本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病的致病突變及其檢測(cè)試劑。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa；RP)是一組由遺傳缺陷引起的進(jìn)行性視網(wǎng)膜退行性疾病，這類疾病以光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的不可逆性凋亡為主要病理特征。RP患者的發(fā)病年齡在不同患者中有較大差異，從幾歲到幾十歲不等，但其首發(fā)臨床表現(xiàn)多為夜盲，伴有視野的縮窄，以及中心視力的進(jìn)行性下降，嚴(yán)重者可致盲。RP是臨床上常見(jiàn)且危害較為嚴(yán)重的一類遺傳性致盲疾病，是嚴(yán)重危害世界范圍內(nèi)工作年齡人群的一大類致盲眼病，RP在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)均有較高的發(fā)病率。我國(guó)是RP遺傳資源大國(guó)，但目前RP相關(guān)的遺傳學(xué)信息多來(lái)自西方國(guó)家，因此對(duì)我國(guó)RP患者進(jìn)行深入的遺傳學(xué)研究，探尋潛在的RP相關(guān)的新致病基因及致病突變顯得尤為重要。

RP為單基因遺傳病，具有顯著的臨床及遺傳異質(zhì)性。RP的遺傳異質(zhì)性表現(xiàn)在眾多基因缺陷均可致病，其常見(jiàn)的遺傳模式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X連鎖隱性遺傳。迄今，全世界已鑒定出75個(gè)RP相關(guān)致病基因和82個(gè)連鎖位點(diǎn)(www.RetNet.org)，且隨著研究深入，該數(shù)目正逐年遞增。與此同時(shí)，攜帶有相同致病基因突變甚至是相同致病突變的患者，其臨床表現(xiàn)亦可能存在較大差異，即顯著的臨床異質(zhì)性。目前仍有40％到50％(西方國(guó)家統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)比率更高)RP患者的致病基因尚未找到，提示存在大量RP的新致病基因有待挖掘。

針對(duì)RP的分子遺傳學(xué)研究必須建立在一定的分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上。研究RP致病基因的一個(gè)重要目的是進(jìn)行RP的分子診斷，鑒于其顯著的遺傳異質(zhì)性，如何檢測(cè)眾多致病基因突變是目前的難題之一?；谶B鎖分析的定位克隆策略是鑒定單基因遺傳病致病基因的經(jīng)典方法，但是同時(shí)也面臨一些困難：①通常需要多代家系，難以分析小家系和散發(fā)病例。②有時(shí)多代家系也不能定位致病位點(diǎn)。③難以在連鎖區(qū)域內(nèi)篩選出正確的致病基因。因此，鑒于RP疾病本身的性質(zhì)及傳統(tǒng)分析技術(shù)的局限性，尋求一種全新的RP致病基因的研究方法顯得尤為迫切。

Secreted phosphoprotein 2(SPP2；MIM 602637)基因位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂2q37.1位置，該 基因含有8個(gè)外顯子，其編碼的Spp-24蛋白是一種含有211個(gè)氨基酸的分泌性蛋白，是cystatin蛋白家族的一員，目前有關(guān)Spp-24蛋白功能的研究較少，SPP2基因突變與疾病，尤其是與視網(wǎng)膜疾病間的關(guān)系國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)任何報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述缺陷，提供一種遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病的致病突變。

本發(fā)明的另一目的是提供該致病突變的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的是提供該致病突變的檢測(cè)試劑。

本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于檢測(cè)遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病的突變的SPP2基因，突變的SPP2基因?yàn)殡s合突變SPP2 p.Gly97Arg或者SPP2 p.Gly29Asp。

野生型SPP2基因在Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因編號(hào)為：ENSG00000072080，所述的突變的SPP2基因SPP2 p.Gly97Arg在物理位置為234967558的堿基由G突變?yōu)镃，其他部分與野生型相同；所述的突變的SPP2基因SPP2 p.Gly29Asp在物理位置為234959515的堿基由G突變?yōu)锳，其他部分與野生型相同。

