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序列表

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本公開(kāi)提供具有治療效用的抗體-脲酶綴合物。更具體地，本公開(kāi)涉及具有綴合至脲酶的一種或多種抗體的治療性綴合物、組合物、其用途及其制備。

背景技術(shù)：

脲酶是催化尿素水解成二氧化碳和氨的酶。具體地，脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨和氨基甲酸酯，隨后通過(guò)自發(fā)水解使產(chǎn)生的氨基甲酸酯降解以產(chǎn)生另外的氨和碳酸。在這方面，脲酶活性?xún)A向于增加其產(chǎn)生氨(其是具有一般毒性的堿性分子)的局部環(huán)境的ph值。

在癌癥治療中使用抗體靶向腫瘤相關(guān)抗原的觀念已經(jīng)有一段時(shí)間了(herlyn等人，(1980)cancerresearch40,717)。然而，關(guān)于脲酶，有毒成分是通過(guò)尿素的酶降解產(chǎn)生的堿性環(huán)境，并且使用高親和力抗體片段。

發(fā)明概述

本技術(shù)涉及抗體-脲酶綴合物。本技術(shù)提供包含適于靜脈內(nèi)注射的藥學(xué)上可接受的水溶液和基本上不含脲酶、不含非綴合抗體和/或不含非水性hplc溶劑的抗體-脲酶綴合物的藥物組合物。

在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約6個(gè)或更多個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約6個(gè)或更多個(gè)抗體部分的平均綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約8-11個(gè)抗體部分的平均綴合比。在一些方面，脲酶是洋刀豆(jackbean)脲酶。

在一些方面，抗體是人源化抗體或非人抗體。在一些方面，抗體的分子量為從約5kda至約200kda。在一些方面，抗體的分子量為從約5kda至約50kda。在一些方面，抗體是單結(jié)構(gòu)域抗體。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體具有不超過(guò)110個(gè)氨基酸殘基、或約90個(gè)至130個(gè)氨基酸殘基的大小。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體的分子量為從約10kda至約50kda。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體的分子量為從約12kda至約15kda。在一些方面，抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗原具有特異性。在一些方面，抗體對(duì)由非小細(xì)胞肺癌表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性。在某一些方面，抗體對(duì)ceacam6具有特異性。

在一些方面，抗體對(duì)ceacam6具有高于約1×10^-6m的kd值的的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約1×10^-8m的kd值的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約1×10^-10m的kd值的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約5nm的ic50值的合親和力。在一些方面，ic50值為約3nm至約5nm。在一些方面，ic50值為約3.22nm。在一些方面，綴合物以約10μg/ml至約30μg/ml的ic50值與ceacam6結(jié)合。在一些方面，綴合物以約20μg/ml的ic50值與ceacam6結(jié)合。

在一些方面，抗體包含含有seqidno：1的氨基酸序列的多肽。在一些方面，抗體包含含有對(duì)seqidno：1的氨基酸序列的至少一個(gè)修改的多肽。

本技術(shù)提供了治療有需要對(duì)象中癌癥的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康谋疚奶峁┑慕M合物，從而治療對(duì)象中的癌癥。

在一些方面，癌癥是非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌或其組合中的一種或多種。在一些方面，癌癥是非小細(xì)胞肺癌。在一些方面，對(duì)象是人。

本技術(shù)提供了制備包含基本上不含脲酶的抗體-脲酶綴合物的組合物的方法，該方法包括在具有約6.0-7.0(如約6.5)的ph值的水性緩沖液中組合活化的抗體和脲酶，將ph值調(diào)節(jié)至8.0-9.0(如約8.3)以形成抗體-脲酶綴合物，并純化抗體-脲酶綴合物，其中該方法不包括色譜純化步驟，諸如常用的蛋白純化色譜法，包括尺寸排阻色譜法(sec)、離子交換色譜法、親和色譜法、固定化金屬親和色譜法、免疫親和色譜法、液固吸附色譜法、疏水相互作用色譜法(hic)、反相色譜法(rpc)和高效液相色譜法等。在一些方面，通過(guò)超透析過(guò)濾法純化抗體-脲酶綴合物。

在一些方面，抗體-脲酶綴合物具有每個(gè)脲酶部分8-11個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，具有約6.5的ph值的緩沖液是乙酸鈉緩沖液。在一些方面，通過(guò)包括添加硼酸鈉溶液的方法將ph值調(diào)節(jié)至約8.3。

本技術(shù)提供增加對(duì)腫瘤抗原的抗體結(jié)合親和力的方法，其包括將多個(gè)抗體分子與脲酶分子綴合以形成抗體-脲酶綴合物，其中所述綴合物對(duì)腫瘤抗原具有比非綴合抗體高至少約100倍的結(jié)合親和力。

在一些方面，抗體是人源化抗體或非人抗體。在一些方面，抗體是單結(jié)構(gòu)域抗體。在一些方面，腫瘤抗原由非小細(xì)胞肺癌表達(dá)。在一些方面，抗體對(duì)ceacam6具有特異性。

本技術(shù)還提供了試劑盒，其包含本文提供的組合物和使用該組合物的說(shuō)明書(shū)。

下面進(jìn)一步描述本公開(kāi)的這些方面和其它方面。

附圖說(shuō)明

圖1a-b描述了在癌細(xì)胞系中l(wèi)-dos47的示例性結(jié)合和細(xì)胞毒性研究。(a)l-dos47與以下五種癌細(xì)胞系的直接結(jié)合：bxpc-3、capan-1、zr-75-30、ls174t和mda-mb231。結(jié)合信號(hào)由與20mm尿素一起孵育時(shí)產(chǎn)生的氨的量表示。在bxpc-3細(xì)胞(●)、capan-1細(xì)胞和zr-75-30細(xì)胞(◆)中觀察到良好的l-dos47結(jié)合，而在ls174t細(xì)胞(▲)中觀察到中等結(jié)合，并且在mda-mb231細(xì)胞(■)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)結(jié)合。此外，在相應(yīng)的細(xì)胞系上沒(méi)有觀察到與非綴合dos47對(duì)照的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，表明l-dos47結(jié)合是特異性的并且歸因于抗體部分。(b)在加入20mm尿素時(shí)，l-dos47對(duì)癌細(xì)胞系誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性。在mda-mb231細(xì)胞(■)中沒(méi)有觀察到作用，其與結(jié)合研究一致。bxpc-3(●)和zr-75-30(◆)對(duì)l-dos47高度敏感，而在capan-1細(xì)胞和ls174t細(xì)胞(▲)中僅發(fā)現(xiàn)中等作用。

圖2a-b描述了l-dos47抗體、dos47抗體和afaikl2抗體與bxpc-3細(xì)胞的示例性直接和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。(a)釕標(biāo)記的l-dos47抗體、afaikl2抗體和非綴合的dos47與bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合。電化學(xué)發(fā)光分析提供了l-dos47抗體和afaikl2抗體與bxpc-3細(xì)胞結(jié)合的直接測(cè)量。用afaikl2抗體(▲)觀察到弱結(jié)合信號(hào)，而由于抗體綴合物上存在多個(gè)afaikl2抗體的親合力，l-dos47顯示出更強(qiáng)的結(jié)合信號(hào)(●)。用陰性對(duì)照dos47(◇)沒(méi)有觀察到結(jié)合。(b)l-dos47-標(biāo)簽與bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合，與l-dos47抗體、afaikl2抗體或dos47競(jìng)爭(zhēng)。可以通過(guò)測(cè)試制品的ic50(導(dǎo)致結(jié)合降低50％所需競(jìng)爭(zhēng)者的量)，來(lái)比較l-dos47抗體和afaikl2抗體兩者的表觀結(jié)合親和力。l-dos47抗體(●)和afaikl2抗體(▲)的ic50分別估計(jì)為2μg/ml和20μg/ml(或3.22nm和1.55μm)，表明l-dos47的結(jié)合親和力約為afaikl2抗體的500倍。用陰性對(duì)照dos47(◇)沒(méi)有觀察到抑制作用。結(jié)果表示代表性實(shí)驗(yàn)的平均值(n＝3)。

圖3a-c描述了示例性的ceacam6基因的過(guò)表達(dá)和敲低。(a)l-dos47與ceacam6轉(zhuǎn)染的h23細(xì)胞的結(jié)合。通過(guò)facs細(xì)胞分選與增加量的選擇抗生素一起富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系群(▲)。與天然h23細(xì)胞(○)和a549細(xì)胞(△)相比，結(jié)合分布圖表明ceacam6在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)水平低于在a549細(xì)胞中的水平。(b)在ceacam6轉(zhuǎn)染的h23細(xì)胞上l-dos47的細(xì)胞毒性試驗(yàn)。與bxpc-3細(xì)胞(●)、a549細(xì)胞(△)和天然h23細(xì)胞(○)相比，在h23細(xì)胞(▲)中的ceacam6過(guò)表達(dá)大大提高了其對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性的敏感性。有趣地是，盡管在(a)中觀察到較弱的l-dos47結(jié)合，但轉(zhuǎn)染的h23細(xì)胞比a549細(xì)胞和bxpc-3細(xì)胞兩者對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性都更敏感。(c)l-dos47與具有敲低的ceacam6基因的bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合。在天然(●)bxpc-3細(xì)胞和對(duì)照(hush-tr3▲)bxpc-3細(xì)胞中觀察到良好的結(jié)合信號(hào)。然而，由于ceacam6基因被shrna(hush#6和hush#7△)沉默，l-dos47結(jié)合喪失，表明ceacam6是被抗體綴合物識(shí)別的表面抗原。結(jié)果表示代表性實(shí)驗(yàn)的平均值(n＝3)。所有值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)小于10％。

圖4描述了具有l(wèi)-dos47的人結(jié)腸癌和肺腺癌的免疫組織化學(xué)染色。陽(yáng)性染色顯示為深色。

圖5描述了afaikl2抗體的氨基酸序列(seqidno：1)。

圖6示例了通過(guò)兩步反應(yīng)合成l-dos47綴合產(chǎn)物。步驟1是使用siab活化抗體，步驟2涉及活化的抗體與脲酶的綴合以形成生物綴合物l-dos47。

圖7描繪了空白制劑、afaikl2、高純度脲酶(hpu)和綴合物l-dos47的示例性尺寸排阻色譜圖。每個(gè)成分的二聚體的非常小的峰，出現(xiàn)在各自單體峰的前面。空白制劑含有10mm組氨酸、1％蔗糖、0.2mmedta，ph值6.8。

圖8描繪了空白制劑(a)、l-dos47(b)、摻有2.4％hp脲酶(hpu)的l-dos47(c)、摻有4.8％hp脲酶(hpu)的l-dos47(d)和摻有7.2％hp脲酶(hpu)的l-dos47(e)的示例性離子交換色譜圖?？瞻字苿┖?0mm組氨酸、1％(w/v)蔗糖、0.2mmedta，ph6.8。

圖9描繪了experionsds窗口的示例性快照。圖塊1：泳道2和泳道4的電泳圖疊加。圖塊2：泳道l，分子量(mw)梯；泳道1、2、7和8：使用經(jīng)過(guò)額外iec凈化的活化afaikl2產(chǎn)生的l-dos47；泳道3-6：使用未經(jīng)過(guò)額外iec凈化的afaikl2產(chǎn)生的l-dos47；泳道9和泳道10：hpu。在圖塊1中，x軸上圖塊1中的數(shù)字2-14是泳道1的電泳圖的峰數(shù)；3*表示內(nèi)部mw標(biāo)準(zhǔn)的最低分子量標(biāo)記峰，14*表示內(nèi)部mw標(biāo)準(zhǔn)的最高mw標(biāo)記峰。

圖10描繪了l-dos47(圖9的泳道2)的示例性電泳圖，顯示了與0-4個(gè)抗體分子連接的脲酶亞基的離散峰。x軸上的數(shù)字1-11是峰數(shù)；3*表示內(nèi)部mw標(biāo)準(zhǔn)的最低分子量標(biāo)記峰，11*表示內(nèi)部mw標(biāo)準(zhǔn)的最高mw標(biāo)記峰。

圖11描述了綴合比對(duì)l-dos47結(jié)合活性的示例性影響。以不同抗體綴合比(從1.8至12)制備l-dos47。測(cè)定l-dos47樣品與固定的ceacam6-a分子的直接結(jié)合。

圖12描述了afaikl2、脲酶和l-dos47的示例性免疫印跡。左圖：l-dos47、脲酶和afaikl2的凝膠電泳(考馬斯藍(lán)染色)。中間圖：用抗afaikl2抗體探測(cè)的afaikl2、脲酶和l-dos47(標(biāo)準(zhǔn)負(fù)載和5x過(guò)載)的蛋白質(zhì)印跡。右圖：用抗脲酶抗體探測(cè)的afaikl2、脲酶和l-dos47(標(biāo)準(zhǔn)負(fù)載和5x過(guò)載)的蛋白質(zhì)印跡。插入框：l-dos47的放大。

圖13描繪了afaikl2-cys-fl的胰蛋白酶消化物在420nm處的示例性rp-hplc色譜圖。在相應(yīng)的hplc峰標(biāo)出鑒定的綴合肽及其肽質(zhì)量。

圖14描述了l-dos47與癌細(xì)胞系bxpc-3、a549和mcf7的示例性直接結(jié)合。結(jié)合信號(hào)用與20mm尿素一起孵育時(shí)產(chǎn)生的氨的量表示。在bxpc-3(·)中觀察到升高的l-dos47結(jié)合，而在a549細(xì)胞(▲)中觀察到中等結(jié)合，并且在mcf7細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)結(jié)合。此外，在相應(yīng)的細(xì)胞系(○,△,▽)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與非綴合dos47對(duì)照的結(jié)合，表明l-dos47結(jié)合對(duì)bxpc-3細(xì)胞和a549細(xì)胞是特異性的。

圖15描繪了在加入20mm尿素時(shí)l-dos47誘導(dǎo)的對(duì)bxpc-3細(xì)胞和a549細(xì)胞的細(xì)胞毒性的實(shí)例。在mcf7細(xì)胞中沒(méi)有觀察到作用。bxpc-3(·)對(duì)l-dos47高度敏感，而在a549細(xì)胞(▲)中僅觀察到中等作用。另外，在相應(yīng)細(xì)胞系(○,△,▽)中沒(méi)有觀察到與非綴合的dos47對(duì)照的結(jié)合。圖的結(jié)果表示代表性實(shí)驗(yàn)的平均值(n＝3)。所有值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)小于10％。

發(fā)明詳述

應(yīng)當(dāng)理解，本公開(kāi)不限于所描述的具體方面或具體實(shí)施方案，因此當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體方面或具體實(shí)施方案的目的，并不旨在限定，因?yàn)楸竟_(kāi)的范圍將僅由所附權(quán)利要求限定。

僅為了讀者的方便，將本公開(kāi)的詳細(xì)描述被分成各個(gè)節(jié)，并且可以將在任何節(jié)中發(fā)現(xiàn)的公開(kāi)與另一節(jié)中的公開(kāi)相結(jié)合。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。

定義

必須指出，如本文和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式“一個(gè)/一種(a/an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及“化合物”包括多種化合物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”用在數(shù)字指定(例如溫度、時(shí)間、數(shù)量、濃度以及包括范圍在內(nèi)的其它值)之前時(shí)表示近似值，其可以變化規(guī)定值的(+)或(-)10％、5％或1％。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“給藥/施用(admnistration)”可以按一次劑量、連續(xù)或間歇地或通過(guò)幾個(gè)亞劑量在總體上提供單次劑量來(lái)起作用。可以在整個(gè)治療過(guò)程中進(jìn)行給藥。確定最有效的給藥手段和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且將隨著用于治療的組合物、治療目的、被治療的靶細(xì)胞和被治療的對(duì)象而變化?？梢酝ㄟ^(guò)治療醫(yī)師所選擇的劑量水平和模式，進(jìn)行單次給藥或多次給藥。合適的劑量制劑和施用藥劑的方法是本領(lǐng)域已知的。還可以確定給藥途徑，并且確定最有效的給藥途徑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且將隨著用于治療的組合物、治療目的、治療對(duì)象的健康狀況或疾病階段以及靶細(xì)胞或靶組織而變化。給藥途徑的非限制性實(shí)例包括：口服給藥、陰道給藥、鼻腔給藥、注射、局部施用、舌下給藥、肺部給藥和通過(guò)栓劑給藥。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親和力”是指受體及其配體之間(例如抗體與其抗原之間)的結(jié)合強(qiáng)度。術(shù)語(yǔ)“kd”或“解離常數(shù)”是指抗體與抗原之間的親和力，即抗體與特定抗原結(jié)合的程度如何。術(shù)語(yǔ)“ic50”或“半數(shù)最大抑制濃度”表示導(dǎo)致測(cè)試制品結(jié)合降低50％所需競(jìng)爭(zhēng)者的量。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指l-氨基酸或d-氨基酸或其混合物，包括天然氨基酸和合成氨基酸等，只要由多肽保留了期望的功能性質(zhì)即可。當(dāng)用在肽序列開(kāi)始時(shí)，nh2是指存在于多肽的氨基末端(或n末端)的游離氨基。當(dāng)用在肽序列的末端時(shí)，cooh是指存在于多肽的羧基末端(或c末端)的游離羧基。氨基酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)多肽縮寫(xiě)如下：a(ala或丙氨酸)；c(cys或半胱氨酸)；d(asp或天冬氨酸)；e(glu或谷氨酸)；f(phe或苯丙氨酸)；g(gly或glycine)；h(his或組氨酸)；i(iie或異亮氨酸)；k(lys或賴(lài)氨酸)；l(leu或亮氨酸)；m(met或甲硫氨酸)；n(asn或天冬氨酰)；p(pro或脯氨酸)；q(gln或谷氨酰胺)；r(arg或精氨酸)；s(ser或絲氨酸)；t(thr或蘇氨酸)；v(val或纈氨酸)；w(trp或色氨酸)；x(xaa或未知或其他)；y(tyr或酪氨酸)；z(glx/gln/glu或谷氨酸/谷氨酰胺)；和dpr(2,3-二氨基丙酸)。在本文中由化學(xué)式表示的所有氨基酸殘基序列，具有在氨基末端至羧基末端的常規(guī)方向上從左至右的取向。在氨基酸殘基序列的開(kāi)始或末端的破折號(hào)，表示與一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的另一序列的肽鍵，或與氨基末端基團(tuán)(如nh2)或乙?；螋然┒嘶鶊F(tuán)(如cooh)的共價(jià)鍵。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含(comprising/comprises)”旨在表示組合物和方法包括所列舉的要素，但不排除其它要素。用于定義組合物和方法時(shí)，“基本上由…組成”意味著排除對(duì)于所述目的的組合具有任何本質(zhì)意義的其他要素。因此，基本上由本文定義的要素組成的組合物或過(guò)程，將不排除不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響本公開(kāi)的基本特征和新穎特征的其它材料或步驟。“由…組成”的意思是排除超過(guò)微量元素的其他成分和實(shí)質(zhì)性方法步驟。由這些轉(zhuǎn)換術(shù)語(yǔ)中的每一個(gè)定義的實(shí)施方案在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“活性劑”、“藥物”和“藥理學(xué)活性劑”在本文中可互換使用，是指當(dāng)施用于對(duì)象時(shí)誘導(dǎo)期望的藥理作用的化學(xué)材料或化合物，并且旨在包括治療劑，其包括放射性核素、藥物、抗癌劑、毒素等。示例性活性劑是抗體脲酶綴合物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指對(duì)抗原具有結(jié)合親和力的肽、多肽或蛋白。典型的抗體結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個(gè)四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一條“輕”鏈和一條“重”鏈。每條鏈的n末端限定了主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100-110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“可變輕鏈”(vl)和“可變重鏈”(vh)分別指這些輕鏈和重鏈。抗體以完整的免疫球蛋白或以其片段如f(ab)’2或fab'單體存在，f(ab)’2是fab的二聚體其本身是通過(guò)二硫鍵與vh-ch1連接的輕鏈，fab'單體其可以由鉸鏈區(qū)二硫鍵的斷裂產(chǎn)生。fab'單體基本上是具有部分鉸鏈區(qū)的fab(參見(jiàn)fundamentalimmunology，w.e.paul，ed.，ravenpress，n.y.(1993)，關(guān)于其他抗體片段的更詳細(xì)的描述)?？梢酝ㄟ^(guò)用例如化學(xué)方法或通過(guò)利用重組dna方法從頭合成的各種肽酶，消化完整的抗體來(lái)產(chǎn)生抗體片段。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括通過(guò)修飾抗體產(chǎn)生的或通過(guò)使用重組dna方法從頭合成產(chǎn)生的抗體片段?？贵w包括單鏈抗體，其包括單鏈fv(sfv)抗體，其中vh和vl連接在一起(直接或通過(guò)肽連接子)以形成連續(xù)多肽。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單結(jié)構(gòu)域抗體”(sdab或“vhh”)是指單重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體類(lèi)型，并且在一些方面可以在天然缺乏輕鏈的駱駝科(camelid)哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體可以衍生自vh區(qū)、vhh區(qū)或vl區(qū)。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體是人源的。在一些方面，人單結(jié)構(gòu)域抗體包含wo2006/099747和wo2009/079793以及wo2012/100343中公開(kāi)的重鏈序列或輕鏈序列，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。在一方面，人單結(jié)構(gòu)域抗體包含在wo2012/100343中討論的框架區(qū)內(nèi)具有二硫鍵的重鏈序列或輕鏈序列。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”還包括通過(guò)結(jié)合特異性抗原以形成復(fù)合物而像抗體一樣起作用的任何合成或基因工程改造的蛋白。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“綴合物”是指共價(jià)連接以形成較大構(gòu)建體的兩個(gè)或更多個(gè)分子。在一方面，通過(guò)直接鍵合連接兩個(gè)分子，其中脲酶上的反應(yīng)性官能團(tuán)與抗體上的互補(bǔ)反應(yīng)性官能團(tuán)結(jié)合，例如賴(lài)氨酸的氨基官能團(tuán)與天冬氨酸或谷氨酸的羧基官能團(tuán)結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解，這種反應(yīng)可能需要常規(guī)的羧基修飾以使其更具反應(yīng)性。另一方面，通過(guò)連接子部分連接兩個(gè)分子。

如本文所用，本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”或“肽”可互換使用。蛋白具有由其亞基序列表示的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并且可以具有二級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)或褶狀結(jié)構(gòu)，以及整體三維結(jié)構(gòu)。雖然“蛋白”通常是指相對(duì)較大的多肽(例如含有100個(gè)或更多個(gè)氨基酸)，而“肽”指較小的多肽相同，但所述術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用。也就是說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“蛋白”可以指較大的多肽以及較小的肽，反之亦然。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶向部分”是指結(jié)合所定義的細(xì)胞群或選擇的細(xì)胞類(lèi)型的分子。靶向部分可以結(jié)合存在于靶細(xì)胞或細(xì)胞群體上或內(nèi)的受體、寡核苷酸、酶底物、抗原決定簇或其它結(jié)合位點(diǎn)。示例性靶向部分是抗體。能夠識(shí)別表達(dá)的抗原的抗體片段和小肽序列，也是考慮的靶向部分。

如本文所用，本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療(treat/treating/treatment)”包括緩解、減輕或改善疾病或病況或其一種或多種癥狀，預(yù)防其他癥狀，改善或預(yù)防癥狀的潛在代謝原因，抑制疾病或病況(例如阻止或抑制疾病或病況的發(fā)展，減輕疾病或病況，導(dǎo)致疾病或病況消退，減輕由疾病或病況引起的狀況，或抑制疾病或病況的癥狀)，并且旨在包括預(yù)防。這些術(shù)語(yǔ)還包括減輕疾病或病況，例如導(dǎo)致臨床癥狀的消退。術(shù)語(yǔ)還包括實(shí)現(xiàn)治療益處和/或預(yù)防益處。治療益處是指根除或改善正在治療的潛在病癥。此外，通過(guò)消除或改善與潛在病癥相關(guān)的一種或多種生理學(xué)癥狀來(lái)實(shí)現(xiàn)治療益處，使得在個(gè)體中觀察到改善，盡管個(gè)體仍然受潛在病癥的折磨。

