專利名稱：針對(duì)g蛋白偶聯(lián)的受體(gpcr)的抗體的制作方法
針對(duì)G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCR)的抗體
本發(fā)明涉及針對(duì)G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCR)的抗體，具體涉及代謝 型谷氨酸受體。
GPCR是己知的最大的受體超家族之一。這些受體在生物學(xué)上非常重 要，且這些受體的故障引起疾病，諸如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、糖 尿病、侏儒癥、色盲癥、色素性視網(wǎng)膜炎(retinalpigmentosa)和哮喘。GPCR 還參與抑郁癥、精神分裂癥、失眠癥、高血壓、焦慮癥、壓力、腎衰竭和 若干其他心血管的、代謝的、神經(jīng)系統(tǒng)的、腫瘤學(xué)的和免疫病癥(F. Horn 和G Vriend, J. Mol. 25 Med.(分子25醫(yī)學(xué)雜志),76:464-468 (1998)。它 們還顯示在HIV感染中起作用(Y. Feng等，Science (科學(xué))，272: 872-877 (1996))。 GPCR的結(jié)構(gòu)由7個(gè)由環(huán)相連接的跨膜螺旋組成。N-端總在胞外 且C-膜在胞內(nèi)。GPCR參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在胞外N-端側(cè)接收信號(hào)。信號(hào)可 以是內(nèi)源配體、化學(xué)部分或光。該信號(hào)然后通過膜轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞質(zhì)側(cè)，在其中 激活異源三聚G蛋白，隨之激發(fā)反應(yīng)(R Horn等，Recept. and Chann.(受體 和通道)，5:305-314(1998))。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供針對(duì)G蛋白偶聯(lián)的受體的表位的抗體，其中 所述抗體結(jié)合該受體的胞外N-端區(qū)域并且抗體與G蛋白偶聯(lián)的受體的結(jié) 合誘導(dǎo)細(xì)胞中的受體內(nèi)在化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體針對(duì)GPCRC類受體，優(yōu)選代謝型谷 氨酸受體，具體針對(duì)代謝型谷氨酸受體mGluR7。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化不依賴與該 受體有關(guān)的G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，優(yōu)選與該受體有關(guān)的Gi偶聯(lián)的 cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體誘導(dǎo) 的受體內(nèi)在化涉及促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是通過用表達(dá)目的G蛋白偶聯(lián)的受體， 優(yōu)選mGluR7的全細(xì)胞免疫合適動(dòng)物制備的。
4在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體通過在2007年8月8日保藏在DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(德國微生物和細(xì)胞 培養(yǎng)物保藏中心))并獲得保藏號(hào)DSM ACC2855的雜交瘤細(xì)胞系 mGluR7-CHO-l/28制備。
在第二個(gè)目的中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體在制備用于治療疾病的藥 物中的用途，所述疾病涉及G蛋白偶聯(lián)的受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。所述 疾病優(yōu)選是神經(jīng)學(xué)病癥或糖尿病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用作用于胞內(nèi)遞送活性化合物的 工具。所述活性化合物優(yōu)選與所述抗體共價(jià)偶聯(lián)。"活性化合物"可以是 任何合適的分子，包括DNA、 RNA、 siRNA、蛋白質(zhì)、肽、或藥物活性試 劑，諸如，例如，毒素、抗生素、抗病原體試劑、抗原、抗體、抗體片段、 免疫調(diào)節(jié)劑、酶、或治療劑。本發(fā)明的抗體適合于胞內(nèi)遞送活性化合物， 原因在于該抗體容許通過與GPCR的結(jié)合靶向胞內(nèi)遞送活性化合物。
在第三個(gè)目的中，本發(fā)明涉及用于篩選G蛋白偶聯(lián)的受體的配體的方 法。所述方法包括
a) 使表達(dá)G蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞或包含G蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞 制劑與待篩選的化合物和本發(fā)明的抗體相接觸，和
b) 測(cè)量抗體與G蛋白偶聯(lián)的受體的相互作用，其中抗體結(jié)合或內(nèi)在 化的水平是配體/G蛋白偶聯(lián)的受體內(nèi)在化的指示。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)G蛋白偶聯(lián)的受體。 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，G蛋白偶聯(lián)的受體是代謝型谷氨酸受體, 優(yōu)選mGluR7。
