優(yōu)先權(quán)要求

根據(jù)35usc§119(e)，本申請要求于2014年7月24日提交的美國專利申請序列no.62/028,638的優(yōu)先權(quán)。上述專利申請的全部內(nèi)容以引用的方式納入本文。

聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)

本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院授予的基金ey10581和5p30ey14104的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明享有某些權(quán)利。

本發(fā)明涉及治療患有由于編碼色素性視網(wǎng)膜炎gtpase調(diào)節(jié)因子(rpgr)蛋白的基因中的功能喪失突變而導(dǎo)致的x連鎖色素性視網(wǎng)膜炎(xlrp)或另一種眼科病癥的人類受試者的方法，所述方法包括將包含腺伴隨病毒載體的核酸給予所述受試者，所述腺伴隨病毒載體包含縮短的人rpgrcdna。

背景技術(shù)：

色素性視網(wǎng)膜炎(rp)是人類遺傳性失明的首要形式。在三種通常的遺傳模式(常染色體顯性、常染色體隱性和x連鎖)中，x連鎖的rp(xlrp)與嚴(yán)重形式的涉及視桿細胞和視錐細胞作為主要靶標(biāo)的疾病有關(guān)(berson1993；sandbergandothers2007)。超過70％的x連鎖的rp和10％-20％的全部rp病例是由編碼rpgr的基因中的突變引起的(baderandothers2003；branhamandothers2012；churchillandothers；pelletierandothers2007)。鑒于目前已知超過100種基因中的突變導(dǎo)致rp和更嚴(yán)重的x連鎖疾病，rpgr是最重要的rp疾病基因之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于成功地重新產(chǎn)生功能性rpgr活性的縮短形式的人rpgr的發(fā)現(xiàn)，并因此包括治療患有由rpgr中的突變引起的rp的受試者的方法?？赏ㄟ^本發(fā)明方法治療的受試者可包括視覺功能喪失(例如對視網(wǎng)膜電圖(erg)測試的受損應(yīng)答)但是保留了一些感光細胞(通過光學(xué)相干斷層成像術(shù)(oct)測定)的那些。

因此，在一方面，本發(fā)明提供了治療患有由于編碼色素性視網(wǎng)膜炎gtpase調(diào)節(jié)因子(rpgr)蛋白的基因中的功能喪失突變而導(dǎo)致的xlrp或另一種臨床上定義的眼科病癥的人類受試者的方法。所述方法包括將包含腺伴隨病毒載體的核酸給予所述受試者，所述腺伴隨病毒載體包含縮短的人rpgrcdna，其中所述縮短的人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長至少80％相同的蛋白，所述蛋白任選地在seqidno:2中的缺失區(qū)(即seqidno:2的氨基酸861和862之間)周圍的區(qū)域中具有最多達共200個額外的氨基酸的缺失。

在一些實施方案中，rpgrcdna受人視紫紅質(zhì)激酶(hrk)啟動子(例如包含seqidno:5或基本上由seqidno:5組成的hrk啟動子)的控制。

在一些實施方案中，所述腺伴隨病毒載體是aav-2，血清型-8(aav2/8)或aav-8。

在一些實施方案中，所述rpgrcdna包含與seqidno:1至少80％相同的序列或基本上由該序列組成。

在一些實施方案中，所述人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長至少95％相同的蛋白。

在一些實施方案中，所述方法包括以約2×10¹⁰vg/ml的低劑量、約2×10¹¹vg/ml的中等劑量，或約2×10¹²vg/ml的高劑量給予所述核酸。在一些實施方案中，將所述核酸給予到視網(wǎng)膜下隙。在一些實施方案中，將微注射插管插入到視網(wǎng)膜下隙——位于視神經(jīng)的顳部并且剛好位于主弓形血管(majorarcadevessel)的上方，以使液體流動能夠朝向視網(wǎng)膜黃斑。

在另一方面，本發(fā)明提供了編碼縮短的人rpgr的核酸，其中所述縮短的人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長至少80％相同的蛋白，所述蛋白任選地在seqidno:2中的缺失區(qū)周圍具有最多達200個額外的氨基酸的缺失。

在一些實施方案中，rpgrcdna受人視紫紅質(zhì)激酶(hrk)啟動子(例如包含seqidno:5或基本上由seqidno:5組成的hrk啟動子)的控制。

在一些實施方案中，所述rpgrcdna包含與seqidno:1至少80％相同的序列或基本上由該序列組成。

在一些實施方案中，所述人rpgrcdna編碼與seqidno:2全長至少95％相同的蛋白。

在一些實施方案中，所述人rpgrcdna與seqidno:1全長至少80％相同，任選地在缺失區(qū)周圍具有編碼最多達200個額外氨基酸的核苷酸的缺失。

本文還提供了載體，例如腺伴隨病毒載體，例如aav-2，血清型-8(aav2/8)或aav-8，其包含編碼本文所述的縮短的人rpgr的核酸，以及含有編碼縮短的人rpgr的核酸并任選地表達所述縮短的人rpgr蛋白的分離的細胞(即不存在于活的人類受試者或宿主動物中的細胞)。

除非另有說明，本文使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。本文記載了用于本發(fā)明的方法和材料；另外，也可使用本領(lǐng)域已知的適合的方法和材料。所述材料、方法和實施例僅為說明性的，不意欲進行限制。本文提到的全部出版物、專利申請、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目(entry)和其他參考文獻以引用的方式全文納入本文。如果出現(xiàn)沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。

根據(jù)以下詳細描述和附圖以及權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將是顯而易見的。

附圖說明

圖1a-b：(a)天然人rpgrorf15編碼區(qū)和兩種縮短形式的aav遞送的人orf15cdna的圖。(b)兩種重組形式的人rpgr-orf15的免疫印跡。小缺失的人cdna的aav遞送(aav-orf15-l，“長型”)導(dǎo)致大小約160kd的人rpgr-orf15蛋白的表達。大缺失的人cdna的aav遞送(aav-orf15-s，“短型”)導(dǎo)致大小約130kd的蛋白的表達。這兩種形式的人rpgr-orf15蛋白比人視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源人rpgrorf15(約200kd)更小。

圖2a-d：在aav-rpgrorf15的視網(wǎng)膜下遞送之后，rpgr-^/-小鼠視網(wǎng)膜中的rpgrorf15表達。(a)疊加在nomarski圖像上以說明外視網(wǎng)膜的分層的人rpgrorf15蛋白的短型(orf15-s)和長型(orf15-l)的熒光圖像。在1-2月齡時進行處理之后3周，對未固定的冷凍視網(wǎng)膜切片進行染色。(b)與小根蛋白(rootletin)共定位的兩種形式的人rpgrorf15的熒光圖像。類似于野生型，兩種形式的人rpgrorf15準(zhǔn)確定位于剛好在小根蛋白遠端的感光細胞連接纖毛。rpe，視網(wǎng)膜色素上皮；os，外段；cc(tz)，連接纖毛(過渡區(qū))；is，內(nèi)段；onl，外核層。(c)對于用orf15-s處理的rpgr^-/-眼(n＝3)、用orf15-l處理的rpgr^-/-眼(n＝3)和野生型眼(n＝3)，hrpgr熒光粒子與連接纖毛處的熒光小根蛋白纖維的比例。獲得內(nèi)段內(nèi)的小根蛋白和在100μm長的中部周邊視網(wǎng)膜上剛好在小根蛋白遠端的rpgr的計數(shù)。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。(d)在rpgr^-/-小鼠的固定漂浮的視網(wǎng)膜切片中，短型和長型orf15蛋白的表達模式。在2-3月齡時進行處理之后4-6周，對切片進行染色以對人rpgrorf15蛋白定位。在野生型視網(wǎng)膜中，觀察到鼠rpgrorf15蛋白為占據(jù)感光細胞內(nèi)段和外段之間區(qū)域的離散的綠色熒光信號(點)，其處于過渡區(qū)或連接纖毛的水平。相比之下，短型orf15(aav-orf15-s)的熒光信號不限于感光細胞連接纖毛的水平，但是觀察到其也是遍及內(nèi)段和外段的離散信號。長型orf15的熒光信號顯示出非常少(如果有的話)的錯誤定位，并且主要限于與野生型類似的連接纖毛區(qū)。os，外段；cc(tz)，連接纖毛(過渡區(qū))；is，內(nèi)段；onl，外核層。