一種突變的Spp-24蛋白，野生型Spp-24蛋白在Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因轉(zhuǎn)錄本編號(hào)為：ENST00000168148，突變的Spp-24蛋白在該野生型蛋白的第97位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼?，或者?9位氨基酸由甘氨酸變?yōu)樘於彼?，其他部分與野生型相同。

本發(fā)明所述的突變的SPP2基因或者所述的突變的Spp-24蛋白在制備遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病檢測(cè)試劑或檢測(cè)設(shè)備中的應(yīng)用。

其中所述的檢測(cè)試劑優(yōu)選自：引物或引物對(duì)、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或多種。

所述的檢測(cè)設(shè)備優(yōu)選包括含有檢測(cè)突變的SPP2基因的基因芯片的檢測(cè)平臺(tái)。

一種檢測(cè)遺傳性視錐細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良疾病的試劑盒，所述的試劑盒包括：

(a)檢測(cè)SPP2基因物理位置為234967558和234959515核苷酸位點(diǎn)的試劑；或檢測(cè)Spp-24蛋白第29位或第97位氨基酸位點(diǎn)的試劑；

(b)說(shuō)明書(shū)。

其中，所述的試劑優(yōu)選選自引物或引物對(duì)、探針、抗體、或核酸芯片中的一種或多種。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的試劑為基于深度測(cè)序?yàn)槠脚_(tái)的基因芯片雜交探針。

檢測(cè)234959515核苷酸位點(diǎn)的雜交探針序列優(yōu)選為chr2|234959442-234959561，序列如SEQ ID NO.1所示；檢測(cè)234967558核苷酸位點(diǎn)的雜交探針序列優(yōu)選為chr2|234967464-234967583，序列如SEQ ID NO.4所示。

作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選，所述的試劑為檢測(cè)234959515核苷酸位點(diǎn)和234967558核苷酸位點(diǎn)的引物對(duì)。

檢測(cè)234967558核苷酸位點(diǎn)的正向引物序列為SEQ ID NO.14，反向引物序列為SEQ ID NO.15；檢測(cè)234959515核苷酸位點(diǎn)的正向引物序列為SEQ ID NO.16，反向引物序列為SEQ ID NO.17。

一種以深度測(cè)序?yàn)槠脚_(tái)篩查RP患者中SPP2基因突變的方法，包括以下步驟：

(1)建立RP患者家系臨床與遺傳資源庫(kù)，收集RP家系的臨床資料及血液標(biāo)本，提取基因組DNA；

(2)設(shè)計(jì)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示的用于檢測(cè)SPP2基因突變的雜交探針，并將其整合到基因芯片上；

(3)利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測(cè)序；

(4)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化的生物信息學(xué)分析，篩選到一個(gè)新的RP新的致病突變?yōu)殡s合突變SPP2 p.Gly97Arg。突變SPP2 p.Gly97Arg位于2號(hào)染色體，物理位置為234967558(Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù))的堿基由G突變?yōu)镃；RNA水平：SPP2基因編碼RNA第289位堿基由G突變?yōu)镃；蛋白水平：SPP2基因編碼蛋白第97位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

步驟(2)所述的基因芯片優(yōu)選Agilent公司生產(chǎn)的基因芯片。

步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測(cè)序優(yōu)選利用美國(guó)Illumina公司的Hi-seq2000儀器完成。

步驟(3)所述的利用制備的基因芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域并進(jìn)行深度測(cè)序優(yōu)選流程為：將基因組DNA片段化，在DNA末端標(biāo)記“A”并與Illumina PE接頭-寡核苷酸混合物相連接；連接產(chǎn)物經(jīng)PCR富集，獲得DNA文庫(kù)，并將DNA文庫(kù)與已知致病基因捕獲芯片雜交、洗脫、純化，獲得編碼序列；創(chuàng)建配對(duì)末端，在Illumina HiSeqTM 2000平臺(tái)上對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行測(cè)序。

