P4-ATPase基因破壞突變體;CZA:察氏固體培養(yǎng)基；CsA:環(huán)抱菌 素 A。
[004引圖6為pLGN-35S-Nos植物表達載體構(gòu)建流程圖
[0046] LF-LF:重組酶識別位點化0邱RT)，為全基因合成而成；35S-MCS-NOS來自pBIN AR 載體(GenBank: AB752377.1)，通過PCR獲得;NPT Π 基因來自細菌轉(zhuǎn)座子Τη5上的aphA2;GUS 基因為報告基因，來自大腸桿菌。
[0047] 圖7為pLGN-35S-BbP4-ATPase載體質(zhì)粒酶切驗證結(jié)果
[004引 M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Markerl5;BbP:pLGN-35S-m3P4-ATPase載體質(zhì)粒經(jīng)酶切后的獲 得的抓P4-ATPase目標(biāo)片段。
[0049] 圖8為pLGN-35S-BbP4-ATPa