圖3：在13月齡時(注射后6個月)，對經(jīng)處理的(長型和短型orf15)和對照rpgr-^/-小鼠視網(wǎng)膜中視桿細胞和視錐細胞的免疫組織化學(xué)(初始為黃色)分析。在用短型orf15(aav8-orf15-s)處理的rpgr-^/-小鼠視網(wǎng)膜中，實際上不能區(qū)分視紫紅質(zhì)和視錐視蛋白(在下半部視網(wǎng)膜中的混合s&m視錐)錯誤定位染色模式與在對照視網(wǎng)膜中觀察到的那些。在這兩種小鼠視網(wǎng)膜中，注意到在內(nèi)段和突觸層中的視錐視蛋白錯誤定位。類似地，與月齡匹配的野生型視網(wǎng)膜相比，視桿和視錐外段縮短且無序，具有減少的外核層。相比之下，在用長型orf15(aav8-orf15-1)處理的rpgr^-/-小鼠視網(wǎng)膜中，視紫紅質(zhì)顯示出類似于野生型小鼠視網(wǎng)膜的外段分隔(partitioning)。另外，與對照視網(wǎng)膜相比，在orf15長型處理的視網(wǎng)膜中，視桿外段更長且組織有序，并且onl更厚。與對照相比，在orf15長型處理的rpgr^-/-小鼠視網(wǎng)膜中，視錐視蛋白染色顯示出更多的具有伸長且組織有序的外段的視錐細胞。

圖4a-b：在rpgr^-/-小鼠中用rpgrorf15-1處理后對感光細胞的拯救。(a)示出了在3只18月齡的小鼠中經(jīng)處理的眼(初始為紅色)和對側(cè)對照眼(初始為藍色)的onl厚度(上圖)和is/os長度(下圖)的堆疊條形圖。(b)來自野生型小鼠和來自18月齡的rpgr-^/-小鼠的經(jīng)orf15-1處理的眼和對側(cè)對照眼的代表性光顯微圖像。圖像取自上半部視網(wǎng)膜中沿著垂直經(jīng)線的中部周邊。

圖5a-c：(a)11-14月齡時來自16只rpgr^-/-小鼠的視桿a波、視桿b波和視錐b波振幅。與野生型小鼠的下限相比，對照眼(od)顯示出視錐b波振幅相對于視桿b波振幅的不成比例的損耗。除了在一種情況中，所有經(jīng)處理的眼(os)都比對側(cè)對照眼具有更大的反應(yīng)。特別地，注意到在該月齡時一半以上的經(jīng)處理的眼具有等于或大于野生型下限的視桿ergb波振幅。眼之間的所有三次測量的平均值顯著不同(p<0.01)。(b)對于暗適應(yīng)的(視桿)b波(上圖)和光適應(yīng)的(視錐)b波(下圖)，在對數(shù)尺度上22只9至18月齡的rpgr^-/-小鼠的erg振幅的散點圖。對于各月齡組，數(shù)據(jù)點在水平方向上輕微移動以使數(shù)據(jù)重疊最小化。使用基于全部可用數(shù)據(jù)的sas的procmixed，通過重復(fù)測量縱向回歸來擬合經(jīng)處理的眼和對照眼的回歸線。(c)來自一對18月齡的經(jīng)orf15-1處理的和對側(cè)對照rpgr^-/-眼的代表性暗適應(yīng)(da)和光適應(yīng)(la)erg波形。示出野生型(月齡匹配)erg波形用于比較。在該月齡時，對照眼分別具有嚴(yán)重減少或幾乎消失的視桿和視錐erg。然而，經(jīng)處理的眼在該時間點時仍具有顯著的視桿和視錐功能，其分別為野生型數(shù)值的約70％和35％。

圖6：5名因rpgrorf15突變而患有xlrp的患者對0.5hz白光閃光和對30hz相同的白光閃光的全視野erg。將三次或多次跡線疊加以說明重現(xiàn)性。跡線上方的點指示閃光開始。盡管對0.5hz閃光的反應(yīng)僅比正常下限(350μv)減小6％至65％，對30hz閃光的反應(yīng)未能如圖說明被檢測出(即，沒有帶通濾波和信號平均)。

具體實施方式

病毒載體介導(dǎo)的體基因療法已在治療人視網(wǎng)膜變性疾病的動物模型中表現(xiàn)出廣闊的前景。迄今為止，已有許多在小動物模型(aliandothers2000；pangandothers2012；pawlykandothers2010；pawlykandothers2005；tanandothers2009)和大動物模型(aclandandothers2001；alexanderandothers2007；beltranandothers2012；komaromyandothers2010；lheriteauandothers2009)中使用腺伴隨病毒(aav)介導(dǎo)的基因遞送以拯救感光細胞變性的成功的研究。在這些病例中，視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)或感光細胞是轉(zhuǎn)基因表達的主要靶標(biāo)。此外，i期臨床試驗——包括對患有靶向rpe的先天性利伯氏黑蒙(lca)(bainbridgeandothers2008；cideciyanandothers2008；maguireandothers2008)以及最近的無脈絡(luò)膜(maclarenandothers2014)的患者的基因治療——已經(jīng)取得了一些成功。目前沒有臨床試驗使用aav介導(dǎo)的基因置換療法來治療患有x連鎖的rp的患者。

本發(fā)明人之前已使用轉(zhuǎn)基因方法，利用在富含嘌呤的羧基末端缺少約600bp的縮短的鼠rpgrorf15同源體證明了在缺少rpgr的小鼠中對視桿細胞和視錐細胞的功能和形態(tài)拯救(hongandothers2005)。在正常個體中頻繁發(fā)現(xiàn)在重復(fù)區(qū)長度中的一些變異(baderandothers2003；jacobiandothers2005；karraandothers2006)。然而，縮短的人rpgr的功能尚未被描述。

在本研究中，由之前記載的視紫紅質(zhì)激酶(rk)啟動子驅(qū)動(khaniandothers2007；sunandothers2010)并且在快速作用的aav8載體中遞送(alloccaandothers2007；natkunarajahandothers2008)的縮短的人rpgrorf15置換基因能夠在rpgr敲除小鼠模型中拯救感光細胞變性表型。orf15外顯子的富含嘌呤的重復(fù)區(qū)是rpgr的準(zhǔn)確的亞細胞定位和功能所必需的，但是將其長度縮短最多達1/3似乎并未損害它的功能。在未來的人類基因治療試驗中，這種縮短的rpgr替換基因提供了迄今為止回避的“全長”rpgrorf15的可行的替代物。

rpgr

rpgr以復(fù)雜的模式表達，已記載默認(rèn)的變體和orf15變體(vervoortandothers2000)。rpgr的默認(rèn)型或組成型跨越外顯子1-19，并且orf15在外顯子16-19開始之前在被指定為orf15的大可變外顯子中終止。orf15外顯子的獨特之處在于，它包含很長一段富含嘌呤的重復(fù)序列，該序列被證明難以克隆成cdna并且在許多重組dna操作步驟中不穩(wěn)定。盡管rpgr的更小的默認(rèn)形式是具有運動纖毛(hongetal,2003)和許多類型的原纖毛(我們未公開的數(shù)據(jù))的組織中的主要形式，rpgr的orf15同源體是視網(wǎng)膜中正常視桿和視錐功能必需的(vervoortandothers2000；vervoortandwright2002)，并且主要在感光細胞中表達(hongandothers2003)。orf15也是rpgr突變的通常位點，具有在22-60％的x連鎖的rp患者中鑒定的突變(breuerandothers2002；vervoortandothers2000)。