有益效果

目前并沒(méi)有研究指出SPP2基因突變與眼部疾病間的關(guān)系，因此，針對(duì)SPP2基因與RP的相關(guān)研究顯得尤為必要。本專利的選擇SPP2基因作為RP的候選基因，是由申請(qǐng)人在多年從事臨床醫(yī)療、遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)上所篩選出的，通過(guò)本發(fā)明方法進(jìn)一步明確了SPP2基因與 RP的關(guān)系。

一個(gè)基因可以對(duì)應(yīng)多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，且不同轉(zhuǎn)錄本所編碼的RNA及蛋白有所不同。本專利中申請(qǐng)人根據(jù)長(zhǎng)期從事遺傳學(xué)研究的經(jīng)驗(yàn)，篩選出SPP2基因的最優(yōu)轉(zhuǎn)錄本，并根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針，從而使篩查效益達(dá)到最高，最終獲得遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病的致病突變SPP2 p.Gly97Arg。

RP具有顯著的遺傳異質(zhì)性，目前已知致病基因75個(gè)，已連鎖位點(diǎn)82個(gè)，且仍存在大量未知的致病基因。本發(fā)明提供了新的致病基因的致病位點(diǎn)，為該疾病的診斷提供了新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1家系圖

圖2先證者眼底照

圖3先證者雙眼光學(xué)相干斷層成像

圖4 SPP2突變及野生型序列測(cè)序圖

圖5保守性分析

圖6野生型及攜帶有突變的LCA5蛋白晶體結(jié)構(gòu)

圖7小鼠各組織、ARPE19及293T細(xì)胞系SPP2基因表達(dá)分析(PCR)

圖8斑馬魚(yú)胚胎6-96小時(shí)個(gè)時(shí)間點(diǎn)SPP2基因表達(dá)分析(原位雜交)

圖9小鼠視網(wǎng)膜各層Spp-24蛋白表達(dá)分析(免疫熒光)

圖10 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生/突變型質(zhì)粒后Flag及Spp-24蛋白細(xì)胞內(nèi)定位分析(免疫熒光)

圖11 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生/突變型質(zhì)粒后Flag及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)定位分析(免疫熒光)

圖12 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生/突變型質(zhì)粒后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)分析(免疫印跡)

圖13野生/突變型mRNA注射后斑馬魚(yú)致畸致死率比較

圖14野生/突變型mRNA注射后斑馬魚(yú)眼球切片PNA/RHO染色(免疫熒光)

圖15野生/突變型mRNA注射后斑馬魚(yú)眼球切片ZPR-2染色(免疫熒光)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

對(duì)一個(gè)四代的患有視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa；RP)的家系的SPP2基因突變進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方法：

1.該家系臨床資源的采集及遺傳資源庫(kù)的建立：

收集該家系中各成員的臨床資料及血液樣本，家系圖見(jiàn)圖1。臨床資料主要包括個(gè)人病史、家族史、最佳矯正視力(best corrected visual acuities；BCVAs)、裂隙燈檢查、眼底照、色覺(jué)檢查、視野檢查(Humphrey視野計(jì))、視覺(jué)誘發(fā)電位檢測(cè)(visual-evoked potentials；VEP)、全視野電生理檢查(electroretinography；ERG)、眼底熒光血管造影檢查(fundus fluorescein angiography；FFA)及光學(xué)相干斷層成像檢查(optical coherence tomography；OCT)等。并用血液基因組DNA提取試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)對(duì)家系各成員的血液基因組DNA進(jìn)行提取。

2.借助于高通量二代測(cè)序挖掘該家系的致病突變：

2.1設(shè)計(jì)并訂制捕獲芯片：

2.1.1 SPP2基因及轉(zhuǎn)錄本序列信息：

該基因捕獲芯片為全外顯子組捕獲芯片，可對(duì)目前所有已知基因進(jìn)行檢測(cè)，其中包括全部目前已知的RP相關(guān)的致病基因。我們所參照的SPP2基因在Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因編號(hào)為：ENSG00000072080(注：該編號(hào)來(lái)自Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)，www.ensembl.org，可輸入基因編碼檢索基因詳細(xì)信息及基因序列)。