術(shù)語"抗體"用于本文中時(shí)包括抗體或抗體片段，包括但不僅限于諸 如Fv、 Fab、 F(ab')2、單鏈抗體的抗體片段。
在另一個(gè)目的中，本發(fā)明提供綴合物，所述綴合物包括本發(fā)明的抗體 和與該抗體共價(jià)連接的活性化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述活性化合物是毒素或siRNA分子，優(yōu)選 siRNA分子。
通過將本發(fā)明的抗體與siRNA分子的末端基團(tuán)共價(jià)鍵合來制備處于A - X - Y形式的siRNA-抗體綴合物的方法，所述方法包括選擇預(yù)定的
5siRNA分子；和使該siRNA分子與本發(fā)明的抗體共價(jià)鍵合，其中A是本 發(fā)明的抗體，X是連接體-介導(dǎo)的共價(jià)鍵，且Y是siRNA分子。
制備siRNA-抗體綴合物的方法可以包括活化siRNA官能團(tuán)，和使活 化的官能團(tuán)與抗體共價(jià)鍵合。待活化的官能團(tuán)可以包括，但不僅限于，胺 基、硫醇基、磷酸基、或其組合。在一些實(shí)施方案中，活化siRNA官能團(tuán) 的物質(zhì)包括l-乙基-3,3-二乙基氨基丙基碳二亞胺，咪唑，N-羥基琥珀酰亞 胺，二氯己基-碳二亞胺，N-卩-馬來酰亞胺丙酸，N-(3-馬來酰亞胺丙-氧基琥 珀酰亞胺酯，N-琥珀酰亞胺基吡啶基二硫代丙酸酯，或其組合。用于制備 本發(fā)明的siRNA抗體綴合物的另一種方法可以參見Handbook of Cell PenetratingPeptides(細(xì)胞穿透肽手冊(cè))，第18章，第二版，2006年4月，編 輯tJlo Langel。
在另一個(gè)目的中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括本發(fā)明的抗體或綴 合物和藥用載體。
為了更好的施用，所述組合物除上述活性成分外還可以包含至少一種 藥用載體。所述載體的實(shí)例包括鹽溶液、無菌水、Ringer's溶液、緩沖鹽 溶液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精(水性)溶液、甘油、乙醇及其混合物。 如果需要，可以添加典型的添加劑，諸如抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑等。 而且，該組合物可以通過添加更多的添加劑，諸如稀釋劑、分散劑、表面 活性劑、結(jié)合試劑和潤滑劑而在制藥學(xué)上被制備以用于以水溶液、混懸液、 乳劑等形式注射。
可以通過不同的施藥途徑，包括靜脈內(nèi)施藥、肌肉內(nèi)施藥、動(dòng)脈內(nèi)施 藥、脊髓內(nèi)施藥、鞘內(nèi)施藥、心臟內(nèi)施藥、經(jīng)皮施藥、皮下施藥、腹膜內(nèi) 施藥、舌下施藥、和局部施藥使本發(fā)明的藥物組合物與身體相接觸。
為了這樣的臨床施藥，可以利用常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明的藥物組合物制備 為適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。
附圖簡述


圖1A-I顯示IgG和Fabl誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化的比較； 圖2顯示分別由IgG和Fabl片段誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化的量化表面染 色和細(xì)胞質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng)度；
6圖3顯示IgG和Fab誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化的動(dòng)力學(xué)； 圖4顯示百日咳毒素對(duì)IgG誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化的影響；4A:細(xì)胞
表面染色中的平均像素強(qiáng)度。4B:細(xì)胞質(zhì)斑點(diǎn)像素強(qiáng)度/細(xì)胞質(zhì)面積。
圖5顯示熒光siRNA在與IgG共價(jià)連接時(shí)的共內(nèi)在化。圖5A-D使用
由siRNA-Cy5標(biāo)記的初級(jí)抗體，圖5E-H使用與siRNA-Cy5混合的初級(jí)抗
體；
圖6顯示IgG (實(shí)心圓)和FAB (實(shí)心三角)片段的濃度-反應(yīng)曲線。 用3 pM弗司扣林，L-AP4的EC80和多種濃度的IgG或FAB刺激細(xì)胞。 測(cè)量cAMP的細(xì)胞含量并將其表述為cAMP含量占僅用3 MM弗司扣林處 理的細(xì)胞的百分比。所有的測(cè)量重復(fù)進(jìn)行三次，并且數(shù)值表示平均值士 SE;
圖7顯示瞬間表達(dá)野生型或嵌合mGlu6或mGlu7受體的活CHO細(xì)胞 的免疫染色，如所示。用IgG-Alexa488染色細(xì)胞。只有具有mGlu7受體 N-端結(jié)構(gòu)域的受體被IgG識(shí)別，這提示IgG結(jié)合mGlu7受體的N-端結(jié)構(gòu) 域。所示的是在40x放大倍數(shù)，很短暴露時(shí)間的代表性圖像。
圖8A顯示IgG對(duì)表達(dá)mGlu7受體的CHO細(xì)胞中Thr202/Tyr204處的 p44/42 MAPK水平的影響。p44/42 MAPK水平通過PathScanTM夾心ELISA 試劑盒，按照制造商的說明確定。IgG4秀導(dǎo)的p44/42MAPK水平的增高在 處理后5分鐘時(shí)瞬間達(dá)到最高水平，并隨后迅速下降。