本發(fā)明人促成開發(fā)了攜帶rpgr中的無效突變、任何rpgr的同源體的水平都不可檢測的第一個x連鎖rp的小鼠模型(hongandothers2000)。rpgr無效小鼠表現(xiàn)出緩慢發(fā)展的視網(wǎng)膜變性，其特征在于早期視錐細胞視蛋白在細胞體和突觸中的錯誤定位以及視桿細胞中的視紫紅質(zhì)水平降低。因此，這些小鼠具有視錐-視桿變性。到12月齡時，通過視網(wǎng)膜電圖(erg)測量的顯著的感光細胞損失以及視錐和視桿功能減退變得明顯。在視網(wǎng)膜中，rpgr經(jīng)由rpgr相互作用蛋白(rpgrip1)結(jié)合于位于內(nèi)段和外段之間的感光細胞連接纖毛(參見，例如boylanandwright2000；hongandothers2001；roepmanandothers2000)。所述連接纖毛類似于運動纖毛或原纖毛的過渡區(qū)，其可充當(dāng)通向外段的通道。這種亞細胞定位模式和突變的小鼠表型表明，rpgr可在視桿和視錐的內(nèi)段和外段之間的蛋白轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用(hongandli2002；hongandothers2000；hongandothers2001)。為了開發(fā)具有更快變性進程的rpgr突變小鼠模型，最近已開發(fā)了若干其他rpgr小鼠系(brunner,etal,2010；huangetal,2012)。最近還報道了天然存在的x連鎖rpgr模型(rd9)(thompsonandothers2012)。在全部這些情況中，包括rpgr無效小鼠表現(xiàn)出緩慢發(fā)展的感光細胞損失，但是視桿和視錐參與程度不同，這可能部分是由于應(yīng)力(strain)和/或色素沉著的差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，敲除模型中的緩慢的變性速率是由于物種差異而非脫離(ablation)不完全，并且確認(rèn)了該鼠模型在患者中的無效rpgr突變的治療研究中的適用性。

全長人rpgr的兩種變體(a和c)(也已知為crd；rp3；cod1；pcdx；rp15；xlrp3；orfl5；和cordx1)記載于genbank；同源體a的登錄號為nm_000328.2(核酸)和np_000319.1(蛋白)；同源體c的登錄號為nm_001034853.1(核酸)和np001030025.1(蛋白)。與變體c相比，變體(a)使用可變剪接位點并且在3’編碼區(qū)包含多個可變外顯子，并且編碼同源體a(也稱為同源體1)，所述同源體a與同源體c相比更短并且具有不同的c端。用于本文所述的示例性組合物的序列如以下seqidno：1所示?？捎糜诒疚乃龅慕M合物和方法的人rpgr的序列可與seqidno：1全長至少80％，例如85％、90％、95％或100％相同，從缺失區(qū)缺失最多達額外的50、100、150或200個氨基酸，所述缺失在以下序列中通過破折號來表示。

具有378bp缺失的人rpgrorf15序列的縮短形式，缺失區(qū)由破折號表示(“-”；破折號的數(shù)目與缺失的大小不相關(guān))。

atgagggagccggaagagctgatgcccgattcgggtgctgtgtttacatttgggaaaagtaaatttgctgaaaataatcccggtaaattctggtttaaaaatgatgtccctgtacatctttcatgtggagatgaacattctgctgttgttaccggaaataataaactttacatgtttggcagtaacaactggggtcagttaggattaggatcaaagtcagccatcagcaagccaacatgtgtcaaagctctaaaacctgaaaaagtgaaattagctgcctgtggaaggaaccacaccctggtgtcaacagaaggaggcaatgtatatgcaactggtggaaataatgaaggacagttggggcttggtgacaccgaagaaagaaacacttttcatgtaattagcttttttacatccgagcataagattaagcagctgtctgctggatctaatacttcagctgccctaactgaggatggaagactttttatgtggggtgacaattccgaagggcaaattggtttaaaaaatgtaagtaatgtctgtgtccctcagcaagtgaccattgggaaacctgtctcctggatctcttgtggatattaccattcagcttttgtaacaacagatggtgagctatatgtgtttggagaacctgagaatgggaagttaggtcttcccaatcagctcctgggcaatcacagaacaccccagctggtgtctgaaattccggagaaggtgatccaagtagcctgtggtggagagcatactgtggttctcacggagaatgctgtgtatacctttgggctgggacaatttggtcagctgggtcttggcacttttctttttgaaacttcagaacccaaagtcattgagaatattagggatcaaacaataagttatatttcttgtggagaaaatcacacagctttgataacagatatcggccttatgtatacttttggagatggtcgccacggaaaattaggacttggactggagaattttaccaatcacttcattcctactttgtgctctaattttttgaggtttatagttaaattggttgcttgtggtggatgtcacatggtagtttttgctgctcctcatcgtggtgtggcaaaagaaattgaattcgatgaaataaatgatacttgcttatctgtggcgacttttctgccgtatagcagtttaacctcaggaaatgtactgcagaggactctatcagcacgtatgcggcgaagagagagggagaggtctccagattctttttcaatgaggagaacactacctccaatagaagggactcttggcctttctgcttgttttctccccaattcagtctttccacgatgttctgagagaaacctccaagagagtgtcttatctgaacaggacctcatgcagccagaggaaccagattatttgctagatgaaatgaccaaagaagcagagatagataattcttcaactgtagaaagccttggagaaactactgatatcttaaacatgacacacatcatgagcctgaattccaatgaaaagtcattaaaattatcaccagttcagaaacaaaagaaacaacaaacaattggggaactgacgcaggatacagctcttactgaaaacgatgatagtgatgaatatgaagaaatgtcagaaatgaaagaagggaaagcatgtaaacaacatgtgtcacaagggattttcatgacgcagccagctacgactatcgaagcattttcagatgaggaagtagagatcccagaggagaaggaaggagcagaggattcaaaaggaaatggaatagaggagcaagaggtagaagcaaatgaggaaaatgtgaaggtgcatggaggaagaaaggagaaaacagagatcctatcagatgaccttacagacaaagcagaggtgagtgaaggcaaggcaaaatcagtgggagaagcagaggatgggcctgaaggtagaggggatggaacctgtgaggaaggtagttcaggagcagaacactggcaagatgaggagagggagaagggggagaaagacaagggtagaggagaaatggagaggccaggagagggagagaaggaactagcagagaaggaagaatggaagaagagggatggggaagagcaggagcaaaaggagagggagcagggccatcagaaggaaagaaaccaagagatggaggagggaggggaggaggagcatggagaaggagaagaagaggagggagacagagaagaggaagaagagaaggagggagaagggaaagaggaaggagaaggggaagaagtggagggagaacgtgaaaaggaggaaggagagaggaaaaaggaggaaagagcggggaaggaggagaaaggagaggaagaaggagaccaaggagagggggaagaggaggaaacagaggggagaggggaggaaaaagaggagggaggggaagtagagggaggggaagtagaggaggggaaaggagagagggaagaggaagaggaggagggtgagggggaagaggaggaaggggagggggaagaggaggaaggggagggggaagaggaggaaggagaagggaaaggggaggaagaa-ggggagggggaagaggaggaaggggaagaagaaggggaggaagaaggagagggagaggaagaaggggagggagaaggggaggaagaagaggaaggggaagtggaaggggaggtggaaggggaggaaggagagggggaaggagaggaagaggaaggagaggaggaaggagaagaaagggaaaaggagggggaaggagaagaaaacaggaggaacagagaagaggaggaggaagaagaggggaagtatcaggagacaggcgaagaagagaatgaaaggcaggatggagaggagtacaaaaaagtgagcaaaataaaaggatctgtgaaatatggcaaacataaaacatatcaaaaaaagtcagttactaacacacagggaaatgggaaagagcagaggtccaaaatgccagtccagtcaaaacgacttttaaaaaatgggccatcaggttccaaaaagttctggaataatatattaccacattacttggaattgaagtaa(seqidno：1)

