本發(fā)明涉及可用于藥物遞送系統(tǒng)的碳硅烷樹枝狀體，和藥物遞送系統(tǒng)用可聚集載體。
背景技術(shù)：
：如今，已經(jīng)開發(fā)了各種疾病治療藥物，特別是諸如抗體、肽適體和核酸等生物聚合物作為下一代藥物已經(jīng)引起關(guān)注。在諸如制造工序中的品質(zhì)控制、藥物制品的儲存和施用方法等各點上，生物聚合物應(yīng)該與包含低分子量化合物作為活性成分的常規(guī)藥物進(jìn)行不同地處理。通常，取決于待治療的疾病和藥物的性質(zhì)，當(dāng)施用藥物制品時，待遞送至靶位點的活性成分的量影響響應(yīng)率。具體而言，已知當(dāng)施用包含生物聚合物作為活性成分的藥物時，施用時抗體根據(jù)劑型而產(chǎn)生的問題降低了所施用藥物的功效和治療效果。因此，已經(jīng)積極開發(fā)各種藥物遞送系統(tǒng)(drugdeliverysystems，dds：藥物遞送系統(tǒng))，作為將藥物制品適當(dāng)遞送到靶部位的方法。作為用于dds的載體，例如，提及例如脂質(zhì)體和塑料珠等。作為使用這樣的用于dds的載體的藥物制品，例如，報道了由脂質(zhì)體組成的那些，所述脂質(zhì)體結(jié)合有與在靶部位中的定位分子特異性結(jié)合的配體(參見專利文獻(xiàn)1和2)；脂質(zhì)體或合成聚合物珠，其上暴露有n-乙?；咸前坊蚱渌?參見專利文獻(xiàn)3和4)，以及結(jié)合有抗體的膠束(參見專利文獻(xiàn)5)等。另外，開發(fā)了具有膠束結(jié)構(gòu)的利用樹枝狀體的載體(參見專利文獻(xiàn)6、7和8)。術(shù)語“樹枝狀體”是一個通用詞，表示樹枝狀聚合物化合物具有規(guī)則的分支結(jié)構(gòu)，其起源是希臘術(shù)語“樹枝”(樹)。數(shù)種樹枝狀體分子組裝成球形形式，在其內(nèi)部具有納米尺度的空間。于是，由于引入分子以在該空間中顯示各種官能團(tuán)，所以具有較高的設(shè)計靈活性。因此，目前在納米
技術(shù)領(lǐng)域：
積極開發(fā)各種新型的樹枝狀體。樹枝狀體可用作用于dds的載體或在生物系統(tǒng)中響應(yīng)外部刺激的分子傳感器。迄今為止，為了預(yù)防和/或治療由病毒或細(xì)菌感染引起的疾病，例如，已經(jīng)開發(fā)了利用樹枝狀體的載體(參見專利文獻(xiàn)9)另一方面，已知具有噻咯基的樹枝狀體顯示通常產(chǎn)生熒光發(fā)射的aie(聚集誘導(dǎo)發(fā)射)。此處，術(shù)語“aie”定義為相互聚集的發(fā)光化合物在被一定波長的光照射之后產(chǎn)生高效發(fā)光的現(xiàn)象(參見非專利文獻(xiàn)1)。然而，不知道在化合物與熒光蛋白結(jié)合后產(chǎn)生類似的發(fā)光?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)[專利文獻(xiàn)][專利文獻(xiàn)1]wo2005/011632[專利文獻(xiàn)2]wo2005/011633[專利文獻(xiàn)3]jp2007-1923a[專利文獻(xiàn)4]jp2009-46414a[專利文獻(xiàn)5]jp2014-73975a[專利文獻(xiàn)6]jp2001-206885a[專利文獻(xiàn)7]jp2005-120068a[專利文獻(xiàn)8]jp2007-238860a[專利文獻(xiàn)9]jp562988b[非專利文獻(xiàn)][非專利文獻(xiàn)1]chemcommun(camb).2009年8月7日；(29):4332-53.doi：10.1039/b904665h.epub2009年5月13日技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的問題如上所述，用于dds的載體的研究正在踴躍地進(jìn)行中；然而，幾乎不可能有效地轉(zhuǎn)運生物聚合物而不損害其性質(zhì)。具體而言，施用途徑中口服施用至生物體，作為活性成分的生物聚合物既不會遞送至腸道也不被腸道吸收，除非能防止載體被胃酸(強(qiáng)酸)分解。另外，靜脈內(nèi)施用(靜脈內(nèi)注射)可以將藥物以高濃度推注到血流中。然而，難以將所施用的藥物以有效濃度遞送至靶部位，這是因為：血液中的藥物迅速分解或排泄至尿中從而降低其血液濃度；其積累在肝中；或者其停留在血液流動中而沒有靶向。遞送至除靶部位之外的其它部位的藥物量的增加可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用?；蛘?，頻繁施用少量藥物對于患者和保健專業(yè)人員都是負(fù)擔(dān)。例如，在前者中，左旋多巴(用于帕金森病的藥物制品)提供的響應(yīng)速率低，因為其通過血腦屏障的通過量太低而不能產(chǎn)生影響。另一方面，左旋多巴的施用量增加導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，這實際上發(fā)生過，這是因為靶向部位是腦的左旋多巴被位于其它位置的酶分解。結(jié)果，使得難以繼續(xù)進(jìn)一步的治療。此外，作為除了引入較高分子量的藥物(生物聚合物)的性質(zhì)之外的性質(zhì)，此類載體需要與所施用的生物體的相互作用最小(生物相容性)。另外，要求其具有另一性質(zhì)，即在遞送至靶部位的同時保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而保存所引入的分子(活性成分)，然后將其從載體中迅速地釋放。對于具有此類性質(zhì)和特性的載體存在強(qiáng)烈的社會需求，因為所述載體迄今為止尚未實現(xiàn)。最近，開展了用于dds的利用諸如天然納米顆粒等外泌體或細(xì)胞(例如紅細(xì)胞)的靶向性質(zhì)和生物相容性的研究。然而，封裝技術(shù)尚未完成，因此尚未實際應(yīng)用。已知在包括有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合溶劑的條件下，樹枝狀體形成其內(nèi)具有由疏水性部分組成的結(jié)構(gòu)的膠束和其內(nèi)具有由親水性部分組成的結(jié)構(gòu)的反膠束。如上所述，在過去，已經(jīng)研究了是否實際使用由在其側(cè)鏈末端攜帶親水性基團(tuán)的碳硅烷樹枝狀體組成的膠束；其中提及的親水性基團(tuán)例如有糖、氨基酸、親水性分子，并且它們保持在膠束外表面上。為了形成膠束，樹枝狀體分子基本上包括內(nèi)部親水性基團(tuán)。然而，不可能在體內(nèi)觀察攜帶親水性基團(tuán)的樹枝狀體是否被遞送至所靶向的組織。原因是aie膠束雖然發(fā)光，但依賴于環(huán)境，光很弱。另一方面，認(rèn)為用蛋白質(zhì)置換保持在分子上的親水性基團(tuán)是非常困難的，因為它們的分子量極其不同，并且根據(jù)溶劑的條件(例如其ph和其鹽濃度等)，蛋白質(zhì)容易變性。因此，對于作為用于確認(rèn)遞送至靶向組織或在所述部位從藥物中釋放的量并估計其量的工具的復(fù)合分子，存在強(qiáng)烈的社會需求。所述復(fù)合分子應(yīng)該由攜帶具有強(qiáng)熒光發(fā)射的生物聚合物(例如熒光蛋白)的碳硅烷樹枝狀體組成，該生物聚合物具有生物靶向能力或生物相容性，并且其應(yīng)該具備靶向組織、在所述部位從藥物釋放以及通過利用兩種熒光分子之間的相互作用評估其量的能力。解決問題的手段本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)：在水性溶劑或由水性溶劑和有機(jī)溶劑組成的混合溶劑中，通過利用硫醇和鹵代烷基之間的反應(yīng)，混合含有噻咯的碳硅烷樹枝狀體和用于標(biāo)記的蛋白質(zhì)(例如綠色熒光蛋白)產(chǎn)生可聚集分子，并且可聚集分子形成其中蛋白質(zhì)在可聚集分子外側(cè)的膠束。