圖8B顯示增高劑量的IgG在處理表達(dá)mGlu7受體的CHO細(xì)胞后5 分鐘時(shí)，誘導(dǎo)可飽和水平的p44/42 MAPK。 IgG觸發(fā)p44/42 MAPK活性 的潛力處于與如圖4中所示抑制L-AP4-誘導(dǎo)的弗司扣林活性抑制的潛力 相同的數(shù)量級(jí)。
圖8C顯示處理表達(dá)mGlu7受體的CHO細(xì)胞后IgG-誘導(dǎo)的p44/42 MAPK活性水平的特異性。在與IgG的比較中，抗6xHisIgG、 orthosteric mGlu7激動(dòng)劑L-AP4和變構(gòu)mGlu7激動(dòng)劑AMN082不觸發(fā)p44/42 MAPK 活性的增加。p44/42 MAPK活性的功效與用陽性對(duì)照PMA獲得的水平相當(dāng)。
圖8D顯示與用陽性對(duì)照PMA獲得的活性相比，用IgG處理未轉(zhuǎn)染的 CHO細(xì)胞后p44/42 MAPK活性的缺少，這提示IgG的mGlu7-特異性活性。實(shí)施例l:使用抗體量化受體由膜到細(xì)胞質(zhì)的遷移 樣品制備
第1天在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)接種穩(wěn)定表達(dá)大鼠mGlu7受體的中國倉鼠
卵巢細(xì)胞-
用Trypsin/EDTA分離細(xì)胞。加入生長培養(yǎng)基并通過流經(jīng)10 ml吸移管 10-20次重新混懸細(xì)胞。確定細(xì)胞濃度并將細(xì)胞混懸液稀釋到合適的濃度。 為了在96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以處于100 |Lil培養(yǎng)基中25.000個(gè)細(xì)胞/孔接種 細(xì)胞。在具有5% C02的濕潤細(xì)胞培養(yǎng)溫育器中37°C溫育細(xì)胞，以容許細(xì) 胞粘附在孔上。
第2天制備I-緩沖劑(1 x HBSS， 20 mM Hepes, 0.1 % BSA,用三次 蒸餾的水制備，未調(diào)節(jié)pH)。用37°C的溫暖的I-緩沖劑制備Hoechst 33258 和氯化TrueBlue溶液(TrueBlue Chloride solution)。在以下添加溶液的過程 中，在孔中保持37°C的溫度。輕輕吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。在每個(gè)孔中，加入 100 pi Hoechst和Trueblue溶液，并在濕潤的溫育器中37°C溫育板30分 鐘。
制備抗體/Fabl溶液并在37°C平衡5分鐘。用100 pd在37°C預(yù)平衡 的I-緩沖劑/孔小心并快速地清洗細(xì)胞一次。然后將60 ^抗體溶液/孔加入 到孔中，并以37。C的溫度溫育板30分鐘。
Alexa532山羊-抗-鼠二級(jí)抗體的1:400溶液用冰冷的PBS制備。在室 溫下用100nlPBS/孔清洗孔三次。將該板轉(zhuǎn)移到冰浴中，將60iil冰冷的 抗體溶液/孔加入到孔中，并溫育該板60分鐘。用100 pl冰冷的PBS/孔 清洗孔三次。每孔中加入溫度為-20。C的150 pi甲醇/孔，并在冰上溫育該 板10分鐘。用100plPBS/孔在室溫下清洗孔，向孔中加入100nl甲醛溶 液/孔，并在室溫下溫育板15分鐘。在室溫下用PBS清洗孔一次。通過用 0.25% Triton X-100溶液在RT溫育5分鐘滲透化(permeabilize)細(xì)胞膜。 用PBS清洗孔一次，并用在PBS中稀釋的10 %體積/體積山羊血清溶液溫 育30分鐘。用新鮮制備的稀釋在PBS中的l:400Alexa647山羊-抗-鼠二級(jí) 抗體替換山羊血清。在RT溫育細(xì)胞30分鐘，并用100 pl PBS/孔在室溫 下小心并快速清洗三次。然后加入100jil4。/。甲醛/孔，并在室溫下溫育孔
815分鐘。將溶液替換為150 plPBS/孔。
量化免疫染色亞細(xì)胞水平
利用來自德國漢堡的Evotec Technologies(Evotec技術(shù))的Opera QEHS HCS讀數(shù)器量化抗體(IgG或Fabl片段)的內(nèi)在化。該機(jī)器裝配有反向 共聚焦熒光顯微鏡，并設(shè)置為從在透明底部微滴定板中制備樣品自動(dòng)獲取 圖像。在該讀數(shù)器中，引入用于圖像分析的軟件"Accapella"，其中可以 制備圖像分析方法(原稿(script))，其確定預(yù)定類型目標(biāo)的定位。
開發(fā)在該實(shí)施例中用于量化的原稿，以確定免疫染色分別在細(xì)胞表面 上和位于胞內(nèi)腔內(nèi)(公認(rèn)為是斑點(diǎn)樣結(jié)構(gòu)，其不與細(xì)胞表面免疫染色共-定位)的強(qiáng)度。該分析基于對(duì)用DNA-特異性熒光團(tuán)、同源完整細(xì)胞染色 TrueBlue、和兩種具有不同綴合的熒光團(tuán)的二抗染色的樣品平行獲得的三 幅圖像。由每個(gè)圖像，確定目標(biāo)。由第一幅特異于DNA染色和TrueBlue 染色的圖像，細(xì)胞核的數(shù)量、位置、尺寸和形狀由更亮的hoechst染色確 定，且細(xì)胞質(zhì)的輪廓由TrueBlue染色確定。由第二幅對(duì)Alexa532 二級(jí)抗 體具有選擇性的圖像，確定細(xì)胞表面免疫染色的面積，并量化強(qiáng)度。由第 三幅，確定細(xì)胞胞質(zhì)中斑點(diǎn)樣結(jié)構(gòu)并量化熒光強(qiáng)度。
比較IgG和Fabl片段誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化