縮短形式的人rpgrorf15的蛋白序列，缺失區(qū)由破折號表示(“-”；破折號的數(shù)目與缺失的大小不相關(guān))

全長人rpgrorf15cdna序列；縮短形式中缺失的378bp在以下序列中以加粗和下劃線示出。

全長人rpgrorf15氨基酸序列；縮短形式中缺失的氨基酸在以下序列中以加粗和下劃線示出。

可使用數(shù)學(xué)算法來實現(xiàn)序列比較并確定兩條序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。例如，可使用needleman和wunsch((1970)j.mol.biol.48：444-453)算法(其在gcg軟件包(可在萬維網(wǎng)gcg.com獲得)中被并入gap程序)，使用默認(rèn)參數(shù)(例如blossum62計分矩陣，空位罰分12，空位延伸罰分4，移碼空位罰分5)來確定兩條氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。

rk啟動子

在本文所述方法的一些實施方案中，使用了置換基因構(gòu)建體，其中縮短的人rpgrcdna被置于人視紫紅質(zhì)激酶(hrk)啟動子的控制下。在一些實施方案中，所述rk啟動子的長度約為200bp(來自視紫紅質(zhì)激酶(rk)基因的短啟動子，其已顯示出在視桿細胞和視錐細胞中驅(qū)動細胞特異性表達(khanietal，2007；sunetal，2010；youngetal，2003))。示例性的hrk啟動子序列是-112/+87(khanietal.，2007)：

gggccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggaaaagtgaggcggccccttggaggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtctttttctagcaccttcttgccactcctaagcgtcctccgtgaccccggctgggatttagcctggtgctgtgtcagccccggt(seqidno：5)

病毒遞送載體

上述縮短的人rpgrcdna被包裝成遞送載體，例如aav8或aav2/8載體。

可以以任何有效的載體(例如任何能夠?qū)⒔M分基因有效遞送到體內(nèi)細胞的制劑或組合物)來給予置換基因(cdna)。方法包括將所述基因插入到非致病性、非復(fù)制型的病毒載體(包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒和單純皰疹病毒-1)或重組的細菌或真核質(zhì)粒。病毒載體直接轉(zhuǎn)染細胞；質(zhì)粒dna可在裸露狀態(tài)下遞送，或借助例如陽離子脂質(zhì)體(lipofectamine)或衍生的(例如抗體綴合的)多聚賴氨酸綴合物、gramacidins、人工病毒包膜或其他這類胞內(nèi)載體，以及在體內(nèi)進行的基因構(gòu)建體的直接注射或capo4沉淀。

在體內(nèi)將核酸引入細胞中的優(yōu)選方法是通過使用包含核酸(例如cdna)的病毒載體。用病毒載體感染細胞的優(yōu)勢在于，大部分靶細胞能夠接收核酸。此外，在病毒載體內(nèi)編碼的分子(例如通過病毒載體中包含的cdna)可在吸收病毒載體核酸的細胞中有效表達。

腺病毒載體和腺伴隨病毒載體可用作重組基因遞送系統(tǒng)，用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)移外源基因，特別是轉(zhuǎn)移到人中。這些載體提供基因到細胞中的有效遞送，并且被轉(zhuǎn)移的核酸被穩(wěn)定整合到宿主的染色體dna中。僅產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的特定的細胞系(被稱為“包裝細胞”)的開發(fā)增大了逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因治療的實用性，并且缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒被表征為用于以基因治療為目的的基因轉(zhuǎn)移(參見miller，blood76：271(1990))。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒可被包裝成病毒粒子，所述病毒粒子可用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用輔助病毒來感染靶細胞。產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和在體外或體內(nèi)用這樣的病毒感染細胞的方案可參見ausubel，etal，eds.，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociates，(1989)，sections9.10-9.14和其他標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊。適合的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的plj、pzip、pwe和pem。用于制備親嗜性和兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的適合的包裝病毒系包括ψcrip、ψcre、ψ2和ψam。逆轉(zhuǎn)錄病毒用于在體外和/或體內(nèi)將多種基因引入許多不同的細胞類型，包括上皮細胞(參見，例如eglitis,etal.(1985)science230:1395-1398；danosandmulligan(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:6460-6464；wilsonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:3014-3018；armentanoetal.(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:6141-6145；huberetal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:8039-8043；ferryetal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:8377-8381；chowdhuryetal.(1991)science254:1802-1805；vanbeusechemetal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:7640-7644；kayetal.(1992)humangenetherapy3:641-647；daietal.(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:10892-10895；hwuetal.(1993)j.immunol.150:4104-4115；u.s.patentno.4,868,116；u.s.patentno.4,980,286；pct申請wo89/07136；pct申請wo89/02468；pct申請wo89/05345；和pct申請wo92/07573)。

另一種可用于本發(fā)明方法的病毒基因遞送系統(tǒng)利用衍生自腺病毒的載體。可操縱腺病毒的基因組，以使它編碼和表達目的基因產(chǎn)物，但是喪失其在正常的裂解病毒生命周期中復(fù)制的能力。參見，例如berkneretal,biotechniques6:616(1988)；rosenfeldetal,science252:431-434(1991)；和rosenfeldetal,cell68:143-155(1992)。源自腺病毒毒株ad5型dl324或腺病毒其他毒株(例如ad2、ad3或ad7等)的適合的腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。重組腺病毒在某些情況下的優(yōu)勢在于，它們不能感染非分裂細胞并且可用于感染多種細胞類型，包括上皮細胞(rosenfeldetal,(1992)，見上文)。此外，病毒粒子是相對穩(wěn)定的并且易于被純化和濃縮，并且如上文所述，可對病毒粒子進行修飾以影響感染性范圍。此外，被引入的腺病毒dna(和其中包含的外源dna)未被整合到宿主細胞的基因組中，而是保持游離，從而避免了由于原位(被引入的dna整合到宿主基因組中的位置(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒dna))插入誘變而產(chǎn)生的潛在問題。此外，腺病毒基因組對外源dna的攜帶能力相對于其他基因遞送載體更大(最多達8千堿基)(berkneretal，見上文；haj-ahmandandgraham,j.virol.57:267(1986))。

