一種聚（癸二?；视投ィ┰谥苽湟暰W(wǎng)膜神經(jīng)細胞載體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞載體及其制備方法領(lǐng)域，特別涉及一種聚（癸二?；视投ィ?在制備視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞載體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 老年性黃斑變性（AMD)和色素性視網(wǎng)膜炎（RP)是造成視神經(jīng)元退化變性進而導(dǎo) 致視力缺陷的兩個主要因素。新發(fā)展的治療手段可將病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)元重建。由此發(fā)展 出多種治療方法，比如基因治療、生長因子治療和小分子藥物療法。但這些治療方法只能延 緩病變惡化，不能從根本上治療疾病。近年來，數(shù)據(jù)顯示體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞元移植到 體內(nèi)替換病變組織的治療方法得到越來越多的關(guān)注。但尋找一種合適的細胞培養(yǎng)基質(zhì)作為 細胞的遞送載體成為這一治療方法突破的關(guān)鍵。聚（癸二酰基甘油二酯）[Poly (sebacoyl diglyceride)，PSeD]是新近研制的功能化可降解聚酯，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的 應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供聚（癸二?；视投ィ┰谥苽湟暰W(wǎng)膜神經(jīng)細 胞載體中的應(yīng)用，該發(fā)明中的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞遞送載體，具有良好的生物相容性，細胞的炎 癥表達和細胞凋亡因子低，而且具有優(yōu)異的促神經(jīng)分化功能。
[0004] 本發(fā)明的聚（癸二?；视投ィ┰谥苽湟暰W(wǎng)膜神經(jīng)細胞載體中的應(yīng)用，視網(wǎng)膜 祖細胞RPCs在視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞載體上進行增殖、分化和迀移；其中，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞載體 的成分包括聚（癸二酰基甘油二酯）PSeD。
[0005] 所述PSeD的分子式為
[0006] 所述PSeD的分子式中n = 10-300。
[0007] 所述PSeD的制備方法包括：將二縮水甘油癸二酸值單體、等摩爾量的癸二酸和催 化量的四丁基溴化銨溶解在DMF中，在氮氣保護下的干燥的反應(yīng)管中150°C反應(yīng)24小時，沉 淀純化，真空干燥，即得。
[0008] 本發(fā)明通過RPCs的分離和培養(yǎng)、PSeD/PLGA對RPCs的增殖和分化作用、免疫細胞 化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡分析、總RNA分離及質(zhì)量控制、逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)、細胞 毒性分析、創(chuàng)傷愈合和統(tǒng)計分析來表征PSeD對RPCs行為的影響。
[0009] 有益效果
[0010] 本發(fā)明的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞遞送載體，具有良好的生物相容性，細胞的炎癥表達和 細胞凋亡因子低，而且具有優(yōu)異的促神經(jīng)分化功能，具有很大的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0011] 圖1為實施例1中PSeD對RPCs的細胞毒性的表征；A :在增殖條件下，炎癥因子 (MCP-1)的表達和細胞在支架上的生長通過qPCR分析；B :RPCs在PSeD和PLGA支架以及對 照組上培養(yǎng)細胞的凋亡因子（Caspase-3)表達；C:增殖條件下培養(yǎng)三天，測量RPC細胞粘 附因子cadherin 4的表達；D :RPC細胞在PSeD和PLGA支架上培養(yǎng)對于通過乳酸脫氫酶釋 放試驗（LDH assays)與對照組的比較；
[0012] 圖2為實施例1中PSeD對RPCs的分化影響；A為在分化條件下，RPCs在PSeD上 的生長情況；B-D為qPCR分析；E-J為蛋白質(zhì)印跡分析；a中比例尺：100 ym ;b中比例尺： 50 u m ；
[0013] 圖3為實施例1中利用免疫染色分析對PSeD對RPC分化的影響；其中，生 長在P S e D上RP C s中含視覺神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物包括：0 3-管蛋白 (A-D)，rhodopsin (E-H)，GFAP (I-L);比例尺為 100 y m;
[0014] 圖4為實施例1中創(chuàng)口愈合實驗的效果數(shù)據(jù)；其中，A為創(chuàng)口愈合圖；B為創(chuàng)口愈 合程度數(shù)據(jù)；C為細胞的迀移速度；比例尺為200 y m。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0016] 實施例1
[0017] PSeD 的合成。
[0018] 二縮水甘油癸二酸酯單體、等摩爾量的癸二酸和催化量的四丁基溴化銨 (TCI，>99. 0% )溶解在DMF中，在氮氣保護的干燥的反應(yīng)管中加熱（150°C )反應(yīng)24小時。 然后反應(yīng)液用乙醚沉淀純化三次，然后將沉淀物抽真空干燥獲得PSeD。
[0019] 通過RPCs的分離和培養(yǎng)、PSeD/PLGA對RPCs的增殖和分化作用、免疫細胞化學(xué)、 蛋白質(zhì)印跡分析、總RNA分離及質(zhì)量控制、逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)、細胞毒性分 析、創(chuàng)傷愈合和統(tǒng)計分析來表征PSeD對RPCs行為的影響。