術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”、“個(gè)體”和“患者”在本文中可互換使用，以指代治療的任何目標(biāo)。本技術(shù)還提供了在原位或其正常位置或部位治療腫瘤細(xì)胞(例如乳腺腫瘤或前列腺腫瘤的腫瘤細(xì)胞)的方法。這些原位腫瘤可以位于各種宿主內(nèi)或上，例如，人宿主、犬宿主、貓宿主、馬宿主、牛宿主、豬宿主等。任何其中發(fā)現(xiàn)腫瘤或腫瘤細(xì)胞的宿主都可以被治療并且符合本技術(shù)。因此，對(duì)象包括脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上不含”顆粒將完全缺乏顆粒，或者幾乎完全缺乏顆粒而使得其效果將與完全缺乏顆粒相同。換句話說(shuō)，“基本上不含”某成分或要素的組合物可能仍然實(shí)際上含有這樣的物品，只要其沒(méi)有可測(cè)量的效果即可。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“基本上”是指大于約90％、大于約95％、大于約96％、大于約97％、大于約98％或大于約99％。在一些實(shí)施方案中，包含抗體-脲酶綴合物的組合物基本上不含非綴合脲酶，意味著組合物含有大于約90％的抗體-脲酶綴合物、大于約95％的抗體-脲酶綴合物、大于約96％的抗體-脲酶綴合物、大于約97％的抗體-脲酶綴合物、大于約98％的抗體-脲酶綴合物或大于約99％的抗體-脲酶綴合物。換句話說(shuō)，組合物含有小于約0.1％的非綴合脲酶、小于約0.5％的非綴合脲酶、小于約1％的非綴合脲酶、小于約2％的非綴合脲酶、小于約3％的非綴合脲酶、小于約4％非綴合脲酶、小于約5％的非綴合脲酶，或小于約10％的非綴合脲酶。術(shù)語(yǔ)“非綴合脲酶”是指不與抗體綴合的脲酶。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脲酶”是指具有天然存在或通過(guò)例如重組核酸技術(shù)和/或化學(xué)合成獲得的尿素酰胺水解酶(e.c.3.5.1.5)的酶活性的酶。脲酶還包括融合蛋白，其包含整個(gè)脲酶、其亞基或其片段，和/或具有保留了該多肽的尿素酰胺水解酶活性的氨基酸取代、缺失或添加的脲酶。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“dos47”是指純化的脲酶。

抗體-脲酶綴合物

本技術(shù)涉及抗體-脲酶綴合物。本技術(shù)提供包含適于靜脈內(nèi)注射的藥學(xué)上可接受的水溶液和基本上不含脲酶、不含非綴合抗體和不含非水性hplc溶劑的抗體-脲酶綴合物的藥物組合物。非水性hplc溶劑包括通常用于制備型hplc或hplc純化的有機(jī)溶劑，諸如甲醇、乙腈、三氟乙酸等。在一些方面，抗體-脲酶綴合物基本上不含來(lái)自磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽。在一些方面，將含有10mm磷酸鹽、50mmnacl，ph值7.0的磷酸鹽緩沖液用于sec純化。在一些方面，在制造產(chǎn)生抗體-脲酶綴合物中不進(jìn)行hplc純化。

在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)或20個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約6個(gè)或更多個(gè)抗體部分的平均綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或11個(gè)抗體部分的平均綴合比。

在一些方面，連接是共價(jià)鍵或直接鍵合，其中脲酶上的反應(yīng)性官能團(tuán)與抗體上的互補(bǔ)反應(yīng)性官能團(tuán)結(jié)合，諸如例如賴(lài)氨酸的氨基(nh2)官能團(tuán)與例如天冬氨酸或谷氨酸的羧基(cooh)官能團(tuán)或半胱氨酸的巰基(sh)結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解，這種反應(yīng)可能需要常規(guī)的羧基修飾以使其更具反應(yīng)性。

反應(yīng)性官能團(tuán)可以是相同的，諸如草酸、琥珀酸等，或者可以是正交官能團(tuán)，諸如氨基(其在綴合后變成nh)和羧基(其在綴合后變成co或coo)?？蛇x地，抗體和/或脲酶可以被衍生化以暴露或附加另外的反應(yīng)性官能團(tuán)。衍生化可以涉及連接許多連接子分子中的任何一種，如可從piercechemicalcompany，rockfordill獲得的那些連接子分子。

如本文所用的“連接子”是用于將靶向部分連接到活性劑(諸如將抗體連接到脲酶)的分子。連接子能夠與靶向部分和活性劑都形成共價(jià)鍵。合適的連接子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：直鏈碳連接子或支鏈碳連接子、雜環(huán)碳連接子、或肽連接子。當(dāng)靶向部分和活性劑分子是多肽時(shí)，連接子可以通過(guò)其側(cè)基與組成氨基酸連接(例如通過(guò)二硫鍵連接到半胱氨酸)。在一優(yōu)選的方面，連接子將連接到末端氨基酸的α碳氨基和羧基。在一些方面，連接是通過(guò)具有兩個(gè)或更多個(gè)官能團(tuán)的連接子(如羧基或氨基)進(jìn)行的，以允許其與脲酶和抗體反應(yīng)。連接子是本領(lǐng)域公知的，并且通常包含1-20個(gè)原子，其包括碳、氮、氫、氧、硫等。

可以使用具有與脲酶上基團(tuán)反應(yīng)的一個(gè)官能團(tuán)和與抗體反應(yīng)的另一基團(tuán)的雙功能連接子，以形成期望的免疫綴合物。可選地，衍生化可以涉及靶向部分的化學(xué)處理，例如用高碘酸鹽處理的糖蛋白抗體的糖部分的二醇斷裂，以產(chǎn)生游離醛基。抗體上的游離醛基可以與試劑上的游離胺基團(tuán)或肼基團(tuán)反應(yīng)，以將試劑與其結(jié)合。(參見(jiàn)第4,671,958號(hào)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào))。在多肽(如抗體或抗體片段)上產(chǎn)生游離巰基的步驟也是已知的(參見(jiàn)第4,659,839號(hào)的美國(guó)專(zhuān)利)。

其它連接子分子及其用途包括描述于以下文獻(xiàn)中的那些：例如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)第188,256號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第4,671,958號(hào)、第4,659,839號(hào)、第4,414,148號(hào)、第4,699,784號(hào)、第4,680,338號(hào)、第4,569,789號(hào)和第4,589,071號(hào)，以及borlinghaus等人(1987)(cancerres.47：4071-4075)。

在一些方面，當(dāng)綴合分子已經(jīng)達(dá)到其靶位點(diǎn)時(shí)，在靶位點(diǎn)處或其附近的連接是可切割的，并且脲酶從靶向部分釋放?？梢酝ㄟ^(guò)酶活性或在靶細(xì)胞內(nèi)或靶標(biāo)位點(diǎn)附近綴合物經(jīng)受的條件來(lái)促進(jìn)對(duì)連接的切割，以從靶向部分釋放脲酶。在一些方面，可以使用在腫瘤部位存在的條件(例如當(dāng)暴露于腫瘤相關(guān)酶或酸性ph時(shí))下可切割的連接子。

可切割的連接子包括描述于以下文獻(xiàn)中的那些：例如美國(guó)專(zhuān)利第4,618,492號(hào)、第4,542,225號(hào)和第4,625,014號(hào)。從這些連接子釋放活性劑的機(jī)理，包括例如光不穩(wěn)定鍵的照射和酸催化的水解。例如美國(guó)專(zhuān)利第4,671,958號(hào)包括對(duì)包含通過(guò)患者補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白水解酶在體內(nèi)的靶位點(diǎn)處切割的連接子的免疫綴合物的描述。在一些方面，合適的連接子是氨基酸殘基或由兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸組成的肽間隔子。

在一些方面，合適的連接子是r¹-l-r²，其中r¹和r²是相同的官能團(tuán)或不同的官能團(tuán)，其中一個(gè)與抗體連接，另一個(gè)與脲酶連接。r¹和r²可以獨(dú)立地選自但不限于：-nh-、-co-、-coo-、-o-、-s-、nhnh-、-n＝n-、＝n-nh-等。l可以是直鏈烴鏈或支鏈烴鏈(如烷基鏈)，其中一個(gè)或多個(gè)碳任選地被氧、氮、酰胺、硫、亞砜、砜、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基等替代。在一些方面，連接子可以是氨基酸殘基或肽。在一些情況下，連接子可以在靶位點(diǎn)處或接近靶位點(diǎn)處由于酶或改變ph值而被切割。適于制備綴合物的某些連接子和步驟描述于以下文獻(xiàn)：美國(guó)專(zhuān)利第4,414,148號(hào)、第4,545,985號(hào)、第4,569,789號(hào)、第4,671,958號(hào)、第4,659,839號(hào)、第4,680,338號(hào)、第4699,784號(hào)、第4,894,443號(hào)和第6,521,431號(hào)。在某些方面，連接子是

其中和代表連接到抗體或脲酶的點(diǎn)。在一些方面，代表連接到抗體的氨基的點(diǎn)，而代表連接到脲酶的硫代基的s原子的點(diǎn)。這個(gè)連接子是使用交聯(lián)劑siab(n-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?氨基苯甲酸酯)來(lái)綴合抗體和尿素酶的殘基。在一些方面，超純化是適合于使用siab作為交聯(lián)劑的綴合方法的分離方法。

在一些方面中，連接子是使用具有下式的連接劑的殘基：

其中x是溴或碘，l是如本文所述的連接子。

在一些方面，交聯(lián)劑是sbap(琥珀酰亞胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯)或sia(n-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯)，在與siab類(lèi)似的條件下(例如，不需要hplc色譜法純化和可以?xún)H需要超透析過(guò)濾)，其可以用于綴合。在一些方面，在siab的連接臂長(zhǎng)度比sbap的連接臂長(zhǎng)度和sia的連接臂長(zhǎng)度更適合/更具靈活性(reflexable)。在一些方面中，交聯(lián)劑是spdp(琥珀酰亞胺基3-(吡啶基二硫基)丙酸酯)、smpt(琥珀酰亞胺基氧羰基-甲基-(2-吡啶基二硫基)甲苯)或smcc(琥珀酰亞胺基4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸酯)，其可以用于綴合，但是可能需要超過(guò)一種分離方法(如iec和乙醇分級(jí)分離)，以從較低產(chǎn)量的綴合反應(yīng)溶液中分離未反應(yīng)的脲酶。

另外，其他成分(如但不限于諸如抗癌劑的治療劑)也可用于與抗體結(jié)合以進(jìn)一步增強(qiáng)治療效果。

脲酶

大量的研究已經(jīng)提供了關(guān)于來(lái)自多種進(jìn)化上不同的細(xì)菌、植物、真菌和病毒的脲酶的遺傳學(xué)的詳細(xì)信息(mobley,h.l.t.等人(1995)microbiol.rev.59:451-480；eurj.biochem.,175,151-165(1988)；labigne,a.(1990)internationalpublicationno.wo90/04030；clayton,c.l.等人(1990)nucleicacidres.18,362以及美國(guó)專(zhuān)利第6,248,330號(hào)和第5,298,399號(hào)，其各自通過(guò)引用并入本文)。特別令人感興趣的是在植物中發(fā)現(xiàn)的脲酶(sirko，a和brodzik，r.(2000)actabiochimpol47(4):1189-95)。一個(gè)示例性的植物脲酶是洋刀豆脲酶。可以在公共數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，entrez(ncbi.nlm.nih.gov/entrez))中鑒定其他有用的脲酶序列。

在一些方面，脲酶是洋刀豆脲酶。洋刀豆脲酶氨基酸序列具有如下所示的seqidno.2的氨基酸序列：

mklspreveklglhnagylaqkrlargvrlnyteavaliasqimeyardgektvaqlmclgqhllgrrqvlpavphllnavqveatfpdgtklvtvhdpisrengelqealfgsllpvpsldkfaetkednripgeilcedecltlnigrkavilkvtskgdrpiqvgshyhfievnpyltfdrrkaygmrlniaagtavrfepgdcksvtlvsiegnkvirggnaiadgpvnetnleaamhavrskgfgheeekdasegftkedpncpfntfihrkeyankygpttgdkirlgdtnllaeiekdyalygdecvfgggkvirdgmgqscghppaisldtvitnaviidytgiikadigikdgliasigkagnpdimngvfsnmiiganteviageglivtagaidchvhyicpqlvyeaissgittlvgggtgpaagtrattctpsptqmrlmlqstddlplnfgftgkgssskpdelheiikagamglklhedwgstpaaidncltiaehhdiqinihtdtlneagfvehsiaafkgrtihtyhsegaggghapdiikvcgiknvlpsstnptrpltsntidehldmlmvchhldreipedlafahsrirkktiaaedvlndigaisiissdsqamgrvgevisrtwqtadkmkaqtgplkcdssdndnfrirryiakytinpaiangfsqyvgsvevgkladlvmwkpsffgtkpemvikggmvawadigdpnasiptpepvkmrpmygtlgkaggalsiafvskaaldqrvnvlyglnkrveavsnvrkltkldmklndalpeitvdpesytvkadgkllcvseattvplsrnyflf(seqidno.2)

可以在公共數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，entrez(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/))中鑒定有用脲酶序列。此外，可以利用用于擴(kuò)增來(lái)自各種生物體的脲酶的引物，其描述于baker，k.m.和collier，j.l.(http：//www.science.smith.edu/departments/biology/lkatz/nemeb_webpage/abstracts.html)，或使用codehop(共識(shí)-簡(jiǎn)并雜合寡核苷酸引物)，其描述于rose等人(1998)nucl.acidsres.26：1628。脲酶可以將底物尿素轉(zhuǎn)化成氨和氨基甲酸酯。這種酶活性可以提高ph值，使環(huán)境更堿性。癌細(xì)胞周?chē)沫h(huán)境是典型酸性的(webb，s.d.等人(2001)novartisfoundsymp240：169-81)。因此，通過(guò)以這種方式提高細(xì)胞外環(huán)境的ph值，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，在本技術(shù)的某些方面，添加抗體-脲酶綴合物導(dǎo)致間質(zhì)液的ph值提高約0.1個(gè)ph單位，例如，0.1-0.5個(gè)ph單位以上。

本技術(shù)的脲酶包括脲酶的天然存在形式及其功能活性變體。預(yù)期了兩種一般類(lèi)型的氨基酸序列變體。氨基酸序列變體是那些在特定氨基酸具有不破壞脲酶活性的一個(gè)或多個(gè)取代的氨基酸序列變體。這些變體包括沉默變體和與天然蛋白基本上同源且功能上等同的保守修飾的變體。當(dāng)其氨基酸序列的至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選至少約95％，甚至更優(yōu)選98％和最優(yōu)選至少約99％與天然蛋白的氨基酸序列相同時(shí)，天然蛋白的變體是與天然蛋白“基本上同源的”。變體可以是僅僅1個(gè)或高達(dá)10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的不同。

第二類(lèi)變體包括是分離的脲酶活性片段的脲酶的大小變體。可以通過(guò)例如片段化脲酶，通過(guò)化學(xué)改性，通過(guò)蛋白水解酶消化，或通過(guò)它們的組合形成大小變體。此外，可以使用基因工程技術(shù)以及從氨基酸殘基直接合成多肽的方法來(lái)產(chǎn)生大小變體。

所謂“功能等同”是指變體序列限定了產(chǎn)生具有與天然脲酶基本上相同的生物活性的蛋白的鏈。本技術(shù)也包括包含大量序列變化的這種功能上等同的變體。因此，天然脲酶蛋白的功能等同變體將具有足夠的生物學(xué)活性以用于治療。在本領(lǐng)域中有可用于確定功能等同的方法?？梢允褂脤?zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于測(cè)量天然脲酶蛋白的活性試驗(yàn)來(lái)測(cè)量生物活性。此外，可以測(cè)試針對(duì)生物活性的天然蛋白產(chǎn)生的抗體結(jié)合到功能等同變體的能力，其中有效結(jié)合指示具有類(lèi)似于天然蛋白構(gòu)象的蛋白。

本技術(shù)的脲酶蛋白序列(包括保守取代序列)，可以作為更大的多肽序列的部分存在，諸如發(fā)生在加入用于純化蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(例如，聚his片段、flag標(biāo)簽片段等)，其中附加的功能性結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍椎碾迕傅鞍撞糠值幕钚杂泻苌俚挠绊懟驔](méi)有影響，或其中可通過(guò)后合成處理步驟(如通過(guò)用蛋白酶處理)除去附加的結(jié)構(gòu)域。

添加不改變本技術(shù)的核酸分子的編碼活性的一個(gè)或多個(gè)核酸或序列(如添加非功能性序列)是基本核酸分子的保守變化，而添加不改變本技術(shù)的多肽活性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是基本多肽的保守變化。這兩種類(lèi)型的添加都是本技術(shù)的特點(diǎn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，公開(kāi)的核酸構(gòu)建體的許多保守變化產(chǎn)生功能相同構(gòu)建體。

可以使用各種測(cè)定序列關(guān)系的方法，包括手工比對(duì)和計(jì)算機(jī)輔助序列比對(duì)和分析。這后一種方法是本技術(shù)的優(yōu)選方法，由于通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助方法提供了增加的吞吐量。各種用于進(jìn)行序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序是可用的，或可以通過(guò)技術(shù)人員來(lái)制備。

如上所述，本技術(shù)中使用的核酸序列和多肽序列(及其片段)不需要與本技術(shù)的脲酶多肽或脲酶核酸分子(或其片段)或相關(guān)分子的相應(yīng)序列是相同的，但可以是基本上相同的(或基本上類(lèi)似)。例如，所述多肽可以經(jīng)歷各種變化，諸如一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核酸的插入、缺失和取代，無(wú)論保守或非保守的，包括其中例如，這樣的變化可能在其用途(例如，在其治療應(yīng)用或給藥應(yīng)用)中提供一定的優(yōu)勢(shì)。

靶向部分

預(yù)期了將靶向部分作為本技術(shù)的化學(xué)實(shí)體，并且與確定的、選擇的細(xì)胞類(lèi)型或靶細(xì)胞群(如癌細(xì)胞)結(jié)合。在這方面有用的靶向部分包括抗體和抗體片段、肽和激素。對(duì)應(yīng)于已知細(xì)胞表面受體的蛋白(包括低密度脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素)、纖維蛋白溶解酶、血小板結(jié)合蛋白(如膜聯(lián)蛋白)和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(包括白細(xì)胞介素、干擾素、促紅細(xì)胞生成素和集落刺激因子)也是預(yù)期的靶向部分?？梢詫⑴c靶細(xì)胞核酸的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸)用作本技術(shù)的靶向部分。靶向部分也可以是與靶細(xì)胞表面結(jié)合的寡核苷酸。保留與確定的靶細(xì)胞群結(jié)合的能力的上面列出的靶向部分的類(lèi)似物，也可以用作靶向部分。

前述的靶向部分的功能等同物也可以用作本技術(shù)的靶向部分。示例性靶向部分功能等同物是設(shè)計(jì)以模仿用于靶向部分靶細(xì)胞結(jié)合的適當(dāng)構(gòu)象和/或取向的有機(jī)化學(xué)構(gòu)建體。另一靶向部分功能等同物是展現(xiàn)靶向部分的結(jié)合親和力的短多肽。

在一些方面，本公開(kāi)的靶向部分是抗體、肽、寡核苷酸等，其與靶細(xì)胞表面上的抗原反應(yīng)。可以使用商購(gòu)或在文獻(xiàn)中描述的多克隆抗體和單克隆抗體。抗體可以是完整抗體或其片段?？梢愿鶕?jù)常規(guī)技術(shù)(如雜交瘤合成、重組dna技術(shù)和蛋白合成)制備單克隆抗體和片段。有用的單克隆抗體和片段可以來(lái)自任何物種(包括人)或可以形成為采用來(lái)自多于一種物種的序列的嵌合蛋白。

在一些方面中，靶向部分是人源化抗體或非人抗體。在一些方面中，靶向部分是單結(jié)構(gòu)域抗體。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體(sdab)或“vhh”是指能夠在駱駝科哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的抗體類(lèi)型的單重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，所述抗體類(lèi)型天然沒(méi)有輕鏈。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體可以來(lái)源于vh區(qū)、vhh區(qū)或vl區(qū)。在一些方面，單結(jié)構(gòu)域抗體是源自人類(lèi)的。在一些方面中，人單結(jié)構(gòu)域抗體包含重鏈序列或輕鏈序列，其公開(kāi)在wo2006/099747和wo2009/079793以及wo2012/100343中，通過(guò)引用將其全部并入本文。在一方面，人單結(jié)構(gòu)域抗體包含具有如在wo2012/100343中所討論的框架區(qū)內(nèi)的二硫鍵的重鏈序列或輕鏈序列。

在一些方面，靶向部分(例如抗體)對(duì)由癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性。癌可能是肛門(mén)癌、膽道癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下咽部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、膽囊癌和膽管癌、小腸癌、尿道癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、生殖道癌、內(nèi)分泌腺癌、甲狀腺癌和皮膚癌。在一些方面，靶向部分(例如抗體)對(duì)由如下腫瘤表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性：類(lèi)癌瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤、原發(fā)性腫瘤、血管瘤、黑素瘤、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤和腦腫瘤、神經(jīng)腫瘤、眼腫瘤和腦膜腫瘤。在一些方面，靶向部分(例如抗體)對(duì)由癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和結(jié)腸癌表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性。在一些方面，靶向部分(例如抗體)對(duì)由非小細(xì)胞肺癌表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性。

在一些方面，抗體對(duì)由非小細(xì)胞肺癌表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性。在一些方面，由非小細(xì)胞肺癌表達(dá)的腫瘤抗原是ceacam6(癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子6)，并且抗體對(duì)ceacam6具有特異性。ceacam6，也被稱(chēng)為非特異性交叉反應(yīng)抗原(nca)或cd66c，是被充分表征的癌癥抗原(11，12)。它與其他人癌胚抗原(如ceacam1、ceacam7和ceacam8)具有高的序列同源性。它是糖基磷酸肌醇(gpi)-連接的細(xì)胞表面蛋白，但是沒(méi)有已知的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在乳腺癌組織、胰腺癌組織、卵巢癌組織、肺癌組織和結(jié)腸癌組織中，ceacam6的表達(dá)是顯著升高的。其增加的表達(dá)涉及腫瘤細(xì)胞的侵襲性行為和轉(zhuǎn)移行為(13)。在一些方面，抗體對(duì)ceacam6具有高于約1×10^-6m的kd值的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約1×10^-8m、1×10^-9m、1×10^-10m或1×10^-20m的kd值的結(jié)合親和力。在一些方面，抗體是識(shí)別肺腺癌細(xì)胞上的ceacam6的單結(jié)構(gòu)域駱駝科抗體片段(afaikl2，seqidno.1)。在一些方面，抗體包含含有如圖5所示的seqidno：1的氨基酸序列的多肽。在一些方面，抗體包含含有對(duì)seqidno：1的氨基酸序列至少一個(gè)修改的多肽。在一些方面，抗體包含含有與seqidno：1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％和99％的序列同源性的多肽。

在一些方面，ceacam6抗體是抗-ceacam6抗體(9a6)：購(gòu)自santacruzbiotech的sc-59899。ceacam6抗體(9a6)是以200μg/ml提供的小鼠單克隆igg1，其是針對(duì)人源的ceacam6表達(dá)腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。推薦用于檢測(cè)人源的ceacam6。

在一些方面，ceacam6抗體是購(gòu)自abcam的抗-ceacam6抗體(ab56234)。抗-ceacam6抗體(ab56234)是ceacam6的兔多克隆抗體。它是針對(duì)對(duì)應(yīng)于人ceacam6的內(nèi)部序列217-266位氨基酸的合成肽(iqnpasanrsdpvtlnvlygpdgptispskanyrpgenlnlschaasnpp(seqidno：3))中的區(qū)域產(chǎn)生的。

在一些方面，ceacam6抗體是購(gòu)自novusbiologicals的抗-ceacam-6/cd66c的抗體，其是針對(duì)ceacam6的兔多克隆抗體，并且經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)-p來(lái)驗(yàn)證。它是針對(duì)指向人ceacam6(np_002474)的中間區(qū)域的合成肽(eiqnpasanrsd(seqidno：4))產(chǎn)生的。

在一些方面，ceacam6抗體是購(gòu)自origene的抗-ceacam6抗體epr4403，其是針對(duì)ceacam6(克隆epr4403)的兔單克隆抗體。它是針對(duì)對(duì)應(yīng)于人ceacam6中的殘基的合成肽產(chǎn)生的。它對(duì)小鼠ceacam6、大鼠ceacam6和人ceacam6具有反應(yīng)性。

在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約10nm的ic50值的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約5nm的ic50值的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物對(duì)ceacam6具有不大于約4nm的ic50值的結(jié)合親和力。在一些方面，ic50值約為3.22nm。在一些方面，綴合物以約10-30μg/ml的ic50值與ceacam6結(jié)合。在一些方面，綴合物以約20μg/ml的ic50值與ceacam6結(jié)合?？梢愿鶕?jù)本文所述的方法或本領(lǐng)域已知的方法，測(cè)定抗體或綴合物與靶抗原的結(jié)合親和力。在一些方面，本技術(shù)描述了該抗-ceacam6-脲酶綴合物(l-dos47)。在一些方面，本技術(shù)描述了抗體-脲酶綴合物，例如，afaikl2-脲酶。通過(guò)針對(duì)非小細(xì)胞肺腺癌a549進(jìn)行淘選，將來(lái)源于美洲駝重鏈抗體所有組成成分的噬菌體庫(kù)，用于確定單結(jié)構(gòu)域抗體(sdab)。將sdab指定為afai。為了綴合的目的優(yōu)化了afai的基因序列，并重命名為afaikl2。在一些方面，在大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)pt7-7系統(tǒng)中克隆和表達(dá)afaikl2抗體。