2.1.2轉(zhuǎn)錄本的選擇：

針對(duì)不同基因選擇特定的轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)基因均含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，在選擇轉(zhuǎn)錄本時(shí)，我們的原則是：首先考慮擁有CCDS編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本，若一個(gè)基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本均編碼蛋白，則首選含氨基酸數(shù)最多的蛋白相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，若多個(gè)轉(zhuǎn)錄本氨基酸含量相同，則進(jìn)一步選擇含堿基數(shù)最多的轉(zhuǎn)錄本。據(jù)以上原則，我們所篩選出的SPP2基因轉(zhuǎn)錄本編號(hào)為：ENST00000168148(注：該編號(hào)來(lái)自Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)，www.ensembl.org，可輸入轉(zhuǎn)錄本編碼檢索轉(zhuǎn)錄本詳細(xì)信息及轉(zhuǎn)錄本序列)。

2.1.2雜交探針的設(shè)計(jì)：

雜交探針的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為：(1)探針覆蓋所有候選基因的目標(biāo)區(qū)域，即外顯子區(qū)域以及外顯子和內(nèi)含子拼接處(外顯子上下游各100個(gè)bp)；(2)去除重復(fù)序列：對(duì)于在基因組出現(xiàn)的高度重復(fù)序列以及在人類基因組中出現(xiàn)2-5倍的較低頻率的重復(fù)片段，我們予以去除，避免捕獲其他同源基因，增加假陽(yáng)性，從而降低檢測(cè)效率。申請(qǐng)人將所有候選基因的目標(biāo)區(qū)域與人類基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)，共移除了2.5％的重復(fù)序列；(3)在探針設(shè)計(jì)過(guò)程中，我們對(duì)臨近的外顯子進(jìn)行了特定的整合，其相鄰探針整合標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)相鄰?fù)怙@子的綜合目標(biāo)區(qū)域(即前個(gè)外顯子的 上游100bp起至后一個(gè)外顯子的下游100bp止)總和小于600bp，即將其整合為一個(gè)探針，以求通過(guò)一對(duì)探針完成多對(duì)外顯子區(qū)域的捕獲；(4)當(dāng)所設(shè)計(jì)探針序列小于250bp時(shí)，在其兩端各包含上下游100bp的內(nèi)含子的基礎(chǔ)上，各繼續(xù)增加相同bp數(shù)的內(nèi)含子，使探針大小達(dá)到250bp。根據(jù)以上設(shè)計(jì)原則，我們針對(duì)SPP2基因所設(shè)計(jì)的探針序列如下：

用于篩選RP致病基因SPP2的雜交探針序列共13條，序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示；

2.2目標(biāo)區(qū)域捕獲及深度測(cè)序：

首先將基因組DNA片段化，并在DNA末端標(biāo)記“A”，與Illumina PE接頭-寡核苷酸混合物相連接，連接產(chǎn)物經(jīng)PCR富集，獲得DNA文庫(kù)。然后將DNA文庫(kù)與已知致病基因捕獲芯片雜交、洗脫、純化，獲得編碼序列。最后創(chuàng)建配對(duì)末端，在HiSeqTM 2000(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA)平臺(tái)上對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行測(cè)序。

2.3對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出候選致病基因：

2.3.1采用Mosaik軟件(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab/Mosaik)處理Illumina原始測(cè)序數(shù)據(jù)(配對(duì)末端數(shù)據(jù))，產(chǎn)生.bam類型文件。將.bam文件輸入GATK，利用GATK檢測(cè)單核苷酸變異體(single nucleotide variant)和小的插入或缺失(insertion/deletions)，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，便于下游的生物信息學(xué)分析，最后產(chǎn)生.vcf類型文件。

2.3.2將患者的測(cè)序結(jié)果在包括dbSNP132

(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.)，HapMap計(jì)劃(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000Genome Project(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黃數(shù)據(jù)庫(kù)(http://yh.genomics.org.cn/)以及Exome Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)在內(nèi)的五個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩查，濾過(guò)所有已知的SNP位點(diǎn)；