此處，水性溶劑含有溶質(zhì)，例如鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水等。此外，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，攜帶在樹枝狀體上的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)膠束形成。此外，他們發(fā)現(xiàn)，混合蛋白質(zhì)、碳硅烷樹枝狀體和模型藥物產(chǎn)生內(nèi)包模型藥物的膠束。作為模型藥物的實例，例如提及色素和抗體等。另外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)：攜帶熒光蛋白的含有噻咯的樹枝狀體在鹽水中發(fā)光；并且發(fā)射現(xiàn)象由熒光共振能量轉(zhuǎn)移fret引起。此外，他們還發(fā)現(xiàn)由攜帶熒光蛋白的含有噻咯的碳硅烷樹枝狀體所形成的膠束具有約50nm～500nm的內(nèi)徑尺寸；并且具有所述內(nèi)徑尺寸的膠束可以包括各種藥物。本發(fā)明在如上所述的情況下完成，其目的是提供一種能夠引入具有各種分子量的化合物和生物聚合物的碳硅烷樹枝狀體，使用該碳硅烷樹枝狀體的用于dds的藥物，以及其制造方法。本發(fā)明包括以下方面。本發(fā)明的一個方面是藥物遞送系統(tǒng)用可聚集材料，其包含以下式(i)所示的可聚集材料：[化學(xué)式1](r1)1e1[((-r5-e2)(r2)m)k(-r3-s-r4-y)3-m]4-l(i)此處，e1是碳、硅和鍺中的任一種，并且它們可以彼此相同或不同。e2是硅或鍺，并且可以彼此相同或不同。r1是可以含有雜原子的相同或不同的烴基，并且在某些情況下其可以包括e1以形成環(huán)。r2表示相同或不同的烴基，或可以含有環(huán)的烴鏈。r3、r4和r5表示相同或不同的烴鏈，并且它們可以含有氧、氮、羰基、醚基或酰胺基。y表示鹵素基團(tuán)。l為的整數(shù)。m為的整數(shù)。k為0或1，并且當(dāng)k為0時，3-m為1。另外，優(yōu)選的是e1和e2都是硅，k是1，l是2，并且m是0。此外，r1優(yōu)選是以下式(ii)中所示的噻咯基，r1含有e1以形成環(huán)。此處，在式(ii)中優(yōu)選的是x是硅，r是苯基，并且n是4。[化學(xué)式2]另外，優(yōu)選的是在式(i)中((-r5-e2)(r2)m)k是-(ch2)3-si-，并且((-r3-s-r4-y)3-m是(-(ch2)3-y)3。更優(yōu)選的是，式(i)中所示的可聚集分子是以下式(iii)中所示的可聚集分子。[化學(xué)式3]優(yōu)選的是，可聚集分子還包含經(jīng)由硫原子結(jié)合的靶向序列提示部(targetedsequencepresentedpart，tspp)，所述硫原子置換至少一個y位置。另外，優(yōu)選的是，可聚集分子能夠在水性溶劑中通過相互聚集而形成直徑為50～500nm尺寸的膠束。此處，式(i)中所示的可聚集分子是式(iv)～(ix)中所示的化合物。[化學(xué)式4][化學(xué)式5][化學(xué)式6][化學(xué)式7][化學(xué)式8][化學(xué)式9]此處，靶向序列提示部優(yōu)選由具有靶向識別部位的蛋白質(zhì)組成。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選是選自由白色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白和綠色熒光蛋白組成的組中的熒光蛋白。另外，靶向識別部位優(yōu)選是用于將由藥物遞送系統(tǒng)用可聚集載體材料形成的膠束遞送至靶向組織的功能肽中的任一種。靶向組織優(yōu)選是選自由具有炎癥的正常組織、其上表達(dá)有不期望基因的組織、其上表達(dá)有不期望基因的細(xì)胞和由腫瘤細(xì)胞組成的組織組成的組中的任何組織。本發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明，可以制備用于dds的可聚集載體材料，該可聚集載體材料用來產(chǎn)生用于遞送藥物等的載體。通過使用所述載體材料，即可聚集分子，可以制備在dds中使用的藥物載體，即，膠束。附圖說明圖1是顯示一般碳硅烷樹枝狀體的基本式(basicformula)的示意圖。圖2是顯示從二甲基硅烷合成二甲基啞鈴(dumbbell)(1)6-br的合成方案的圖。圖3是顯示所制備膠束的粒徑分布的圖。圖4是通過使用掃描電子顯微鏡觀察到的所制備膠束的典型電子顯微鏡照片。圖5是顯示通過將gfp和式(x)中所示的噻咯樹枝狀體的復(fù)合體(下文中，將其稱為“gfp-噻咯樹枝狀體復(fù)合體”)、僅gfp、或者僅式(x)中所示的噻咯樹枝狀體溫育而獲得的產(chǎn)物的發(fā)光性質(zhì)的圖。圖6是顯示在模型藥物的存在下制備的膠束的粒徑分布的圖。圖7是顯示當(dāng)膠束由gfp-噻咯樹枝狀體復(fù)合體組成并且其包含dil時的發(fā)光性質(zhì)的圖。所述膠束在360nm激發(fā)。圖8是顯示當(dāng)膠束由gfp-噻咯樹枝狀體復(fù)合體組成并且其包含用alexa594標(biāo)記的wga時的發(fā)光性質(zhì)的圖。所述膠束在360nm激發(fā)。圖9是在不同退火溫度下進(jìn)行反向pcr后，反向pcr產(chǎn)物的電泳凝膠圖像。圖10是顯示結(jié)合有靶肽序列的聚集熒光蛋白驅(qū)動的膠束的熒光光譜的測定結(jié)果的圖。圖11是顯示結(jié)合有mcf-7的靶肽序列的聚集熒光蛋白驅(qū)動的膠束的粒徑分布的圖。具體實施方式以下詳細(xì)地解釋本發(fā)明。本發(fā)明是藥物遞送系統(tǒng)用可聚集載體材料，其包含如上所述的下式(i)所示的可聚集分子。[化學(xué)式10](r1)1e1[((-r5-e2)(r2)m)k(-r3-s-r4-y)3-m]4-l(i)此處，式(i)所示的化合物優(yōu)選含有：(a)下式(ii)中所示的噻咯基(此處，r1含有e1以形成環(huán))；[化學(xué)式11](b)如-(ch2)3-si-的(-r5-e2)(r2)m)k，和如(-(ch2)3-y)的(-r3-s-r4-y)3-m，因為在水性溶劑中形成適當(dāng)尺寸的膠束。本發(fā)明的碳硅烷樹枝狀體(以下有時稱為“噻咯樹枝狀體”)進(jìn)一步優(yōu)選為具有以下結(jié)構(gòu)的化合物，因為其允許包含可聚集性質(zhì)和后述的靶向序列提示部。[化學(xué)式12]典型碳硅烷樹枝狀體的結(jié)構(gòu)示于圖1a～1c。圖1a所示的化合物稱為扇(0)3，其具有被圈圍繞的核。圖1b中的化合物稱為啞鈴(1)6，其中兩個圖1a中所示的扇(0)3與替代核的具有兩個甲基的硅(me-si-me)結(jié)合。圖1c所示的化合物稱為球(1)6。其具有球形形式，并且由結(jié)構(gòu)與扇(0)3相同的分子組成，但是核不與啞鈴的si(me-si-me)結(jié)合，其中啞鈴的甲基被置換。本發(fā)明的碳硅烷樹枝狀體的結(jié)構(gòu)與常規(guī)碳硅烷樹枝狀體的結(jié)構(gòu)完全不同，與分子末端結(jié)合的溴原子之一涉及與靶向序列提示部形成鍵。此處，從能夠進(jìn)行由樹枝狀體構(gòu)成的dds用藥物的特異性遞送的角度出發(fā)，靶向序列提示部優(yōu)選為具有靶向識別部位的蛋白質(zhì)。另外，優(yōu)選的是構(gòu)成靶序列的蛋白質(zhì)具有位于折疊蛋白外側(cè)的硫醇基。