人源化靶向部分能夠降低宿主受體中抗體或多肽的免疫反應(yīng)性，以允許增加半衰期和減少不良免疫反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)例如將編碼小鼠fv區(qū)的核苷酸序列或其互補(bǔ)決定區(qū)與編碼人恒定結(jié)構(gòu)域區(qū)和fc區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行遺傳重組，將小鼠單克隆抗體人源化。也可以將小鼠殘基保留在人可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)域內(nèi)以確保適當(dāng)?shù)陌形稽c(diǎn)結(jié)合特性。用于將各種活性劑遞送至癌細(xì)胞的基因工程抗體綜述于bodey，b.(2001)expertopinbiol.ther.1(4):603-17。

在一些方面，靶向部分是與靶細(xì)胞表面上的受體反應(yīng)的配體。因此，靶向部分可以包括但不限于：對(duì)細(xì)胞結(jié)合成分具有親和力的激素，包含被細(xì)胞結(jié)合成分識(shí)別的碳水化合物部分的任何分子，以及與細(xì)胞結(jié)合成分結(jié)合的藥物或小分子。短語(yǔ)“結(jié)合成分”包括受體和受體分子。優(yōu)選地，結(jié)合成分是細(xì)胞表面結(jié)合成分。在一方面，靶向部分是與靶位點(diǎn)結(jié)合的天然存在的蛋白(如胰島素)。包括白細(xì)胞介素和諸如粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和腫瘤壞死因子(tnf)的因子的細(xì)胞因子，也是已知的與表達(dá)其高水平受體的特異性細(xì)胞結(jié)合的特異性靶向部分(terlikowski，sj(2002)toxicology174(3)：143-152)。

為了降低暴露于非靶細(xì)胞或非靶組織的脲酶或其它活性劑，可以篩選靶向部分以鑒定顯示最小非靶反應(yīng)性的那些靶向部分，同時(shí)保持靶特異性和反應(yīng)性。通過(guò)減少非靶暴露(和不利的非靶定位和/或毒性)，可以施用增加劑量的脲酶或其它活性劑。這允許施用最高可能濃度的脲酶或其它治療劑以最大限度地暴露靶細(xì)胞，同時(shí)保持低于不可接受的非靶細(xì)胞毒性的閾值。

在一些方面，使用兩種或更多種活性劑-靶向部分綴合物，其中每種綴合物包括不同的靶向部分，例如不同的抗體種類(lèi)。每種所用的靶向部分結(jié)合到可以與相同或不同靶位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的不同靶位點(diǎn)區(qū)域。每種施用的綴合物的活性劑成分可以相同或不同。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第4,867,962號(hào)和第5,976,535號(hào)，其各自通過(guò)引用并入本文。在一些方面，由于每種靶向部分(例如抗體種類(lèi))識(shí)別不同的靶位點(diǎn)區(qū)域(即表位)，因此改善了活性劑綴合到靶位點(diǎn)的靶位點(diǎn)的增加。這種可選的靶位點(diǎn)區(qū)域方法為活性劑提供了更多潛在的靶位點(diǎn)結(jié)合點(diǎn)。因此，例如通過(guò)表位飽和和/或空間位阻可以避免實(shí)際或有效的靶位點(diǎn)飽和。因此，可以實(shí)現(xiàn)活性劑(例如脲酶)的遞增積累?？蛇x地，或聯(lián)合地，可以使用另外的脲酶特異性基因產(chǎn)物作為活性劑，例如用于在靶位點(diǎn)生產(chǎn)催化活性全酶。示例性的脲酶脫輔酶包括由細(xì)菌ureabc基因編碼的γ亞基、β亞基和α亞基(burne，r.a.和chen，y.m.(2000)microbesandinfection2：533-542)。

可以分析針對(duì)特定靶位點(diǎn)的單克隆抗體的交叉反應(yīng)性模式，以鑒定用于治療應(yīng)用的具有非重疊交叉反應(yīng)性的一組兩種或更多種靶特異性單克隆抗體。短語(yǔ)“交叉反應(yīng)性的非重疊模式”，表示由一種抗體種類(lèi)結(jié)合的非靶組織與由另一抗體種類(lèi)結(jié)合的非靶組織顯著不同。交叉反應(yīng)性的模式對(duì)于成比例地減少用于治療應(yīng)用的活性劑的暴露所需的程度是不同的。優(yōu)選較少的抗體對(duì)(或更大的一組抗體)重疊。

可以通過(guò)多種方法篩選抗體?？梢允褂妹庖呓M織化學(xué)分析來(lái)確定與靶組織的反應(yīng)性和與非靶組織的交叉反應(yīng)性?？梢酝ㄟ^(guò)將組織暴露于抗體來(lái)鑒定抗體種類(lèi)要結(jié)合的組織；洗滌組織以除去任何未結(jié)合的抗體；并檢測(cè)結(jié)合的抗體的存在。體外組織化學(xué)方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如sanchez-islas，e.和leon-olea，m.(2001)nitricoxide5(4)：302-16。

當(dāng)靶向部分相對(duì)較短時(shí)，可以使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)肽合成技術(shù)合成。對(duì)于多肽化學(xué)合成方法的一方面，預(yù)期了其中將序列的c末端氨基酸連接到不溶性支持體上并隨后順序添加序列中的剩余氨基酸的固相合成。固相合成技術(shù)描述于barany和merrifield，solid-phasepeptidesynthesis；pp.3-284inthepeptides：analysis，synthesis，biology.vol.2：specialmethodsinpeptidesynthesis，parta.，merrifield等人，j.am.chem.soc.,85：2149-2156(1963)和stewart等人，solidphasepeptidesynthesis，第2版。piercechem.co.,rockford,iii.(1984)。

可以通過(guò)任何合適的方法制備編碼抗體或脲酶的dna，包括例如克隆和限制合適的序列或通過(guò)如下方法的直接化學(xué)合成：諸如narang等人(1979)meth.enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；brown等人meth.enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；beaucage等人(1981)tetra.lett.,22:1859-1862的二乙基亞磷酰胺法(1981)和美國(guó)專(zhuān)利第4,458,066號(hào)的固體支持法。

化學(xué)合成產(chǎn)生單鏈寡核苷酸。這可以通過(guò)與互補(bǔ)序列雜交或通過(guò)使用單鏈作為模板與dna聚合酶聚合而轉(zhuǎn)化成雙鏈dna。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，雖然dna的化學(xué)合成限于約100個(gè)堿基的序列，但是通過(guò)連接較短的序列可以獲得更長(zhǎng)的序列。

可選地，可以克隆子序列，并使用合適的限制酶切割適當(dāng)?shù)淖有蛄?。然后可以將片段連接以產(chǎn)生期望的dna序列。

制備抗體-脲酶綴合物的方法

本技術(shù)提供了制備包含抗體-脲酶綴合物且基本上不含非綴合脲酶(如基于抗體-脲酶綴合物重量不超過(guò)約5％、4％、3％、2％或1％的脲酶)的組合物的方法，該方法包括：(1)在溶劑中組合活化的抗體和脲酶，且在所述溶劑中活化抗體和脲酶基本上不反應(yīng)(如不超過(guò)每小時(shí)10％、5％或1％的反應(yīng))形成反應(yīng)混合物，其中活性抗體和脲酶在溶劑中的分布是均勻的，和(2)改變(1)的混合物的性質(zhì)，使得活化的抗體容易與脲酶反應(yīng)形成抗體-脲酶綴合物。在一些方面，(1)的混合物的性質(zhì)是ph值。在一些方面，改變(1)混合物的性質(zhì)包括將ph值增加到活化抗體容易與脲酶反應(yīng)以形成抗體-脲酶綴合物的值。在一些方面，在(2)中活化的抗體容易(例如至少90％或至少95％的活化抗體)與脲酶以如下速度反應(yīng)：在改變混合物的性質(zhì)約6小時(shí)、約5小時(shí)、約4小時(shí)、約3小時(shí)、約2小時(shí)或約1小時(shí)后，混合物基本上不含非綴合脲酶。

在一些方面，所述方法包括在具有約6.0-7.0(如約6.5)的ph值的酸性水性緩沖液中組合活化的抗體和脲酶，將ph值調(diào)節(jié)至約8.0-9.0(如約8.3)的堿性ph值以形成抗體-脲酶綴合物，并通過(guò)超透析過(guò)濾法純化抗體-脲酶綴合物，其中該方法不包括色譜純化步驟。在一些方面，所述水性緩沖液具有約5-8的ph值。在一些方面，將活化的抗體和脲酶在酸性水性緩沖液中組合。在一些方面，活化的抗體和脲酶的比率為從約3至約12。在一些方面，抗體-脲酶綴合物具有每個(gè)脲酶部分6-15個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，抗體-脲酶綴合物具有每個(gè)脲酶部分8-11個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，ph調(diào)節(jié)劑是緩沖劑或緩沖溶液。在一些方面，ph調(diào)節(jié)劑包含以下的一種或多種：鹽酸、硫酸、硝酸、硼酸、碳酸、重碳酸、葡糖酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、檸檬酸、單乙醇胺、乳酸、乙酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、磷酸、甲磺酸、蘋(píng)果酸、丙酸、三氟乙酸、其鹽或其組合。在一些方面，緩沖劑包含以下的一種或多種：甘氨酸、乙酸、檸檬酸、硼酸、鄰苯二甲酸、磷酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、碳酸、鹽酸、氫氧化鈉、其鹽或其組合。在一些方面，緩沖溶液包括以下的一種或多種：甘氨酸鹽酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽-乙酸鹽-硼酸鹽緩沖液、鄰苯二甲酸鹽緩沖液或其組合。在一些方面，緩沖液不是磷酸鹽緩沖液。在一些方面，酸性緩沖液是乙酸鈉緩沖液。在一些方面，通過(guò)包括加入水性堿溶液如硼酸鈉溶液(例如0.1-5m，或1m)的方法，將ph值調(diào)節(jié)至堿性ph值。不希望受理論的束縛，乙酸鈉緩沖液具有低的緩沖能力，適用于通過(guò)ph8.5，1m硼酸鹽緩沖液，將ph值調(diào)節(jié)至8.3。在一些方面，使用tris-hcl緩沖液(例如1mtris-hcl)將混合物調(diào)節(jié)至ph值8-9(例如8.3)。

在一些方面，將反應(yīng)時(shí)間和抗體/脲酶比保持為常數(shù)。在一些方面，反應(yīng)混合物中抗體/脲酶的摩爾比為：約25、或約21、或約1.8-12的抗體/脲酶。在一些方面，將抗體/脲酶摩爾比從4調(diào)整到25。在一些方面，抗體/脲酶摩爾比至少為6。

在一些方面，在純化(如超透析過(guò)濾)之后，混合物中存在不超過(guò)1％或2％的未反應(yīng)的抗體。在一些方面，可以使用其它非hplc純化方法。例如，可以將乙醇結(jié)晶/分級(jí)分離用于具有較低產(chǎn)率的純化。在一些方面，抗體的分子量不超過(guò)50kda，諸如約10-20kda或約13kda，并且所述純化為超透析過(guò)濾。在一些方面，所述方法提供抗體-脲酶綴合物，其產(chǎn)率為總蛋白重量的至少約60％，總蛋白重量的約70％，總蛋白重量的約80％，或總蛋白重量的至少90％。總蛋白是指脲酶和afaikl2抗體的組合量(重量)。在一些方面，在純化前，不超過(guò)10％-20％(占總蛋白重量)的非綴合抗體殘留在反應(yīng)混合物中。

本技術(shù)提供了包含在酸性水性溶劑(如上所述)中的活化的抗體和脲酶且基本上不含(如基于脲酶重量不超過(guò)約5％、4％、3％、2％或1％的抗體-脲酶綴合物)抗體-脲酶綴合物的穩(wěn)定組合物。本技術(shù)還提供了包含在水性溶劑中的抗體-脲酶綴合物且基本上不含(如基于抗體-脲酶綴合物重量不超過(guò)約5％、4％、3％、2％或1％的脲酶)非綴合脲酶的組合物，其中所述水性溶劑具有約8-9如8.3(如上所述)的ph值。在一些方面，包含抗體-脲酶綴合物的組合物還包含占總抗體(活化的抗體和未反應(yīng)的抗體)的不超過(guò)約40％至60％的非綴合抗體。在一些方面，包含抗體-脲酶綴合物的組合物還包含占總蛋白的不超過(guò)約10％至20％的非綴合抗體。

由于脲酶導(dǎo)致體內(nèi)氨的釋放，氨具有一般毒性并且本身不能靶向腫瘤，所以非綴合脲酶的存在增加了脲酶在正常組織中的存在并對(duì)正常組織產(chǎn)生毒性的風(fēng)險(xiǎn)。然而，由于脲酶的大小和其他性質(zhì)，抗體與脲酶的綴合不會(huì)導(dǎo)致足夠的大小或其他差異，從而允許通過(guò)色譜純化方法將抗體-脲酶綴合物從非綴合的脲酶中容易地分離出來(lái)，特別是以大規(guī)模方式。

本技術(shù)令人驚奇地提供脲酶與抗體的基本完全綴合，使得不進(jìn)行任何色譜純化所得產(chǎn)物基本上不含非綴合的脲酶。通過(guò)基本上不含脲酶，通過(guò)全身給藥，本文所述的組合物將組合物中基本上所有脲酶部分遞送至靶位點(diǎn)。將脲酶靶向遞送至靶位點(diǎn)減少或消除了由脲酶產(chǎn)生的氨的一般毒性，并減少需要施用的脲酶的量以產(chǎn)生治療效果。本技術(shù)特別適用于大規(guī)模制備(如至少約1g、10g、100g或1kg)用于臨床用途，特別是用于治療轉(zhuǎn)移性腫瘤(其通過(guò)局部施用脲酶難于或無(wú)法實(shí)施治療)的基本上不含用脲酶的抗體-脲酶綴合物。

本技術(shù)還提供了增加對(duì)腫瘤抗原的抗體結(jié)合親和力的方法，其包括將多個(gè)抗體分子與脲酶分子綴合以形成抗體-脲酶綴合物，其中所述綴合物具有比非綴合的抗體高至少約100倍(如約200倍、約300倍、約400倍和約500倍)的與腫瘤抗原的結(jié)合親和力。在一些方面，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)顯示，由于增加的親合力，抗體-脲酶綴合物的結(jié)合親和力比天然單結(jié)構(gòu)域抗體的結(jié)和親和力強(qiáng)約100倍、約200倍、約300倍、約400倍和約500倍。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約6個(gè)或更多個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)或12個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或11個(gè)抗體部分的綴合比。在一些方面，綴合物具有每個(gè)脲酶部分約8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或11個(gè)抗體部分的平均綴合比。在一些方面，脲酶是洋刀豆脲酶。在一些方面，抗體是人源化抗體或非人抗體。在一些方面，抗體是單結(jié)構(gòu)域抗體。在一些方面，腫瘤抗原由非小細(xì)胞肺癌表達(dá)。在一些方面，抗體對(duì)ceacam6具有特異性。在一些方面，抗體對(duì)ceacam6具有高于約1×10^-6m的kd值的結(jié)合親和力。在一些方面，綴合物以不大于約1×10^-8m的kd值與ceacam6結(jié)合。在一些方面，綴合物以不大于約1×10^-10m的kd值與ceacam6結(jié)合。在一些方面，綴合物以不大于約5nm的ic50值與ceacam6結(jié)合。在一些方面，ic50值為約3.22nm。在一些方面，綴合物以約20μg/ml的ic50值與ceacam6結(jié)合。也稱(chēng)為非特異性交叉反應(yīng)抗原(nca)或cd66c的ceacam6，是被充分表征的癌癥抗原。它與其他人癌胚抗原(如ceacam1、ceacam7和ceacam8)具有高的序列同源性。它是糖基磷酸肌醇(gpi)連接的細(xì)胞表面蛋白，但沒(méi)有已知的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在乳腺癌組織、胰腺癌組織、卵巢癌組織、肺癌組織和結(jié)腸癌組織中，ceacam6的表達(dá)是顯著升高的。

組合物制劑

本技術(shù)的組合物包含基本上不含脲酶且任選地不含非水性hplc溶劑的抗體-脲酶綴合物。在一些方面，組合物是藥學(xué)上可接受的組合物。組合物還可以包含生物相容的藥物載體、佐劑或媒介物。在一些方面，組合物為固體形式。在一些方面，組合物是包含約0.1-10mg/ml、約0.5-5mg/ml、約1-5mg/ml、或約1.5-2.0mg/ml綴合物的水溶液。在一些方面，水溶液還包含賦形劑，諸如組氨酸、蔗糖和edta中的一種或多種。在一些方面，水溶液包含約1-20mm(如10mm)組氨酸，約0.1-5w/v％(如1w/v％)蔗糖、約0.1-0.5mm(如0.2mmedta)。在一些方面，水溶液具有約6.5-7(如約6.8)的ph值。在一些方面，水溶液不含有磷酸鹽。在一些方面，組合物是通過(guò)水溶液的凍干獲得的固體形式。在一些方面，固體形式不含磷酸鹽。

組合物還可以包括與賦形劑或其它藥學(xué)上可接受的載體混合的其它核苷酸序列、多肽、藥物或激素。除藥物組合物以外的組合物，任選地包含液體，即水或基于水的液體。

要添加到藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的賦形劑，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且易于獲得的那些。賦形劑的選擇將部分地由用于施用產(chǎn)品的具體方法來(lái)確定。因此，存在用于本技術(shù)背景下的各種合適的制劑。

用于藥物組合物的制劑和給藥的技術(shù)，可參見(jiàn)remington'spharmaceuticalsciences，第19版，williams&wilkins，1995，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。賦形劑的選擇將部分地由根據(jù)本技術(shù)用于施用產(chǎn)品的具體方法來(lái)確定。因此，存在用于本技術(shù)背景下的各種合適的制劑。以下方法和賦形劑僅僅是示例性的，絕不是限制性的。

可以使用任何常規(guī)方法(例如混合、溶解、成粒、研磨、乳化、包封、包埋、熔融紡絲、噴霧干燥或凍干過(guò)程)制造本技術(shù)的藥物組合物。然而，根據(jù)給藥途徑和所需劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員將確定最佳藥物制劑。這種制劑可影響施用藥劑的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。

將藥物組合物配制成含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，并且可以任選地包含促進(jìn)將活性化合物加工成藥學(xué)上可使用的制劑的賦形劑和助劑。給藥形式通常將決定載體的性質(zhì)。例如，用于腸胃外給藥的制劑可以包含水溶性形式的活性化合物水溶液。適合腸胃外給藥的載體可以選自鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水和其他生理上相容的溶液。用于胃腸外給藥的優(yōu)選載體是生理上相容的緩沖液，諸如hank溶液、ringer溶液或生理緩沖鹽水。對(duì)于組織給藥或細(xì)胞給藥，在制劑中使用適合于要透過(guò)的特定屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的。對(duì)于包含蛋白的制劑，制劑可以包括穩(wěn)定材料，諸如多元醇(例如蔗糖)和/或表面活性劑(例如非離子表面活性劑)等。

可選地，用于腸胃外使用的制劑可以包含作為合適的油性注射懸浮液制備的活性化合物的懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)和合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)或脂質(zhì)體。含水注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液還可含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑以允許制備高度濃縮的溶液。還可以使用乳化劑(例如水包油分散體和油包水分散體)，任選地通過(guò)乳化劑或分散劑(表面活性材料；表面活性劑)來(lái)穩(wěn)定。如上所述的含有活性劑的脂質(zhì)體也可以用于腸胃外給藥。

可選地，可以使用本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體配制包含適于口服給藥劑量的試劑的藥物組合物。配制用于口服給藥的制劑可以是片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、錠劑、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液或粉劑的形式。為了說(shuō)明，可以通過(guò)將活性化合物與固體賦形劑組合獲得口服用的藥物制劑，任選地研磨所得混合物，并且如果需要加入合適的助劑之后，加工顆?；旌衔镆垣@得片劑。口服制劑可以使用類(lèi)似于腸胃外使用的所述的那些類(lèi)型的液體載體，例如緩沖水溶液、懸浮液等。

這些制劑可以含有一種或多種賦形劑，其包括但不限于：a)稀釋劑，如糖，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；b)粘合劑，如硅酸鋁鎂和來(lái)自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯的淀粉等；c)纖維素材料(如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、樹(shù)膠(如阿拉伯樹(shù)膠和黃蓍膠)和蛋白(如明膠和膠原蛋白)；d)崩解劑或增溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、瓊脂、海藻酸或其鹽(如海藻酸鈉)；或泡騰組合物；e)潤(rùn)滑劑，如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其鎂鹽或鈣鹽，以及聚乙二醇；f)香味劑和甜味劑；g)著色劑或色素，例如用于鑒定產(chǎn)品或表征活性劑的量(劑量)；和h)其他成分，如防腐劑、穩(wěn)定劑、溶脹劑、乳化劑、溶液促進(jìn)劑，用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和緩沖劑。

所述藥物組合物可以作為活性劑的鹽來(lái)提供，該鹽可以由許多酸形成，包括但不限于：鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等。鹽傾向于更易溶于水性溶劑或其它質(zhì)子溶劑，它們是相應(yīng)的游離堿形式。

綴合物本身的特性和綴合物制劑，可以影響所施用的綴合物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。通過(guò)臨床前的體外和體內(nèi)研究，可以收集這些藥代動(dòng)力學(xué)信息和藥效學(xué)信息，稍后可以在臨床試驗(yàn)過(guò)程中在人體中證實(shí)這些信息?？梢詮脑S多來(lái)源獲得基于體內(nèi)動(dòng)物數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行人類(lèi)臨床試驗(yàn)的指導(dǎo)，包括例如http://www.clinicaltrials.gov。因此，對(duì)于本技術(shù)方法中使用的任何化合物，可以首先從生物化學(xué)測(cè)定和/或基于細(xì)胞的測(cè)定來(lái)估計(jì)哺乳動(dòng)物(特別是人)中的治療有效劑量。然后，可以在動(dòng)物模型中配制劑量，以實(shí)現(xiàn)能調(diào)節(jié)綴合物活性的期望的循環(huán)濃度范圍。隨著人類(lèi)研究的進(jìn)行，有關(guān)各種疾病和病況的合適劑量水平和治療時(shí)間的進(jìn)一步信息將會(huì)出現(xiàn)。

可以通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序，來(lái)確定所述綴合物的毒性和治療功效，例如用于確定ld50(50％群體的致死劑量)和ed50(50％群體的治療有效的劑量)。

其他活性劑

在本技術(shù)的組合物中也可以包括其他活性劑?？梢栽诩?xì)胞與第一活性劑接觸之前、同時(shí)或之后，在組合物中利用其他活性劑如抗腫瘤劑(針對(duì)增殖細(xì)胞的活性劑)。例如，在脲酶已經(jīng)靶向腫瘤細(xì)胞之后，其可以具有調(diào)節(jié)或調(diào)控腫瘤外部環(huán)境的能力，例如通過(guò)ph值變化。有利于堿性環(huán)境的活性劑(如抗腫瘤劑)則更為有效。