另一種可用于遞送核酸的病毒載體系統(tǒng)是腺伴隨病毒(aav)。腺伴隨病毒是天然存在的缺陷型病毒，其需要另一種病毒(例如腺病毒或皰疹病毒)作為輔助病毒以實現(xiàn)有效復(fù)制和生產(chǎn)性的生命周期(參見muzyczkaetal,curr.topicsinmicro,andimmunol.l58:97-129(1992))。它也是可將其dna整合到非分裂細胞中并且表現(xiàn)出高頻率穩(wěn)定整合的少數(shù)病毒之一(參見，例如flotteetal,am.j.respir.cell.mol.biol.7:349-356(1992)；samulskietal,j.virol.63:3822-3828(1989)；和mclaughlinetal,j.virol.62:1963-1973(1989))。aav的包含少達300堿基對的載體能夠被包裝并整合。外源dna的空間被限制在約4.5kb。aav載體(如tratschinetal,mol.cell.biol.5:3251-3260(1985)中記載的載體)可用于將dna引入細胞中。已使用aav載體將許多核酸引入不同的細胞類型中(參見，例如hermonatetal,proc.natl.acad.sci.usa81:6466-6470(1984)；tratschinetal,mol.cell.biol.4:2072-2081(1985)；wondisfordetal,mol.endocrinol.2:32-39(1988)；tratschinetal,j.virol.51:611-619(1984)；和flotteetal,j.biol.chem.268:3781-3790(1993))。

在優(yōu)選的實施方案中，所述病毒遞送載體是重組的aav2/8病毒。

在給藥前，最終產(chǎn)品將經(jīng)過一系列超純化步驟以符合臨床級標(biāo)準(zhǔn)。

受試者選擇

為本發(fā)明的治療方法的候選者的受試者包括被診斷具有由編碼rpgr的基因中的突變引起的rp的那些。也可使用本文所述的方法來治療患有由編碼rpgr的基因中的突變引起的其他眼科臨床確定的病癥(例如x連鎖的視錐-視桿營養(yǎng)不良)的受試者?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來診斷由編碼rpgr的基因中的突變引起的xlrp或另一種眼科病癥。

本文所述的方法可包括鑒定受試者(例如，兒童、青少年或年輕成年受試者)，其患有由編碼rpgr的基因中的突變引起的xlrp或另一種眼科病癥，或疑似患有由編碼rpgr的基因中的突變引起的xlrp或另一種眼科病癥(例如，基于存在所述病癥的癥狀并且沒有其他明顯的原因)；以及從所述受試者獲得包含基因組dna的樣品，使用已知的分子生物學(xué)方法檢測rpgr中突變的存在，以及選擇具有導(dǎo)致xlrp或另一種病癥的rpgr中的突變的患者。檢測rpgr中的突變可包括檢測orf15中的突變，例如sandbergetal,(2007).investophthalmolvissci48,1298-304；droretal,amjhumgenet.nov2003；73(5):1131-1146中所記載的。

rpgrorf15中的突變包括移碼突變、無義突變、剪接位點突變和錯義突變。示例性的突變包括orf15glu446(1-bp-del)、orf15glu447(2-bp-del)和orf15glys521(l-bp-ins)。

檢測rpgr中的突變也可包括對受試者的rpgr基因進行全部測序或部分(例如orf15區(qū)域)測序，以及比較所述序列與參照序列(例如，genbank登錄號ng_009553.1)以檢測突變。移碼突變、截短突變、改變保守氨基酸的突變或影響調(diào)控區(qū)(例如啟動子)的突變可被認(rèn)為是導(dǎo)致本文所述的xlrp或另一種眼科病癥的突變；可通過體外(例如在培養(yǎng)的細胞中)或體內(nèi)(例如在轉(zhuǎn)基因動物中)表達突變體并測定例如功能或亞細胞定位來確認(rèn)功能改變。

可使用本文所述的方法來治療的患有因rpgr突變而導(dǎo)致的xlrp或另一種眼科病癥的患者優(yōu)選保留一些感光細胞和視覺功能，例如通過標(biāo)準(zhǔn)視覺功能或視野測試和/或光學(xué)相干斷層成像術(shù)(otc，例如譜域otc(sd-oct))所測量的；參見，例如sandbergetal,investophthalmolvissci.2007；48:1298-1304。本文所述的方法可包括鑒定受試者，其被診斷為患有因rpgr突變而導(dǎo)致的xlrp或另一種眼科病癥，其具有導(dǎo)致他們的病癥的rpgr中的經(jīng)確認(rèn)的突變；以及檢測他們的視覺能力并檢測剩余的中央感光細胞的存在?？墒褂帽景l(fā)明方法來治療的受試者(例如兒童、青少年、年輕成年人或成年人受試者)優(yōu)選具有至少20/200的視敏度(用于測定視敏度的方法是本領(lǐng)域熟知的；參見例如johnson,deafnessandvisiondisorders:anatomyandphysiology,assessmentprocedures,ocularanomalies,andeducationalimplications,charlesc.thomaspublisher；1999；carlson,n；kurtz,d.；heath,d.；hines,c.clinicalproceduresforocularexamination.appleton&lange；norwalk,ct.1990)和中央凹中的可檢測的外核層(例如，至少正常厚度的75％、80％、90％、95％或99％)。

實施例

在以下實施例中對本發(fā)明作進一步描述，所述實施例并不限制權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的范圍。

材料和方法

以下材料和方法用于下文所述的實施例。

動物

之前記載了rpgr^-/-小鼠的產(chǎn)生和分析(hongandothers2000)。用于本研究的rpgr^-/-小鼠是從我們的機構(gòu)動物設(shè)施中養(yǎng)育的缺合型rpgr雄性和純合型(rpgr^-/-)雌性之間的同胞交配而繁殖的。用于研究的野生型小鼠是來自charlesriver實驗室(wilmington,ma)的c57bl。將小鼠養(yǎng)育在12hr光照/12hr黑暗的光照周期中。研究按照在眼科和視覺研究中使用動物的arvo聲明完成，并且由馬薩諸塞州眼耳醫(yī)院的iacuc批準(zhǔn)。

質(zhì)粒構(gòu)建和重組aav8的產(chǎn)生

使用被設(shè)計以包含全部rpgrorf15同源體編碼區(qū)的引物，通過pcr從人視網(wǎng)膜cdna擴增人rpgrorf15cdna。盡管使用多種方法反復(fù)嘗試，仍未得到全長orf15cdna，這與其他研究者和我們自己的經(jīng)驗一致(hongandothers2005)。相反，我們獲得了在orf15外顯子中包含大的314個密碼子(942bp)框內(nèi)缺失的縮短的orf15cdna(剩余2517bp)，其中富含嘌呤的重復(fù)區(qū)被移除(密碼子696-1010del，“短型”)(圖1a)。通過重組dna操作來構(gòu)建第二orf15cdna，其在外顯子15的高度重復(fù)區(qū)中包含126個密碼子(378bp)框內(nèi)缺失(在orf15外顯子中剩余3081bp)(密碼子862-988del，“長型”)。對這些orf15cdna進行測序以驗證保真度。為了構(gòu)建aav載體，將rpgrcdna插入到親本paav-rk-zsgreen載體的多克隆位點。將所得的paav-rk-mrpgr和paav-rk-hrpgr載體包裝成aav。通過三部分轉(zhuǎn)染產(chǎn)生aav2/8假型載體：(1)編碼目的基因的aav載體質(zhì)粒；(2)編碼來自血清型2的aavrep蛋白和來自血清型8的cap蛋白的aav輔助質(zhì)粒plt-rc03；和(3)進入293a細胞的腺病毒輔助小質(zhì)粒phgti-adeno1)。使用xiao及其合作者開發(fā)的方案進行轉(zhuǎn)染(xiao,etal,1998)。轉(zhuǎn)染后兩天，通過反復(fù)的冷融循環(huán)來裂解細胞。在初步除去細胞碎片后，通過核酸酶(benzonase)處理來除去病毒生產(chǎn)細胞的核酸組分。通過碘克沙醇密度梯度純化重組的aav載體粒子。將純化的載體粒子用pbs大量透析，并通過斑點印跡雜交進行滴定。