2.3.3將患者的測(cè)序結(jié)果所對(duì)應(yīng)的基因序列進(jìn)行比較和分析，優(yōu)先分析插入/缺失突變、無(wú)義突變和錯(cuò)義突變，結(jié)果可分為三類，包括已知突變、已知基因的新突變和新基因的突變。

2.4經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，鑒定致病基因：

PCR法分別針對(duì)篩選出的突變位點(diǎn)及鄰近DNA序列在相應(yīng)家系中進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物序列采用Primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。所用PCR的反應(yīng)體系(20μL體系)為：5*buffer 4μL，25mM MgCl₂2μL，DNA 1μL，正向引物F 1μL，反向引物R 1μL，10mM dNTP0.4μL，Taq酶0.1μL，ddH₂O 10.5μL。PCR反應(yīng)程序：98℃5min，35個(gè)循環(huán)(98℃10s，60℃15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與紫外線切膠儀下切 取PCR產(chǎn)物凝膠并純化。對(duì)所有的PCR產(chǎn)物分別以正、反向引物測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，使用NCBI在線對(duì)比工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假陽(yáng)性結(jié)果，并篩選出在家族中共分離的突變位點(diǎn)。其中檢測(cè)234967558核苷酸位點(diǎn)的正向引物序列為SEQ ID NO.14，反向引物序列為SEQ ID NO.15。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.家系臨床資料：

眼科臨床專家對(duì)該家系中的四名患者II：3、III：2、III：3和IV：1進(jìn)行了詳細(xì)全面的臨床檢查后，對(duì)該兩名患者作出“視網(wǎng)膜色素變性”的臨床診斷，下面以先證者為例，對(duì)其詳細(xì)臨床資料進(jìn)行說(shuō)明：

1)BCVAs：右眼0.6，左眼0.5；

2)裂隙燈檢查：雙眼人工晶體在位，雙眼輕度后發(fā)障；

3)眼底照：雙眼骨細(xì)胞樣色素沉積，視盤蒼白，視網(wǎng)膜血管變細(xì)以及周邊部視網(wǎng)膜變性(圖2)；

4)視野檢查：雙眼管狀視野；

5)ERG：雙眼視錐、視桿細(xì)胞反應(yīng)均消失，呈熄滅波；

9)OCT：雙眼黃斑周邊部?jī)?nèi)、外節(jié)盤層均消失，視網(wǎng)膜色素上皮層萎縮(圖3)。

2.該家系遺傳檢測(cè)結(jié)果：

通過(guò)對(duì)家族中的兩名患者II：3、IV：1及一名正常人III：5進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序及生物信息學(xué)分析后，我們發(fā)現(xiàn)了兩位患者均攜帶有可疑的雜合突變SPP2 p.Gly97Arg，其對(duì)應(yīng)核苷酸改變?yōu)镾PP2 c.G289C，未發(fā)現(xiàn)其他可疑的致病基因突變位點(diǎn)。檢測(cè)該位點(diǎn)的雜交探針序列為chr2|234967464‐234967583，序列如SEQ ID NO.4所示。經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證證實(shí)該突變位點(diǎn)在該家族中表現(xiàn)為共分離，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。突變SPP2 p.Gly97Arg位于2號(hào)染色體，物理位置為234967558(Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù))的堿基由G突變?yōu)镃；RNA水平：SPP2基因編碼RNA第289位堿基由G突變?yōu)镃；蛋白水平：SPP2基因編碼蛋白第97位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼?，該基因相關(guān)的突變從未在RP患者中發(fā)現(xiàn)。

根據(jù)我們所設(shè)計(jì)的篩選流程，借助我們所設(shè)計(jì)的基因芯片及深度測(cè)序技術(shù)，我們成功證實(shí)所檢測(cè)到的該SPP2基因雜合突變?yōu)镽P新致病基因，p.Gly97Arg為該疾病的新致病位點(diǎn)。