在某些方面，預(yù)期了將能夠通過(guò)脲酶酶促處理的底物用作活性劑。在一些方面，活性劑是脲酶可以用來(lái)形成銨離子的底物(例如尿素)。

示例性的抗腫瘤劑包括細(xì)胞因子和其它部分，如白細(xì)胞介素(例如il-2、il-4、il-6、il-12等)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、干擾素(例如γ-干擾素)、集落刺激因子(例如gm-csf、m-csf等)、血管通透性因子、凝集素炎癥反應(yīng)啟動(dòng)子(選擇素)(如l-選擇素、e-選擇素、p-選擇素)和蛋白質(zhì)部分(如c1q受體蛋白和nk受體蛋白)。其他合適的抗腫瘤劑包括，抑制血管生成并因此抑制轉(zhuǎn)移的化合物。這些試劑的實(shí)例包括：魚(yú)精蛋白甲羥孕酮、戊聚糖多硫酸鹽(pentosanpolysulphate)、蘇拉明、紫杉酚、沙利度胺、血管抑素、干擾素-α、金屬蛋白酶抑制劑、血小板因子4、生長(zhǎng)激素抑制素、凝血酶敏感蛋白(thromobospondin)?？捎糜诒炯夹g(shù)的活性劑的其它代表性實(shí)例和非限制性實(shí)例包括：長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春地辛、白消安、苯丁酸氮芥(chiorambucil)、螺鉑、順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤、阿霉素、絲裂霉素、博來(lái)霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巰嘌呤、米托坦、甲基芐肼、更生霉素(放線菌素d)、柔紅霉素、鹽酸阿霉素、紫杉酚、普卡霉素、氨魯米特、雌氮芥、氟他胺、亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬、睪內(nèi)酯、曲洛司坦、安吖啶(m-amsa)、天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶)、依托泊苷、血液制品(如血卟啉)或上述的衍生物?；钚詣┑钠渌鼘?shí)例包括遺傳物質(zhì)，如天然或合成來(lái)源的核酸、rna和dna，包括重組rna和dna。編碼某些蛋白的dna可用于治療許多不同類(lèi)型的疾病。例如，可以提供腫瘤壞死因子基因或白細(xì)胞介素-2基因來(lái)治療晚期癌癥；可以提供胸苷激酶基因來(lái)治療卵巢癌或腦腫瘤；并且可以提供白細(xì)胞介素-2基因來(lái)治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤；惡性黑素瘤或腎癌。預(yù)期了用于本技術(shù)的其他活性劑，其描述于第6,261,537號(hào)美國(guó)專(zhuān)利，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文?？鼓[瘤劑和用于檢測(cè)這些藥劑的篩選，綜述于monga,m.和sausville,e.a.(2002)leukemia16(4):520-6。

在一些方面，活性劑是弱堿性抗腫瘤化合物，其療效被實(shí)質(zhì)瘤中較高的細(xì)胞內(nèi)/較低的細(xì)胞外ph梯度降低。示例性弱堿性抗腫瘤化合物包括：阿霉素、柔紅霉素、米托蒽醌、表柔比星、絲裂霉素、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春花生物堿(如長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春新堿)、烷化劑(如環(huán)磷酰胺和鹽酸氮芥)以及抗腫瘤嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。

在一些方面，組合物包括脲酶，并且基本上缺少任何細(xì)胞因子(例如，腫瘤壞死因子和/或干擾素)。在這方面，脲酶單獨(dú)或與除細(xì)胞因子以外的活性劑組合小分子抗腫瘤劑，對(duì)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)是有效的。因此，在這方面，組合物可以或可以不與所治療的對(duì)象中存在的內(nèi)源性細(xì)胞因子或天然細(xì)胞因子一致地起作用，但所施用的組合物不含有另外的外源性細(xì)胞因子。

在一些方面，所述其他活性劑不是培美曲塞和/或卡鉑。在一些方面，所述其他活性劑不是葉酸抗代謝物和/或鉑劑。

遞送和給藥方法

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法，將抗體-脲酶綴合物組合物遞送至癌細(xì)胞。在治療應(yīng)用中，將組合物以足以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的量施用于具有癌細(xì)胞的患者。可以通過(guò)多種途徑給藥，包括但不限于腸胃外、腸內(nèi)、經(jīng)上皮、經(jīng)粘膜、透皮和/或手術(shù)，將藥物組合物暴露于癌細(xì)胞。

腸胃外給藥方式包括通過(guò)如下方式施用組合物的那些：例如靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、髓內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用和心室內(nèi)注射施用、皮下施用、性腺內(nèi)施用(intragonadal)或瘤內(nèi)針刺彈丸注射施用，或使用適當(dāng)?shù)谋眉夹g(shù)的延長(zhǎng)的連續(xù)施用、脈動(dòng)施用或計(jì)劃灌注施用或微灌注施用。腸內(nèi)給藥方式包括口服給藥(包括口腔和舌下)和直腸給藥。經(jīng)上皮給藥方式包括例如經(jīng)粘膜給藥和透皮給藥。經(jīng)粘膜給藥包括例如腸內(nèi)給藥以及經(jīng)鼻、吸入和深肺給藥、陰道給藥和直腸給藥。透皮給藥包括被動(dòng)或主動(dòng)的透皮或經(jīng)皮方式，包括例如貼劑方式和離子電滲裝置方式，以及局部敷用糊劑、藥膏或軟膏方式。外科手術(shù)技術(shù)包括植入藥性持久(儲(chǔ)庫(kù))組合物、滲透泵等。

可以根據(jù)對(duì)象所需要和耐受的劑量和頻率，施用單次給藥或多次給藥的活性劑。無(wú)論如何，組合物應(yīng)提供足夠量的活性劑，以有效治療對(duì)象。

在一些方面，本技術(shù)預(yù)期了使用諸如脂質(zhì)體和/或納米膠囊的囊泡作為化學(xué)實(shí)體，用于將包含抗體-脲酶綴合物的藥物組合物遞送至癌細(xì)胞。這種制劑對(duì)于引入本文公開(kāi)的多肽、藥物和/或抗體的藥學(xué)上可接受的制劑可能是優(yōu)選的。脂質(zhì)體的形成和使用通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。(參見(jiàn)例如backer，m.v.等人，(2002)bioconjugchem13(3)：462-7)。在優(yōu)選的方面，所公開(kāi)的組合物可以包埋在脂質(zhì)體中。

納米膠囊通?？梢砸苑€(wěn)定和可再生的方式捕獲化合物(whelan，j.(2001)drugdiscovtoday6(23)：1183-84)。為了避免由于細(xì)胞內(nèi)聚合物超載引起的副作用，可以使用能夠在體內(nèi)降解的聚合物來(lái)設(shè)計(jì)這樣的超微顆粒(大小約為0.1μm)。預(yù)期將滿足這些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸異丁酯納米顆粒用于本技術(shù)中，并且這樣的顆粒可以容易地制備，如描述于例如lambert，g.等人(2001)intjpharm214(1-2)：13-6。制備含有生物活性物質(zhì)的聚烷基-氰基-丙烯酸酯納米顆粒的方法及其用途，描述于第4,329,332號(hào)、第4,489,055號(hào)和第4,913,908號(hào)美國(guó)專(zhuān)利。納米膠囊可以從諸如capsulution，inc.(www.capsulution.com)等來(lái)源商購(gòu)。

包含用于遞送組合物的納米膠囊的藥物組合物，描述于第5,500,224號(hào)、第5,620,708號(hào)和第6,514,481號(hào)美國(guó)專(zhuān)利。第5,500,224號(hào)美國(guó)專(zhuān)利描述了納米膠囊的膠態(tài)懸浮液形式的藥物組合物，其包含基本上由含有溶解有表面活性劑的油組成的油相和懸浮在其中的具有小于500納米直徑的多個(gè)納米膠囊。第5,620,708號(hào)美國(guó)專(zhuān)利描述了組合物和用于施用藥物和其它活性劑的方法。組合物包含附著于特異性結(jié)合存在于哺乳動(dòng)物腸上皮細(xì)胞表面上的靶分子的結(jié)合部分的活性劑載體顆粒。所述結(jié)合部分以足以引發(fā)顆粒活性劑載體的內(nèi)吞作用或吞噬作用的結(jié)合親和力或親合力結(jié)合靶分子，使得載體被腸上皮細(xì)胞吸收。然后，活性劑將從載體釋放到宿主的體循環(huán)。以這種方式，可以避免腸道中降解敏感性藥物(如多肽)的降解，同時(shí)增加從腸道吸收蛋白和多肽?？蛇x地，本技術(shù)預(yù)期了在靶細(xì)胞周?chē)沫h(huán)境中釋放活性劑。例如，在一方面，抗體-脲酶綴合物在靶向部分結(jié)合到靶細(xì)胞后從納米膠囊中釋放，使得脲酶被釋放到靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)周?chē)奈h(huán)境中。第6,379,683號(hào)和第6,303,150號(hào)美國(guó)專(zhuān)利描述了制備納米膠囊的方法及其用途，并且通過(guò)引用并入本文。

將使用的藥物組合物以有效量施用于對(duì)象。通常，有效量是有效(1)減少尋求治療的疾病的癥狀的量；或(2)誘導(dǎo)與治療尋求治療的疾病相關(guān)的藥理學(xué)變化的量。對(duì)于癌癥，有效量可以包括如下有效的量：減少腫瘤的大??；減緩腫瘤的生長(zhǎng)；預(yù)防或抑制轉(zhuǎn)移；或者增加受影響對(duì)象的預(yù)期壽命。接觸包括向細(xì)胞中加入包含靶向部分和以所選擇電荷和與第二、相反電荷的卷曲形成肽相互作用以形成穩(wěn)定的α-螺旋卷曲螺旋異源二聚體的能力為特征的第一卷曲形成肽的綴合物。隨后，向細(xì)胞中加入脂質(zhì)體。脂質(zhì)體包含外表面和內(nèi)部隔室；位于脂質(zhì)體內(nèi)部隔室的活性劑(例如脲酶)；和多個(gè)第二肽，其中每個(gè)第二肽被連接到脂質(zhì)體的外表面。

在一些方面，接觸包括將脂質(zhì)體添加到細(xì)胞中，其中脂質(zhì)體具有包埋形式的活性劑(例如抗體-脲酶綴合物)，并且脂質(zhì)體的外表面包括有效且特異性結(jié)合靶表面的細(xì)胞靶向部分，以及有效地屏蔽靶向部分以免于與靶表面相互作用的親水性聚合物覆蓋層。親水聚合物覆蓋層可以由通過(guò)可釋放的鍵與脂質(zhì)體中的表面脂質(zhì)成分共價(jià)連接的聚合物鏈組成。在一些方面，將釋放劑以能有效引起所添加的脂質(zhì)體中大部分鍵的釋放的量加入到腫瘤細(xì)胞中，從而將靶向部分暴露于靶表面。可釋放的鍵可以是可還原的化學(xué)鍵如二硫鍵、酯鍵和肽鍵。

在一些方面，本文預(yù)期了針對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象的基于脂質(zhì)體的療法。該方法包括對(duì)對(duì)象全身施用(例如靜脈內(nèi)施用)具有表面結(jié)合的靶向部分和親水性聚合物覆蓋層的脂質(zhì)體。由可釋放地連接的聚合物鏈組成的親水性聚合物覆蓋層，有效地屏蔽靶向部分以免于與其靶標(biāo)的相互作用。使所施用的脂質(zhì)體全身循環(huán)，直到實(shí)現(xiàn)期望的脂質(zhì)體生物分布。向?qū)ο笫┯糜行У匾鸫蟛糠?例如，大于所施用脂質(zhì)體中可釋放鍵的約50％，優(yōu)選大于約70％，更優(yōu)選大于約90％)裂解的量的釋放劑。當(dāng)釋放親水性聚合物鏈以與其靶標(biāo)相互作用時(shí)，所述靶向部分被暴露。

在一些方面，脂質(zhì)體用于治療實(shí)體瘤。脂質(zhì)體包括抗體-脲酶綴合物，以及任選地，包埋形式的其他活性劑(例如抗腫瘤藥物)，并且通過(guò)有效且特異性結(jié)合腫瘤特異性抗原的靶向部分而靶向腫瘤區(qū)域。在一示例性方法中，通過(guò)在脂質(zhì)體中包括vegf配體，使脂質(zhì)體靶向腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞，用于選擇性附著到在增殖性腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的flk-1,2受體(niederman，tm等人(2002)procnatlacedsci99(10)：7009-14)。

在一些方面，脂質(zhì)體具有在約30-400nm的尺寸。已經(jīng)顯示在該大小范圍內(nèi)的脂質(zhì)體能夠通過(guò)存在于腫瘤脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞襯里層中的“間隙”進(jìn)入腫瘤(maruyama，k等人(1999)advdrugdelivrev40(1-2)：89-102)。

在施用(例如靜脈內(nèi)施用)脂質(zhì)體之后，并且在經(jīng)過(guò)足夠的時(shí)間以使脂質(zhì)體分布在對(duì)象中并結(jié)合腫瘤之后，向?qū)ο笫┯冕尫艅┮詮闹|(zhì)體中釋放親水性表面覆蓋層。釋放表面覆蓋層對(duì)于暴露靶向部分以允許脂質(zhì)體與靶細(xì)胞結(jié)合是有效的。在一方面，親水性表面覆蓋層通過(guò)ph敏感性鍵附著到脂質(zhì)體上。脂質(zhì)體與腫瘤結(jié)合后釋放該鍵。

上述任何方面中的脂質(zhì)體，可以任選地包括一種或多種包埋的抗腫瘤藥物或顯像劑或二者?？梢约尤胫|(zhì)體并使其分散，然后可以施用釋放劑以釋放親水性表面覆蓋層，以暴露附著的靶向部分并開(kāi)始結(jié)合?？梢匀绲?,043,094號(hào)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)中所述制備和施用脂質(zhì)體，其通過(guò)引用并入本文。

在本技術(shù)中可以使用其他遞送劑，諸如第6,180,114號(hào)美國(guó)專(zhuān)利中所述的小單層囊泡(suv)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，存在不是嚴(yán)重血管化的或者被緊密連接所連接的細(xì)胞和/或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制保護(hù)的一些區(qū)域，其減少或阻止了存在于血流中的大分子的進(jìn)入。因此，例如，全身施用治療劑以治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤或其他腦癌，可能受到抵抗大腦分子進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔空間的血腦屏障的制約。在這些類(lèi)型的腫瘤中，治療組合物可優(yōu)選直接施用于腫瘤部位。因此，例如，可以通過(guò)將治療組合物直接施用(例如通過(guò)彈丸注射、微注射或手術(shù)植入導(dǎo)管)于腫瘤部位來(lái)治療腦腫瘤。

劑量

對(duì)于本技術(shù)的方法，可以使用調(diào)節(jié)劑量時(shí)間和順序的任何有效的給藥方案。人對(duì)象的示例性劑量水平，將取決于給藥方式、腫瘤的程度(大小和分布)、患者個(gè)體大小以及癌癥對(duì)脲酶治療的應(yīng)答性。

當(dāng)將抗體-脲酶綴合物組合物施用于(例如直接注射)腫瘤中時(shí)，示例性劑量為約0.1至1,00010μg/kg體重(如約0.2至5μg/kg，或約0.5至2μg/kg)?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的圖像引導(dǎo)技術(shù)(例如熒光透視)來(lái)引導(dǎo)注射針的安放，使得醫(yī)生可以相對(duì)于靶組織觀察針的位置。這種引導(dǎo)工具可以包括超聲、熒光透視、ct或mri。

在一些方面，可以在施用抗體-脲酶綴合物進(jìn)入腫瘤期間或之后，通過(guò)用能夠檢測(cè)對(duì)象癌組織區(qū)域中ph值變化的工具監(jiān)測(cè)腫瘤組織，來(lái)監(jiān)測(cè)施用劑量的抗體-脲酶綴合物的有效性或分布。這樣的工具可以包括可以直接插入腫瘤的ph探針或可視化工具(如磁共振成像(mri)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(ct)或熒光透視)?？梢栽跊](méi)有額外的成像劑情況下進(jìn)行mri問(wèn)診，這僅僅是基于作為ph值函數(shù)的組織的磁性能差異。ct或熒光透視成像可能需要額外的ph敏感成像劑，其不透明度受組織培養(yǎng)基的ph值影響。這些試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

在施用任何抗體-脲酶綴合物之前，可以通過(guò)相對(duì)于周?chē)＝M織的其較低ph值來(lái)顯現(xiàn)腫瘤組織。因此，正常組織可以具有約7.2的正常ph值，而腫瘤組織可以為低0.1個(gè)至0.4個(gè)或更高的ph值單位。也就是說(shuō)，在注射任何抗體-脲酶綴合物之前，可以通過(guò)其較低的ph值來(lái)明確腫瘤組織的程度。在施用脲酶后，具有脲酶的腫瘤區(qū)域的ph值將開(kāi)始上升，并且可以通過(guò)將所得圖像與較早的給藥前圖像進(jìn)行比較來(lái)鑒定。

通過(guò)以這種方式問(wèn)診組織，可以監(jiān)測(cè)ph值的變化程度和組織受影響的程度。基于這種問(wèn)診，醫(yī)生可以向該部位施用其他組合物，和/或可以在腫瘤部位內(nèi)的另外區(qū)域施用組合物。可以重復(fù)該過(guò)程直到在實(shí)體腫瘤的整個(gè)區(qū)域達(dá)到期望的ph變化程度，例如0.2至0.4個(gè)ph值單位。

可以以合適的間隔重復(fù)(例如每周一次或每周兩次)給藥如通過(guò)直接注射，直到觀察到期望的，優(yōu)選腫瘤塊基本上消退或完全消退。如上所述，可以通過(guò)在處理過(guò)程中顯現(xiàn)處理組織的ph值的變化來(lái)監(jiān)測(cè)治療效果。因此，在每次額外的注射之前，可以顯現(xiàn)組織的ph值以確定目前存在的腫瘤程度，此后可以使用組織的ph值變化來(lái)監(jiān)測(cè)對(duì)組織施用新劑量的抗體-脲酶組合物。

當(dāng)通過(guò)非直接注射的方法腸胃外施用抗體-脲酶組合物時(shí)，抗體-脲酶組合物的示例性劑量為100-100,000個(gè)國(guó)際單位/kg脲酶活性/kg對(duì)象體重。如本文所述，該方法中的抗體-脲酶組合物包括用于將脲酶靶向癌癥細(xì)胞(例如實(shí)體瘤位點(diǎn))的抗體，或用于在腫瘤部位選擇性地螯合尿素酶的抗體(例如以脂質(zhì)體形式)。

對(duì)組織ph值變化敏感的成像技術(shù)，可用于監(jiān)測(cè)給藥劑量的有效性。由于這種靶向可能需要幾個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，所以該方法可以包括如上所述在注射抗體-脲酶組合物之前和給藥后數(shù)小時(shí)(例如12-24小時(shí))，監(jiān)測(cè)腫瘤ph值以確認(rèn)腫瘤部位已被充分地給藥，如通過(guò)腫瘤區(qū)域ph值的升高所證實(shí)。根據(jù)這種問(wèn)診結(jié)果，該方法可以確定額外的劑量，直到觀察到期望的ph值升高，例如0.2-0.4個(gè)ph值單位。一旦確立了該劑量，可以定期(例如每周一次或兩次)對(duì)患者進(jìn)行類(lèi)似劑量的脲酶組合物的治療，直到達(dá)到腫瘤大小或狀況的改變。

考慮到改變藥物作用的各種因素(如藥劑的比活性，疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性，患者的應(yīng)答性，患者的年齡、狀況、體重、性別和飲食，任何感染的嚴(yán)重程度等)，由主治醫(yī)師鑒于良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐來(lái)確定最終劑量方案?？梢钥紤]的其他因素包括：給藥的時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的耐受/應(yīng)答。由本領(lǐng)域從業(yè)人員，尤其是根據(jù)所公開(kāi)的劑量信息和測(cè)定方法，以及在臨床試驗(yàn)中觀察到的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，常規(guī)地進(jìn)行適用于治療的涉及本文提及的任何制劑的劑量的進(jìn)一步改進(jìn)?？梢酝ㄟ^(guò)使用已建立的用于確定體液中的試劑或其它樣品的濃度的測(cè)定方法以及劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)來(lái)確定合適的劑量。

給藥的頻率將取決于藥劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和給藥途徑。調(diào)整劑量和給藥以提供足夠水平的活性劑或維持期望的效果。因此，可以根據(jù)需要以單劑量、多個(gè)離散劑量、持續(xù)輸注、緩釋儲(chǔ)庫(kù)或其組合來(lái)施用藥物組合物，以維持期望的藥劑最低水平。

可以每天一次或每天超過(guò)一次(例如每天兩次、三次或四次)施用短效藥物組合物(即，短半衰期)?？梢悦?-4天、每周或每?jī)芍芤淮问┯瞄L(zhǎng)效藥物組合物。將泵(例如皮下泵、腹膜內(nèi)泵或硬膜下泵)用于連續(xù)輸注。

可以制備在藥學(xué)上可接受的載體中包含綴合物的組合物，置于合適的容器中，并標(biāo)記用于治療指定的病況。標(biāo)簽上指示的病況可以包括但不限于治療各種癌癥類(lèi)型。也涵蓋如下所述的試劑盒，其中試劑盒包含藥物組合物的劑型和包含使用該組合物治療醫(yī)學(xué)病況的說(shuō)明的包裝說(shuō)明書(shū)。

通常，將綴合物組合物以有效量施用于對(duì)象。通常，有效量是有效(1)減少尋求治療的疾病的癥狀的量；或(2)誘導(dǎo)與治療尋求治療的疾病相關(guān)的藥理學(xué)變化的量。對(duì)于癌癥，有效量可以包括如下有效的量：減少腫瘤的大??；減緩腫瘤的生長(zhǎng)；預(yù)防或抑制轉(zhuǎn)移；或增加受影響對(duì)象的預(yù)期壽命。

治療方法

本技術(shù)提供了治療對(duì)象的癌癥的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康谋疚奶峁┑慕M合物，從而治療對(duì)象的癌癥。適合通過(guò)本文的方法治療的癌癥通常包括：癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤。癌可以是肛門(mén)癌、膽道癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下咽部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、膽囊癌和膽管癌、小腸癌、尿道癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、生殖道癌、內(nèi)分泌腺癌、甲狀腺癌和皮膚癌。其他適合的癌癥包括：類(lèi)癌瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤、原發(fā)性腫瘤、血管瘤、黑素瘤、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤和腦腫瘤、神經(jīng)腫瘤、眼腫瘤和腦膜腫瘤。

在一些方面，待治療的癌癥形成實(shí)體腫瘤，諸如癌、肉瘤、黑素瘤和淋巴瘤。在一些方面，癌癥是以下中的一種或多種：非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌或其組合。在一些方面，癌癥是非小細(xì)胞肺癌。在一些方面，對(duì)象是人。

可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)估計(jì)治療有效劑量。癌癥動(dòng)物模型，如具有小鼠腫瘤的免疫能力小鼠，或具有人腫瘤異種移植物的免疫受損小鼠(例如，裸鼠)，在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且被廣泛地描述于以引用并入本文的許多參考文獻(xiàn)中。這些信息與在大鼠、狗和/或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的安全性研究結(jié)合使用，以確定在人類(lèi)中安全和潛在有用的初始劑量。用于估計(jì)生物體內(nèi)劑量的其他信息，可來(lái)自臨床試驗(yàn)報(bào)告的實(shí)際人癌癥研究。

在一些方面，癌癥治療方法旨在包括治愈以及改善癌癥的至少一種癌癥癥狀。如果患者被治愈了癌癥，癌癥進(jìn)入緩解期，生存期以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式延長(zhǎng)，腫瘤進(jìn)展時(shí)間以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式增長(zhǎng)，基于為每種類(lèi)型的淋巴細(xì)胞惡性腫瘤或造血惡性腫瘤建立的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，淋巴細(xì)胞腫瘤負(fù)荷或造血腫瘤負(fù)荷減少，或者實(shí)體瘤負(fù)荷已經(jīng)按照如實(shí)體瘤應(yīng)答評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)定義的減少，則治療了癌癥患者(recist1.0或recist1.1，therasse等人，jnatl.cancerinst.92(3)：205-216,2000和eisenhauer等人，eur.j.cancer45：228-247,2009)。如本文所用，“緩解期”是指先前證明患有癌癥的患者中不存在生長(zhǎng)中的癌細(xì)胞。因此，緩解期的癌癥患者，或者治愈了其癌癥，或者其癌癥是存在的但不容易檢測(cè)的。因此，當(dāng)腫瘤不能增大或轉(zhuǎn)移時(shí)，癌癥可能是在緩解期。如本文所用的完全緩解期，是通過(guò)診斷方法(如成像，諸如x射線、mri、ct和pet，或血液活檢或骨髓活檢)所示的疾病不存在。當(dāng)癌癥患者進(jìn)入緩解期時(shí)，其后可能會(huì)復(fù)發(fā)，其中癌癥再次出現(xiàn)。

在一些方面，所述治療不與培美曲塞和/或卡鉑聯(lián)合。在一些方面，所述治療不與葉酸抗代謝物化合物和/或鉑劑聯(lián)合。

試劑盒

在一些方面，本技術(shù)提供使用本文所述方法抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑盒。試劑盒包括含有一種或多種活性劑的容器。試劑盒可以另外包括用于實(shí)施本技術(shù)方法的本文所述的任何其它成分。