由于硫醇基與樹枝狀體中含有的鹵素原子反應(yīng)以起到結(jié)合蛋白質(zhì)和樹枝狀體的作用，位于折疊蛋白質(zhì)側(cè)面的硫醇基團(tuán)可能不參與形成鍵。此處，“具有硫醇基的蛋白質(zhì)”包含原本具有硫醇基的蛋白質(zhì)、具有利用基因工程技術(shù)等新引入的硫醇基的蛋白質(zhì)，以及具有由含半胱氨酸的蛋白質(zhì)中的半胱氨酸的還原產(chǎn)生的硫醇基的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)中硫醇基的位置沒有特別限制。然而，有時優(yōu)選硫醇基位于蛋白質(zhì)的特定區(qū)域中。注意，含半胱氨酸的蛋白質(zhì)中的半胱氨酸可以是利用基因工程技術(shù)(例如用半胱氨酸置換現(xiàn)有的任意氨基酸、將其插入預(yù)定位置等)插入到預(yù)定位置的那些。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，容易通過使用已知的基因工程方法如定點誘變等在蛋白的期望位置引入半胱氨酸殘基。構(gòu)成靶向序列提示部的蛋白質(zhì)優(yōu)選具有締合(association)特性(以下有時稱為“締合性”)，并且其沒有特別限定。然而，優(yōu)選使用綠色熒光蛋白(以下有時統(tǒng)稱為“gfp”，包括發(fā)射除綠色以外的熒光的以下熒光蛋白)及其變體。由于結(jié)合有熒光蛋白的碳硅烷樹枝狀體通過蛋白質(zhì)的締合而發(fā)射強(qiáng)烈的熒光，因此易于檢測締合狀態(tài)。作為本發(fā)明中使用的gfp，例如可以提及序列表中序列號1所示的gfp，序列號2所示的gfp，作為藍(lán)色熒光蛋白的序列表中序列號3所示的bfp，序列表中序列號4所示的yfp，等等，以及由clontechlaboratories，inc.提供的cfp、rfp和其它變體gfp，等等。除此之外，可以使用序列表中序列號5所示的源自discosoma(泡泡菇珊瑚)的熒光蛋白。然而，優(yōu)選使用序列表中序列號1所示的gfp，因為其具有強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，并且易于處理。另外，此類gfp可以通過使用已知的方法制備，例如參考biochem.biophys.acta1679(2004)222-229；biochem.biophys.res.commun.330(2005)454-460等。此外，gfp可以采用通過外包給蛋白質(zhì)制造公司生產(chǎn)的gfp。當(dāng)用于形成本發(fā)明的可聚集載體的樹枝狀體由作為框架的含有引起aie效果的官能團(tuán)(例如噻咯等)的分子以及作為靶向序列提示部的締合性蛋白質(zhì)(例如熒光蛋白)組成，由此形成膠束時，聚集的噻咯也發(fā)射熒光。結(jié)果，在締合的熒光蛋白和聚集的噻咯之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret：熒光共振能量轉(zhuǎn)移)，使熒光變強(qiáng)。當(dāng)膠束塌陷時，fret消失。因此，當(dāng)利用本發(fā)明制造的膠束用作藥物遞送用載體時，可以通過使用fret的變化作為指標(biāo)來監(jiān)測其體內(nèi)狀態(tài)。此外，此類監(jiān)視使得能夠跟蹤載體的位置及其狀態(tài)。為了引起熒光蛋白和噻咯枝體狀之間的fret，熒光蛋白在噻咯樹枝狀體上的固定位置是重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地通過初步實驗等確定蛋白質(zhì)上與樹枝狀體結(jié)合的位置。當(dāng)gfp用作熒光蛋白時，優(yōu)選結(jié)合與n-末端區(qū)域、c-末端區(qū)域、n-末端區(qū)域和c-末端區(qū)域中的一個區(qū)域鄰接的環(huán)區(qū)域。優(yōu)選的是在該區(qū)域中存在具有硫醇基的諸如半胱氨酸等氨基酸。此處，n-末端區(qū)域中的結(jié)合是指，從核心部位突出的部分(例如由位于接近n-末端的10個氨基酸組成的部分)與噻咯樹枝狀體結(jié)合。與c-末端的情況相同，從核心部位突出的部分(例如由靠近n-末端的10個氨基酸組成的部分)與噻咯樹枝狀體結(jié)合。在本發(fā)明的噻咯樹枝狀體上攜帶的鹵素基團(tuán)的位置沒有特別限定。然而，優(yōu)選位于噻咯樹枝狀體的側(cè)鏈上。更優(yōu)選的是，如式(iii)所示，其位于距離噻咯基最遠(yuǎn)位置的側(cè)鏈末端。如上所述，用于本發(fā)明方法的噻咯樹枝狀體例如是以上式(i)中所示的化合物。接下來，根據(jù)k、l和m的組合，式(i)中所示的噻咯樹枝狀體可以具有各種結(jié)構(gòu)。其典型化合物示于下式。[化學(xué)式13](r1)e1(-r3-s-r4-y)3(ia)[化學(xué)式14]e1(-r3-s-r4-y)4(ib)[化學(xué)式15](r1)2e1[(-r5-e2(-r3-s-r4-y)3]2(ic)[化學(xué)式16]e1[-r5-e2(-r3-s-r4-y)3]4(id)其中，在式(ia)、(ib)、(ic)和(id)，e1是碳、硅和鍺中的任一種，并且可以彼此相同或不同；e2是硅或鍺，并且可以彼此相同或不同；r1表示烴基；r3、r4和r5表示相同或不同的烴鏈，所述烴鏈可以含有氧、氮、羰基、醚基或酰胺基中的任一種；y表示鹵素基團(tuán)。作為式(i)中所示的化合物，例如，可以使用式(iii)中所示的化合物。所述化合物可以例如按照方案1所示，經(jīng)由已知的中間體18通過噻咯核2(1，1-二芳基-2，3，4，5-四苯基噻咯)從1,2-二苯基乙炔(diphenylacetylen)合成。接下來，利用h2ptcl6-6h2o作為催化劑通過以三氯硅烷將2硅氫化，然后使用芳基鎂溴化物進(jìn)行格式反應(yīng)，從而獲得噻咯核樹枝狀體3。所獲得的噻咯核樹枝狀體3用二氯己基硼烷處理，然后在堿性水性溶液中用過氧化氫進(jìn)行水解，從而獲得六羥基衍生物4。隨后，將六羥基衍生物進(jìn)行o-甲磺?；?，以用溴陰離子置換，從而獲得化合物5(tetrahedronlett.,200748:4365-4368)。[化學(xué)式17]構(gòu)成靶向序列提示部的具有靶向識別部位的蛋白質(zhì)不受限制，只要其具有締合性質(zhì)即可。然而，蛋白質(zhì)優(yōu)選為選自白色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白和綠色熒光蛋白組成的組中的任何一種熒光蛋白。這是因為它們?nèi)菀踪徺I，并且具有高強(qiáng)度熒光，因此它們產(chǎn)生fret以產(chǎn)生強(qiáng)熒光。此處，藍(lán)色熒光蛋白包括發(fā)射藍(lán)色或青色熒光的任何一種。本發(fā)明的可聚集分子通過下述制備：將具有硫醇基的蛋白質(zhì)(其是靶向序列提示部)和式(iii)中所示的在側(cè)鏈具有鹵素基團(tuán)的樹枝狀體化合物混合，然后將混合物溫育以使蛋白質(zhì)的硫醇基和樹枝狀體化合物的鹵素基團(tuán)反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)與樹枝狀體化合物結(jié)合。此時，期望用還原劑(例如dtt)預(yù)先處理蛋白質(zhì)以使-sh基團(tuán)保持在非氧化狀態(tài)。方案1顯示通過使用所述反應(yīng)引入一個gfp分子的反應(yīng)。[化學(xué)式18]例如，方案1中所示的反應(yīng)可以在合適的溶劑中進(jìn)行，例如水性溶劑，如pbs，鹽水等。這種情況下的反應(yīng)條件取決于所用的蛋白質(zhì)。反應(yīng)溫度可以在所用蛋白質(zhì)的變性溫度下，例如0℃～50℃，優(yōu)選30℃～45℃，更優(yōu)選約37℃。