實(shí)施例2：

針對(duì)實(shí)施例1中所檢測(cè)出的致病基因進(jìn)行功能學(xué)研究，此處以上述檢測(cè)到的SPP2基因新 突變p.Gly97Arg為例。此外，我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，選擇并構(gòu)建了SPP2基因的另外一個(gè)高度懷疑可能致病的突變，p.Gly29Asp，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這個(gè)突變與p.Gly97Arg突變類似的致病性。

實(shí)驗(yàn)方法：

1.保守性分析：

采用NCBI HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)對(duì)所篩選得到突變?cè)诙鄠€(gè)物種中進(jìn)行保守性評(píng)估及預(yù)測(cè)。

2.根據(jù)SIFT和PROVEN值預(yù)測(cè)突變的致病能力：

采用兩款主流在線預(yù)測(cè)軟件：SIFT Human Protein DB(http://sift.bii.a-star.edu.sg/)及PROVEAN(v.1.1.3；http://provean.jcvi.org/index.php)，預(yù)測(cè)錯(cuò)義突變對(duì)蛋白水平的影響，從而預(yù)測(cè)突變的致病能力。

3.蛋白晶體結(jié)構(gòu)改變研究：

采用SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)軟件對(duì)LCA5野生型蛋白及攜帶有p.Ala212Pro突變的突變蛋白結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行預(yù)測(cè)，評(píng)估突變所引起的蛋白結(jié)構(gòu)改變。

4.基因表達(dá)譜檢測(cè)：

4.1小鼠各組織及兩株細(xì)胞系cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與SPP2基因表達(dá)檢測(cè)：

我們分離得到了C57BL/6小鼠的以下組織用于小鼠cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：心臟、肝臟、大腦、肺臟、腎臟、小腸、胃、脾臟、肌肉、神經(jīng)視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜色素上皮層及視神經(jīng)，我們還獲得了ARPE19(購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，ATCC編號(hào)：CRL-2302)和HEK293T(購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，ATCC編號(hào)：CRL-3216)兩株細(xì)胞系來(lái)用于細(xì)胞系cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。我們首先利用Trizol法分別提取上述12種小鼠組織及兩株細(xì)胞系的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，再利用PCR法對(duì)SPP2基因的cDNA序列片段進(jìn)行擴(kuò)增，并用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所用PCR的反應(yīng)體系與實(shí)例1中所采用的體系一致，檢測(cè)小鼠組織SPP2表達(dá)所用正向引物序列F1為：ATGGAGCAGGCAATGCTGAA，反向引物序列R1為：TCACTCAAAGCCAGAATTTACTCTTG；檢測(cè)小鼠組織β-actin表達(dá)所用正向引物序列F2為：GAGACCTTCAACACCCCAGC，反向引物序列R2為：ATGTCACGCACGATTTCCC；檢測(cè)細(xì)胞系SPP2表達(dá)所用正向引物序列F3為：ATGATTTCCAGAATGGAGAAGATGAC，反向引物序列R3為：TTACTCAAAGTCAGTATTTATTCTTGCTCTG；檢測(cè)細(xì)胞系β-actin表達(dá)所用正向引物序列F4為：GCTCGTCGTCGACAACGGCTC，反向引物序列R4為：CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC。

4.2 SPP2探針合成及斑馬魚(yú)整胚原位雜交：

按照4.1中的方法構(gòu)建斑馬魚(yú)胚胎全身組織的cDNA文庫(kù)，利用PCR的方法擴(kuò)增得到斑馬SPP2全長(zhǎng)cDNA，利用Roche試劑盒合成斑馬魚(yú)SPP2原位雜交檢測(cè)探針。收集不同時(shí)間點(diǎn)，包括6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)的斑馬魚(yú)胚胎，利用上述合成的探針。對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行整胚原位雜交，并用Leica顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

4.3小鼠眼球切片及免疫熒光染色：

取成年C57BL/6小鼠的完整眼球組織，固定、脫水后分離得到眼杯，OCT包埋冰凍后進(jìn)行冰凍切片(Leica冰凍切片機(jī))，對(duì)冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，一抗為Spp-24抗體，漂洗后再加入熒光二抗和DAPI，封片后用Olympus激光共聚焦顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