試劑盒可以任選地包括含有公開(kāi)用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性劑的用法說(shuō)明的(即，方案)的說(shuō)明材料。因此，一方面，試劑盒包括含有活性劑，優(yōu)選脲酶的藥物組合物，以及教導(dǎo)向?qū)ο笫┯迷摻M合物以治療對(duì)象中癌癥的說(shuō)明材料。在一方面，說(shuō)明材料教導(dǎo)向?qū)ο笫┯萌缦铝康碾迕附M合物，其量取決于腫瘤的大小，并且當(dāng)通過(guò)直接注射施用組合物進(jìn)入腫瘤時(shí)，每mm³腫瘤0.1至100個(gè)國(guó)際單位的脲酶活性，當(dāng)經(jīng)腸胃外施用組合物于對(duì)象而不是通過(guò)直接注射進(jìn)入腫瘤中時(shí)，其量為100-100,000個(gè)國(guó)際單位/kg國(guó)際單位脲酶活性/kg對(duì)象體重。

在另一方面，說(shuō)明材料教導(dǎo)了以有效減少或逆轉(zhuǎn)實(shí)體瘤中較高的細(xì)胞內(nèi)/較低的細(xì)胞外ph值梯度的脲酶量，向還在接受其有效性被實(shí)體瘤中較高的細(xì)胞內(nèi)/較低的細(xì)胞外ph值梯度降低的弱堿性抗腫瘤化合物的對(duì)象施用脲酶組合物。

可選地，說(shuō)明材料教導(dǎo)了在可有效定位對(duì)象的實(shí)體瘤中的脲酶的條件下，向含有或懷疑含有實(shí)體瘤的對(duì)象施用脲酶組合物，用能夠檢測(cè)對(duì)象組織中細(xì)胞外ph值的變化的診斷工具問(wèn)診對(duì)象，以及鑒定在所述給藥后顯示細(xì)胞外ph值升高的對(duì)象內(nèi)的組織區(qū)域。

雖然說(shuō)明材料通常包括書(shū)面材料或印刷材料，但是它們不限于此。本技術(shù)涵蓋了任何能夠存儲(chǔ)這些說(shuō)明并將其傳遞給最終用戶(hù)的介質(zhì)。這樣的介質(zhì)包括但不限于：電子存儲(chǔ)介質(zhì)(例如，磁盤(pán)、磁帶、盒帶、芯片)，光學(xué)介質(zhì)(例如，cdrom)等。這樣的介質(zhì)可以包括提供這種說(shuō)明材料的因特網(wǎng)站點(diǎn)的地址。

實(shí)施例

給出以下實(shí)施例是為了說(shuō)明本公開(kāi)的各個(gè)方面。它們并不意圖以任何方式限制本公開(kāi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本公開(kāi)很好地適用于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)并獲得所提及的目的和優(yōu)點(diǎn)，以及本文中固有的任何目標(biāo)、目的和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的實(shí)施例(以及本文所述的方法)目前代表優(yōu)選方面。它們是示例性的，并不意圖限制本公開(kāi)的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到包含在由權(quán)利要求的范圍限定的本公開(kāi)的精神內(nèi)的變化和其它用途。

實(shí)施例1.l-dos47：靶向表達(dá)ceacam6的腫瘤的抗體-脲酶綴合物

相對(duì)于正常組織，腫瘤的微環(huán)境通常是酸性的。響應(yīng)于由異常脈管系統(tǒng)的局部缺氧導(dǎo)致無(wú)氧糖酵解而引起的乳酸積累，似乎是直接原因(1,2)。然而，即使在氧的存在下，癌細(xì)胞繼續(xù)無(wú)氧代謝葡萄糖(3)。這表明轉(zhuǎn)變的代謝表型和所產(chǎn)生的酸性環(huán)境可能賦予癌細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(4)。

已經(jīng)表明，將尿素轉(zhuǎn)變成氨并提高溶液ph值的洋刀豆脲酶，對(duì)癌細(xì)胞是細(xì)胞毒性的(8)。在負(fù)載人乳腺癌和肺癌的異種移植物的小鼠中，向腫瘤內(nèi)注射酶也顯著延遲了腫瘤生長(zhǎng)(8)。然而，在臨床環(huán)境中，腫瘤內(nèi)遞送癌癥治療劑是一個(gè)困難的實(shí)踐。在患有晚期和顯著轉(zhuǎn)移性疾病的患者中，瘤內(nèi)注射不是可行的選擇。更實(shí)際的方法是通過(guò)靜脈內(nèi)注射來(lái)遞送酶。然而，脲酶缺乏靶向結(jié)構(gòu)域，并且酶的全身遞送可能導(dǎo)致脫靶毒性。使用特異性靶向腫瘤的抗體-酶綴合物將脲酶遞送至癌癥部位。所述綴合物中使用的該抗體能特異性識(shí)別在非小細(xì)胞肺癌患者中的ceacam6。

選擇識(shí)別肺腺癌細(xì)胞(17)上的ceacam6的單結(jié)構(gòu)域駱駝科抗體片段(afaikl2，seqidno.1)，用于與洋刀豆脲酶(dos47)綴合以產(chǎn)生癌癥治療劑。本技術(shù)描述了對(duì)這種抗ceacam6-脲酶綴合物(l-dos47)進(jìn)行的一些相關(guān)臨床前研究(目前處在人類(lèi)i期臨床研究中)。

將洋刀豆脲酶的抗腫瘤活性與抗-ceacam6單結(jié)構(gòu)域抗體的特異性，以抗體-脲酶偶聯(lián)物(l-dos47)的形式組合。l-dos47特異性結(jié)合表達(dá)ceacam6的癌細(xì)胞系，并發(fā)揮有效的細(xì)胞毒作用。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)顯示，由于增加的親合力，l-dos47的結(jié)合親和力比天然單結(jié)構(gòu)域抗體強(qiáng)約500倍。l-dos47的細(xì)胞毒性取決于原位尿素的可用性和靶細(xì)胞對(duì)氨毒性的敏感性。通過(guò)沉默ceacam6基因來(lái)保護(hù)bxpc-3細(xì)胞免受l-dos47的影響，而ceacam6過(guò)表達(dá)致使轉(zhuǎn)染的h23細(xì)胞對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性敏感。人正常組織和癌組織的免疫化學(xué)染色顯示，l-dos47優(yōu)先結(jié)合肺腺癌，以及結(jié)合結(jié)腸腺癌和胰腺腺癌，具有陽(yáng)性但較弱的染色。小鼠肺腺癌a549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移研究也表明，l-dos47在10μg/ml濃度下可有效減少肺中癌細(xì)胞計(jì)數(shù)。

材料。洋刀豆(canavaliaensiformis)脲酶得自biovectrainc.(pei，加拿大)，并通過(guò)酸沉淀、醇分級(jí)分離和離子交換色譜法進(jìn)一步純化。通過(guò)sds-page、hplc和質(zhì)譜法測(cè)定，酶的純度>97％。脲酶的一個(gè)單位定義為在25℃和ph值7.6下產(chǎn)生1μmol/分鐘的氨。

來(lái)自美洲駝的重鏈抗體庫(kù)的噬菌體文庫(kù)，用于通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺腺癌a549進(jìn)行淘選來(lái)鑒定單結(jié)構(gòu)域抗體(sdab)。sdab被指定為afai(17)。優(yōu)化afai的基因序列用于綴合目的，并重命名為afaikl2。然后將afaikl2抗體在大腸桿菌bl21(de3)pt7-7系統(tǒng)中克隆并表達(dá)。使用離子交換色譜法從包涵體中純化該抗體。使用異雙功能交聯(lián)劑n-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?氨基-苯甲酸酯(siab)，進(jìn)行抗體與脲酶的綴合。首先通過(guò)伯胺基團(tuán)用siab連接子的nhs酯部分活化afaikl2抗體?；罨目贵w通過(guò)交聯(lián)劑的碘乙酰基結(jié)合脲酶，以釋放存在于酶上的巰基。通過(guò)以2:1的質(zhì)量比將高純度脲酶和活化的抗體混合，來(lái)控制靶向綴合比(1:6至1:10，脲酶與抗體比)。通過(guò)超透析過(guò)濾純化抗體-脲酶綴合物。

尿素、胰蛋白酶(組織培養(yǎng)級(jí))、吩嗪硫酸乙酯(pes)、硝普化鈉、次氯酸鈉溶液、苯酚、nacl、kh2po4、mgso4、nahco3和戊二醛，購(gòu)自sigmachemicalco.(st.louis，mo)。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2h-四唑(mts)和胰蛋白酶(用于肽片段化和質(zhì)譜分析)，購(gòu)自promegacorp.(madison，wi)。過(guò)氧化氫(30％)、siab、kcl、d-葡萄糖、hcl、na2hpo4和nah2po4，購(gòu)自fisherscientific(ottawa，on)。牛血清白蛋白v部分(bsa)購(gòu)自roche(indianapolis，in)。氯化銨(0.100m)購(gòu)自riccachemical(arlington，tx)?？?afaikl2-過(guò)氧化物酶綴合物，由rocklandimmunochemicals(gilbertsville，pa)生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)基(rpmi)、胎牛血清和抗生素，獲自lifetechnologies(burlington，on)。雌性crtac：ncr-foxn1^nu裸鼠，由taconic(hudson，ny)提供。實(shí)驗(yàn)中使用的改性krebsringer緩沖液(krb)含有nacl(98.3mm)、kcl(4.73mm)、kh2po4(1.19mm)、mgso4(1.19mm)、d-葡萄糖(11.7mm)、na2hpo4(11.1mm)和nah2po4(2.77mm)，ph值7.2。

靛酚測(cè)定

使用改良的靛酚測(cè)定法(18)，測(cè)定脲酶酶反應(yīng)產(chǎn)生的氨的量。簡(jiǎn)言之，通過(guò)將165mg苯酚和132mgnaoh顆粒溶解在10ml水中，然后加入66μl硝普化鈉溶液(10mg/ml)，新鮮制備溶液a。通過(guò)向5ml水中加入40μl次氯酸鈉制備溶液b。將來(lái)自全細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)(見(jiàn)下文)的樣品溶液(每次30μl)轉(zhuǎn)移到含有50μl/孔的5nnaoh:h2o(3.3:46.7)和20μl/孔水的新的96孔板中。加入溶液a(50μl/孔)和溶液b(50μl/孔)，然后將平板轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上，在37℃顯色30分鐘。在630nm處測(cè)量od值。使用氯化氨作為標(biāo)準(zhǔn)品(0至150μm)，從校準(zhǔn)曲線計(jì)算在孔中產(chǎn)生的氨的量。

l-dos47的全細(xì)胞結(jié)合測(cè)定

通過(guò)在96孔培養(yǎng)板中接種100μl/孔的腫瘤細(xì)胞(4×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔)，并在37℃孵育過(guò)夜，來(lái)制備細(xì)胞單層。從平板上去除培養(yǎng)基，并在室溫(rt)下用100μl/孔的0.05％戊二醛(在磷酸鹽緩沖鹽水，pbs中)將細(xì)胞單層固定10分鐘。然后用pbs洗滌平板，加入120μl/孔的甘氨酸溶液(50mm)，并在37℃下孵育20分鐘。孵育后，將平板用120μl/孔的1％bsa/pbs在37℃封閉30分鐘。然后，將平板用緩沖液a(pbs中0.05％bsa)洗滌3次，加入80μl/孔的稀釋的l-dos47溶液或dos47溶液，并在37℃下孵育1.5小時(shí)。通過(guò)尿素方法或抗體方法產(chǎn)生結(jié)合信號(hào)：(1)用尿素方法，將平板用緩沖液a洗滌4次，加入80μl/孔的20mm尿素(在ph值7.6的0.1m磷酸鹽緩沖液中制備)，并在37℃下孵育30分鐘。孵育后，加入40μl/孔的1nhcl以停止反應(yīng)。使用靛酚測(cè)定法測(cè)定每個(gè)孔中產(chǎn)生的氨的量。(2)對(duì)于抗體方法，在封閉步驟前，首先用100μl/孔的0.3％過(guò)氧化氫猝滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30分鐘。在用試驗(yàn)物質(zhì)孵育后，用pbs洗滌平板，并在含有0.05％tween-20和0.1％奶粉的緩沖液a中，制備稀釋的抗-afaikl2-過(guò)氧化物酶抗體綴合物(1:8,000)。將平板用緩沖液a洗滌3次，向平板中加入100μl/孔的抗體-過(guò)氧化物酶綴合物。在37℃下孵育1小時(shí)后，將平板用緩沖液a洗滌3次。在含有0.03％h2o2的檸檬酸鈉緩沖液中，制備1mm的過(guò)氧化物酶底物，加入100μl/孔的底物溶液，并在室溫下孵育30分鐘。將平板轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)儀，在405nm下測(cè)量od值。

l-dos47的細(xì)胞毒性測(cè)定

通過(guò)在96孔培養(yǎng)板中接種100μl/孔的腫瘤細(xì)胞(4×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔)，并在37℃孵育過(guò)夜，來(lái)制備細(xì)胞單層。從每個(gè)孔中去除培養(yǎng)基，加入80μl/孔的l-dos47或dos47，并在37℃下進(jìn)一步孵育2小時(shí)。孵育后，將平板用緩沖液a洗滌3次。然后將100μl/孔的krb中的尿素(20mm)加入到平板中，將其在37℃下孵育過(guò)夜。去除培養(yǎng)基，用100μl/孔普通培養(yǎng)基代替。使用mts細(xì)胞活力測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力，其中制備mts/pes溶液混合物(20:1體積/體積；mts，2mg/ml；pes，1mg/ml)，并將20μl/孔的混合物加入到平板中。然后將平板在37℃下孵育1-2小時(shí)，并在630nm處測(cè)量od值，參考490nm處的od值。

基于細(xì)胞的電化學(xué)發(fā)光(ecl)結(jié)合測(cè)定

根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用釕-nhs-酯(sulfo-tag，mesoscalediscoverymsd；rockville，md)標(biāo)記l-dos47、afaikl2抗體和dos47。這些釕標(biāo)記的蛋白允許直接測(cè)量l-dos47和afaikl2與靶抗原的結(jié)合。對(duì)于直接結(jié)合測(cè)定，在96孔sectorpr高結(jié)合板(msd)上，制備bxpc-3細(xì)胞單層。固定和封閉后，加入各種量的l-dos47標(biāo)簽或afaikl2標(biāo)簽。將平板在37℃下孵育1.5小時(shí)。孵育后，將板洗滌兩次，并用讀取緩沖液(readbuffer)(msd)填充。然后立即使用sectorpr-100讀取器(msd)讀取ecl信號(hào)。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，使用l-dos47或afaikl2抗體來(lái)抑制l-dos47標(biāo)簽與bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合。使用1μg/ml的l-dos47標(biāo)簽結(jié)合bxpc-3細(xì)胞。使用各種濃度的競(jìng)爭(zhēng)者(l-dos47或afaikl2)來(lái)競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記的l-dos47的結(jié)合。孵育后，將平板洗滌兩次，并用讀取緩沖液填充。然后立即使用sectorpr-100讀取器讀取平板。

bxpc-3細(xì)胞中的ceacam6基因敲低

為了證實(shí)ceacam6是由l-dos47識(shí)別的特異性抗原，使用來(lái)自origene(rockville，md)的hush-29發(fā)夾表達(dá)克隆，使陽(yáng)性細(xì)胞系bxpc-3的ceacam6基因沉默。這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄短發(fā)夾rna(shrna)序列，其通過(guò)rna干擾阻斷靶基因轉(zhuǎn)錄。用hush質(zhì)粒轉(zhuǎn)染bxpc-3細(xì)胞，并且使用嘌呤霉素來(lái)選擇出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。從轉(zhuǎn)染hush6(aaggcgaaagagtggatggcaacagtcta(seqidno：5))、hush7(aagaagcaaccggacagttccatgtatac(seqidno：6))和對(duì)照質(zhì)粒hush-trs，獲得不同的克隆。通過(guò)抗生素選擇來(lái)獲得兩種陽(yáng)性穩(wěn)定細(xì)胞系(hush#6和hush#7)和對(duì)照(hush-trs)。然后使用全細(xì)胞結(jié)合測(cè)定法，將這些克隆用于檢查與l-dos47的結(jié)合。用l-dos47孵育后，將平板用緩沖液a洗滌3次，加入80μl/孔的20mm尿素(在ph值7.6的0.1m磷酸鹽緩沖液中制備)。將平板在37℃下孵育30分鐘。通過(guò)加入40μl/孔的1nhcl終止酶促反應(yīng)。使用靛酚測(cè)定法測(cè)定產(chǎn)生的氨的量。

將ceacam6基因轉(zhuǎn)染到h23細(xì)胞

將含有g(shù)418選擇標(biāo)記的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體克隆，其具有pmp-gfp基因(質(zhì)膜蛋白-綠色熒光蛋白)和ceacam6基因。使用cellfectin試劑(lifetechnologies)，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到h23細(xì)胞中。簡(jiǎn)言之，將在2ml完全rpmi培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清和50u/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素)中的2×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的h23細(xì)胞，接種在6孔培養(yǎng)板中并在37℃下孵育過(guò)夜。將cellfectin試劑(10μl)和dna(1-2μl)分別稀釋于100μl無(wú)血清rpmi培養(yǎng)基中。然后將兩種稀釋溶液合并，輕輕混合，并在室溫下孵育30分鐘。將平板用1.5ml無(wú)血清rpmi培養(yǎng)基洗滌兩次。將合并的溶液稀釋于0.8ml無(wú)血清rpmi培養(yǎng)基中，輕輕混合，并加入到細(xì)胞中。將細(xì)胞于37℃在co2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。第二天，用2ml完全rpmi培養(yǎng)基代替該培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞共表達(dá)了來(lái)自與ceacam6相同的mrna的gfp。通過(guò)在含有400μg/mlg418抗生素的培養(yǎng)基中孵育來(lái)選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將細(xì)胞直接分選或用cy5.5標(biāo)記的l-dos47孵育后分選，其表明ceacam6的表面表達(dá)。

l-dos47對(duì)人腫瘤組織的免疫化學(xué)染色

篩選代表42個(gè)癌組織和正常組織的總共400個(gè)組織樣品(axelwellmann，universityhospitalaachen，rwthaachengermany)。首先將載玻片在62℃的烘箱中以垂直取向孵育1小時(shí)以除去石蠟。然后，將載玻片在二甲苯代替物中脫蠟5×4分鐘。將載玻片在100％、95％和75％乙醇中水合2x3分鐘每次，然后浸入自來(lái)水中5分鐘。用0.3％h2o2淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30分鐘。使用vectastaineliteabc試劑盒(vectorlabs，burlington，on)，檢測(cè)載玻片上的l-dos47結(jié)合。簡(jiǎn)言之，在pbs中洗滌3×5分鐘后，將載玻片在封閉血清中于4℃孵育過(guò)夜。然后將載玻片在l-dos47溶液(在緩沖液a中為20μg/ml)中于37℃中孵育1.5小時(shí)。用pbs洗滌后，將載玻片用小鼠抗-脲酶抗體(sigma，1:1500)在37℃孵育1小時(shí)。用pbs洗滌后，將載玻片用生物素化的二抗溶液(vectorlabs)孵育30分鐘。用pbs洗滌后，將載玻片與vectastaineliteabc試劑一起孵育30分鐘。用pbs洗滌后，將載玻片在新鮮的dab(3,3-二氨基聯(lián)苯胺)過(guò)氧化物酶底物溶液混合物(vectorlabs)中，在室溫下孵育2分鐘。通過(guò)在自來(lái)水中洗滌5分鐘來(lái)停止反應(yīng)。然后將載玻片在meyer蘇木精中復(fù)染10sec。將載玻片在75％、80％、95％和100％乙醇中脫水。在二甲苯中清洗后，用clarion安裝介質(zhì)安裝載玻片。

a549轉(zhuǎn)移研究

接種a549腫瘤細(xì)胞(5×10⁶)，并在低結(jié)合培養(yǎng)板中生長(zhǎng)。一旦獲得足夠的數(shù)量，收獲細(xì)胞并以5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸于培養(yǎng)基中。然后將細(xì)胞以1ml/孔置于6-孔的低結(jié)合組織培養(yǎng)板中。然后將終濃度為10μg/ml或15μg/ml的l-dos47(1ml)加入每個(gè)孔中。用10μg/ml的v21-dos47綴合物(靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)受體的抗體-脲酶綴合物)處理同種型對(duì)照。將細(xì)胞在37℃下孵育4小時(shí)。孵育后，將細(xì)胞離心并用無(wú)菌pbs洗滌3次，并在無(wú)菌pbs中重懸至1×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml。然后每只小鼠接受1×10⁶個(gè)處理的細(xì)胞的單次接種。本研究由4組雌性crtac：ncr-foxn1^nu小鼠(未處理、同種型和l-dos47(10μg/ml和15μg/ml))組成。通過(guò)尾靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)接種a549腫瘤細(xì)胞，總共40只小鼠(每組10只)。

每組5只動(dòng)物在第22天(3周)安樂(lè)死，而剩余動(dòng)物保持到第71天(10周)。處死后，用墨汁(calvertlabs；olyphant，pa)氣管內(nèi)注射動(dòng)物；然后切除肺，隨后在fekete溶液(calvertlabs)中固定。通過(guò)在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)肺中的轉(zhuǎn)移性腫瘤(病灶)的數(shù)目，來(lái)確定測(cè)試物品對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。拍攝來(lái)自各組的代表性肺。

l-dos47結(jié)合各種癌細(xì)胞系

在5種腫瘤細(xì)胞系-bxpc-3、capan-1、zr-75-30、ls174t和mda-mb231之間，觀察到l-dos47的不同結(jié)合分布圖(圖1a)。結(jié)果顯示，l-dos47與兩種胰腺細(xì)胞系(bxpc-3和capan-1)和乳腺細(xì)胞系(zr-75-30)結(jié)合良好，表明ceacam6抗原在細(xì)胞表面表達(dá)。在結(jié)腸細(xì)胞系ls174t中也觀察到中等結(jié)合，但在乳腺細(xì)胞系mda-mb231(陰性對(duì)照)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)結(jié)合。當(dāng)與脲酶綴合時(shí)，afaikl2抗體提供了針對(duì)表達(dá)ceacam6細(xì)胞的特異性靶向。這通過(guò)在dos47處理的細(xì)胞中沒(méi)有結(jié)合信號(hào)得以證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。

l-dos47的細(xì)胞毒性

圖1b顯示，bxpc-3和zr-75-30都對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性敏感。在用小于1μg/ml的l-dos47處理的這兩種細(xì)胞系中，觀察到細(xì)胞存活的快速下降。在capan-1細(xì)胞和ls174t細(xì)胞中，觀察到中等作用。l-dos47對(duì)陰性對(duì)照細(xì)胞系mda-mb231沒(méi)有任何作用。來(lái)自更多細(xì)胞系的結(jié)合和細(xì)胞毒性的結(jié)果列表顯示在表1中。l-dos47細(xì)胞毒性直接取決于l-dos47對(duì)相應(yīng)細(xì)胞系的結(jié)合活性。a549和capan-1的較弱的細(xì)胞毒性應(yīng)答，是由于這兩種細(xì)胞系對(duì)氨毒性的較高耐受性(數(shù)據(jù)未顯示)。另一方面，h23細(xì)胞對(duì)氨高度敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管在細(xì)胞表面沒(méi)有ceacam6抗原，h23細(xì)胞仍然顯示出對(duì)l-dos47的一些弱的細(xì)胞毒性應(yīng)答，這可能是由于在孔中存在非特異性結(jié)合的l-dos47。

表1.從l-dos47對(duì)9種人腫瘤細(xì)胞系的各種結(jié)合和細(xì)胞毒性研究獲得的結(jié)果總結(jié)

其中：+，陽(yáng)性(+的數(shù)表示活性強(qiáng)度)；-，陰性

來(lái)自四種人組織的五種細(xì)胞系(bxpc-3、capan-1、zr-75-30、ls174t和a549)，顯示出如表1中所示的強(qiáng)l-dos47結(jié)合和對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性的良好敏感性(a549除外)。l-dos47的細(xì)胞毒性作用或多或少依賴(lài)于與癌細(xì)胞的相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度。圖中的結(jié)果表示代表性實(shí)驗(yàn)的平均值(n＝3)。所有值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)小于10％。

l-dos47與bxpc-3細(xì)胞的直接和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合

基于細(xì)胞的電化學(xué)發(fā)光結(jié)合測(cè)定，允許直接檢測(cè)結(jié)合到腫瘤細(xì)胞的釕標(biāo)記的抗體綴合物。在圖2a中，發(fā)現(xiàn)釕標(biāo)記的l-dos47和afaikl2抗體都結(jié)合bxpc-3細(xì)胞，而釕標(biāo)記的dos47作為陰性對(duì)照。因?yàn)閘-dos47中呈現(xiàn)較高的抗體親合力(6-10個(gè)抗體)，l-dos47顯示出比afaikl2抗體高得多的結(jié)合親和力。使用l-dos47和afaikl2抗體作為競(jìng)爭(zhēng)者來(lái)抑制釕標(biāo)記的l-dos47與bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果(圖2b)。l-dos47和afaikl2抗體均抑制釕標(biāo)記的l-dos47與bxpc-3的結(jié)合，并且如預(yù)期的那樣，l-dos47表現(xiàn)出更好的結(jié)合親和力，并因此比afaikl2抗體更強(qiáng)地抑制釕標(biāo)記的l-dos47與bxpc-3的結(jié)合?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)試物品的ic50(導(dǎo)致結(jié)合降低50％所需競(jìng)爭(zhēng)者的量)來(lái)比較l-dos47和afaikl2抗體的表觀結(jié)合親和力。估計(jì)l-dos47和afaikl2抗體的ic50分別為2μg/ml和20μg/ml；或?qū)τ趌-dos47為3.22nm(對(duì)于1個(gè)脲酶比6個(gè)抗體的綴合比，mw＝622k)和對(duì)于afaikl2為1.55μm(mw＝12.9k)。結(jié)果表明，l-dos47的結(jié)合親和力為afaikl2抗體的結(jié)合親和力的約500倍。