當(dāng)使用gfp時，反應(yīng)性可以溫度依賴性地升高，直到42℃。因此，優(yōu)選使用gfp來制備用于dds的可聚集載體材料。另外，反應(yīng)時間根據(jù)反應(yīng)溫度而不同。但是，例如其為小時，優(yōu)選為小時，更優(yōu)選為約小時。這是因為在這樣的反應(yīng)時間過程中所用的具有硫醇基的蛋白質(zhì)與噻咯樹枝狀體結(jié)合而形成膠束。也就是說，由于形成蛋白質(zhì)-樹枝狀體復(fù)合體，膠束外側(cè)由作為親水性部分的蛋白質(zhì)組成，其內(nèi)側(cè)由作為疏水性部分的樹枝狀體的核部分組成。也就是說，認(rèn)為膠束是在締合性蛋白與樹枝狀體的側(cè)鏈結(jié)合時通過蛋白質(zhì)的締合產(chǎn)生的驅(qū)動力形成。這里，至少一種或多種蛋白質(zhì)在側(cè)鏈末端置換有鹵素原子，以結(jié)合噻咯樹枝狀體。因此，通過反應(yīng)獲得的藥物遞送系統(tǒng)用可聚集載體材料作為化學(xué)式iv)～(ix)中所示的綴合物的混合物而獲得。當(dāng)具有硫醇基的蛋白質(zhì)是熒光蛋白時，此類蛋白質(zhì)與樹枝狀體的混合比(摩爾比)可以是，在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為1時，樹枝狀體例如為1～20；優(yōu)選1：5～15，更優(yōu)選約1：10。另外，當(dāng)進(jìn)行反應(yīng)時，優(yōu)選的是將變?yōu)榘邢蜃R別部位的氨基酸序列引入作為靶向序列提示部的蛋白質(zhì)，因為其能夠?qū)崿F(xiàn)后述dds中的有效遞送。靶向識別部位的此類引入可以通過使用反向pcr來進(jìn)行。反應(yīng)后，可以通過凝膠過濾除去未反應(yīng)的熒光蛋白，并且可以獲得本發(fā)明的用于dds的可聚集分子。靶向識別部位的引入使得能夠?qū)⒂杀景l(fā)明的用于dds的可聚集分子組成的膠束特異性遞送至具有炎癥的正常組織、具有不期望基因表達(dá)的組織和由腫瘤細(xì)胞等組成的組織等。此處，作為具有炎癥的正常組織的實例，可以提及具有自身免疫疾病的獨特特征的組織。另外，提及例如具有不期望基因表達(dá)的組織，提及具有通過snp分析在所述疾病和單堿基取代之間的明確關(guān)聯(lián)的組織等。作為具有不期望基因表達(dá)的細(xì)胞的實例，可以提及如上所述源自表達(dá)有不期望基因的組織的細(xì)胞。此外，作為由癌細(xì)胞組成的組織的實例，可以提及乳腺癌組織、肺癌組織、肝癌組織和子宮頸癌組織等。作為靶標(biāo)識別部位，可以提及序列表中序列號所示的氨基酸序列。實施例以下實施例僅是實例性的，并不限制本發(fā)明的范圍。(實施例1)用于dds的可聚集分子和膠束的制備在該實施例中，使用以下gfp作為蛋白質(zhì)，并使用噻咯樹枝狀體作為樹枝狀體。(1)用于dds的可聚集分子的制備在該實施例中，使用具有以下化學(xué)式(x)的化合物(下文有時將其稱為“二甲基啞鈴(1)6-br”)作為具有鹵素基團(tuán)的樹枝狀體，并且使用gfp(綠色熒光蛋白)(序列號1)作為具有硫醇基的蛋白質(zhì)。[化學(xué)式19]根據(jù)已經(jīng)由本發(fā)明人等報道的方法(參見biochim.biophys.acta1679(2004)222-229；biochem.biophys.res.commun.330(2005)454-460)制備此處使用的gfp(序列表中的序列號1)。序列號1中所示的gfp的氨基酸序列在c末端區(qū)域中的251位氨基酸已經(jīng)被半胱氨酸置換，而在60位處初始存在的半胱氨酸被絲氨酸置換。首先，以1mm作為終濃度，將dtt加入20μm濃度的gfp溶液(磷酸鹽緩沖鹽水，以下簡稱為“pbs”)，并將gfp溶液在室溫下處理10分鐘，以將gfp表面上的半胱氨酸還原。將200μm式(x)所示的噻咯樹枝狀體的溶液(在dmso溶液中)10μl添加至400～450μl的20μmgfp溶液(在pbs中)，使終濃度為10倍摩爾當(dāng)量，然后以渦旋混合器混合。渦旋后，將溶液置于37℃下過夜溫育以使gfp和噻咯樹枝狀體結(jié)合，隨后形成膠束。該實驗的溫育時間為約16～18小時。通過使用動態(tài)光散射法(dls；動態(tài)光散射)測定溶液中膠束顆粒的性質(zhì)。結(jié)果示于表1。[表1]在25℃測定5次的pbs中原料和產(chǎn)物的平均粒徑[nm]另外，使用zetasizernano-s(由malverninstrumentltd.制造)，通過532nm的激光束波長，在25℃下測定反應(yīng)混合物中的粒徑。結(jié)果示于圖3。圖3a顯示僅溫育gfp并測定所得產(chǎn)物的粒徑的結(jié)果。圖3b顯示僅溫育噻咯樹枝狀體并測定所得產(chǎn)物的粒徑的結(jié)果。圖3c顯示將gfp和式(x)中所示的噻咯樹枝狀體混合并溫育，并測定所得產(chǎn)物的粒徑的結(jié)果。橫軸顯示所得產(chǎn)物的粒徑，縱軸表示具有橫軸所示尺寸的全部產(chǎn)物的百分比。當(dāng)溫育gfp和噻咯樹枝狀體(僅gfp-噻咯)時，獲得的膠束的粒徑為約150nm。與此相對，僅溫育gfp時觀察到的粒徑約為4nm，并且僅溫育噻咯樹枝狀體時觀察到的粒徑約為650nm。認(rèn)為觀察到大尺寸顆粒的原因是由于在僅溫育噻咯樹枝狀體時噻咯樹枝狀體之間的聚集而形成大的聚集體引起。接下來，根據(jù)用掃描電子顯微鏡(sem；掃描電子顯微鏡)對所獲得的膠束顆粒進(jìn)行的觀察，確認(rèn)大量顆粒的粒徑為約少數(shù)顆粒的粒徑為約500nm(參見圖4)。從這些結(jié)果清楚地證明，通過使用本發(fā)明的用于dds的可聚集載體形成的膠束的粒徑分布為約并且存在許多粒徑為約100～200nm的顆粒。另外，通過使用sem的電子顯微鏡照片表明，這些顆粒具有球形膠束結(jié)構(gòu)。當(dāng)噻咯的疏水性核部分為聚集體時，在本實施例中使用的噻咯樹枝狀體具有發(fā)光性質(zhì)，即aie效應(yīng)；于是，確認(rèn)當(dāng)樹枝狀體形成膠束結(jié)構(gòu)時，樹枝狀體發(fā)光。因此，我們檢查了在由gfp與噻咯樹枝狀體結(jié)合的gfp-噻咯樹枝狀體組成的膠束中是否發(fā)生噻咯和gfp之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret：熒光共振能量轉(zhuǎn)移)。從反應(yīng)混合物中去除未反應(yīng)的熒光蛋白和樹枝狀體(游離分子)，我們進(jìn)行了發(fā)光性質(zhì)實驗(參見圖5)。為了檢查發(fā)光性質(zhì)，僅含有噻咯樹枝狀體的溫育產(chǎn)物在360nm波長下激發(fā)(白色正方形)，僅含有g(shù)fp的溫育產(chǎn)物在488nm波長下激發(fā)(白色三角形)，含有g(shù)fp和噻咯樹枝狀體的溫育產(chǎn)物在360nm波長下激發(fā)(黑色圓)。由噻咯-gfp綴合物組成的膠束(其是通過溫育gfp和式(x)的噻咯樹枝狀體而獲得的產(chǎn)物)，顯示出在510nm附近處的由fret導(dǎo)致的發(fā)光。如圖5所示，噻咯樹枝狀體顯示約480nm的發(fā)射峰。另外，gfp和噻咯樹枝狀體的綴合物沒有顯示出尖銳的發(fā)射峰，但是在510nm附近具有最高的值。與之相對，gfp顯示出510nm左右的尖銳發(fā)射峰，并且被認(rèn)為是由從噻咯樹枝狀體至gfp的fret引起。當(dāng)膠束塌陷時，被認(rèn)為是由fret引起的gfp的發(fā)光也消失。也就是說，當(dāng)使用由具有aie效應(yīng)的樹枝狀體和締合性蛋白(例如熒光蛋白)組成的分子(gfp-噻咯綴合物)制備膠束時，在樹枝狀體和gfp之間產(chǎn)生fret，并且塌陷的膠束失去fret。從以上可以看出，當(dāng)使用本發(fā)明的膠束作為用于dds的可聚集載體時，可以確認(rèn)膠束被遞送至的組織或器官。