[0020] 實施例中的NC表示無材料空白試驗組。
[0021] (l)RPCs的分離和培養(yǎng)
[0022] 本發(fā)明所用動物均依照視覺與眼科協(xié)會動物使用標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照Schepens眼 科研究所動物飼養(yǎng)使用委員會審批過的程序進行。視網(wǎng)膜神經(jīng)祖細胞從出生1天的綠色熒 光蛋白呈陽性（GFP+)的轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠身上獲得，合并視網(wǎng)膜經(jīng)過切碎及幾個周期 0. 1 %的I型膠原蛋白酶消化進行分離。分離的RPCs用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)進行過濾， 在轉(zhuǎn)速為800rpm下離心4min，將細胞在含有DMEM/F12 (Invitrogen)，1 % N2神經(jīng)供給物 (Invitrogen)，2mML_ 谷氨酰胺（Invitrogen)，100U/ml 青霉素-鏈霉素（Invitrogen)，and 20ng/ml表皮生長因子（EGF，Invitr〇gen)的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。將細胞種植在培養(yǎng)皿中 并每隔3-4天傳代一次。為了對細胞的分化情況進行分析，將增殖培養(yǎng)液用分化培養(yǎng)液替 代，將其中表皮生長因子（EGF)除去，并加入10%的胎牛血清（Invitrogen)。用于細胞培養(yǎng) 的聚合物樣品涂膜于聚苯乙稀組織培養(yǎng)板（Tissue culture-treated polystyrene, TCPS) 上。將濃度為lg/1的PSeD和PLGA(作為對照）的甲醇溶液分別加入到12孔聚苯乙烯組 織培養(yǎng)板（tissue culture-treated polystyrene, TCPS)中（80 yl/孔）。待甲醇揮發(fā)后， 置于真空中抽吸12小時進一步去除溶劑獲得涂膜的組織培養(yǎng)板。將組織培養(yǎng)板置于紫外 光下30min進行殺毒，然后用lml磷酸鹽緩沖液清洗三次，再用lml培養(yǎng)液潤洗，接著種上 RPCs，進行培養(yǎng)。
[0023] (2) PSeD/PLGA對RPCs的增殖和分化作用
[0024] RPCs在PSeD/PLGA的生長情況分別在培養(yǎng)第1，3，5天時用標(biāo)準(zhǔn)落射熒光顯微 鏡（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)進行拍照觀察，其增殖情況通過CCK-8試劑盒 (cell counting kit-8, Do jindo, Kumamoto, Japan)進行進一步檢測。細胞培養(yǎng)在 96 孔板， 濃度為1 X 104個細胞/孔，CCK8溶液在第一天，第二天，第三天直接加入孔板中，在37°C繼 續(xù)培養(yǎng)4h后，用ELISA讀板器（ELX800, BioTeK，USA)測量其在450nm處的吸光度，細胞活 性用A450值進行表示。為了表征在分化條件下，生長在PSeD上的RPCs細胞形態(tài)，在第三 天的時候用標(biāo)準(zhǔn)落射焚光顯微鏡（Olympus 1X51 ;01ympus, Tokyo, Japan)放大10倍和20 倍進行拍攝。
[0025] (3)免疫細胞化學(xué)
[0026] RPCs在培養(yǎng)三天后（增殖條件下）或者七天后（分化條件下），RPC-PSeD，RPC-PLGA和RPC-glass復(fù)合物用磷酸緩沖液（PBS)潤洗三次然后室溫下用多聚甲 醛（Invitrogen)固定15分鐘。磷酸緩沖液潤洗三次后，細胞固定在固定液（磷酸緩沖 液包括10%常規(guī)羊血清（111￥；[1：1'(^611)，0.3%1'1'；[1:011父-100(31區(qū)1]13-八1(11'；[(311)和0.1% NaN3(Sigma-Aldrich))中1小時。4°C下與初級抗體培育過夜，然后細胞與二級抗體繼 續(xù)培育（Alexa Fluor546_goat anti-mouse/rabbit，BD，l:800)，繼續(xù)水洗。細胞核用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI ;Invitr0gen)染色。免疫細胞利用熒光顯微鏡（Olympus BX51，Japan)觀察，拍照。免疫活性細胞比例根據(jù)劃分由DAPI染色的細胞核數(shù)目確定。每組 隨機劃取區(qū)域分別觀測到共500至1000細胞。數(shù)據(jù)收集使用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD)0
[0027] 5_ 漠 _2_ 脫氧尿昔（BrdU)慘雜：在 10yM BrdU (Sigma-Aldrich, Poole, UK)存在 條件下培養(yǎng)8小時，室溫下用4%的多聚甲醛處理樣品15分鐘然后用封閉緩沖液（PBS含 有 10% 的 NGS，0. 3% riton X-100,和 100 y g/ml RNaseA)培育 60 分鐘。細胞隨后用 PBS 潤洗，室溫下用2M HC1培育30分鐘，然后先用PBS再用漢克斯平衡鹽溶液（HBSS)室溫 下潤洗。4°C下利用抗 BrdU 抗體在培育過夜（1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA，USA)，細胞用PBS潤洗，和熒光共輒二級抗體（Alexa Fluor488-goat anti-mouse，1:800)室溫下培育1小時。細胞核利用DAPI染色。免疫活性細胞利用熒光顯 微鏡（Olympus BX51, Japan)觀察，拍照。
[0028] (4)蛋白質(zhì)印跡分析
[0029]使用 RIPA(Radioimmunopr