在h23細(xì)胞中過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染的ceacam6基因

用ceacam6基因轉(zhuǎn)染后，鑒定出陽(yáng)性克隆h23-cc6#7。通過(guò)用l-dos47-cy5.5重新分選h23-cc6#7克隆，獲得具有更接近于a549細(xì)胞的ceacam6水平的克隆。用更高量的g418抗生素(800μg/ml)進(jìn)一步孵育克隆，有助于選擇具有較高水平的ceacam6表達(dá)的克隆。盡管h23-cc6#7比a549細(xì)胞和bxpc-3細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)較少的ceacam6，但由于其對(duì)氨的毒性的高度易感性(數(shù)據(jù)未顯示)，該ceacam6轉(zhuǎn)染的克隆比bxpc-3細(xì)胞對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性更敏感(圖3b)。

bxpc-3細(xì)胞中的ceacam6基因敲低

與天然bxpc-3細(xì)胞和對(duì)照克隆(hush-tr3)相比，l-dos47與兩個(gè)ceacam6敲低克隆(hush#6和hush#7)的結(jié)合顯著降低(圖3c)。實(shí)驗(yàn)清楚地表明，ceacam6在細(xì)胞表面的存在對(duì)于l-dos47結(jié)合是重要的。沉默該基因確實(shí)顯著降低了l-dos47的結(jié)合。

l-dos47對(duì)人腫瘤組織的免疫化學(xué)染色

正常組織和癌組織篩選表明，l-dos47幾乎唯一地識(shí)別腺癌亞型(表2)。在篩選的400多個(gè)組織樣品中，其代表由各種癌組織和匹配的正常組織組成的42組，肺腺癌組織顯示相當(dāng)大的染色，有超過(guò)80％的細(xì)胞被識(shí)別。相應(yīng)的年齡匹配的正常肺組織是陰性，其少數(shù)活化肺細(xì)胞中有病灶暗示。顯示一些陽(yáng)性但弱染色的其他組織是結(jié)腸腺癌和胰腺腺癌。圖4顯示用l-dos47進(jìn)行結(jié)腸腺癌和肺腺癌免疫化學(xué)染色。

表2.篩選l-dos47結(jié)合的人正常組織和癌組織

用l-dos47進(jìn)行的人結(jié)腸腺癌和肺腺癌免疫組織化學(xué)染色如圖4所示。

a549轉(zhuǎn)移研究

在3周時(shí)，接受用10μg/ml和15μg/mll-dos47處理的a549細(xì)胞的小鼠顯示出降低的肺腫瘤計(jì)數(shù)，與未處理的對(duì)照組相比展示顯著的降低(p<0.05)(表3)。然而，在10周時(shí)，沒(méi)有觀察到腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均數(shù)量的顯著降低。盡管不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但用10μg/mll-dos47治療，與未治療的對(duì)照組相比，治療后3周和10周顯示平均腫瘤細(xì)胞數(shù)量一致下降(表3)。有趣地是，同種型對(duì)照(v21-dos47)也影響并減少了肺中的腫瘤計(jì)數(shù)的數(shù)量?？傊谥委熀?周，用10μg/ml的l-dos47處理的a549細(xì)胞減少了肺腫瘤的平均數(shù)，但是這種作用是短暫的，因?yàn)樵谥委熀?0周沒(méi)有觀察到平均腫瘤數(shù)目的顯著降低。

表3.在a549轉(zhuǎn)移研究中計(jì)數(shù)的肺腫瘤的平均數(shù)

^#平均值±sem；當(dāng)與未處理的對(duì)照組相比時(shí)，*p<0.05。

如表3所示，在體外用l-dos47或同種型對(duì)照(v21-dos47)處理a549人肺腺癌細(xì)胞。在37℃下孵育4小時(shí)后，將細(xì)胞用pbs洗滌3次，并以1×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml重懸于pbs中。然后每只小鼠接受1×10⁶個(gè)處理的細(xì)胞的單次接種。每組5只動(dòng)物在注射后3周和10周安樂(lè)死。通過(guò)在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)肺中的轉(zhuǎn)移性腫瘤的數(shù)量，來(lái)確定測(cè)試物品對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。將l-dos47治療組的轉(zhuǎn)移性腫瘤生長(zhǎng)，與未經(jīng)治療的對(duì)照組進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)比較。用l-dos47共注射治療后3周，顯著減少腫瘤計(jì)數(shù)的數(shù)量。

證明了，基于由脲酶介導(dǎo)的氨產(chǎn)生和局部ph值升高，使用脲酶作為潛在癌癥治療劑(8)。然而，相對(duì)于正常細(xì)胞所述酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性缺乏，已經(jīng)限制了其作為癌癥治療劑的應(yīng)用?？贵w-藥物綴合物(adc)的應(yīng)用，或更具體地，該技術(shù)的抗體導(dǎo)向酶前藥治療(adept)的應(yīng)用，可以規(guī)避這種限制。在該實(shí)施例中，通過(guò)將ceacam6特異性美洲鴕單結(jié)構(gòu)域抗體(afaikl2)與脲酶(dos47)綴合，來(lái)制備抗體-脲酶綴合物(l-dos47)的特殊形式。綴合的afaikl2抗體提供了特異性，因此提高了脲酶對(duì)表達(dá)ceacam6的腫瘤的療效。通過(guò)體外結(jié)合研究來(lái)評(píng)估l-dos47對(duì)在細(xì)胞表面表達(dá)ceacam6的癌細(xì)胞的特異性(圖1和圖2)。這些研究結(jié)果表明，l-dos47結(jié)合表達(dá)ceacam6的細(xì)胞系(bxpc-3、capan-1、zr-75-30和ls174t)，但不結(jié)合不表達(dá)的細(xì)胞系(mda-mb231)。此外，通過(guò)ceacam6在癌細(xì)胞中的敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了ceacam6的功能作用(圖3)。通過(guò)將ceacam6編碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到h23細(xì)胞中，ceacam6被過(guò)表達(dá)，而在bxpc-3細(xì)胞中通過(guò)小發(fā)夾rna介導(dǎo)的ceacam6缺失來(lái)進(jìn)行基因敲低。結(jié)合研究顯示，l-dos47以高親和力結(jié)合天然bxpc-3細(xì)胞，但不結(jié)合具有ceacam6基因敲低的bxpc-3細(xì)胞(圖3c)。相比之下，ceacam6在h23細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)使得該細(xì)胞對(duì)l-dos47結(jié)合和細(xì)胞毒性敏感(圖3a和圖3b)。這些結(jié)果表明，l-dos47與ceacam6抗原的特異性結(jié)合對(duì)于抗體綴合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性是重要的。相對(duì)于單獨(dú)抗體，將抗體與脲酶綴合的另一個(gè)好處是親合力的總體增加。ecl結(jié)合分析顯示，具有6-10個(gè)抗體比1個(gè)脲酶的摩爾綴合比的l-dos47與bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合，超過(guò)單一抗體與bxpc-3細(xì)胞的結(jié)合500倍(圖2b)。進(jìn)一步的結(jié)合研究表明，對(duì)于l-dos47結(jié)合ceacam6，大于6:1的抗體比酶的綴合比是最佳的(數(shù)據(jù)未顯示)。

通過(guò)體外研究和體內(nèi)研究調(diào)查了作用機(jī)制。脲酶是l-dos47的活性成分，以前的研究已經(jīng)證明在體外脲酶對(duì)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性(8)。對(duì)裸鼠的a549(肺)腫瘤和mcf-7(乳腺)腫瘤進(jìn)行脲酶瘤內(nèi)給藥，顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)(8)。然而，脲酶或l-dos47的細(xì)胞毒性也依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞系對(duì)氨的敏感性。例如，在圖1a中，l-dos47與bxpc-3、zr-75-30和capan-1的結(jié)合大致相同，但與其他兩種細(xì)胞系相比，capan-1顯示出中等的細(xì)胞毒性應(yīng)答(圖1b)。與bxpc-3和zr-75-30相比，capan-1對(duì)氨細(xì)胞毒性作用較不敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。類(lèi)似地，人肺腺癌h23細(xì)胞對(duì)氨的存在敏感；與bxpc-3細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)和a549細(xì)胞(圖3a)相比，盡管在細(xì)胞表面上呈現(xiàn)較少的ceacam6抗原，但一旦用ceacam6基因轉(zhuǎn)染，該細(xì)胞系變得對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性敏感(圖3b)?？傊?，對(duì)于l-dos47對(duì)腫瘤發(fā)揮細(xì)胞毒作用，在細(xì)胞表面表達(dá)ceacam6和對(duì)氨的敏感性是兩個(gè)重要的要求。

人癌癥組織的免疫組織化學(xué)篩選顯示，l-dos47對(duì)肺腺癌、結(jié)腸腺癌和胰腺癌是特異性的(表2)，但不針對(duì)相應(yīng)的正常組織。脲酶表面的多重抗體的綴合，大大增強(qiáng)了對(duì)ceacam6抗原的特異性(圖1a和圖2)，并且降低了該酶的非特異性結(jié)合性質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)。體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)了l-dos47對(duì)腫瘤異種移植物的療效。在對(duì)裸小鼠腫瘤異種移植物的l-dos47的靜脈內(nèi)注射給藥中(數(shù)據(jù)未顯示)和a549肺腺癌轉(zhuǎn)移研究中，觀察到腫瘤生長(zhǎng)抑制(表3)。在用10μg/ml或15μg/mll-dos47注射后3周的處理的a549細(xì)胞中，觀察到肺部病灶的顯著減少(表3)。然而，10周后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，這可能是由于來(lái)自動(dòng)物對(duì)l-dos47的清除。同種型對(duì)照(v21-dos47，抗vegfr2-dos47綴合物)也引起一定程度的肺部病灶的減少，盡管事實(shí)是a549細(xì)胞在正常條件下不表達(dá)vegfr2。ohwada等人(19)報(bào)道，在暴露于50mmhcl后的a549細(xì)胞中誘導(dǎo)了vegfr功能?？梢酝ㄟ^(guò)外源vegf給藥來(lái)恢復(fù)受損的a549細(xì)胞的抑制增殖，而加入中和性的抗-vegfr1抗體和抗-vegfr2抗體則重新抑制細(xì)胞增殖。然而，vegf抗體和抗-vegfr抗體都對(duì)對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有影響。不希望被理論束縛，在這種轉(zhuǎn)移研究中，可能在細(xì)胞制備過(guò)程中誘導(dǎo)a549細(xì)胞中的vegfr2功能。這解釋了為什么在同種型對(duì)照組中觀察到細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。來(lái)自體外研究和體內(nèi)研究的結(jié)果表明，抗體綴合至脲酶使得該抗體綴合物能夠以良好的選擇性和療效特異性靶向表達(dá)ceacam6的腫瘤，這為l-dos47的臨床開(kāi)發(fā)提供了概念證明。

實(shí)例2.在復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性非鱗狀nsclc(非小細(xì)胞肺癌)中的l-dos47劑量升高研究

這項(xiàng)研究的主要目的是，評(píng)估在具有第iv階段(tnmm1a和m1b)復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性非鱗狀非小細(xì)胞肺癌的患者中，與培美曲塞/卡鉑的標(biāo)準(zhǔn)雙效治療聯(lián)合的l-dos47劑量范圍的安全性、耐受性以及有效性。

主要療效判定指標(biāo)如下。不良事件患者的數(shù)量，作為與培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療的l-dos47安全性和耐受性的度量，是隨訪12周的參與者。這被指定為安全性問(wèn)題。ae報(bào)告期從第1周期的第1天開(kāi)始，直至最后的研究訪問(wèn)。次要療效判定指標(biāo)如下。根據(jù)recist1.1接受聯(lián)合治療的患者的客觀反應(yīng)率最長(zhǎng)為12周，并且未被指定為安全性問(wèn)題。在已經(jīng)完成了至少2個(gè)周期的研究治療并且具有至少1次治療后疾病評(píng)估的患者中，將根據(jù)1.1版本的recist評(píng)估客觀腫瘤反應(yīng)。接受持續(xù)臨床受益的患者數(shù)量隨訪達(dá)12周，并未被指定為安全性問(wèn)題。定義為與l-dos47+培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療后，達(dá)到完全應(yīng)答、部分應(yīng)答和穩(wěn)定疾病的患者百分比。與培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療給藥后，l-dos47的最大觀察血漿濃度(cmax)長(zhǎng)達(dá)12周，并未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療給藥后，出現(xiàn)l-dos47的最大觀察血漿濃度(tmax)的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12周，并未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中，確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療給藥后，l-dos47的濃度-時(shí)間曲線下面積(auc)長(zhǎng)達(dá)12周，未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療給藥后，l-dos47的終末消除半衰期長(zhǎng)達(dá)12周，并未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療，用l-dos47給藥的患者的抗l-dos47抗體的存在長(zhǎng)達(dá)12周，并被指定為安全性問(wèn)題。從用l-dos47給藥的所有患者中收集和分析血清樣品。

將進(jìn)行涉及培美曲塞和卡鉑+l-dos47的實(shí)驗(yàn)。患者將被招募到l-dos47升高劑量的群組中，每個(gè)群組最少3名患者，最多6名患者。l-dos47的起始劑量為0.59μg/kg；可評(píng)估的進(jìn)一步可能的劑量水平為0.78μg/kg、1.04μg/kg、1.38μg/kg和1.84μg/kg。分別與l-dos47聯(lián)合施用的培美曲塞[500mg/m²]和卡鉑[auc6]的護(hù)理劑量標(biāo)準(zhǔn)，將在群組間保持不變。治療周期為21天，患者在周期的第1天、第8天和15天接受l-dos47治療，并且在每個(gè)治療周期的第1天接受培美曲塞/卡鉑。計(jì)劃患者將接受4個(gè)周期l-dos47+培美曲塞/卡鉑的聯(lián)合治療。根據(jù)研究者的意見(jiàn)，只要有臨床益處并且耐受性良好，在4個(gè)周期聯(lián)合治療后疾病沒(méi)有發(fā)展的和沒(méi)有經(jīng)歷不可接受的毒性的患者，將有機(jī)會(huì)繼續(xù)接受l-dos47治療直到疾病進(jìn)展。根據(jù)研究者的意見(jiàn)，由于培美曲塞/卡鉑毒性而無(wú)法完成4個(gè)周期l-dos47+培美曲塞/卡鉑聯(lián)合治療的患者，只要有臨床益處并且耐受性良好，將有機(jī)會(huì)在停用培美曲塞/卡鉑后繼續(xù)接受l-dos47治療直到疾病進(jìn)展。

實(shí)施例3.用于治療非小細(xì)胞肺癌的免疫綴合物l-dos47的i期/ii期非盲、非隨機(jī)劑量升高研究

本研究的主要目的是，評(píng)價(jià)當(dāng)作為單一療法給予時(shí)，非鱗狀非小細(xì)胞肺癌患者的l-dos47劑量范圍的安全性、耐受性和有效性。

主要療效判定指標(biāo)如下。藥物相關(guān)不良事件的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，作為l-dos47的安全性和耐受性的度量長(zhǎng)達(dá)12周，并被指定為安全性問(wèn)題。在從第1周期第1天開(kāi)始，直到最后研究訪問(wèn)的ae報(bào)告期間評(píng)估這些結(jié)果。

主次療效判定指標(biāo)如下。在輸注后的第一個(gè)2小時(shí)期間的l-dos47相關(guān)毒性，是在輸注后的第一個(gè)2小時(shí)期間，并被指定為安全性問(wèn)題。通過(guò)ae和sae的發(fā)生率和嚴(yán)重程度以及生命體征的變化來(lái)評(píng)估這些結(jié)果。所有報(bào)告的不良事件和嚴(yán)重不良事件的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均在時(shí)間框架之下，即參與者將被隨訪12周和30天的隨訪期。這些結(jié)果被指定為安全性問(wèn)題，并從第1周期第1天開(kāi)始，直到最后研究訪問(wèn)的ae報(bào)告期間被評(píng)估。其他安全參數(shù)(臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)估、生命體征、體重、氧氣需求和12導(dǎo)聯(lián)心電圖)從基線的變化在直到12周的時(shí)間框架內(nèi)，并被指定為安全性問(wèn)題。安全參數(shù)包括臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)估、生命體征、重量、氧需求量和12導(dǎo)聯(lián)心電圖?？筶-dos47抗體隨時(shí)間推移評(píng)估長(zhǎng)達(dá)12周，并被指定為安全性問(wèn)題。從用l-dos47給藥的所有患者中收集和分析血清樣品。

其他療效判定指標(biāo)如下。在每個(gè)劑量水平下，l-dos47的最大觀察血漿濃度(cmax)在直到12周的時(shí)間框架內(nèi)，并未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在每個(gè)劑量水平下，出現(xiàn)l-dos47的最大觀察血漿濃度(tmax)的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12周，并未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在每個(gè)劑量水平下，測(cè)量l-dos47的濃度-時(shí)間曲線下面積(auc)長(zhǎng)達(dá)12周，并未指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在每個(gè)劑量水平下，l-dos47的終點(diǎn)消除半衰期在直到12周的時(shí)間框架內(nèi)，并未被指定為安全性問(wèn)題。將從收集自用l-dos47給藥的所有患者的血漿樣品中確定l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)?；颊邔⒈徽心嫉絣-dos47升級(jí)劑量的群組中，每個(gè)群組最少3名患者，最多6名患者。l-dos47的起始劑量為0.12μg/kg；進(jìn)一步可能的劑量水平包括0.21μg/kg、0.33μg/kg、0.46μg/kg、0.59μg/kg、0.78μg/kg、1.04μg/kg、1.38μg/kg、1.84μg/kg、2.45μg/kg、3.26μg/kg和4.33μg/kg。治療周期為21天，患者在第1周期的第1天和第8天接受l-dos47治療。

患者將被招募到群組中，每群組最少三名患者，最多六名患者。在隨后的患者可以進(jìn)行遞增之前，給定劑量水平的所有患者必須完成第1周期(3周的周期)。在安全性和可用的藥代動(dòng)力學(xué)(pk)數(shù)據(jù)已由試驗(yàn)指導(dǎo)委員會(huì)(tsc)審查后，將進(jìn)行劑量遞增至下一劑量水平的決定。遞增l-dos47將持續(xù)，直到達(dá)到最大耐受劑量(mtd)。在第一階段確定l-dos47的mtd后，最多可以招募20名患者(從i期開(kāi)始)來(lái)評(píng)估l-dos47的初步療效(即使用1.1標(biāo)準(zhǔn)版本(疾病進(jìn)展和生存)的實(shí)體腫瘤反應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)答率[recist])；監(jiān)測(cè)將包括每?jī)蓚€(gè)周期的放射學(xué)評(píng)估。也將進(jìn)一步評(píng)估l-dos47的安全性和耐受性。將收集l-dos47的藥代動(dòng)力學(xué)信息以及關(guān)于其活性的相關(guān)觀察結(jié)果。

對(duì)于所有患者，使用l-dos47的治療將持續(xù)，直到患者經(jīng)歷疾病進(jìn)展、不可接受的毒性，患者撤回同意或已經(jīng)完成了四個(gè)治療周期，并且不希望繼續(xù)進(jìn)行額外的周期，以先發(fā)生者為準(zhǔn)。四個(gè)周期后，根據(jù)研究者的意見(jiàn)，只要有持續(xù)的臨床益處并且耐受性好，患者可能會(huì)持續(xù)接受l-dos47。

實(shí)施例4：制備和表征用于治療非小細(xì)胞肺癌(nsclc)的駱駝科單結(jié)構(gòu)域抗體-脲酶綴合物

最常用的癌癥化療藥物的有效性，受到其狹窄的治療指標(biāo)和對(duì)腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性作用的限制。抗體定向酶前藥治療(adept)通過(guò)將抗體-酶綴合物遞送到腫瘤位點(diǎn)來(lái)改善選擇性，其中抗體-酶綴合物在腫瘤位點(diǎn)與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合，而剩余的未結(jié)合的綴合物從血流中消除[20]。一旦抗體-酶綴合物積累，前藥被施用并且在腫瘤部位通過(guò)抗體-酶綴合物的酶部分轉(zhuǎn)化為其活性細(xì)胞毒性形式，從而實(shí)現(xiàn)選擇性腫瘤細(xì)胞死亡。由于adept概念是由bagshawe于1987年引入的[20-22]，研究人員已經(jīng)應(yīng)用了這一概念的變化來(lái)開(kāi)發(fā)更有效和更具有特效的抗癌藥物[22-24]。開(kāi)發(fā)了不同代的半乳糖苷前藥和抗體-半乳糖苷酶綴合物，以減少全身毒性，同時(shí)增加活化藥物的細(xì)胞毒性[25]。改造人嘌呤核苷磷酸化酶的突變形式，以增強(qiáng)基于腺苷的前藥作為底物的特異性[26]。此外，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不同類(lèi)型的免疫酶輸注蛋白，以改善酶活性和抗體親合力[27-29]。

描述了l-dos47的制備和表征，其是具有每個(gè)天然脲酶分子約10個(gè)抗體的綴合比的單結(jié)構(gòu)域重組抗體與洋刀豆脲酶的化學(xué)綴合物。l-dos47免疫綴合物使用在腫瘤組織中天然豐富的尿素作為產(chǎn)生氨的前藥。afaikl2抗體與靶腫瘤細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原ceacam6[33]的選擇性結(jié)合導(dǎo)致尿素酶的積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞外尿素的水解以產(chǎn)生細(xì)胞毒性的氨，并產(chǎn)生不利于癌細(xì)胞的堿性環(huán)境[34]。由于綴合物的復(fù)雜性和大小，其可以具有高達(dá)680kda的分子量，因此開(kāi)發(fā)了綴合物化學(xué)、反應(yīng)和分離程序以應(yīng)對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)中的挑戰(zhàn)。由于脲酶具有選擇抗體的多個(gè)潛在的綴合位點(diǎn)，所以使用experionsds微通道凝膠電泳系統(tǒng)來(lái)表征l-dos47對(duì)藥物效力至關(guān)重要的綴合比[31,32]。通過(guò)尺寸排阻色譜法測(cè)定l-dos47綴合物純度。通過(guò)質(zhì)譜肽圖譜和蛋白質(zhì)印跡來(lái)表征l-dos47的化學(xué)特性。由于在單結(jié)構(gòu)域抗體的cdr3區(qū)域上攜帶伯胺(k32)，所以通過(guò)rp-hplc和maldi質(zhì)譜法測(cè)定抗體側(cè)的綴合位點(diǎn)的分布。還通過(guò)esi質(zhì)譜法表征抗體側(cè)和脲酶?jìng)?cè)的綴合位點(diǎn)。通過(guò)elisa評(píng)估綴合比對(duì)l-dos47結(jié)合ceacam6的親和力的影響。進(jìn)行體外研究，以確認(rèn)l-dos47結(jié)合及其在表達(dá)ceacam6的癌細(xì)胞系中引起細(xì)胞毒性的能力。