圖1顯示表達(dá)大鼠-mGluR7的細(xì)胞的圖像，所述細(xì)胞在清洗和轉(zhuǎn)移到 冰上進(jìn)行如流程中所述的第二次染色和固定前己經(jīng)與67 nM初級(jí)抗體、 fabl片段或緩沖劑一起在37。C溫育。每排包含在孔的相同視野中平行獲 得的圖像。圖A-C使用33nM初級(jí)抗體，圖D-F使用67 nM fabl片段和 圖G-I不使用初級(jí)抗體或fabl片段。圖A、 D和G顯示以對(duì)trueblue和 hoechst染色具有選擇性的過濾設(shè)置獲得的圖像激光405 nm，由Longpath 650過濾器反射，經(jīng)過Shortpath 568過濾器和Bandpath 455/70過濾器過濾 的發(fā)射光。圖B、 E和H顯示以對(duì)使用Alexa532 二級(jí)抗體的細(xì)胞表面染 色具有選擇性的過濾設(shè)置獲得的圖像激光532 nm，由LP650反射和經(jīng) 過LP568和BP586/40過濾的發(fā)射光。圖C、 F和I顯示以對(duì)在膜滲透化后 使用Alexa647 二級(jí)抗體的全細(xì)胞染色具有選擇性的過濾設(shè)置獲得的圖像激光635 nm，通過LP650并經(jīng)BP690/50過濾的發(fā)射光。像素強(qiáng)度從黑到 白的灰度變化范圍顯示在每幅圖像的左下角。
完整的IgG和Fabl片段在與表達(dá)mGluR7的CHO細(xì)胞一起在37。C 溫育時(shí)表現(xiàn)不同。IgG很大程度地內(nèi)在化，而Fabl片段幾乎專門位于細(xì)胞 表面上。
圖2顯示關(guān)于各自IgG和Fabl片段量化的表面染色和細(xì)胞質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng) 度。圖A:細(xì)胞表面染色中的平均像素強(qiáng)度。圖B:細(xì)胞質(zhì)斑點(diǎn)像素強(qiáng)度 /細(xì)胞質(zhì)面積。
IgG和Fab片段誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化的動(dòng)力學(xué)
實(shí)驗(yàn)按照具有以下改進(jìn)的流程進(jìn)行用初級(jí)抗體或Fab片段在37。C 溫育細(xì)胞至多60分鐘，然后轉(zhuǎn)移到冰上，并在用二級(jí)抗體染色前將溶液 替換為新鮮冰冷的初級(jí)抗體或Fab片段溶液，l小時(shí)。用遵從甲醛固定的 染色步驟代替細(xì)胞質(zhì)的Trueblue和hoechst染色，其中樣品在與處于PBS 中的3 uM Hoechst和2pg/ml CellmaskBlue —起在室溫下溫育15分鐘，隨 后用4%甲醛在室溫下進(jìn)行二次固定15分鐘。
圖3顯示IgG和Fab結(jié)合和吸收的動(dòng)力學(xué)。黑圈22nMIgG，白圈 33nMFab。曲線是兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+A標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn) 行三次。圖A:細(xì)胞表面染色中的平均像素強(qiáng)度。圖B:細(xì)胞質(zhì)斑點(diǎn)像素 強(qiáng)度/細(xì)胞質(zhì)面積。IgG顯示胞內(nèi)斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)增加的累積，其曲線在開始的 20-30分鐘后平化。在比較中，關(guān)于Fab片段，可以檢測(cè)到非常微小的增 加。
百日咳毒素對(duì)IgG誘導(dǎo)的內(nèi)在化的影響
實(shí)驗(yàn)按照具有以下改進(jìn)的流程進(jìn)行，即在實(shí)驗(yàn)日，在用抗體溫育前5 小時(shí)，將百日咳毒素在PBS中的20x稀釋液，最終為500ng/ml加入到孔 中。
圖4顯示使用不同濃度IgG的劑量反應(yīng)曲線。黑圈百日咳毒素處理
的細(xì)胞，白圈無百日咳毒素。每個(gè)點(diǎn)是三個(gè)孔的平均值+A標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖 A:細(xì)胞表面染色中的平均像素強(qiáng)度。圖B:細(xì)胞質(zhì)斑點(diǎn)像素強(qiáng)度/細(xì)胞質(zhì)
10面積。百日咳毒素預(yù)處理不影響IgG誘導(dǎo)的mGluR7內(nèi)在化，即IgG誘導(dǎo) 的受體內(nèi)在化不依賴于受體的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。
抗體介導(dǎo)的siRNA的細(xì)胞吸收
實(shí)驗(yàn)按照具有以下改進(jìn)的流程進(jìn)行將細(xì)胞與67nm與siRNA-Cy5綴 合的初級(jí)抗體(摩爾比1: 0.3)或67nm初級(jí)抗體與20nM siRNA-Cy5 的混合物在一起37。C溫育40分鐘。用于檢測(cè)細(xì)胞表面第一次免疫染色的 二級(jí)抗體用Alexa488標(biāo)記，且用于檢測(cè)全細(xì)胞第一次免疫染色的二級(jí)抗 體用Alexa532標(biāo)記。用遵從甲醛固定的染色步驟代替細(xì)胞質(zhì)的Trueblue 和hoechst染色，其中樣品與處于PBS中的3 uM Hoechst禾n 2pg/ml CellmaskBlue —起在室溫下溫育15分鐘，隨后用4%甲醛在室溫下進(jìn)行二 次固定15分鐘。
圖5顯示表達(dá)大鼠-mGluR7的細(xì)胞的圖像，所述細(xì)胞在如上所述染色 和固定之前已經(jīng)與siRNA-Cy5綴合的初級(jí)抗體或初級(jí)抗體和siRNA-Cy5 的混合物一起在37。C溫育。每排包含在孔的相同視野中平行獲得的圖像。 圖A-D是用siRNA-Cy5標(biāo)記的初級(jí)抗體，圖E-H是與siRNA-Cy5混合的 初級(jí)抗體。