5.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：

分別合成野生型和突變型人源SPP2基因全長(zhǎng)cDNA并將其克隆至pCMV-C-Flag載體(碧云天)，構(gòu)建Flag標(biāo)簽的Spp-24^WT、Spp-24^Gly29Asp和Spp-24^Gly97Arg質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)候?qū)?xì)胞進(jìn)行固定，對(duì)細(xì)胞爬片免疫熒光染色，一抗為Flag抗體與Spp-24/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抗體的組合，漂洗后再加入熒光二抗和DAPI，封片后用Olympus激光共聚焦顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

6.斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)：

分別合成野生型和突變型人源SPP2基因全長(zhǎng)cDNA并將其克隆至pxT7載體，構(gòu)建pxT7標(biāo)簽的Spp-24^WT、Spp-24^Gly29Asp和Spp-24^Gly97Arg質(zhì)粒，利用這些質(zhì)粒合成相應(yīng)的SPP2mRNA，包括Spp-24^Anti、Spp-24^WT、Spp-24^Gly29Asp以及Spp-24^Gly97Arg mRNA。將上述合成的mRNA分別進(jìn)行顯微注射到斑馬魚(yú)胚胎中，觀察斑馬魚(yú)整體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，統(tǒng)計(jì)和比較不同注射組斑馬魚(yú)的致畸致死率。對(duì)注射后4天的斑馬魚(yú)進(jìn)行固定、脫水和OCT包埋，對(duì)其眼球組織進(jìn)行冰凍切片，對(duì)冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，一抗為PNA/RHO/ZPR-2抗體，漂洗后再加入熒光二抗和DAPI，封片后用Olympus激光共聚焦顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.保守性分析：

SPP2 p.Gly29Asp及p.Gly97Arg這兩個(gè)位點(diǎn)在鼠、豬、狼、猩猩及人類等多個(gè)物種中均高度保守，即這兩個(gè)位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，從而進(jìn)一步證明該位點(diǎn)的突變可能會(huì)引起較為嚴(yán)重的病理現(xiàn)象(圖5)。

2.SIFT和PROVEN值預(yù)測(cè)：

SPP2 p.Gly29Asp和p.Gly97Arg的SIFT結(jié)果均為破壞性(damaging)，PROVEN結(jié)果均為有害的(deleterious)，高度提示這兩個(gè)突變位點(diǎn)均擁有較大的致病可能性。

3.蛋白晶體結(jié)構(gòu)改變研究：

蛋白晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SPP2 p.Gly29Asp和p.Gly97Arg突變均可導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)的改變(圖6)，從而改變蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白功能產(chǎn)生影響。值得提出的是，SPP2 p.Gly29Asp可以導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)段的蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生扭轉(zhuǎn)，進(jìn)一步影響蛋白功能。

4.基因表達(dá)譜：

半定量PCR研究結(jié)果顯示，SPP2基因在小鼠的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量在不同組織中差異較大，該基因在我們所關(guān)注的眼組織，包括神經(jīng)視網(wǎng)膜層、視網(wǎng)膜色素上皮層和視神經(jīng)中均有較為顯著的表達(dá)(圖7)。與此同時(shí)，SPP2基因在兩個(gè)人源的細(xì)胞系A(chǔ)RPE19和293T中也均有表達(dá)(圖7)。斑馬魚(yú)原位雜交結(jié)果顯示，在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的各個(gè)不同階段(從6小時(shí)至96小時(shí))，SPP2基因在斑馬魚(yú)眼組織均有較為顯著的持續(xù)表達(dá)(圖8)。小鼠眼球切片免疫熒光染色結(jié)果顯示，Spp-24蛋白在小鼠視網(wǎng)膜的各層均有表達(dá)，在外節(jié)盤層和視網(wǎng)膜色素上皮層的表達(dá)尤為豐富(圖9)。綜上，我們的結(jié)果從多角度證明了SPP2基因和Spp-24蛋白在神經(jīng)視網(wǎng)膜層，尤其是外節(jié)盤層和視網(wǎng)膜色素上皮層的表達(dá)。