視網(wǎng)膜下注射

使用腹膜內(nèi)注射氯胺酮(90mg/kg)/甲苯噻嗪(9mg/kg)，將小鼠置于全身麻醉。將0.5％丙對卡因溶液作為局部麻醉劑施用到角膜。通過局部施用環(huán)噴托酯和鹽酸去氧腎上腺素使瞳孔擴大。在眼科手術(shù)顯微鏡下，使用18號針頭，穿過與角膜緣鄰近的角膜切開一個小切口。將安裝到hamilton注射器的33號鈍針頭通過切口插入到晶狀體后并推過視網(wǎng)膜。在視網(wǎng)膜的鼻象限內(nèi)的位置，在視網(wǎng)膜下進行全部注射。在視網(wǎng)膜的鼻象限內(nèi)，在視網(wǎng)膜下進行注射。每只眼接受2×10⁹載體基因組(aav-orf15-l)/μl或5×10⁹載體基因組(aav-orf15-s)/μl。將rpgr-orf15載體給予至左眼(os，左眼)，并且將對照載體(aav8-rk-egfp)給予至右眼(od，右眼)。這些在本文中分別被稱為“經(jīng)處理的”或“對照”。通過向載體懸浮液中添加0.1體積％的熒光素(100mg/mlak-fluor,alcon,inc.)來輔助注射期間的可視化(visualization)。注射之后的眼底檢查發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下>30％的視網(wǎng)膜分離，確認(rèn)了成功的視網(wǎng)膜下遞送。在1月齡時對小鼠群(總共n＝50)進行注射以進行蛋白表達研究，并且在主要感光細胞喪失之前在3至7月齡時(因為erg在該月齡期間保持正常)進行注射以進行功能(erg)和組織學(xué)研究。

組織學(xué)和免疫熒光法

對于光學(xué)顯微鏡檢查和透射電子顯微鏡檢查，將摘出的眼固定在溶于0.1m二甲胂酸鹽緩沖液(ph7.5)中的1％甲醛、2.5％戊二醛中10分鐘。在除去前段和晶狀體之后，在4℃將眼杯(eyecup)留在相同的固定劑中過夜。將眼杯用緩沖液沖洗，然后在四氧化鋨中后固定，通過分級醇系列脫水并包埋在epon中。切割半薄切片(1μm)，用于光學(xué)顯微鏡觀察。對于em，將超薄切片在乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛中染色，然后在jeol100cx電子顯微鏡上檢查。

對于纖毛蛋白的免疫熒光染色，摘除眼睛，速凍并在低溫恒溫器中切成10μm切片。然后在玻片上收集未固定的冷凍切片并進行染色。對于所有其他蛋白的免疫染色，收集漂浮的視網(wǎng)膜切片并進行染色。對于這一過程，將眼置于固定劑(2％甲醛，0.25％戊二醛/pbs)中并除去它們的前段和晶狀體。固定的持續(xù)時間通常為20分鐘。將固定的組織浸泡在30％蔗糖/pbs中至少2小時，速凍并與未固定的組織類似地切成切片。然后將切片收集到pbs緩沖液中并使其在免疫染色過程的持續(xù)時間中保持自由漂浮。觀察染色的切片并在激光掃描共焦顯微鏡(modeltcssp2；leica)上拍照。使用的抗體是小鼠rpgr(si)、人rpgrc100、抗小根蛋白、1d4(抗視紫紅質(zhì))、混合藍/綠視錐抗視蛋白和hoechst33342、核染料染色。

免疫印跡分析

在ripa緩沖液中使視網(wǎng)膜組織均質(zhì)化，在laemmli緩沖液中煮沸并在5％sds-page凝膠上以15μg/泳道上樣。凝膠分離后，通過電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)印在pvdf膜上。將膜用5％脫脂乳封閉，并在室溫下用一級抗體孵育過夜。沖洗后，將膜用過氧化物酶綴合的二級抗體孵育。westpico化學(xué)發(fā)光底物(pierce)用于檢測。對于歸一化(normalization)，將蛋白質(zhì)樣品在sds-page上分離并用轉(zhuǎn)導(dǎo)素α抗體(vanderbilt大學(xué)heidihamm博士的贈予)探測。

erg記錄

使小鼠在黑暗中過夜適應(yīng)，在試驗前經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉來麻醉小鼠。使用鹽酸去氧腎上腺素和鹽酸環(huán)噴托酯來使每只動物的兩個瞳孔局部放大，然后將小鼠置于加熱的平臺上。在ganzfeld拱頂(dome)中使用以1分鐘間隔出現(xiàn)的白光的10-μs閃光(1.37×10⁵cd/m²)在黑暗中引起視桿主導(dǎo)的反應(yīng)。在41cd/m²視桿脫敏的白光背景下，使用以1hz間隔出現(xiàn)的相同閃光(1.37×10⁵cd/m²)來引起光適應(yīng)的視錐反應(yīng)。使用與每只角膜(其用鹽酸丙對卡因局部麻醉并用羥丙甲纖維素眼液(goniosol)潤濕)接觸的銀線環(huán)形電極同時從雙眼監(jiān)測erg，使用頸部中的皮下電極作為參照；將電屏蔽的室用作接地端(ground)。

將所有反應(yīng)在1000增益(在2hz和300hz下-3db；am502,tektronixinstruments,beaverton,or)下差異放大，使用可調(diào)節(jié)的峰峰輸入振幅在16位分辨率下數(shù)字化(pci-6251,nationalinstruments,austin,tx)，并使用定制軟件在個人計算機上顯示(labview,version8.2,nationalinstruments)。單獨地對于每只眼，將視錐反應(yīng)通過60hz陷波濾波器和可調(diào)節(jié)的產(chǎn)物-拒絕窗口(artifact-rejectwindow)進行調(diào)整，求和(n＝4-20)，然后擬合到具有可變硬度的三次樣條函數(shù)以提高信噪比而不影響時間特征；以這種方式，我們能夠以小至2μv來解析b波反應(yīng)。

統(tǒng)計學(xué)分析

使用jmp，版本6(sasinstitute,cary,nc)來比較橫向的erg振幅和隱含的次數(shù)。使用procmixedofsas，版本9.3(sasinstitute)的重復(fù)測量分析用于組織學(xué)比較并用于比較處理的眼相對于未處理的眼的縱向erg數(shù)據(jù)。

患者

檢查從sharon,etal(2003)中記載的數(shù)據(jù)組獲得的針對111名患有因orf15rpgr突變而導(dǎo)致的xlrp的患者的全視野視網(wǎng)膜電圖(erg)數(shù)據(jù)，以比較對0.5hz白光的b波振幅，其反映了剩余的視桿+視錐功能，以及對相同白光的30hz閃光的b波振幅，其反映了剩余的單獨的視錐功能。為了確定他們是否患有視桿-視錐或視錐-視桿疾病，我們計算了對于od和對于os他們對0.5hz閃光的振幅除以他們對30hz閃光的振幅的比值；在我們的系統(tǒng)中正常的下限的相同比值為350μv/50μv＝7。為了更精確地定量對0.5hz閃光的反應(yīng)振幅并且使主要的感光細胞變性的可能的次要效應(yīng)最小化，我們集中在其對0.5hz閃光的振幅>50μv(反映出早期或程度較輕的疾病)的那些患者(n＝14)。