圖A和E顯示以對(duì)trueblue和hoechst染色具有選擇性的過濾設(shè)置獲 得的圖像激光405 nm激發(fā)，由Longpath 650過濾器反射、經(jīng)過Shortpath 568過濾器和Bandpath 455/70過濾器過濾的發(fā)射光。
圖B和F顯示以對(duì)Cy5具有選擇性的過濾設(shè)置獲得的圖像用激光 635 nm激發(fā)，通過LP650并經(jīng)BP690/50過濾的發(fā)射光。
圖C和G顯示以對(duì)初級(jí)抗體和Alexa532 二級(jí)抗體的全細(xì)胞染色具有 選擇性的過濾設(shè)置獲得的圖像用激光532 nm激發(fā)，由LP650和shortpath 568反射和經(jīng)過BP586/40過濾的發(fā)射光。
圖D和H顯示以對(duì)在膜滲透化后初級(jí)抗體和Alexa488 二級(jí)抗體的細(xì) 胞表面特異性染色具有選擇性的過濾設(shè)置獲得的圖像激光488 nm激發(fā)， 由LP650反射和經(jīng)過Shortpass 568過濾器和Bandpath532/60過濾器的發(fā) 射光。
像素強(qiáng)度從黑到白的灰度變化范圍顯示在每幅圖像的下部。IgG可以介導(dǎo)siRNA的細(xì)胞吸收。當(dāng)與siRNA-Cy5共價(jià)連接的IgG與 表達(dá)mGluR7的CHO細(xì)胞一起在37°C溫育時(shí)，IgG和siRNA-Cy5均內(nèi)在 化，并共定位在胞內(nèi)腔中。在無IgG和siRNA之間的共價(jià)連接的條件下， 只有IgG內(nèi)在化。
實(shí)施例2:產(chǎn)生表達(dá)大鼠mGlu7的細(xì)胞系
將大鼠mGlu7a受體剪接變體的cDNA(Genbank: D16817)插入到真核 表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中。按照制造商的說明，利用Lipofectamine力口，將 該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到缺乏二氫葉酸還原酶活性的CHO細(xì)胞(CHO-dhfr—)中，所述 細(xì)胞具有在5個(gè)cAMP-反應(yīng)元件(CRE)的控制下的熒光素酶受體基因。通 過有限的稀釋分離并通過在受體基因測(cè)定中的活性識(shí)別克隆。用處于測(cè)定 緩沖液中的1 pM弗司扣林和0.5 mML-AP4刺激細(xì)胞。4小時(shí)后，將上 清液更換為裂解緩沖液并測(cè)量熒光素酶活性。反應(yīng)范圍從無減弱到約83% 減弱。選擇表現(xiàn)出最大抑制弗司扣林-介導(dǎo)的熒光素酶活性的克隆細(xì)胞系并 將其確定為高達(dá)至少20代始終提供良好反應(yīng)。
對(duì)于全細(xì)胞免疫化，利用Lipofectamine加使用mGlu7表達(dá)質(zhì)粒再次 瞬間轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的細(xì)胞系并冷凍以在液氮中進(jìn)行免疫化。
實(shí)施例3:全細(xì)胞免疫化
使用穩(wěn)定表達(dá)mGluR7轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，通過重復(fù)注射活細(xì)胞進(jìn)行 對(duì)瑞士白化病小鼠的免疫化。按照G. K6hler和C. Milstein (1975) "Continuous cultures of fbsed cells secreting antibody of predefined specificity
(連續(xù)培養(yǎng)分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞)".Nature (自然) 256:495-497， 一旦動(dòng)物表現(xiàn)出針對(duì)mGluR7的特異性免疫反應(yīng)，摘除脾細(xì) 胞并與Ag8融合。
實(shí)施例4: cAMP測(cè)定
在實(shí)驗(yàn)前17-24小時(shí)，將穩(wěn)定表達(dá)大鼠mGluR7受體的細(xì)胞接種到具 有透明底部的黑色96孔板中((Coming Costar # 3904)的具有7.5%透析胎 牛血清的生長培養(yǎng)基中，并在濕潤的溫育器中以5% C02和37。C溫育。將生長培養(yǎng)基更換為具有1 mM IBMX的Krebs Ringer碳酸氫鹽緩沖液， 并在30°C溫育30分鐘。將0.3 mM L-AP4和3 |iM弗司扣林加入到最終 測(cè)定體積100 pi中之前15分鐘時(shí)添加化合物，并在30°C溫育30分鐘。 該測(cè)定通過添加50 pi裂解試劑和50 pi檢測(cè)溶液并在室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)終 止。
時(shí)間-分辨的能量轉(zhuǎn)移通過裝備有ND:YAG激光作為激發(fā)源的板::視覺 TRF讀數(shù)器(Evotec Technologies GmbH,德國漢堡)測(cè)量。用355nm處的激 發(fā)和具有100ns延遲和100 ns門的發(fā)射光測(cè)量該板2次，在730(帶寬30 nm)或645 nm (帶寬75 nm)的總曝光時(shí)間分別是10s。在730nm處測(cè)量的 信號(hào)必須針對(duì)釕背景，Alexa的直接發(fā)射光和緩沖液對(duì)照進(jìn)行校正。FRET 信號(hào)計(jì)算如下FRET = T730-Alexa730-P(T645-B645) ， P = Ru730-B730/Ru645-B645，其中T730是在730nm處測(cè)量的測(cè)試孔，T645 是在645nm處測(cè)量的測(cè)試孔，B730和B645分別是在730 nm和645 nm 處的緩沖液對(duì)照。由跨度為10 nM-0.13 nMcAMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)確定 cAMP的含量。