另外，即使在遞送至靶組織或器官的膠束塌陷之后，也可以追蹤熒光蛋白的熒光。由此，可以利用遞送至細(xì)胞中的熒光蛋白來檢測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等。(3)將藥物等內(nèi)包在由gfp-噻咯樹枝狀體復(fù)合體組成的膠束中的實驗接下來，確認(rèn)本發(fā)明的膠束是否用于藥物內(nèi)包。在該實驗中，使用dii(1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸鹽，promokinepk-ca707-60010，由promocellgmbh制造)、油橙ss(由tokyochemicalindustry制造，產(chǎn)品號：t0553)、山羊抗小鼠igg(由abcamplc制造，產(chǎn)品號：ab6708)-alexa610(由molecularprobes制造，產(chǎn)品號：a30050)和wga(wheatgermagglutinin：小麥胚芽凝集素，由molecularprobes制造)(wga-alexafluoro(注冊商標(biāo))594綴合物，產(chǎn)品號：w11262)作為模型藥物。向20μm其中半胱氨酸被還原的gfp中添加200μm式(x)所示的噻咯樹枝狀體(在dmso溶劑中)10μl，以具有10倍摩爾當(dāng)量的終濃度，添加以下任一種，并以渦旋混合器混合，在37℃溫育過夜(約16～18小時)：dii(終濃度；1μm，熒光染料)、油橙ss(終濃度；20μm，熒光染料)、山羊抗小鼠igg-alexa610(終濃度；0.1μm)和wga(終濃度；2μm)。測定在添加有各模型藥物的樣品中是否形成內(nèi)包各藥物的膠束；并且如果形成內(nèi)包藥物的膠束，則使用動態(tài)光散射法測定其粒徑。結(jié)果示于表2。此處這里，使用dii、油橙ss和山羊抗小鼠igg-alexa610作為藥物模型。圖6a～6c顯示當(dāng)使用模型藥物時的粒度分布。當(dāng)用這些模型藥物制備膠束時，圖6a顯示了在dii存在下的分布；圖6b顯示了在油橙ss的存在下的分布；并且圖6c分別顯示在山羊抗小鼠igg-alexa610存在下的分布。橫軸顯示膠束的粒徑，縱軸表示具有橫軸所示各尺寸的膠束相對于全部膠束數(shù)量的百分比。當(dāng)添加dii時，膠束尺寸為約95nm；另外當(dāng)添加油橙ss時，其為約95nm；并且當(dāng)添加igg-alexa610時，其為約180nm。[表2]在25℃測定5次的pbs中原料和產(chǎn)物的平均粒徑[nm]圖7顯示內(nèi)包dii(熒光染料)的膠束的發(fā)光性質(zhì)的檢查結(jié)果。圖7b顯示圖7a中500nm附近的光譜的放大圖。橫軸表示波長(nm)，縱軸表示相對熒光強(qiáng)度(a.u.)。首先制備內(nèi)包dii的膠束，并準(zhǔn)備以下測試樣品以用于測量其熒光：膠束用pbs洗滌3次；通過孔徑為0.45μm的濾器過濾反應(yīng)混合物以除去游離染料；并且通過孔徑為0.22μm的濾器代替孔徑為0.45μm的濾器過濾反應(yīng)混合物以除去游離染料。如圖7a和7b所示，當(dāng)樣品在360nm的波長處激發(fā)時，在480nm的波長附近觀察到肩峰。據(jù)認(rèn)為，這些峰表明了來自噻咯的發(fā)光。據(jù)認(rèn)為510nm附近的峰表明從噻咯至gfp的fret；并且570nm附近的峰表明從噻咯至dii的fret。從這些結(jié)果確認(rèn)，dil內(nèi)包在膠束中。接下來，檢查內(nèi)包用alexa594標(biāo)記的wga的膠束的發(fā)光性質(zhì)(參見圖8a和b)。圖8a顯示當(dāng)添加標(biāo)記有alexa594的wga時原位反應(yīng)混合物的測定結(jié)果。另外，圖8b顯示通過使用超濾旋轉(zhuǎn)柱(由millipore制造)將未引入膠束中的物質(zhì)(stuffs)去除后的結(jié)果，例如未反應(yīng)的蛋白質(zhì)、標(biāo)記有alexa的wga、噻咯樹枝狀體或gfp。在圖8中，實線表示通過混合處理gfp-噻咯樹枝狀體復(fù)合體和wga而獲得的產(chǎn)物的發(fā)光性質(zhì)；虛線(brokenline)表示通過混合gfp和wga處理而獲得的產(chǎn)物的發(fā)光性質(zhì)。在圖中，實線表示由內(nèi)包標(biāo)記有alexa594的wga的gfp-噻咯樹枝狀體復(fù)合體組成的膠束的測定結(jié)果；虛線顯示分別內(nèi)包gfp和標(biāo)記有alexa594的wga的混合物的測定結(jié)果(激發(fā)波長在各情況下為360nm)。圖8顯示未經(jīng)原位超濾旋轉(zhuǎn)柱處理的反應(yīng)混合物的測定結(jié)果。在圖8a中，分別在480nm、510nm和610nm附近檢測到來自噻咯樹枝狀體、gfp和wga的發(fā)光。與此相對，如圖8b所示，經(jīng)超濾旋轉(zhuǎn)柱處理的樣品未顯示來自游離噻咯樹枝狀體、gfp和wga的發(fā)光，因為它們被去除了(虛線)。從以上確認(rèn)，標(biāo)記有alexa594的wga內(nèi)包在所制備的膠束中。(實施例2)結(jié)合靶肽序列的熒光蛋白的制備結(jié)合熒光蛋白的靶肽序列如下制備。蛋白質(zhì)在c末端與本發(fā)明的膠束結(jié)合，并且其在n末端與靶肽結(jié)合，所述靶肽結(jié)合在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的受體。(1)反向pcr(1-1)肽序列的選擇所選擇靶肽的肽序列示于以下表3中。mcf-7是人乳腺癌衍生細(xì)胞。[表3]細(xì)胞種類肽序列序列號mcf-7dmpgtvlp6(1-2)引物對制備在以下表4中記載用于對表3中所示的肽序列進(jìn)行反向pcr的引物。這些引物設(shè)計成使得在肽序列的dm和pgtvlp之間開始延伸反應(yīng)。[表4](1-3)用于反向pcr的模板質(zhì)粒的制備通過以下論文中所述的方法制備用于反向pcr的模板質(zhì)粒?！皃rotease-sensitivesignalingbychemicallyengineeredintramolecularfluorescentresonanceenergytransfermutantsofgreenfluorescentprotein.”mihosuzuki等，biochimicaetbiophysicaacta(bba)-genestructureandexpression第1679卷，第3期，2004年9月17日，222-229頁(1-3-1)用于gfpuv5突變體的質(zhì)粒構(gòu)建通過i167t突變以及正向引物5’cattgaagatggctccgttcaa(序列號9)和反向引物5’cattgaagatggctccgttcaa(序列號10)使用反向pcr，通過用于基因操作的同義突變以及隨后的環(huán)化處理，從pgfpgcn4制備gfpuv5。以此方式獲得的構(gòu)建體命名為pgfpgcn5。其后，將gfpuv5的cdna克隆到pet21a(由novabeninc.制造)中以表達(dá)所述蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)純化并命名為gfpuv5tag。使用引物擴(kuò)增編碼區(qū)5’ctcgaccat[atggctagcatgactggtggacagcaaatgggt]cgcatgagtaaaggagaagaacttttca(序列號11)，和5’tgacgtgaattcatta[gtgatggtgatggtgatg]tttgtagagctcatccatgc(序列號12)。