5.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

不同轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞核為DAPI標(biāo)記，外源性Spp-24蛋白為Flag標(biāo)記，外源性和內(nèi)源性Spp-24蛋白總和為Spp-24標(biāo)記。轉(zhuǎn)染野生型Spp-24質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中外源性Spp-24蛋白均勻的分布在細(xì)胞膜周圍，內(nèi)源性的Spp-24蛋白則均勻分布在細(xì)胞內(nèi)，而轉(zhuǎn)染兩種突變型Spp-24^Gly29Asp和Spp-24^Gly97Arg質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性Spp-24蛋白均出現(xiàn)了胞內(nèi)的積聚，提示轉(zhuǎn)染突變型Spp-24^Gly29Asp和Spp-24^Gly97Arg質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞內(nèi)外源性的Spp-24蛋白出現(xiàn)了分泌障礙，且這些突變的外源性的Spp-24蛋白會(huì)與細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性的Spp-24蛋白相互作用，進(jìn)一步影響到內(nèi)源性的Spp-24蛋白的正常分泌(圖10)。

為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)染突變型Spp-24質(zhì)粒后這些Spp-24蛋白發(fā)生異常積聚的具體環(huán)節(jié)，我們將外源性的Spp-24蛋白和細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共染。研究發(fā)現(xiàn)，這些突變的Spp-24蛋白均出現(xiàn)了在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積聚(圖11)。于是，我們進(jìn)一步研究這些突變的Spp-24蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的異常積聚是否會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的破壞(ER stress)，我們進(jìn)一步分別提取了轉(zhuǎn)染野生型和兩種突變型Spp-24質(zhì)粒的細(xì)胞的總蛋白，利用蛋白印跡的方法對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能相關(guān)的蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，我們的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染突變型Spp-24質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中PDI、BIP、IRE1α、 Ero1-Lα的表達(dá)量均較野生型明顯上升，提示轉(zhuǎn)染突變型Spp-24質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的破壞(圖12)。

6.斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

我們進(jìn)一步利用在體實(shí)驗(yàn)比較注射不同SPP2mRNA組的斑馬魚(yú)整體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變以及眼部組織結(jié)構(gòu)特異性的改變。我們的研究結(jié)果顯示，注射野生型mRNA的斑馬魚(yú)其致死率和致畸率與注射無(wú)義mRNA的斑馬魚(yú)并無(wú)明顯差距，而注射突變型Spp-24^Gly29Asp或Spp-24^Gly97Arg mRNA的斑馬魚(yú)其致死率和致畸率較野生型注射組均出現(xiàn)了明顯的上升(圖13)。與此同時(shí)，我們針對(duì)這一部分注射后的斑馬魚(yú)進(jìn)行了眼組織切片免疫熒光染色，用RHO標(biāo)記了斑馬魚(yú)的視桿細(xì)胞，用PNA標(biāo)記了斑馬魚(yú)的視錐細(xì)胞，用ZPR-2標(biāo)記了斑馬魚(yú)的視網(wǎng)膜色素上皮層，結(jié)果顯示，注射突變型mRNA的斑馬魚(yú)的視桿細(xì)胞層(RHO標(biāo)記)和視網(wǎng)膜色素上皮層(RPE標(biāo)記)缺失，但視錐細(xì)胞層(PNA標(biāo)記)相對(duì)完整，而注射野生型mRNA的斑馬魚(yú)各細(xì)胞層均較完整(圖14、15)。綜上，斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變型SPP2mRNA會(huì)引起斑馬魚(yú)視桿細(xì)胞和RPE細(xì)胞的特異性損害，這一結(jié)果與病人中得到的結(jié)果類似。

綜上，我們通過(guò)遺傳學(xué)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論從多方面證實(shí)了SPP2基因p.Gly29Asp和p.Gly97Arg突變的危害。