具有orf15突變的患者的erg

對于14名對0.5hz白光閃光具有最強反應(yīng)(反映出剩余的視桿+視錐功能)的患者而言，對該條件的振幅范圍為53μv至329μvod和59μv至282μvos。他們對相同白光的30hz閃光的振幅(反映出單獨的視錐功能并使用帶通濾波和振幅<10μv的信號平均來進行監(jiān)測)范圍為0.98μv至23.5μvod和0.95μv至20μvos。對0.5hz閃光的反應(yīng)振幅除以對30hz閃光的反應(yīng)振幅的比值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差為47.0±12.7od和48.7±13.0os。這些平均值顯著不同于7.0——基于正常的下限的比值(非參數(shù)符號秩檢驗，p＝0.0004od和p＝0.001os)。換言之，這些具有orf15突變的患者具有顯著不成比例的視錐功能喪失。這些erg的實例示于圖6。

實施例1.aav介導(dǎo)的人rpgrorf15的表達

我們構(gòu)建了兩種人rpgrorf15置換基因，一種具有126個密碼子的框內(nèi)缺失(長型，orf15-l)，另一種具有314個密碼子的框內(nèi)缺失(短型，orf15-s)。將這兩種基因插入到aav8載體中，所述載體受人視紫紅質(zhì)激酶啟動子(圖1a)的控制(khaniandothers2007；sunandothers2010)。所述兩種人rpgrorf15置換基因的視網(wǎng)膜下遞送(左眼)導(dǎo)致產(chǎn)生重組rpgr蛋白。通過蛋白質(zhì)印跡法，在給予aav載體之后2周，長型orf15產(chǎn)生約160kd蛋白，而短型orf15產(chǎn)生約125kd蛋白。這兩種蛋白產(chǎn)物都小于人視網(wǎng)膜組織中的天然orf15(約200kd)(圖1b、c)。當(dāng)使用針對人rpgr的c端的抗體探測時，這兩種置換orf15形式呈現(xiàn)為單一條帶。在我們的實驗條件和給予的劑量下，orf15-s和orf15-l的表達水平是相當(dāng)?shù)摹φ昭?右眼)接受aav-gfp。

通過未固定的冰凍切片的免疫熒光染色可在rpgr^-/-小鼠的視網(wǎng)膜中看見orf15的兩種形式(視網(wǎng)膜下注射之后3周)，其準(zhǔn)確定位于連接纖毛所在的內(nèi)段和外段之間的層。然而，短型(aav8-orf15-s)產(chǎn)生的信號比長型(aav8-orf15-l)產(chǎn)生的信號弱得多(圖2a)。在良好轉(zhuǎn)導(dǎo)的視網(wǎng)膜區(qū)，來自經(jīng)長型處理的視網(wǎng)膜的信號似乎無法與野生型信號區(qū)分開(圖2a、b)。使用抗體對纖毛根絲——其源自基體的近端并向細胞內(nèi)部延伸，因此被用作纖毛區(qū)的極好的標(biāo)記物(hongandothers2003；yangandothers2002)——進行的雙標(biāo)記確認(rèn)了重組rpgr到連接纖毛的準(zhǔn)確亞細胞定位(圖2b)。不同于通過蛋白質(zhì)印跡法測定的蛋白表達水平的相似性，只有長型orf15似乎在與根絲數(shù)目匹配的每個cc具有強信號，而在短型處理的視網(wǎng)膜中，許多根絲在其遠端不具有rpgr信號。圖2c示出了相對于用長型或短型人orf15處理的rpgr^-/-小鼠視網(wǎng)膜中以及未處理的野生型小鼠視網(wǎng)膜中的小根蛋白纖維的計數(shù)，代表rpgr標(biāo)記計數(shù)的柱狀圖。orf15長型相對于野生型，平均比值(rpgr信號計數(shù)除以小根蛋白纖維計數(shù))沒有差異(dunnett’s方法，p＝.24)，但是與野生型相比，orf15短型的平均比值顯著更低(p＝.0019)。

鑒于通過免疫印跡法測定的相似的表達水平，在連接纖毛處的蛋白定位差異表明，或許一部分短型orf15錯誤定位到感光細胞內(nèi)部的其他位置。通過免疫染色對固定的視網(wǎng)膜切片(其以損耗信號強度為代價，更好地保存組織)的進一步分析揭示出短型orf15的錯誤定位到感光細胞內(nèi)段和外段的orf15模式(圖2d)。對于長型orf15而言，未見到錯誤定位，所述長型orf15與野生型具有相似的染色模式。因此，短型rpgr在cc處的染色缺乏是由于定位于或局限于該亞細胞區(qū)室的能力降低，而非總體表達水平更低。

實施例2.在rpgr無效的小鼠中的人orf15-l(長型)表達促進視桿和視錐細胞存活

為了研究所述兩種置換基因的治療功效，我們通過免疫染色評估了rpgr^-/-小鼠感光細胞以尋找視桿和視錐細胞形態(tài)改善的征象。到13月齡(處理后6個月)時，使用短型人orf15未觀察到視桿或視錐細胞形態(tài)的顯著差異(圖3)；在該月齡時對照和短型orf15處理的眼都具有典型的變性外觀。與野生型眼相比，視桿和視錐外段縮短且無序，可看見視桿視蛋白在整個外核層的錯誤定位以及視錐視蛋白另外在突觸層中的錯誤定位。在對照和短型orf15處理的眼中，外核層的厚度也同樣減小。

相比之下，用長型人orf15處理的眼在視桿細胞中具有正確分布于外段的視蛋白表達，沒有明顯的錯誤定位征象。類似地，在這些用更長的orf15構(gòu)建體處理的眼中，視錐視蛋白的錯誤定位是罕見的。此外，發(fā)現(xiàn)經(jīng)orf15-l處理的眼比對照或經(jīng)orf15-s處理的眼具有更多的視桿和視錐細胞(具有幾乎正常的外段)。

基于這些發(fā)現(xiàn)，在用長型orf15處理的小鼠中進行縱向研究。為了定量經(jīng)orf15-l處理的眼相對于對照眼的拯救程度，我們測量了3只rpgr^-/-小鼠的對側(cè)眼中外核層(onl)的厚度和感光細胞內(nèi)段/外段的長度。這些在上半球的3個區(qū)和下半球的3個區(qū)中進行測量，每個區(qū)分隔600μm并且在沿著垂直經(jīng)線距視神經(jīng)頭的任一側(cè)600μm處開始；在11月齡和18月齡時，使用重復(fù)測量全因子回歸來鑒定作為主效應(yīng)的眼、半球和區(qū)域以及它們的交叉產(chǎn)物的差異，以確定治療作用是否在位置上發(fā)生改變。在11月齡時，onl厚度正常分布但是內(nèi)段/外段長度不是正常分布(shapiro-wilkw擬合優(yōu)度檢驗，p＝.016)；在18月齡時，onl厚度和內(nèi)段/外段長度都不是正常分布(分別為p＝.0011和p＝.0002)。在11月齡時，經(jīng)處理的眼的平均onl厚度(48.0μm)顯著大于對照眼(38.0μm,p＝.0015)；經(jīng)處理的眼的平均內(nèi)段/外段長度(45.1μm)也顯著大于對照眼(29.5μm，p<.0001，對于歸一化的秩p<.0001)。在該月齡時，對于上半球和下半球而言，關(guān)于onl厚度和is/os長度的治療益處是相當(dāng)?shù)?。?8月齡時，對側(cè)眼之間的視網(wǎng)膜形態(tài)差異更加顯著：對于經(jīng)處理的眼，平均onl厚度為22.8μm；對于對照眼，平均onl厚度為13.7μm(p<.0001，對于歸一化的秩p<.0001)；而對于經(jīng)處理的眼，平均內(nèi)段/外段長度為19.8μm；對于對照眼，平均內(nèi)段/外段長度為7.3μm(p<.0001，對于歸一化的秩p<.0001)。在該月齡時，我們最初觀察到，18月齡時對于is/os長度而言在上部視網(wǎng)膜的治療益處顯著大于在下部視網(wǎng)膜的治療益處(p＝.0036)，但是將長度轉(zhuǎn)換為歸一化的秩之后不再成立(p＝.17)。圖4a說明了3只18月齡的小鼠中經(jīng)處理的眼和對照眼中根據(jù)區(qū)域的onl厚度和is/os長度。