開(kāi)發(fā)和表征作為用于表達(dá)ceacam6的腫瘤的治療劑的免疫綴合物(l-dos47)。在大腸桿菌bl21(de3)pt7-7系統(tǒng)中表達(dá)靶向ceacam6的單結(jié)構(gòu)域抗體afaikl2。從洋刀豆磨粉中提取和純化高純度脲酶(hpu)。使用n-琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯(siab)作為交聯(lián)劑來(lái)活化afaikl2，然后將其與脲酶綴合。通過(guò)改變ph值來(lái)控制活化反應(yīng)和綴合反應(yīng)。在這些條件下，材料比率實(shí)現(xiàn)每個(gè)脲酶分子8-11個(gè)抗體的綴合比，殘留的游離脲酶含量幾乎可以忽略不計(jì)(<2％)，可以?xún)H使用超濾去除未反應(yīng)的抗體和水解的交聯(lián)劑制備高純度(>95％)的l-dos47綴合物。通過(guò)包括sec、iec、蛋白質(zhì)印跡、elisa和lc-ms^e肽圖譜的一組分析技術(shù)來(lái)表征l-dos47。隨著抗體-脲酶綴合比的增加，觀察到更高的結(jié)合信號(hào)。然而，在高于每脲酶6個(gè)抗體的綴合比下，效果較不明顯。通過(guò)在三種細(xì)胞系(bxpc-3、a549和mcf7)中篩選，證實(shí)l-dos47的特異性和細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)bxpc-3(表達(dá)ceacam6的細(xì)胞系)對(duì)l-dos47最為敏感。正在研究l-dos47作為在人i期臨床研究中用于非小細(xì)胞肺癌(nsclc)的潛在治療劑。

制備高純度尿素酶的中間體尿素酶(以下稱(chēng)為粗制尿素酶或dos47)，采購(gòu)自biovectrainc.(charlottetown，pecanada)。在用于綴合前，純化粗制脲酶以去除洋刀豆基質(zhì)蛋白污染物(如刀豆球蛋白和伴刀豆球蛋白a)。將粗制脲酶溶解在高純度水中，并用10mm乙酸、0.2mmedta(乙酸鹽-edta緩沖液)將ph值調(diào)至5.15，然后使用硅藻土503的漿液在真空下過(guò)濾。將濾餅用10mm乙酸鈉、1mmedta、ph值5.15的緩沖液洗滌，并在真空下干燥。將含脲酶的濾液冷卻至0-4℃，并通過(guò)加入冷凍乙醇分級(jí)分離至終濃度為25％(v/v)。將混合物攪拌15分鐘，然后使用洗滌的硅藻土503在真空下過(guò)濾。將濾餅用含有25％(v/v)乙醇的乙酸鹽-edta緩沖液洗滌，然后在真空下干燥。

將濾餅重新懸浮于乙酸鹽-edta緩沖液中，并將該漿液在真空下通過(guò)硅藻土過(guò)濾以收集濾液。所得濾餅用乙酸鹽-edta緩沖液洗滌，并在真空下干燥。將洗滌濾液和初始濾液通過(guò)0.65μm小皿過(guò)濾。使用兩個(gè)sartoriussartocon100000damwco聚醚砜膜，將該乙醇分級(jí)分離的脲酶濾液濃縮至～2x，隨后緩沖液更換為乙酸鹽-edta緩沖液。

將咪唑和tcep(三羥甲基氨基甲烷(2-羧乙基)磷化氫鹽酸鹽)，分別以20mm和1mm的終濃度加入到該培養(yǎng)基純度脲酶中，并將ph值調(diào)節(jié)至6.5。將蛋白溶液加載到用20mm咪唑、1mmtcep、ph值6.5的緩沖液(咪唑-tcep緩沖液)預(yù)平衡的deae-sepharosefastflow柱上。所有步驟以500ml/min的流速進(jìn)行。該柱用咪唑-tcep緩沖液洗滌，然后用含有80mmnacl的咪唑-tcep緩沖液洗滌，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。用含有180mmnacl的咪唑-tcep緩沖液洗脫脲酶。合并a280>0.1和sec的純度≥90-97％的級(jí)分。

使用兩個(gè)sartorioussartocon100000damwcopesu膜，將合并的級(jí)分濃縮至濃度為6-8mg/ml的目標(biāo)蛋白，然后對(duì)含有10mm乙酸鈉、1mmedta、ph值6.5的乙酸鹽-edta緩沖液進(jìn)行滲濾。該步驟的產(chǎn)率通常>起始活性的55％。表達(dá)和純化afaikl2藥物中間體，afaikl2抗體的氨基酸序列如圖5(seqidno.1)所示。

在大腸桿菌bl21(de3)pt7-7系統(tǒng)中表達(dá)抗體基因。將一個(gè)小瓶的主細(xì)胞庫(kù)，通過(guò)三個(gè)接種步驟無(wú)菌地接種到補(bǔ)充有50mg/l卡那霉素、1g/l葡萄糖、0.02g/lmgso4和0.01％biospumex消泡劑的350lluriahiveg(20g/l)試劑的500l發(fā)酵罐中?？刂圃撨^(guò)程以將溶解氧維持在>20％，溫度在37℃±2℃，背壓在5-20psi之間，ph值在7.0±0.2，od600在0.5-40之間和葡萄糖濃度在1-3g/l之間。一旦培養(yǎng)物達(dá)到7-10的od600，通過(guò)加入iptg至終濃度為1mm來(lái)誘導(dǎo)抗體表達(dá)，并允許持續(xù)6-8小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，洗滌并裂解以釋放包涵體，然后重懸于10倍體積的ph值6.8的50mm咪唑中。將細(xì)胞懸浮液分批均質(zhì)，并將勻漿首先通過(guò)75微米不銹鋼衛(wèi)生篩，然后通過(guò)最小壓力為10,000psi的微射流機(jī)總共三次，同時(shí)保持溫度低于10℃。將細(xì)胞裂解物離心，將不溶物質(zhì)合并，并且在均化作用下將沉淀重新懸浮于10倍體積的含有5mmdtt的1％tritonx-100中。通過(guò)離心收集洗滌的沉淀。重復(fù)該洗滌，然后用含有5mmdtt的ph值4.0的25mm乙酸鈉洗滌二次，以除去殘留的tritonx-100，并將沉淀緩沖至ph值4。

將含有洗滌的包涵體的沉淀，重新懸浮于8m尿素、25mmdtt、125mm乙酸鈉，ph值4.0的緩沖液中，然后用ross均質(zhì)器和架空混合器交替溶解，直至視覺(jué)外觀無(wú)進(jìn)一步變化，然后單獨(dú)用架空混合器總共混合3小時(shí)。將溶解的包涵體離心，將澄清的上清液以550ml/min加載到sp-sepharosexl柱上，該柱用在ph值4.0的125mm乙酸鈉中的8m尿素(sp平衡緩沖液)預(yù)平衡。加載澄清的上清液后，用平衡緩沖液洗滌柱，直到洗脫液a280降低到0.05以下，然后用在有50mmnacl的ph值4.0的乙酸鈉中的8m尿素緩沖液洗滌，直到洗脫液a280降低到0.05以下。將泵速降低到275ml/min，并將3cv的含有25mm乙酸鈉、180mmnacl、ph值4.0的8m尿素緩沖液施加到柱上，以洗脫afaikl2。合并a280>0.4和a280/a260比例>1.5的級(jí)分，并分析其純度和蛋白含量。該步驟的百分產(chǎn)率通常為35％-45％。用sp平衡緩沖液將合并的物料稀釋至≤2.5g/l，用ph值8.0的2mtris-cl將ph值調(diào)節(jié)至8.0，加入dtt至2.5mm，并將調(diào)節(jié)池混合60分鐘以完全還原變性蛋白。然后將變性蛋白溶液在ph值8.5的含有25mmtris-cl的重折疊緩沖液中稀釋至小于0.1mg/ml的最終蛋白濃度。重新折疊在2-8℃進(jìn)行，并通過(guò)ellman測(cè)定和c18反相hplc進(jìn)行跟蹤，直到游離巰基的水平<0.75μm，并且僅檢測(cè)到完全氧化的蛋白。

將重折疊的蛋白溶液加載到用ph值6.8的25mm咪唑預(yù)平衡的q-sepharosexl柱上，并用平衡緩沖液洗滌柱直到a280<0.05，然后用含有50mmnacl的ph值6.8的25mm咪唑洗滌，直至a280<0.01。然后用含有150mmnacl的ph值6.8的25mm咪唑洗脫蛋白，收集級(jí)分直到a280≤0.3。合并級(jí)分以產(chǎn)生不低于97％純度和產(chǎn)率不低于45％的目標(biāo)池。然后使用具有hydrosart再生纖維素5000mwco柱的uf/df系統(tǒng)，將池濃縮至3-5g/l，隨后與ph值7.0的10mm磷酸鹽緩沖液進(jìn)行緩沖液交換并凍干。

綴合化學(xué)

分兩步進(jìn)行綴合(圖6)。在第一步中，通過(guò)與siab的nhs酯部分反應(yīng)來(lái)活化afaikl2上的伯胺基團(tuán)。在第二步中，通過(guò)siab的碘乙酰胺末端將活化的afaik2與尿素酶上的巰基偶聯(lián)。如圖6所示，l-dos47綴合產(chǎn)物的合成是兩步反應(yīng)。步驟1是使用siab活化抗體，步驟2涉及活化的抗體與脲酶的綴合，以形成生物綴合物l-dos47。

afaikl2抗體的活化。將凍干的afaikl2(25g)溶于注射用水(wfi)中。將siab(2.00g)溶于無(wú)水dmf中，并且以三等份加入到afaikl2溶液中，每次加入后攪拌60分鐘。在最終加入siab1小時(shí)后，通過(guò)加入超過(guò)原始添加量的siab的10×摩爾過(guò)量的甘氨酸，來(lái)終止任何剩余的未反應(yīng)的nhs基團(tuán)。為了除去水解的和甘氨酸猝滅的siab，使用sartorioussartocon5000damwco將反應(yīng)溶液濃縮至10mg/ml的afaikl2，隨后緩沖液更換為ph值6.5的10mm乙酸鈉、1mmedta的緩沖液。

活化的抗體與脲酶的綴合。將高純度脲酶(50g)與活化的afaikl2在ph值6.5的10mm乙酸鈉、1mmedta緩沖液中混合。然后通過(guò)加入ph值8.5的1m硼酸鈉使ph值達(dá)到8.3，其允許活化的抗體上的碘乙?；c脲酶上可用的半胱氨酸殘基反應(yīng)。使反應(yīng)在攪拌下進(jìn)行90分鐘。然后通過(guò)加入超過(guò)原始添加量的siab的10×摩爾過(guò)量的半胱氨酸來(lái)終止未反應(yīng)的碘乙酰基，并將該溶液混合60分鐘。為了除去未綴合的afaikl2，使用100000damwcosartorioussartocon，將l-dos47濃縮至6mg/ml的目標(biāo)，然后緩沖液交換為ph值6.8的10mml-組氨酸、2.2mmedta的緩沖液。加入蔗糖至1％w/v的終濃度，并用ph值6.8的10mml-組氨酸、2.2mmedta緩沖液將l-dos47稀釋至為1.8g/l的目標(biāo)濃度。

用于純度評(píng)估的尺寸排阻色譜法(sec)。使用有empower2軟件的具有996pad的waters2695hplc系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。在210-400±4nm處記錄色譜圖，提取280nm的信號(hào)進(jìn)行處理。在superose6100/300gl柱(ge)上進(jìn)行分離。在10mm磷酸鹽、50mmnacl、0.2mmedta，ph值7.2的緩沖液中洗脫蛋白。在注射100μl純樣品后，以0.5ml/min的恒流進(jìn)行分離。柱在室溫下運(yùn)行，而樣品溫度控制在5±2℃。

用于殘留脲酶的離子交換色譜法(iec)。使用具有996pad和empower軟件的waters2695hplc系統(tǒng)。在210-400nm±4nm處采集色譜圖，提取280nm處的信號(hào)進(jìn)行處理。將柱(mono-q5/50gl，ge)在室溫下運(yùn)行，同時(shí)將樣品溫度控制在5±2℃。洗脫緩沖液含有50mm乙酸鹽、0.025％聚山梨酯80(超純hx2，nofcorporation，tokyo)，有(緩沖液b)或無(wú)(緩沖液a)0.70mnacl，ph值5.5。在注射樣品之前，將柱用15％緩沖液b和85％緩沖液a以1ml/min流速(6cv)平衡6分鐘。洗滌周期(15％緩沖液b，以1.0ml/min進(jìn)行6分鐘)后，用15-60％緩沖液b的梯度在20分鐘內(nèi)以0.5ml/min流速洗脫蛋白。用100％緩沖液b以1.0ml/min清洗6分鐘后，在下一次樣品注入之前，將該柱用15％緩沖液b重新平衡。將800μl純的l-dos47樣品摻有hp脲酶參照標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到最終百分比為0-8％w/w，并且注入50μl/樣品。使用標(biāo)準(zhǔn)加法作為校準(zhǔn)方法，將峰高用于計(jì)算殘留脲酶含量。

將experionsds微通道凝膠電泳用于測(cè)定綴合比。使用bioradexperion自動(dòng)電泳系統(tǒng)和bioradsds凝膠電泳試劑盒(pro260試劑盒)，分析l-dos47綴合比。將樣品用tris-hcl緩沖液(10mm，0.2mmedta，ph值7.0)稀釋至0.5mg/ml的目標(biāo)蛋白濃度，然后將4μl稀釋的樣品或分子量梯子與2μl樣品緩沖液混合并短暫離心。將樣品在70℃加熱10分鐘，然后在用凝膠染色溶液引發(fā)該系統(tǒng)和通道之后，將樣品加載到微通道芯片上。experion軟件自動(dòng)記錄電泳圖。

通過(guò)sds-page凝膠電泳來(lái)分離用于鑒定表征l-dos47測(cè)試樣品和afaikl2/hpu對(duì)照的蛋白質(zhì)印跡，然后使用invitrogeniblot系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。由平行運(yùn)行的凝膠制成重復(fù)的印跡。需要使用兔抗-afaikl2igg一抗(rockland)的檢測(cè)和使用與堿性磷酸酶(ap)(sigma)綴合的山羊抗兔igg的二次檢測(cè)一起確認(rèn)afaikl2的身份。需要使用兔抗脲酶igg一抗(rockland)的檢測(cè)和使用與ap(sigma)綴合的山羊抗兔igg的二次檢測(cè)一起確認(rèn)脲酶的身份。對(duì)于使用抗afaikl2igg的檢測(cè)，將l-dos47樣品在含有0.1mg/mlbsa的1×tbs中稀釋至0.002mg/ml，然后與蛋白凝膠上樣緩沖液1:1混合，加熱至70℃持續(xù)10分鐘，每泳道加載0.01μg的l-dos47。對(duì)于使用抗-脲酶igg的檢測(cè)，將l-dos47樣品在含有0.1mg/mlbsa的1×tbs中稀釋至0.02mg/ml，然后與蛋白凝膠上樣緩沖液1:1混合，加熱至70℃持續(xù)10分鐘，每泳道加載0.1μg的l-dos47。用含有nbt/bcip的ap緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡的最終顯影。

具有不同綴合比的l-dos47的elisa

為了研究綴合比對(duì)l-dos47與其靶向抗原ceacam6結(jié)合的親和力的影響，通過(guò)調(diào)節(jié)綴合過(guò)程中的afaikl2/hpu摩爾比，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下產(chǎn)生具有不同綴合比的l-dos47綴合物。通過(guò)sds-experion測(cè)定所得綴合物的綴合比，并使用總蛋白試劑盒(sigma，tp0200)通過(guò)microlowry測(cè)定蛋白濃度。用100μl/孔的ceacam6-a(ceacam6全抗原的結(jié)構(gòu)域a)(pbs中為2.5μg/ml)包被微量滴定板，并在室溫下孵育6小時(shí)。將平板用緩沖液a(pbs中的0.05％bsa)洗滌兩次，用150μl/孔的3％bsa/pbs于4℃封閉過(guò)夜，然后用緩沖液a洗滌兩次。所有后續(xù)步驟在室溫下進(jìn)行，伴有輕輕搖動(dòng)。加入l-dos47(100μl/孔)并孵育2小時(shí)，將平板用緩沖液a洗滌3次，然后加入100μl/孔的抗-脲酶igg(1：12000，rockland)并孵育1小時(shí)。用緩沖液a洗滌三次后，加入100μl/孔的山羊抗-兔igg-ap(1：6000，sigma)并孵育1小時(shí)。用緩沖液a洗滌三次后，加入100μl/孔的ap底物溶液，并孵育25分鐘。在405nm處測(cè)定吸光度。

確定afaikl2抗體上的活化位點(diǎn)

為了制備熒光素標(biāo)記的半胱氨酸(cys-fl)，將半胱氨酸過(guò)量與nhs-酯熒光素(pierce)在1m硼酸鹽(ph值8.0)中于室溫下反應(yīng)60分鐘。通過(guò)rp-hplc用c8柱分離反應(yīng)溶液。通過(guò)maldi質(zhì)譜法鑒定cys-fl峰級(jí)分，并根據(jù)其在493nm和ph值7下的消光系數(shù)通過(guò)光譜法確定其濃度。將峰級(jí)分等分試樣凍干，并在-20℃的黑暗中儲(chǔ)存。首先用siab交聯(lián)劑在實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；罨痑faikl2抗體，并通過(guò)內(nèi)部制備的g25脫鹽柱除去水解的siab。使活化的抗體與熒光素標(biāo)記的半胱氨酸(cys-fl)在ph值8.3的100mm硼酸緩沖液中于室溫下反應(yīng)90分鐘。通過(guò)g25脫鹽柱將反應(yīng)溶液與30mm碳酸氫銨緩沖液交換，將得到的afaikl2-cys-fl在含有20％乙腈的30mm碳酸氫銨中稀釋至0.5-0.8mg/ml。加入胰蛋白酶(promega)達(dá)到20:1的最終蛋白與胰蛋白酶的比例，并在37℃進(jìn)行消化36小時(shí)。通過(guò)加入0.1mtcep將胰蛋白酶消化物還原至2mm的終濃度，然后通過(guò)反相hplc分離(具有zobax300sb-c18柱(5μm，4.6x150mm)的agilent1100系統(tǒng)，在55分鐘內(nèi)從0至45％的乙腈的梯度、0.025％tfa)，并在420nm處記錄吸收。因?yàn)閍faikl2上的siab活化的賴(lài)氨酸與熒光素標(biāo)記的半胱氨酸連接，所以不可能被胰蛋白酶接近，并且應(yīng)該產(chǎn)生肽(xnkxm)-cys-fl。收集含有熒光素修飾肽的峰級(jí)分，并應(yīng)用反射模式(micromasstof2e)的maldi-質(zhì)譜。使用相應(yīng)肽的hplc峰面積來(lái)計(jì)算每個(gè)活化位點(diǎn)的分布百分比。

通過(guò)esi質(zhì)譜法進(jìn)行綴合肽的肽作圖和鑒定。使用watersxevog2qtof質(zhì)譜儀和具有beh300c18柱(1.7μm，2.1x150mm)的acquineuplc系統(tǒng)h級(jí)。將每個(gè)l-dos47樣品(1.5-2.0mg/ml，50.0μl)與0.063±0.003g胍-hcl混合。該鹽完全溶解后，加入1.50μl的0.7mdtt并將溶液在60℃下孵育30分鐘。加入10.0μl的0.20m碘乙酰胺(iaa)，并用飽和的tris-base溶液將ph值調(diào)至8.0-8.5。將樣品在37℃下孵育60分鐘。將50.0μl每個(gè)烷基化樣品與15.0μl的0.1mcacl2和80.0μl的tris緩沖液(50mmtris-hcl，ph值8.0)混合，然后加入3.00μl的0.5mg/ml胰蛋白酶溶液。在37℃進(jìn)行胰蛋白酶消化20-24小時(shí)。經(jīng)胰蛋白酶消化后，將50.0μl消化物與0.50μl純甲酸混合，以用于lc-ms分析。將柱溫度設(shè)定為60℃，并將溶劑a(在水中的0.075％v/v甲酸)和溶劑b(在乙腈中的0.075％甲酸)用于uplc分離。以0.15ml/min的流速，在80分鐘內(nèi)從0至55％溶劑b的梯度進(jìn)行uplc。

由masslynxv4.1軟件控制lc-ms分析。在50-2000da的m/z范圍內(nèi)以分辨率模式進(jìn)行l(wèi)c-ms^etic(總離子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)采集，掃描速率為0.3/s，毛細(xì)管電壓為3.0kv，樣品錐電壓為25v，提取錐電壓為4.0kv。隨著碰撞能量從20v增加至40v，進(jìn)行高能碰撞誘導(dǎo)的碎片tic數(shù)據(jù)采集。離子源溫度設(shè)定在100℃，去溶劑化溫度設(shè)定在300℃。去溶劑氣流量為600l/小時(shí)。用100fmole/μlglu-fibb以3.0μl/分鐘的流速獲得實(shí)時(shí)鎖定質(zhì)量tic原始數(shù)據(jù)集(掃描/20s)。

在分辨率為20000的肽圖模式下，用biopharmalynx(v1.2)處理質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)。應(yīng)用785.8426da的鎖定質(zhì)量，進(jìn)行實(shí)時(shí)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)質(zhì)量校準(zhǔn)。低能ms離子強(qiáng)度閾值設(shè)定在3000個(gè)計(jì)數(shù)，而ms^e高能離子強(qiáng)度閾值設(shè)定為300個(gè)計(jì)數(shù)。將ms數(shù)據(jù)集和ms^e數(shù)據(jù)集的質(zhì)量匹配公差設(shè)置為15ppm。將afaikl2氨基酸序列和脲酶氨基酸序列輸入到肽匹配/鑒定的序列文庫(kù)中。將可變修飾劑(包括脫酰胺n、脫酰胺琥珀酰亞胺n、氧化m、氧化2xm、+k、+na和氨基甲酰甲基c(用于烷基化半胱氨酸)的固定修飾劑)用于肽圖分析。為了鑒定afaikl2側(cè)的綴合肽，將脲酶的含半胱氨酸肽加上交聯(lián)劑siab(c9h7o2n，161.0477da)的連接部分作為可變修飾劑產(chǎn)生，并被包含在可變修飾劑庫(kù)中。在這種情況下，包括氨基甲酰甲基c作為可變修飾劑。為了鑒定脲酶?jìng)?cè)的綴合肽，將afaikl2的賴(lài)氨酸中間肽xnkxm加上siab的連接部分作為可變修飾劑產(chǎn)生，并被包含在可變修飾劑庫(kù)中。

l-dos47的全細(xì)胞結(jié)合測(cè)定

通過(guò)在96孔培養(yǎng)板中接種100μl/孔的mcf-7細(xì)胞、bxpc-3細(xì)胞和a549細(xì)胞(4×10⁴細(xì)胞/孔)并在37℃孵育過(guò)夜來(lái)制備細(xì)胞單層。然后從平板中去除培養(yǎng)基，并在室溫(rt)下用100μl/孔的在pbs中的0.05％戊二醛將細(xì)胞單層固定10分鐘。然后用pbs洗滌平板，并加入120μl/孔的50mm甘氨酸。在37℃下孵育20分鐘后，將平板用120μl/孔的1％bsa/pbs在37℃封閉30分鐘。然后將平板用緩沖液a(pbs中0.05％bsa)洗滌3次，加入80μl/孔的稀釋的l-dos47或dos47，并在37℃下孵育1.5小時(shí)。將平板用緩沖液a洗滌4次，加入在ph值7.6、0.1mpbs中的80μl/孔的20mm尿素，并在37℃下孵育30分鐘。孵育后，加入40μl/孔的1nhcl以停止反應(yīng)。使用改進(jìn)的靛酚測(cè)定法測(cè)定每個(gè)孔中產(chǎn)生的氨的量。簡(jiǎn)言之，通過(guò)將165mg苯酚和132mgnaoh溶解在10ml水中，然后加入66μl硝普鈉溶液(10mg/ml)制備新鮮的溶液a。通過(guò)向5ml水中加入40μl次氯酸鈉制備溶液b。將來(lái)自全細(xì)胞結(jié)合測(cè)定的樣品溶液(每個(gè)30μl)，轉(zhuǎn)移到含有50μl/孔的5nnaoh:h2o(3.3:46.7)和20μl/孔水的新的96孔板中。加入溶液a(50μl/孔)和溶液b(50μl/孔)，然后將平板轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上，在37℃顯色30分鐘。在630nm處測(cè)量od值。使用0至150mm氯化銨作為標(biāo)準(zhǔn)品，從校準(zhǔn)曲線計(jì)算在所述孔中產(chǎn)生的氨的量。

l-dos47的細(xì)胞毒性測(cè)定。通過(guò)在96孔培養(yǎng)板中接種100μl/孔的mcf-7細(xì)胞、bxpc-3細(xì)胞和a549細(xì)胞(4×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔)并在37℃下孵育過(guò)夜來(lái)制備細(xì)胞單層。然后從平板中去除培養(yǎng)基，加入80μl/孔的稀釋的l-dos47或dos47，并在37℃下進(jìn)一步孵育2小時(shí)。孵育后，將平板用kr-ii緩沖液/0.05％bsa洗滌3次，并加入100μl/孔的20mm尿素溶液。將平板在37℃下孵育過(guò)夜，然后去除培養(yǎng)基并用100μl/孔普通培養(yǎng)基替換。使用mts細(xì)胞活力測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞活力，其中制備21:1v/v的mts/pes(mts：2mg/ml；pes：1mg/ml)的溶液，并將20μl/孔的混合物加入平板中。然后將平板在37℃下孵育1小時(shí)，并在6300nm處測(cè)量od值，參考490nm處的od值。