在序列號11中，將附著至表位標(biāo)簽的附著標(biāo)簽標(biāo)記為[]，所述表位標(biāo)簽由從用于t7基因的10個蛋白質(zhì)面向gfpuv5系列的n末端的末端開始的11個氨基酸組成。序列號12為gfpuv5系列的c末端提供his標(biāo)簽，并且在該序列中的his標(biāo)簽以[]顯示。將這些插入pet21a中，然后將其用ndei和ecori兩者消化。將pgfpgcn質(zhì)粒用于基因操作，pet21a質(zhì)粒用于在t7啟動子控制下的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過dna測序(abiprism3100，由geneticanalyzer制造)確認(rèn)gfpuv5基因的核苷酸序列及其突變體。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)了另外三個同義突變：30位ser處的agt至agc，his78處的cat至cac，以及gln183處的caa至cag。繼續(xù)進(jìn)行包括這些突變的實驗，因為這些突變對熒光蛋白無害。經(jīng)純化的gfpuv5tag的熒光強(qiáng)度是gfpuv4tag的熒光強(qiáng)度的約1.9倍。之后，將48位或70位處的半胱氨酸殘基通過使用pgfpgcn5的反向pcr替換為隨機(jī)氨基酸。寡核苷酸5’cttaaatttattnnkactggaaaac(序列號13)和5’ggtaagttttccgtatgttg(序列號14)用于半胱氨酸48的突變，5’gtgttcaannkttttcccgttatccg(序列號15)和5’catacgtcagagtagtgacaag(序列號16)用于半胱氨酸70的突變。將大腸桿菌bl21(de3)的培養(yǎng)物用獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并通過使用日光激發(fā)針對具有強(qiáng)熒光的那些進(jìn)行篩選，并在瓊脂培養(yǎng)基上選擇。在48位(置換為ala、asp、glu、gly、ile、leu、asn、pro、ser、thr、val和tyr之一)獲得數(shù)個發(fā)射強(qiáng)熒光的突變體。然而，c70v半胱氨酸突變體在70位點僅給出適當(dāng)?shù)臒晒?。為了產(chǎn)生具有強(qiáng)熒光強(qiáng)度的雙重半胱氨酸突變gfpuv5，將具有單突變的質(zhì)粒用ncoi和ecori兩者消化并再次連接至各區(qū)域。使用單個突變體進(jìn)行選擇。uv5co標(biāo)簽(c48s/c70v)在所有重組體中顯示最高的熒光強(qiáng)度。接下來，通過反向pcr分別在6位和229位引入半胱氨酸。使用具有c48s突變的質(zhì)粒和一組以下引物來引入各自的突變。用于glu置換：5’tgtcttttcactggagttgtccc(序列號17)和5’ttctcctttactcattttttc(序列號18)用于ile置換：5’tgcacacatggcatggatgagctc(序列號19)和5’cccagcagcagttacaaactc(序列號20)具有胰蛋白酶靶序列(glu-gly-arg)的三個蛋白酶標(biāo)簽具有各種間隔子序列，它們是無間隔子、thr間隔子或gly-thy間隔子，并且在his-231和asp-231之間置換必需的半胱氨酸。這些構(gòu)建體通過使用puvc48stag、所獲得的質(zhì)粒(模板)和以下引物獲得。5’cagcgccgttgtgagctctacaaataatgaatt(用于無間隔子：序列號21)5’acatgtgagctctacaaataa(用于thr間隔子：序列號22)和5’ggaacatgtgagctctacaaa(用于gly-thy間隔子：序列號23)(反向引物)5’tgtaatcccagcagcagttac(用于無間隔子：序列號24)5’acggccctgtgtaatccc(用于t和gt間隔子：序列號25)將所獲得的質(zhì)粒分別命名為puv5tryps0tag、puv5-tryps1tag和puv5tryps2tag。詳細(xì)參見表1。(1-3-2)gfpuv5tag突變體的純化將大腸桿菌bl21(de3)用所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)過夜后處于靜止期的12ml大腸桿菌接種于補(bǔ)充有50μg/ml氨芐青霉素和0.5mmiptg的38mllb培養(yǎng)基中，在37℃溫育8小時。通過以2,500xg離心20分鐘收集細(xì)胞，并將其重懸浮在10ml的pbs中。將細(xì)胞球團(tuán)沉淀在含有50mmtris和8m尿素的10ml裂解緩沖液(ph8.0)中在室溫下裂解15分鐘，然后渦旋。將裂解的細(xì)胞以1,200xg離心15分鐘，并取上清液與懸浮在pbs中的ni2+nta樹脂(由qiagenco.ltd.制造)混合。用pbs和20mm咪唑依次洗滌樹脂后，用250mm咪唑溶液洗脫結(jié)合的gfpuv5tag突變體。為了交換緩沖液，將洗脫液施加至用10倍稀釋的pbs平衡的pd-10凝膠電泳過濾柱(由amershambioscienceco.ltd.制造)。收集洗脫的gfpuv5tag突變體蛋白，并通過使用考馬斯蛋白檢驗試劑(由pierceco.制造)確定其濃度。通過15％sds-page分析經(jīng)純化的gfpuv標(biāo)簽突變體。用于反向pcr的模板質(zhì)粒的核酸序列顯示為序列號26。(1-4)pcr的條件制備以下表5中所示的反應(yīng)混合物，并在以下表6中所示的條件下進(jìn)行反向pcr。[表5][表6](1-5)通過凝膠電泳確認(rèn)取一部分pcr溶液，并在電壓100v下用0.8％page進(jìn)行施加電壓時間30分鐘的凝膠電泳，以確認(rèn)在各樣品中擴(kuò)增的肽。電泳結(jié)果顯示在圖9中。(2)去除獨立的a序列和純化pcr產(chǎn)物制備以下表7中所示的反應(yīng)混合物，使其在120℃下反應(yīng)30分鐘以除去通過pcr產(chǎn)生的獨立的a序列。之后，通過使用qiaquick(注冊商標(biāo))，pcr純化試劑盒(由qiagen制造)根據(jù)試劑盒附帶的說明書純化pcr產(chǎn)物。[表7](3)連接反應(yīng)隨后，制備以下表8中所示的反應(yīng)混合物，并使其在160℃下反應(yīng)大于3小時以制備用于轉(zhuǎn)化后述的大腸桿菌dh5α的環(huán)狀質(zhì)粒。[表8](4)e.colidh5α的轉(zhuǎn)化將10μl大腸桿菌dh5αa感受態(tài)細(xì)胞(biodynamicslaboratory制造)在使用前立即在冰上解凍，并制備感受態(tài)細(xì)胞溶液。將1μl的連接反應(yīng)溶液加入感受態(tài)細(xì)胞溶液中，并在冰上靜置30分鐘。其后，將溶液在42℃下溫育30秒，然后在冰上冷卻2分鐘。向該溶液中添加soc培養(yǎng)基(由toyoboco.,ltd.制造)90μl，在37℃下在振蕩器上反應(yīng)1小時。其后將其接種在補(bǔ)充有氨芐青霉素(由toyoboco.,ltd.制造)的lb選擇培養(yǎng)基上，并在37℃下溫育過夜。(5)集落pcr將轉(zhuǎn)化獲得的集落進(jìn)行集落pcr以確認(rèn)預(yù)測的插入物。(5-1)制備用于pcr的反應(yīng)混合物制備以下表9中所示的用于集落pcr的反應(yīng)混合物。[表9]將用于集落pcr的反應(yīng)混合物倒入pcr管中，收集在補(bǔ)充有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌，并加入到管中。根據(jù)以下表10中所示的程序進(jìn)行pcr。