圖6顯示IgG (實(shí)心圓)和FAB (實(shí)心三角)片段的濃度-反應(yīng)曲線。 用3 弗司扣林，L-AP4的EC80和不同濃度的IgG或FAB刺激細(xì)胞。 測(cè)量cAMP的細(xì)胞含量并將其表述為cAMP含量占僅用3 弗司扣林處 理的細(xì)胞的百分比。所有的測(cè)量重復(fù)進(jìn)行三次，并且數(shù)值表示平均值士 SE。 orthosteric mGlu7激動(dòng)劑L-AP4的活性受到添加IgG的完全抑制。IC50計(jì) 算為2.4nM。 FAB部分對(duì)抗激動(dòng)劑L-AP4(IC50:486nM)，這提示為了有 效對(duì)抗L-AP4活性需要IgG的二價(jià)結(jié)合模式。
實(shí)施例5:構(gòu)建嵌合受體
利用交換PCR構(gòu)建編碼嵌合mGlu6和mGlu7受體的cDNA。 mGlu6/7 受體構(gòu)建體含有565個(gè)源自大鼠mGluR6的N-端胞外區(qū)的氨基酸和剩余的 大鼠mGhiR7a受體C-端部分，其包括完整的跨膜區(qū)；mGluR7/6構(gòu)建體基 本是在氨基酸576處具有融合點(diǎn)的反向嵌合物。將cDNA克隆到pcDNA3.1 中并利用Lipofectamine加瞬間轉(zhuǎn)染到CHO-dhfr-細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后， 將細(xì)胞接種在培養(yǎng)基中由聚-D-賴氨酸包被的蓋玻片上并在第二天進(jìn)行染色。將在24孔板中生長的細(xì)胞置于冰上，加入IgG或IgG-Alexa488 (1:100) 并在DMEM中溫育30分鐘，在添加兔-抗鼠FITC抗體(1:100)前用DMEM 清洗2次，靜置于冰上溫育30分鐘，并且在進(jìn)行如前的兩次清洗步驟后 用甘油/PBS(l:l)封固。
圖7顯示瞬間表達(dá)野生型或嵌合mGlu6或mGlu7受體的活CHO細(xì)胞 的免疫染色，如所示。用IgG-Alexa488染色細(xì)胞。只有具有mGlu7受體 N-端結(jié)構(gòu)域的受體被IgG識(shí)別，這提示IgG結(jié)合mGlu7受體的N-端結(jié)構(gòu) 域。所示的是在40x放大倍數(shù)，很短暴露時(shí)間的代表性圖像。
實(shí)施例6: IgG-誘導(dǎo)的p44/42 MAPK活性
將穩(wěn)定表達(dá)大鼠mGluR7受體的細(xì)胞接種到6孔板的生長培養(yǎng)基中。 第二天，將培養(yǎng)基替換為2ml饑餓培養(yǎng)基(含有0.1%無脂肪酸BSA的 Opti-MEM)。下一天，用處于150 pl饑餓培養(yǎng)基中的化合物在37。C刺激 細(xì)胞指定的時(shí)間，否則刺激細(xì)胞5分鐘。用冰冷PBS清洗細(xì)胞并將其溶解 中150 |il含有1 mM P -甘油磷酸、lmM EDTA、 1 mM EGTA、 lpg/ml抑 酶醛肽、150mM氯化鈉、2.5mM磷酸鈉、20 mM Tris-CI、 lmM PMSF 和1%TritonX-100的緩沖液中，刮掉并在冰上進(jìn)行超聲波降級(jí)。離心后， 利用PathScanTM夾心ELISA試劑盒，按照制造商的說明分析上清液的 p44/42 MAPK活性。利用EnVision讀數(shù)器(Perkin Elmer)閱讀吸光度 (450nM)。
圖8A顯示IgG對(duì)表達(dá)mGlu7受體的CHO細(xì)胞中Thr202/Tyr204處的 p44/42 MAPK水平的影響。p44/42 MAPK水平通過PathScanTM夾心ELISA 試劑盒，按照制造商的說明確定。IgG-誘導(dǎo)的p44/42MAPK水平的增高在 處理后5分鐘時(shí)瞬間達(dá)到最高水平，并隨后迅速下降。
圖8B顯示增高劑量的IgG在處理表達(dá)mGlu7受體的CHO細(xì)胞后5 分鐘時(shí)，誘導(dǎo)可飽和水平的p44/42 MAPK。 IgG觸發(fā)p44/42 MAPK活性 的潛力處于與如圖4中所示抑制L-AP4-誘導(dǎo)的弗司扣林活性抑制的潛力 相同的數(shù)量級(jí)。
圖8C顯示處理表達(dá)mGlu7受體的CHO細(xì)胞后IgG-誘導(dǎo)的p44/42 MAPK活性水平的特異性。在與IgG的比較中，抗6xHisIgG、 orthosteric
14mGlu7激動(dòng)劑L-AP4和變構(gòu)mGlu7激動(dòng)劑AMN082不觸發(fā)p44/42 MAPK 活性的增加。p44/42 MAPK活性的功效與用陽性對(duì)照PMA獲得的水平相 當(dāng)。
圖8D顯示與用陽性對(duì)照PMA獲得的活性相比，用IgG處理未轉(zhuǎn)染的 CHO細(xì)胞后p44/42 MAPK活性的缺少，這提示IgG的mGlu7-特異性活性。
實(shí)施例7: siRNA制備 寡核糖核苷酸合成
寡核糖核苷酸按照10 pmol規(guī)模使用ABI 394合成器(Applied Biosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)))的固相上的亞磷酰胺技術(shù)合成。關(guān)于RNA序列 信息參見表1。合成在由受控的孔玻璃(CPG, 520A，具有75 pmol/g的負(fù)荷, 獲自Prime Synthesis, Aston, PA，美國)制成的固體支持物上進(jìn)行。常規(guī) RNA亞磷酰胺，2，-(9-甲基亞磷酰胺以及輔劑購自Proligo(漢堡，德國)。