洋刀豆脲酶是由六個(gè)相同的約91kda的亞基組成的六聚酶，每個(gè)亞基具有15個(gè)游離的半胱氨酸殘基。afaikl2抗體含有7個(gè)伯胺和一個(gè)二硫鍵?？贵w上的伯胺和脲酶上的半胱氨酸殘基是通過(guò)異雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)綴合的基礎(chǔ)。然而，綴合物的分子大小和兩種蛋白的性質(zhì)在綴合產(chǎn)物的大規(guī)模制備、純化和表征方面造成了挑戰(zhàn)。用作腸胃外藥物時(shí)，該免疫綴合物在生理ph附近的水性介質(zhì)中必須是可溶的和穩(wěn)定的；因此，重組抗體的等電點(diǎn)(pi)需要仔細(xì)的序列設(shè)計(jì)，因?yàn)殡迕甘菑闹参飦?lái)源提取的并且其pi(觀察到的pi為4.8-5.1)不能被改變。優(yōu)化以確保反應(yīng)均勻性并去除殘留反應(yīng)物和副產(chǎn)物對(duì)綴合化學(xué)至關(guān)重要。雖然幾種交聯(lián)劑[24,30]被廣泛用于蛋白綴合并且在開(kāi)發(fā)過(guò)程中進(jìn)行篩選，但是由于兩個(gè)交聯(lián)反應(yīng)最適ph值的差異，選擇n-琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯(siab)用于l-dos47綴合物制備。在制備過(guò)程中，在ph值7.0時(shí)用交聯(lián)劑活化抗體，然后緩沖交換至ph值6.5并與脲酶混合。然后通過(guò)將反應(yīng)介質(zhì)的ph值升高至8.3，將抗體與脲酶連接。因?yàn)檫B接活化的afaikl2與脲酶的反應(yīng)速率在ph值6.5時(shí)非常低，通過(guò)在ph值6.5下預(yù)混合來(lái)確保大反應(yīng)容器中的材料均勻性。因此，殘留游離脲酶的分布和脲酶-(ab)x的亞種類(lèi)僅由概率和物質(zhì)摩爾比決定。在8-11抗體/脲酶的綴合比下，殘留脲酶含量理論上可以忽略，并且可以使用超濾法純化l-dos47綴合物以除去未反應(yīng)的抗體和水解的交聯(lián)劑。l-dos47綴合物、游離afaikl2和游離脲酶的大小排阻色譜圖，如圖7所示。

l-dos47綴合物在～24.6分鐘時(shí)洗脫，二聚體(可能通過(guò)二硫鍵連接或被以?xún)蓚€(gè)siab活化的afaikl2分子連接)在20.5分鐘時(shí)作為小的未分離峰洗脫，并且聚合物在空白時(shí)間(～15分鐘)作為痕量峰值洗脫。在～40分鐘的痕量峰代表緩沖液成分。l-dos47綴合峰寬度稍大于但是與游離尿素酶的峰寬相當(dāng)，表現(xiàn)出均勻分布的綴合反應(yīng)。游離抗體在37分鐘時(shí)洗脫?？贵w峰前面的小的未分離峰代表非共價(jià)二聚體。通常在制備批次中觀察到高純度的抗體(>95％)，其高分子量物質(zhì)種類(lèi)包括不超過(guò)5％的二聚體。hpu通常在～26.9分鐘時(shí)洗脫主峰，在24分鐘時(shí)洗脫小二聚體峰和在15分鐘時(shí)洗脫痕量聚合物峰。將粗制脲酶純化為hpu產(chǎn)生～97％的單體，而二聚體和聚合物的總和不超過(guò)3％。通常僅使用超濾進(jìn)行簡(jiǎn)單純化即可達(dá)到95％以上的l-dos47純度。因?yàn)閟ec在天然條件下運(yùn)行，它可以確定由于蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的降解和解離而導(dǎo)致的有效分子量的變化；因此，該方法也用作l-dos47的穩(wěn)定性指示試驗(yàn)。使用離子交換色譜法評(píng)估l-dos47中殘留游離脲酶的存在(圖8)。

殘留游離脲酶在15.33分鐘時(shí)洗脫，這非常接近摻入的脲酶峰(15.42分鐘)。hpu峰從大型l-dos47峰(1.48的rs)得到很好的分離。如圖8的插圖所示，測(cè)定殘留脲酶含量的標(biāo)準(zhǔn)添加方法(摻有2.4％、4.8％和7.2％w/whpu的l-dos47)，顯示出良好的線性(0.9995的r²)。該樣品計(jì)算的殘留脲酶含量為0.72％，并且殘留脲酶在迄今為止的所有制備批次中都沒(méi)有超過(guò)2％，證明在這些條件下殘留脲酶實(shí)際上可以忽略不計(jì)，并且制備過(guò)程不需要額外的步驟以從非綴合的脲酶中分離l-dos47綴合物。

在l-dos47制備期間，六個(gè)單體脲酶亞單位中的每一個(gè)可以與0個(gè)、1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)afaikl2分子綴合；因此，在變性條件下，l-dos47的sds-experion產(chǎn)生從～90-155kda的多個(gè)離散峰/帶的圖案。另外，在抗體活化反應(yīng)期間，可以用每個(gè)抗體分子(afaikl2-(siab)2)的兩個(gè)siab隨機(jī)活化一小部分抗體，這導(dǎo)致這些抗體分子中的每一個(gè)與脲酶的兩個(gè)亞單位綴合。因此，單抗體雙亞基會(huì)產(chǎn)生范圍從200-260kda較小的第二組未良好分離的峰/條帶。

在圖9中，圖塊2描繪了虛擬凝膠圖像，圖塊1包含了泳道1和4的電泳圖的疊加。泳道1-2和7-8中的l-dos47實(shí)驗(yàn)室規(guī)模樣品是用在第二綴合反應(yīng)之前通過(guò)離子交換色譜法純化的活化的afaikl2制備的。因?yàn)槿コ薬faikl2-(siab)2種類(lèi)，所得到的綴合物缺少相互交聯(lián)的亞基，并且僅觀察到一組峰/帶。在第3-6泳道的l-dos47樣品中，afaikl2在活化步驟后無(wú)需另外純化而直接用于綴合，因此存在小的第二組峰/帶。泳道9和10用hpu樣品過(guò)載。

峰面積(圖9，圖塊1)和帶強(qiáng)度(圖9，圖塊2)取決于與相應(yīng)數(shù)量的抗體分子連接的脲酶亞基的相對(duì)豐度。峰面積在基線校正后通過(guò)軟件積分，并且l-dos47綴合比(cr)計(jì)算如下(參見(jiàn)圖10，來(lái)自圖9的凝膠的泳道2的示意圖)：

cr＝6*(pk1*0+pk2*1+pk3*2+pk4*3+pk5*4)/(pk1+pk2+pk3+pk4+pk5)

其中pki(i＝1-5)是與i-1抗體分子連接的脲酶亞單位的峰面積。

因?yàn)樵诖笠?guī)模制備l-dos47期間，活化的抗體不進(jìn)行離子交換色譜純化，所以在這些樣品的電泳圖中出現(xiàn)第二組未良好分離的峰。然而，因?yàn)榛罨稽c(diǎn)分布由概率和抗體與siab的摩爾比確定，兩組峰預(yù)期具有相似的強(qiáng)度模式。因?yàn)闂l帶未良好分離并與260kda分子量標(biāo)記物重疊，因此第二組峰不用于計(jì)算綴合比。雖然afaikl2-(siab)2種類(lèi)理論上可以通過(guò)連接到來(lái)自不同天然脲酶分子的兩個(gè)亞基來(lái)產(chǎn)生二聚體綴合物或多聚體綴合物，但在l-dos47樣品尺寸排阻色譜圖中觀察到的組合的二聚體和多聚體峰面積的最小水平(小于3％)(圖7)表明，大多數(shù)afaikl2-(siab)2種類(lèi)有助于單個(gè)天然脲酶分子的亞基間連接以產(chǎn)生單體l-dos47，而不是分子間連接以產(chǎn)生二聚體綴合物和多聚體綴合物。此外，sec色譜圖中這些二聚體峰和多聚體峰的存在可以在邏輯上歸因于二硫鍵，因?yàn)轭?lèi)似的峰也出現(xiàn)在hp脲酶的尺寸排阻色譜圖中。因此，電泳圖中的第二組峰不用作質(zhì)量控制的參數(shù)。

l-dos47的綴合比對(duì)于其對(duì)ceacam6(抗體所靶向的腫瘤抗原)的親和力至關(guān)重要。通過(guò)調(diào)節(jié)afaikl2/hp脲酶摩爾比來(lái)產(chǎn)生具有不同綴合比(每個(gè)脲酶1.8至12個(gè)afaik)的l-dos47，以評(píng)估綴合比對(duì)結(jié)合親和力的影響。發(fā)現(xiàn)l-dos47對(duì)固定化ceacam6-a的結(jié)合親和力，與綴合到脲酶的抗體數(shù)量直接成正比(圖11)。綴合的抗體越多，觀察到結(jié)合信號(hào)越高。然而，綴合比為6以上時(shí)效果較差。

通過(guò)雙重蛋白質(zhì)印跡分析l-dos47(圖12)，證實(shí)了通過(guò)sds-experion看到的條帶圖案。插圖框顯示了主要印跡的加框區(qū)域的放大，其中脲酶和綴合物(n1-n4分別對(duì)應(yīng)于具有1至4個(gè)綴合的afaikl2的脲酶)被標(biāo)記。當(dāng)用抗脲酶抗體探測(cè)時(shí)，91kda脲酶帶是最強(qiáng)烈可見(jiàn)的，并且較高分子量帶(對(duì)應(yīng)于更高度綴合的種類(lèi))的強(qiáng)度降低。相比之下，當(dāng)用抗afaikl2抗體探測(cè)時(shí)，91kda條帶幾乎不可見(jiàn)，接下來(lái)的兩個(gè)較高分子量條帶是最強(qiáng)烈的(n1和n2)。這是由于它們是綴合物中的優(yōu)勢(shì)帶的事實(shí)。通過(guò)抗-afaikl2和抗-脲酶抗體兩者可以顯現(xiàn)l-dos47的能力，證明了綴合物中兩個(gè)種類(lèi)都存在，抗體的特異性通過(guò)以下事實(shí)證實(shí)：抗-afaikl2抗體不與脲酶結(jié)合，抗-脲酶抗體不與afaikl2結(jié)合。

因?yàn)閘-dos47是afaikl2和脲酶的化學(xué)綴合物，所以應(yīng)該從綴合物的胰蛋白酶消化物中檢測(cè)來(lái)自抗體和脲酶的胰蛋白酶肽以及兩種蛋白的共價(jià)交聯(lián)的肽。進(jìn)行esilc-ms^e肽作圖以表征該綴合物。如相關(guān)內(nèi)容所示，來(lái)自afaikl2的肽出現(xiàn)在l-dos47譜中，但不在hp脲酶譜中。從l-dos47的胰蛋白酶消化物中，afaikl2的氨基酸序列和脲酶氨基酸序列的肽覆蓋率為100％，典型質(zhì)量誤差小于6ppm，并且通過(guò)具有小于±15ppm質(zhì)量誤差的其高能ms/msb/y碎片離子確認(rèn)每種肽。

為了鑒定afaikl2的活化位點(diǎn)并確定每個(gè)綴合位點(diǎn)的分布，使用siab活化afaikl2，然后綴合到熒光素標(biāo)記的半胱氨酸(cys-fl)上。在胰蛋白酶消化所得afaikl2-cys-fl后，通過(guò)rp-hplc色譜進(jìn)行分離，收集峰級(jí)分用于maldi-ms，以鑒定cys-fl連接的抗體胰蛋白酶肽。因?yàn)橹挥衧iab活化的位點(diǎn)可以連接到cys-熒光素，其中0.025％tfa中的最大吸收波長(zhǎng)為420nm，所以在420nm處應(yīng)該僅檢測(cè)到活化的肽峰。例如，如果afaikl2的賴(lài)氨酸#32被siab活化，則應(yīng)該連接到cys-fl，并且在胰蛋白酶消化期間將會(huì)漏掉該胰蛋白酶消化位點(diǎn)；因此，應(yīng)該觀察到分子量為2768.113da的峰，其代表cys-fl連接的賴(lài)氨酸中間肽(lscaahdpifdk32nlmgwg)-cys-fl(seqidno：7)，表示為l2k32-cys-fl。afaikl2-cys-fl的胰蛋白酶消化物的rp-hplc色譜圖，如圖13所示。

具有檢測(cè)到的質(zhì)量值的鑒定的綴合肽，也在圖13中的相應(yīng)hplc峰處標(biāo)記。根據(jù)抗體的氨基酸序列，來(lái)自六個(gè)賴(lài)氨酸殘基的伯胺和n-末端胺在理論上可用用于活化反應(yīng)。然而，實(shí)際上只有四個(gè)被活化了。這最有可能是由于抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)暴露了表面上的那些四個(gè)伯胺，同時(shí)將其他伯胺埋在天然結(jié)構(gòu)內(nèi)部。根據(jù)其峰面積和圖13中所有確定的hplc峰面積的總和，計(jì)算每個(gè)活化位點(diǎn)的分布(表4)。

表4.afaikl2上每個(gè)活化位點(diǎn)的hplc峰面積和分布百分比

如表4所示，對(duì)于交聯(lián)劑，抗體的最活躍位點(diǎn)是l2k76，其次是l2m1，然后是l2k44。l2k32對(duì)于抗體結(jié)合是必不可少的，也是最不活躍的位點(diǎn)，但仍占總反應(yīng)性的～18％。對(duì)于l-dos47，交聯(lián)劑活化的afaikl2與暴露于脲酶四級(jí)結(jié)構(gòu)表面的半胱氨酸殘基共價(jià)連接。因此，應(yīng)該從l-dos47的胰蛋白酶消化物的肽譜中檢測(cè)共價(jià)交聯(lián)的肽。

為了鑒定那些共價(jià)交聯(lián)的肽，通過(guò)biopharmalynx處理來(lái)自l-dos47樣品的胰蛋白酶消化物的esilc-ms^e原始數(shù)據(jù)，但用含有用于脲酶?jìng)?cè)的所有15個(gè)半胱氨酸殘基的一組用戶(hù)創(chuàng)建的修飾劑的可變修飾劑庫(kù)進(jìn)行搜索。根據(jù)表4中的活化分布，這些用戶(hù)創(chuàng)建的修飾劑是三種賴(lài)氨酸中間肽加上siab的連接部分(c9h5o2n，159.0320da)(表示為l2k76、l2k44和l2k32)，以及n-末端甲硫氨酸加上連接(表示為l2m1)。結(jié)果(相關(guān)內(nèi)容的細(xì)節(jié))證明，在每個(gè)脲酶亞基的15個(gè)半胱氨酸殘基中，僅6個(gè)是基本上綴合的。最容易獲得的半胱氨酸是uc824，其次是uc663、uc59、uc207、uc329和uc268。脲酶活性必不可少的半胱氨酸殘基cys592是基本上不綴合的。四個(gè)交聯(lián)劑活化的afaikl2位點(diǎn)對(duì)脲酶?jìng)?cè)的六個(gè)半胱氨酸殘基中每一個(gè)的相對(duì)可用性也是不同的。例如，uc329只能接近l2m1。這些基本的綴合位點(diǎn)也通過(guò)其ms/ms片段譜確認(rèn)。作為實(shí)例，通過(guò)將綴合肽l2k32uc663作為用來(lái)自afaikl2側(cè)的(lscaahdpifdknlmgwgr(seqidno：8))-連接-(2346.0674da)作為修飾劑來(lái)修飾的脲酶肽(seqidno：9)cdssdndnfr進(jìn)行搜索，以2.1ppm的質(zhì)量匹配誤差鑒定綴合肽l2k32uc663，其序列為(lscaahdpifdknlmgwgr(seqidno：8)-連接-(cdssdndnfr(seqidno：9)，并且具有3517.4873的肽質(zhì)量。通過(guò)將肽作為用來(lái)自脲酶?jìng)?cè)的連接-(cdssdndnfr(seqidno：9))(1330.4520da)作為修飾劑來(lái)修飾的afaikl2肽lscaahdpifdknlmgwgr(seqidno：8)進(jìn)行搜索，以2.1ppm的質(zhì)量匹配誤差還鑒定了同樣的肽。通過(guò)將綴合肽作為用來(lái)自afaikl2側(cè)的修飾劑來(lái)修飾的脲酶肽進(jìn)行搜索，繪制了具有來(lái)自脲酶?jìng)?cè)的9個(gè)b/y片段離子的該綴合肽的高能量碰撞誘導(dǎo)的ms/ms光譜。通過(guò)將肽作為具有用來(lái)自脲酶?jìng)?cè)的修飾劑的afaikl2肽進(jìn)行搜索，還繪制了從afaikl2側(cè)具有14個(gè)b/y離子的同樣的光譜。

在bxpc-3細(xì)胞系、a549細(xì)胞系和mcf7細(xì)胞系中，觀察到不同的l-dos47結(jié)合分布圖(圖14)。結(jié)果顯示，l-dos47與胰腺細(xì)胞系bxpc-3結(jié)合良好，表明在細(xì)胞表面表達(dá)了ceacam6抗原。在肺細(xì)胞系a549中觀察到中等結(jié)合，但在乳腺細(xì)胞系mcf7中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)結(jié)合。當(dāng)與脲酶(dos47)綴合時(shí)，afaikl2抗體提供了針對(duì)表達(dá)ceacam6的細(xì)胞的特異性靶向。這是通過(guò)用非綴合的dos47對(duì)照處理的三種細(xì)胞系中沒(méi)有結(jié)合信號(hào)證實(shí)的。

bxpc-3細(xì)胞對(duì)l-dos47細(xì)胞毒性非常敏感(圖15)，如用小于1μg/ml的l-dos47處理細(xì)胞時(shí)，觀察到的細(xì)胞存活的快速下降所示。在a549細(xì)胞中觀察到中度細(xì)胞毒性，而在mcf7中沒(méi)有觀察到作用，與結(jié)合研究的結(jié)果一致。此外，陰性對(duì)照dos47對(duì)任何細(xì)胞系都沒(méi)有細(xì)胞毒性作用。

在其大規(guī)模制備中成功應(yīng)用了開(kāi)發(fā)用于l-dos47免疫綴合物的綴合和純化的方法。使用已建立的綴合化學(xué)和反應(yīng)條件，通過(guò)將交聯(lián)劑活化的抗體與hp脲酶中間體預(yù)混合，然后調(diào)節(jié)ph值以活化綴合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了良好的均勻性。在每個(gè)脲酶分子8-11個(gè)抗體的綴合比下，殘留的脲酶含量幾乎可以忽略不計(jì)，并且可以?xún)H使用超濾法純化l-dos47綴合物以除去未反應(yīng)的抗體和水解的交聯(lián)劑，并且避免了從最終免疫綴合物分離殘留脲酶的挑戰(zhàn)步驟。該方法產(chǎn)生高純度的l-dos47產(chǎn)物(>95％)，游離脲酶低于2％。通過(guò)elisa評(píng)估l-dos47對(duì)固定化ceacam6-a的結(jié)合親和力，與綴合脲酶的抗體數(shù)目直接成正比，并且當(dāng)綴合比大于6時(shí)結(jié)合親和力達(dá)到平衡。對(duì)所有大規(guī)模批量，綴合比具有每個(gè)脲酶分子9至11個(gè)抗體的范圍，證明在這些條件下已經(jīng)實(shí)現(xiàn)最佳綴合。雙抗體蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了該綴合物的化學(xué)特性。esilc-ms^e肽圖譜分析獲得了來(lái)自l-dos47免疫綴合物的抗體和脲酶的100％序列回收率。通過(guò)相應(yīng)肽的ms/msb/y片段圖譜證實(shí)了包括afaikl2和脲酶的c末端序列和n末端序列的具有多于3個(gè)氨基酸殘基的肽序列。通過(guò)l-dos47樣品的esilc-ms^e肽圖譜分析，鑒定了有效綴合位點(diǎn)(afaikl2側(cè)4個(gè)，脲酶?jìng)?cè)6個(gè))。通過(guò)來(lái)自抗體側(cè)和脲酶?jìng)?cè)的相關(guān)肽的ms/msb/y片段圖譜，證實(shí)了這些交聯(lián)肽。

通過(guò)與抗體綴合的l-dos47的對(duì)應(yīng)物相對(duì)的dos47不存在結(jié)合活性和細(xì)胞毒活性，闡明了l-dos47對(duì)表達(dá)ceacam6的兩種細(xì)胞系bxpc-3和a549的特異性。在測(cè)試的三種細(xì)胞系中，bxpc-3顯示出最強(qiáng)的結(jié)合信號(hào)，而a549僅顯示中度結(jié)合。bxpc-3的結(jié)合信號(hào)約為a549的結(jié)合信號(hào)的5倍。該結(jié)果與細(xì)胞毒性測(cè)定中觀察到的結(jié)果一致。l-dos47誘導(dǎo)了對(duì)bxpc-3明顯高于對(duì)a549的細(xì)胞殺傷作用。由于缺乏l-dos47結(jié)合，在mcf-7中沒(méi)有觀察到細(xì)胞毒性應(yīng)答。正在研究l-dos47作為用于非小細(xì)胞肺癌人類(lèi)i期臨床研究中的潛在治療劑。

應(yīng)當(dāng)理解，雖然已經(jīng)結(jié)合上述方面描述了本公開(kāi)，但是前述描述和實(shí)施例旨在說(shuō)明而不是限制本公開(kāi)的范圍。在本公開(kāi)的范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和修改對(duì)于本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。

本公開(kāi)的范圍不應(yīng)受所描述的具體方面的限制，這些具體方面旨在作為本公開(kāi)的各個(gè)方面的單一說(shuō)明，并且在功能上等同的任何組合物或方法都在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本公開(kāi)的精神或范圍的情況下，可以在本公開(kāi)的方法和組合中進(jìn)行各種修改和變化。因此，本公開(kāi)旨在覆蓋該公開(kāi)的修改和變化，只要它們?cè)谒綑?quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)。

在本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體和單獨(dú)地指明通過(guò)引用并入。

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序列表

<110>赫利克斯生物藥品公司

<120>用于治療目的的抗體-脲酶綴合物

<130>105013-1610

<140>

<141>

<150>62/107,210

<151>2015-01-23

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>122

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成多肽

<400>1

metaspvalglnleuglnalaserglyglyglyvalvalglnprogly

151015

glyserleuargleusercysalaalahisaspproilepheasplys

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

serglyglyglyglugluaspaspglylys

115120

<210>2

<211>840

<212>prt

<213>洋刀豆(canavaliaensiformis)

<400>2

metlysleuserproarggluvalglulysleuglyleuhisasnala

151015

glytyrleualaglnlysargleualaargglyvalargleuasntyr

202530

thrglualavalalaleuilealaserglnilemetglutyralaarg

354045

aspglyglulysthrvalalaglnleumetcysleuglyglnhisleu

505560

leuglyargargglnvalleuproalavalprohisleuleuasnala

65707580

valglnvalglualathrpheproaspglythrlysleuvalthrval

859095

hisaspproileserarggluasnglygluleuglnglualaleuphe

100105110

glyserleuleuprovalproserleuasplysphealagluthrlys

115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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370375380

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420425430

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435440445

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450455460

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485490495

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500505510

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515520525

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565570575

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580585590

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610615620

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690695700

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725730735

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740745750

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755760765

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770775780

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785790795800

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805810815

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835840

<210>3

<211>50

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成多肽

<400>3

ileglnasnproalaseralaasnargseraspprovalthrleuasn

151015

valleutyrglyproaspglyprothrileserproserlysalaasn

202530

tyrargproglygluasnleuasnleusercyshisalaalaserasn

354045

propro

50

<210>4

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成多肽

<400>4

gluileglnasnproalaseralaasnargserasp

1510

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成寡核苷酸

<400>5

aaggcgaaagagtggatggcaacagtcta29

<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成寡核苷酸

<400>6

aagaagcaaccggacagttccatgtatac29

<210>7

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成多肽

<400>7

leusercysalaalahisaspproilepheasplysasnleumetgly

151015

trpglycys

<210>8

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成多肽

<400>8

leusercysalaalahisaspproilepheasplysasnleumetgly

151015

trpglyarg

<210>9

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述:合成多肽

<400>9

cysaspserseraspasnaspasnphearg

1510