[表10](5-2)電泳在100v的施加電壓下用1.2％page對pcr反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳30分鐘。將確認(rèn)了擴(kuò)增的集落接種到含有l(wèi)b液體培養(yǎng)基(由toyoboco.，ltd.制造)的培養(yǎng)瓶中，并在37℃下溫育。(6)質(zhì)粒的純化在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌中的質(zhì)粒通過使用wizardplussvminipreps.dna純化系統(tǒng)(由promegaco.制造)根據(jù)其所附帶說明書進(jìn)行純化。其后，將經(jīng)純化質(zhì)粒的序列送到eurofingenomicsco.，ltd.以對其分析。(7)大腸桿菌bl(de3)的轉(zhuǎn)化將10μl大腸桿菌bl(de3)感受態(tài)細(xì)胞(由biodynamicslaboratory制造)在使用前立即在冰上解凍，并制備感受態(tài)細(xì)胞溶液。將1μl通過測序確認(rèn)含有靶序列的質(zhì)粒溶液加入感受態(tài)細(xì)胞溶液中，并在冰上靜置30分鐘。其后，將溶液在42℃下溫育30秒，然后在冰上冷卻2分鐘。向該溶液中添加soc培養(yǎng)基(由toyoboco.,ltd.制造)90μl，在37℃下在振蕩器上反應(yīng)1小時。其后將其接種在補(bǔ)充有氨芐青霉素的lb選擇培養(yǎng)基上，并在37℃靜置過夜。第二天，收集發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染集落，并接種到含有1ml補(bǔ)充有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。然后，將它們在37℃下靜置過夜以進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。(8)與靶肽序列結(jié)合的熒光蛋白的純化(8-1)集落培養(yǎng)對于樣品，準(zhǔn)備4個50ml尺寸的管，向其中加入4ml補(bǔ)充有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基和290μl預(yù)培養(yǎng)溶液，并在振蕩器上在28℃下培養(yǎng)4小時。其后，向其中加入43μl的100mmiptg(異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷)，并將它們在28℃下在振蕩器上培養(yǎng)過夜。(8-2)蛋白質(zhì)的回收第二天，將四個管中的培養(yǎng)物收集到一個管中。用1mlpbs(-)緩沖液(由wakopurechemicalindustry,ltd.制造)洗滌三個轉(zhuǎn)移了內(nèi)容物的管，并將洗滌液也加入到收集有培養(yǎng)物的收集管中。將收集的管在室溫下以5,000rpm離心5分鐘(離心機(jī)名：kubota3740，馬達(dá)編號：kubotaaf2018，由kubotaco.制造)其后，(i)棄去上清液，向沉淀球團(tuán)中加入3mlpbs(-)緩沖液，(ii)充分渦旋，然后將管以5000rpm離心5分鐘。重復(fù)步驟(i)和(ii)兩次。將4ml的b-per裂解緩沖液(由reagent制造)加入沉淀球團(tuán)中，并將其加蓋并在室溫下在振蕩器上攪拌過夜。(8-3)通過his標(biāo)簽純化將2mlni-nta瓊脂糖(由qlagen制造)放入15ml管中，(i)將管以1,000rpm離心1分鐘，(ii)棄去上清液，向管加入1xpbs緩沖液并充分渦旋。重復(fù)步驟(i)和(ii)三次制備ni-nta樹脂。將含有b-per裂解緩沖液的管在室溫下以12,000rpm離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到15mlfalcon管中。將400μl充分?jǐn)嚢璧膎i-nta樹脂加入管中，然后使用旋轉(zhuǎn)振蕩器在室溫下攪拌10分鐘。其后，將管在室溫下以1,000rpm離心1分鐘，棄去上清液。(iii)將4ml的1xpbs緩沖液加入到管中，并充分渦旋，(iv)將管在室溫下以1,000rpm離心1分鐘，棄去上清液。步驟(iii)和(iv)重復(fù)兩次。之后，將(v)將4ml的20mm咪唑(由wakopurechemicalindustry,ltd.制造)加入到管中并充分渦旋，(vi)將管在室溫下以1,000rpm離心1分鐘，除去上清液。步驟(v)和(vi)重復(fù)兩次。向管中加入500μl的250mm咪唑，并用旋轉(zhuǎn)振蕩器在室溫下攪拌10分鐘。此后，將管以1,000rpm離心1分鐘，將發(fā)出綠色熒光的上清液轉(zhuǎn)移到新的15mlfalcon管中，以制備用于下一階段中凝膠過濾的蛋白質(zhì)純化溶液。(8-4)通過凝膠過濾的純化使蛋白質(zhì)純化溶液中的咪唑與pbs交換，將溶液純化以獲得感興趣的靶肽序列結(jié)合熒光蛋白。在上述步驟中，使用由geheathcarejapankk制造的nap5柱根據(jù)其所附的說明書進(jìn)行純化。(9)靶肽序列結(jié)合熒光蛋白的選擇根據(jù)常規(guī)方法，通過使用280nm吸光度測定從純化步驟獲得的靶肽序列結(jié)合熒光蛋白的濃度，并通過使用488nm吸光度測定發(fā)色團(tuán)濃度(發(fā)色團(tuán)形成能力)。選擇a488/a280的比例超過1.5的蛋白質(zhì)作為感興趣的靶肽序列結(jié)合熒光蛋白。結(jié)果示于表11中。[表11](實施例3)靶肽序列結(jié)合膠束(締合熒光蛋白驅(qū)動型膠束)的制備以與實施例1中所用相同的方法，使用實施例2中制備的靶肽序列結(jié)合熒光蛋白代替gfp來形成結(jié)合有靶肽序列的膠束，其是締合熒光蛋白驅(qū)動膠束。(1)發(fā)光性質(zhì)以與實施例1相同的方式測定具有如上所述制備的帶有靶肽序列結(jié)合熒光蛋白的締合熒光蛋白驅(qū)動膠束的發(fā)光性質(zhì)(參見圖10)。在圖10的圖例中，反應(yīng)物顯示了噻咯樹枝狀體和靶肽序列結(jié)合熒光蛋白的復(fù)合體，未反應(yīng)材料顯示沒有它們的那些，并且各數(shù)值表示激發(fā)光的波長(nm)。在靶肽序列結(jié)合膠束中與實施例1中同樣在510nm附近觀察到發(fā)射峰。通過與實施例1中所用相同的動態(tài)光散射法測量靶肽序列結(jié)合膠束的顆粒性質(zhì)(參見圖11)。在圖11中，橫軸表示所獲得膠束的粒徑，縱軸表示水平軸所示尺寸的膠束占所有尺寸膠束的百分比。結(jié)果，與實施例1同樣確認(rèn)具有約粒徑的顆粒。從以上證明，具有靶肽序列的熒光蛋白結(jié)合膠束與沒有靶序列的那些形成相等大小的膠束。此外，估計在實施例1和本實施例中獲得的膠束均是締合熒光蛋白驅(qū)動型膠束。工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明用于醫(yī)藥制品領(lǐng)域，特別是藥物遞送領(lǐng)域。