具 體地，使用下列amidites: (5，-0-二甲氧基三苯甲基-A^-(苯甲酰)-2，-0-f-丁 基二甲基甲硅烷基-腺苷-3，-0-(2-氰基乙基-A^V-二異丙基氨基)亞磷酰胺, 5，-0-二甲氧基三苯甲基-#-(乙酰基)-2，-0+丁基二甲基甲硅烷基-胞苷 -3，-CK2-氰基乙基-iV，A^二異丙基氨基)亞磷酰胺，(5'-0-二甲氧基三苯甲 基_#-(異丁酰)_2，-0+丁基二甲基甲硅垸基-鳥苷-3，-0-(2-氰基乙基-^,二 異丙基氨基)亞磷酰胺，和5'-0-二甲氧基三苯甲基-2，-0+丁基二甲基甲 硅垸基-尿苷-3，-0(2-氰基乙基-MA^二異丙基氨基)亞磷酰胺。2'-0-甲基 亞磷酰胺與常規(guī)RNA amidites攜帶相同的保護(hù)基團(tuán)，除了 #々-丁基苯氧 基乙酰基)保護(hù)的2'-0-甲基-胞苷。將全部的amidites溶于無水乙腈(100 mM)中并加入分子篩(3A)。為了在該低聚物的3'-末端產(chǎn)生巰基連接體，使 用來自Glen Research (Glen研究)(Sterling,弗吉尼亞，美國)的l-O-二甲 氧基三苯甲基-己基-二硫化物，l'-[(2-氰基乙基HN,N-二異丙基)]-亞磷酰胺 連接體。在不改變?cè)摵铣芍芷诘臈l件下，利用相應(yīng)的亞磷酰胺(獲自GE Healthcare,德國慕尼黑)使Cy5熒光染料附著于5，-末端。5-乙基硫代四 唑(ETT, 500 mM處于乙腈中)用作活化劑溶液。偶聯(lián)時(shí)間是6分鐘。為了 引入硫代磷酸酯鍵合，使用100 mM處于無水乙腈中的3-乙氧基-l,2,4-二 噻唑啉-5-酮(EDITH,獲自Link Technologies (連接技術(shù))，Lanarkshire,蘇格蘭)溶液。
支持物結(jié)合的低聚物的分裂和去保護(hù)
在固相合成完成后，將干燥的固體支持物轉(zhuǎn)移到15mL管中并用甲胺 的甲醇溶液(2M,Aldrich)45。C處理180分鐘。離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到新 的15 mL管中并用1200 |iL 7V-甲基吡咯垸-2-酮(N-methylpyrolidine-2-one) (NMP, Fluka, Buchs,瑞士)清洗CPG。清洗物與甲醇甲胺溶液合并并加入 450|uL三乙胺三氫氟化物(TEA'3HF ， Alfa Aesar， Karlsruhe,德國)。將該 混合物置于65°C 150分鐘。冷卻至室溫后，加入0.75 mLNMP和1.5 mL of 乙氧基三甲基硅垸(Fluka，Buchs,瑞士)。 IO分鐘后，通過離心收集沉淀的 寡核糖核苷酸，棄去上清液并將固體重構(gòu)到lmL緩沖液A (見下)中。
純化寡核糖核苷酸
粗低聚物通過在AKTA Explorer系統(tǒng)(GE Helthcare)上使用XTerra Prep MS C8 10x 50 mm柱(Waters, Eschbom，德國)的RP HPLC純化。緩沖液A 是100mM三乙基醋酸銨(Biosolve, Valkenswaard,荷蘭)且緩沖液B含有 處于緩沖液A中的50°/。乙腈。使用5 mL/min的流速。記錄260nm, 280nm 和643 nm處的UV蹤跡。使用58柱體積(CV)中5%B到60%B的梯度。 匯集合適的餾分，并用3MNaOAc, pH=5.2和70%乙醇進(jìn)行沉淀。
最后，純化的低聚物通過在含有Sephadex G-25 (GE Healthcare)的柱上 進(jìn)行尺寸排阻層析法脫鹽。溶液的濃度通過在UV光度計(jì)(Beckman Coulter, Krefdd，德國)中在260nm處的吸光度測(cè)量確定。直到進(jìn)行退火，將各個(gè) 鏈作為冷凍溶液保存在-20。C。
退火寡核糖核苷酸以產(chǎn)生siRNA
互補(bǔ)鏈通過結(jié)合等摩爾RNA溶液退火。將混合物冷凍干燥并用適當(dāng) 體積的退火緩沖液(IOO mM NaCl, 20 mM磷酸鈉，pH 6.8)重構(gòu)以獲得理想 的濃度。將該溶液置于95。C水浴中，其在3h內(nèi)冷卻至室溫。
siRNA序列信息
有義鏈(5'—3'): (Cy5)cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTdT(C6SSC6)dT反義鏈(5'—3'):UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT
小寫字體2'OMe核苷酸；s:硫代磷酸酯鍵合；dT:脫氧胸苷
實(shí)施例8:抗體-siRNA綴合物的制備
抗體的馬來酰亞胺活化單克隆抗體mGluR7-CHO-l/28與IO倍摩爾 過量SMCC (磺基琥珀酰亞胺基4-[N馬來酰亞胺甲基]環(huán)己胺-l-羧酸酯)反 應(yīng)，隨后通過脫鹽除去過量的(未反應(yīng)的)試劑。
siRNA活化用TCEP(Tris[2-羧基乙基]磷化氫)還原Cy5標(biāo)記的具有 單脫氧胸苷的C6SSC6-連接體的siRNA，從而選擇性還原二硫鍵。
然后加入含有巰基的siRNA，以與己經(jīng)與該單克隆抗體附著的馬來酰 亞胺基團(tuán)反應(yīng)。然后利用NEM(N-乙基馬來酰亞胺)封閉siRNA上的未反 應(yīng)的游離巰基，并通過尺寸排阻層析法在Superdex 200 HR 10/30柱上純化 終產(chǎn)物。
最終的標(biāo)記-比通過nanodrop (在280nm處的IgG吸附，646nm處的 Cy5,消光系數(shù)Cy5:250'000)確定。
塑料器皿，溶液和試劑
測(cè)試板Costar 96孔特殊視覺板(Special Optics plate)，目錄號(hào)3614
10xHBSS Hepes BSA
Hoechst 33258 氯化TrueBlue
Ce謹(jǐn)ask Blue
甲醛
山羊抗鼠Alexa488抗體 山羊抗鼠Alexa 532抗體 山羊抗鼠Alexa 647抗體
GIBCO目錄號(hào)14065-049 1 M溶液，GIBCO目錄號(hào)15630-056 牛血清白蛋白級(jí)分V，Sigma，目錄號(hào)A-3059 Sigma # B-2261 (bisBenzimide),在DMSO中溶解到 lOmM.