圖4b示出了取自18月齡時代表性的經(jīng)orf15-l處理的眼和對側(cè)對照眼的代表性光顯微圖像。在對照視網(wǎng)膜中，保存最好的區(qū)域僅有約2-3排松散排列的感光細胞核，具有縮短和無序的感光細胞內(nèi)段/外段。注意到內(nèi)段和外段的邊緣不再明顯。另一方面，經(jīng)處理的視網(wǎng)膜始終具有約5-6排感光細胞，具有更長、更有序和明顯的內(nèi)段和外段。

實施例3.人rpgrorf15長型表達改善了視桿和視錐細胞功能

在9-18月齡的rpgr^-/-小鼠群體(n＝22)中評估視網(wǎng)膜功能，所述視網(wǎng)膜功能通過全視野視桿和視錐erg來監(jiān)測。小鼠在3至7月齡之間接受治療，并且在注射之后6個月時立即記錄后續(xù)erg。圖5a示出了在11至14月齡之間進行測試的16只小鼠的眼的視桿和視錐erg振幅。與野生型小鼠的下限相比，對照眼(od)顯示出視錐b波振幅相對于視桿b波振幅的不成比例的損耗，如之前在rpgr^-/-小鼠的鼠模型中所觀察到的以及如視錐-視桿變性所顯示的。在每只小鼠(除一只小鼠以外)中，與對側(cè)對照眼(od)相比，經(jīng)處理的眼(os)具有更大的erga波和b波振幅，表明視桿和視錐感光細胞功能的改善。實際上，一半以上的經(jīng)處理的眼(9/16)具有等于或大于月齡匹配的野生型值下限(虛線)的視桿b波振幅。視桿erga波振幅的幾何平均值為121μvos和65μvod，視桿ergb波振幅的幾何平均值為482μvos和267μvod。平均視錐ergb波振幅為22μvos和11μvod。這些數(shù)據(jù)表明，對于該月齡范圍，aav-orf15處理使視桿功能改善81-86％，視錐功能改善100％。

在全部22只小鼠群組中，我們使用重復(fù)測量縱向回歸來比較眼的視桿和視錐b波振幅的變化速率(圖5b)。對于對照眼的視桿b波振幅，估計的平均變化速率為-8.6％/月，對于經(jīng)處理的眼的視桿b波振幅，估計的平均變化速率為-3.8％/月；這兩個平均值之間的差異是顯著的(p＝0.0001)。對于對照眼的視錐b波振幅，估計的平均變化速率為-5.8％/月，對于經(jīng)處理的眼的視錐b波振幅，估計的平均變化速率為-0.8％/月；這兩個平均值之間的差異也是顯著的(p<0.0001)。此外，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的眼的視錐b波振幅的衰減并非顯著不同于零(p＝0.54)，表明視錐功能的穩(wěn)定性，不具有可觀察到的進展。

圖5c示出了代表性的視桿和視錐erg以說明在經(jīng)處理的眼和對照眼(包括18月齡(最終時間點)的野生型)中的波形。在該月齡時對照眼的視桿功能嚴(yán)重降低(平均降低75％)，而視錐功能最小且在一些情況下實際上是不可檢測的。相反，在該時間點經(jīng)處理的眼仍具有顯著的視桿和視錐功能，盡管其功能低于在野生型眼中所見的那些功能。

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其他實施方案

應(yīng)理解，盡管已結(jié)合本發(fā)明的詳細說明對本發(fā)明進行了描述，但前述說明意欲說明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍通過所附的權(quán)利要求書的范圍來限定。其他方面、優(yōu)勢和修改在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

序列表

<110>麻省眼耳科醫(yī)院

<120>色素性視網(wǎng)膜炎的rpgr基因治療

<130>00633-0182wo1

<150>us62/028,638

<151>2014-07-24

<160>5

<170>fastseqforwindowsversion4.0

<210>1

<211>3081

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>缺失378bp的人rpgrorf15序列

<400>1

atgagggagccggaagagctgatgcccgattcgggtgctgtgtttacatttgggaaaagt60

aaatttgctgaaaataatcccggtaaattctggtttaaaaatgatgtccctgtacatctt120

tcatgtggagatgaacattctgctgttgttaccggaaataataaactttacatgtttggc180

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gtcaaagctctaaaacctgaaaaagtgaaattagctgcctgtggaaggaaccacaccctg300

gtgtcaacagaaggaggcaatgtatatgcaactggtggaaataatgaaggacagttgggg360

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ctttttatgtggggtgacaattccgaagggcaaattggtttaaaaaatgtaagtaatgtc540

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aatgatacttgcttatctgtggcgacttttctgccgtatagcagtttaacctcaggaaat1200

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tctttttcaatgaggagaacactacctccaatagaagggactcttggcctttctgcttgt1320

tttctccccaattcagtctttccacgatgttctgagagaaacctccaagagagtgtctta1380

tctgaacaggacctcatgcagccagaggaaccagattatttgctagatgaaatgaccaaa1440

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aacgatgatagtgatgaatatgaagaaatgtcagaaatgaaagaagggaaagcatgtaaa1680

caacatgtgtcacaagggattttcatgacgcagccagctacgactatcgaagcattttca1740

gatgaggaagtagagatcccagaggagaaggaaggagcagaggattcaaaaggaaatgga1800

atagaggagcaagaggtagaagcaaatgaggaaaatgtgaaggtgcatggaggaagaaag1860

gagaaaacagagatcctatcagatgaccttacagacaaagcagaggtgagtgaaggcaag1920

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gaaaaggagggggaaggagaagaaaacaggaggaacagagaagaggaggaggaagaagag2820

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aaacgacttttaaaaaatgggccatcaggttccaaaaagttctggaataatatattacca3060

cattacttggaattgaagtaa3081

<210>2

<211>1026

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>缺失126個氨基酸的人rpgrorf15序列

<400>2

metarggluproglugluleumetproaspserglyalavalphethr

151015

pheglylysserlysphealagluasnasnproglylysphetrpphe

202530

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505560

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130135140

leuseralaglyserasnthrseralaalaleuthrgluaspglyarg

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valserasnvalcysvalproglnglnvalthrileglylysproval

180185190

sertrpilesercysglytyrtyrhisseralaphevalthrthrasp

195200205

glygluleutyrvalpheglygluprogluasnglylysleuglyleu

210215220

proasnglnleuleuglyasnhisargthrproglnleuvalserglu

225230235240

ileproglulysvalileglnvalalacysglyglygluhisthrval

245250255

valleuthrgluasnalavaltyrthrpheglyleuglyglnphegly

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275280285

ilegluasnileargaspglnthrilesertyrilesercysglyglu

290295300

asnhisthralaleuilethraspileglyleumettyrthrphegly

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aspglyarghisglylysleuglyleuglyleugluasnphethrasn

325330335

hispheileprothrleucysserasnpheleuargpheilevallys

340345350

leuvalalacysglyglycyshismetvalvalphealaalaprohis

355360365

argglyvalalalysgluileglupheaspgluileasnaspthrcys

370375380

leuservalalathrpheleuprotyrserserleuthrserglyasn

385390395400

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420425430

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