序列表的自由文本序列號1：gfp的氨基酸序列序列號2：gfp的氨基酸序列序列號3：bfp的氨基酸序列序列號4：yfp的氨基酸序列序列號5：源自discosoma的熒光蛋白的氨基酸序列序列號6：mcf-7識別肽序列序列號7：用于反向pcr的正向引物序列號8：用于反向pcr的反向引物序列號9：用于反向pcr的正向引物序列號10：用于反向pcr的反向引物序列號11：用于反向pcr的引物序列號12：用于反向pcr的引物序列號13：寡核苷酸序列號14：寡核苷酸序列號15：寡核苷酸序列號16：寡核苷酸序列號17：用于反向pcr的正向引物序列號18：用于反向pcr的反向引物序列號19：用于反向pcr的正向引物序列號20：用于反向pcr的反向引物序列號21：用于反向pcr的正向引物序列號22：用于反向pcr的正向引物序列號23：用于反向pcr的正向引物序列號24：用于反向pcr的反向引物序列號25：用于反向pcr的反向引物序列號26：用于反向pcr的質(zhì)粒的堿基序列序列表<110>國立大學(xué)法人埼玉大學(xué)&石匠株式會社<120>碳硅烷樹枝狀體及用于藥物遞送系統(tǒng)的使用該樹枝狀體獲得的可聚集載體<130>p15su010jp<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>263<212>prt<213>artificialsequence<220><223>forproteinhaveingthiolgroup,gfp<220><221>misc_feature<222>(1)..(263)<400>1metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetserlysgly151015glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly202530aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp354045alathrtyrglylysleuthrleulyspheileserthrthrglylys505560leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyval65707580glncyspheserargtyrproasphismetlysarghisaspphephe859095lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrileserphe100105110lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly115120125aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu130135140aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis145150155160asnvaltyrilethralaasplysglnlysasnglyilelysalaasn165170175phelysthrarghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp180185190histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro195200205aspasnhistyrleuserthrglnseralaleuleulysaspproasn210215220glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly225230235240serglyilethraspgluvalaspglythrcysgluleutyrlysgly245250255glyhishishishishishis260<210>2<211>258<212>prt<213>artificialsequence<220><223>forproteinhavingthiolgroup,gfp<220><221>misc_feature<222>(1)..(258)<400>2metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetserlysgly151015glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly202530aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp354045alathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylys505560leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyval65707580glncyspheserargtyrproasphismetlysarghisaspphephe859095lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrileserphe100105110lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly115120125aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu130135140aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis145150155160asnvaltyrilethralaasplysglnlysasnglyilelysalaasn165170175phelysthrarghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp180185190histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro195200205aspasnhistyrleuserthrglnseralaleuleulysaspproasn210215220glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly225230235240ilethrhisglymetaspgluleutyrlysglyglyhishishishis245250255hishis<210>3<211>259<212>prt<213>artificialsequence<220><223>forproteinhavingthiolgroup,bfp<220><221>misc_feature<222>(1)..(259)<400>3metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetvalserlys151015glyglugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuasp202530glyaspvalasnglyhislyspheservalserglygluglyglugly354045aspalathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrgly505560lysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrhisgly65707580valglncyspheserargtyrproasphismetlysglnhisaspphe859095phelysseralametprogluglytyrvalglngluargthrilephe100105110phelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglu115120125glyaspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelys130135140gluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasnpheasnser14515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