Molecular Probes (分子探針)目錄號(hào)T1323,在1:2 MeOH:DMSO中溶解到2mM DMSO中5mg/ml, Invitrogen目錄號(hào)H34558 4%,在PBS中由36.5。/。儲(chǔ)液(Fluka,目錄號(hào)47629)稀釋 :lpg/nl溶液Invitrogen目錄號(hào)A11029 :lUg/pl溶液Invitrogen目錄號(hào)A11200A :l|ig/pl溶液Invitrogen目錄號(hào)A21235ATriton X-100:
山羊血清 百日咳毒素
Krebs Ringer L-AP4
弗司扣林 IBMX
裂解試劑 檢測(cè)溶液
生長培養(yǎng)基
Opti-MEM
Lipofectamine力口
pcDNA3.1(+)
CHO-dhfr-
測(cè)定緩沖液
裂解緩沖液
PMA AMN082 PathScan 無脂肪酸BSA
Fluka目錄號(hào)93426,在PBS中稀釋到4%體積/體積 Sigma目錄號(hào)G9023
Sigma目錄號(hào)P-2980.儲(chǔ)液在50%甘油，0.5M NaCl,
50 mM Tris-甘氨酸中0.2 mg/ml
Sigma # K-4002,
Tocris#0103
Sigma #F 3917
Sigma
Tris, NaCl, 1.5% Triton XI00， 2.5% NP40, 10% NaN3 20 nM mAb Alexa700畫cAMP 1:1，禾卩48 )iM釕 -2-AHA-cAMP
DMEM (Invitrogen No 31331), lx HT補(bǔ)齊U, 10% FCS
Invitrogen# 11058-021
Invitrogen
Invitrogen
ATCC No CRL-9096
5 mM KCL, 154 mM NaCl, 2.3 mM CaC12, 5 mM
NaHC03, 1 mMMgC12, 5.5 mM葡萄糖，5 mMHepes, 10
一 IBMX, pH 7.4 25 mM Tris， 0.4 mM DTT, 0.4 mM CDTA, 0.2%甘油，
0.2% Triton X-IOO， pH 7.8 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(Sigma存P8139) Dibenzhydrylethane-l,2-二胺二氫氯化物，機(jī)構(gòu)內(nèi)部合成
夾心ELISA試劑盒#7315, Cell Signaling, Beverly, MA Sigma #A-6003-25G
盡管顯示并描述了本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方案，但是顯然應(yīng)該理解為 本發(fā)明不受其限制，而是可以另外在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)不同的實(shí)施和 實(shí)踐。
權(quán)利要求
1.針對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的表位的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述受體的胞外N-端區(qū)域并且所述抗體與G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的受體內(nèi)在化。
2. 權(quán)利要求l的抗體，其中所述受體屬于GPCRC類，優(yōu)選所述受體 是代謝型谷氨酸受體。
3. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述代謝型谷氨酸受體是mGluR7。
4. 權(quán)利要求1-3的抗體，其中所述抗體誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化涉及促分裂 原活化的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
5. 權(quán)利要求1-4的抗體，其是單克隆抗體。
6. 權(quán)利要求1-5的抗體，其是IgG。
7. 權(quán)利要求1-6的抗體，其中所述抗體通過雜交瘤細(xì)胞系 mGluR7隱CHO-l/28制備。
8. 權(quán)利要求l-7的抗體，其中所述抗體誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化不依賴于與 所述受體有關(guān)的G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，優(yōu)選與所述受體有關(guān)的Gi 偶聯(lián)的cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化。
9. 權(quán)利要求1-8的抗體，其作為藥物。
10. —種綴合物，其包括權(quán)利要求1-8的抗體和與所述抗體共價(jià)連接 的活性化合物。
11. 權(quán)利要求10的綴合物，其中所述活性化合物是毒素或siRNA分子， 優(yōu)選siRNA分子。
12. —種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-8的抗體或權(quán)利要求10或11 的綴合物和藥用載體。
13. 權(quán)利要求1-8的抗體或權(quán)利要求10或11的綴合物用于胞內(nèi)遞送 活性化合物的應(yīng)用。
14. 權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述活性化合物是與所述抗體共價(jià)偶聯(lián) 的毒素或siRNA分子。
15. 權(quán)利要求1-8的抗體在制備用于治療疾病的藥物中的應(yīng)用，所述 疾病涉及G蛋白偶聯(lián)的受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。
16. 權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述疾病是神經(jīng)學(xué)病癥或糖尿病。
17. —種用于篩選G蛋白偶聯(lián)的受體的配體的方法，所述方法包括以下步驟使表達(dá)所述G蛋白偶聯(lián)的受體的細(xì)胞或包含所述G蛋白偶聯(lián)的受體的 細(xì)胞制劑與待篩選的化合物和權(quán)利要求1-8的抗體相接觸，和測(cè)量抗體與所述G蛋白偶聯(lián)的受體的相互作用，其中抗體結(jié)合或內(nèi)在 化的水平是配體/G蛋白偶聯(lián)的受體相互作用的指示。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中使用穩(wěn)定表達(dá)所述G蛋白偶聯(lián)的受體的 細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求17或18的方法，其中所述G蛋白偶聯(lián)的受體是代謝型 谷氨酸受體，優(yōu)選mGluR7。
20. 基本如本文中所述的化合物、方法和應(yīng)用，尤其參考前述實(shí)施例。
全文摘要
本發(fā)明提供針對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的表位的抗體，其中所述抗體結(jié)合該受體的胞外N-端區(qū)域并且該抗體與G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的受體內(nèi)在化。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101687927SQ200880015679
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月15日
發(fā)明者克里斯托夫·烏爾默, 桑納何·詹森索夫曼, 胡格斯·馬蒂勒 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司