相關(guān)專利申請的交叉引用

本申請要求提交于2014年10月27日的美國臨時申請62/069,057的權(quán)益，該美國臨時申請由此全文以引用方式并入本文。

本申請整體涉及包含自然殺傷(nk)細胞的組合物和方法。更具體地，本申請涉及對能夠攻擊和殺傷癌細胞、病毒感染細胞和某些免疫細胞的內(nèi)源性自然殺傷(nk)細胞的體內(nèi)、離體或體外刺激和擴增。

背景技術(shù)：

來自遺傳型上hla匹配的同胞的造血干細胞移植(hsct)已經(jīng)改善了患有血液癌癥惡性腫瘤和骨髓衰竭綜合征的患者的長期存活。每年，有超過10,000名美國人患上危及生命的疾病，該等疾病的唯一治愈希望就是從不相關(guān)的供體或臍血單位(cordbloodunit)進行骨髓移植。然而，可以從同種異體干細胞移植受益的患者中超過70％沒有匹配的同胞供體。這些情況會延遲治療，因此有必要訴諸不太理想地使用部分不匹配的供體，這最終導(dǎo)致移植物抗宿主病(gvhd)、移植失敗和復(fù)發(fā)的發(fā)生率增大，所有這些都顯著降低了患者的存活。

移植過程的持續(xù)時間和昂貴的經(jīng)濟、精神和健康負擔造成了附加限制。因此，來自不相關(guān)供體的hsct的應(yīng)用僅限于具有能夠持續(xù)該過程的適當社會經(jīng)濟支持的較年輕、較健康的患者。

由于無法根除殘留的癌細胞，高復(fù)發(fā)率引起了進一步的挑戰(zhàn)。雖然hsct被認為是治愈性的，但癌癥復(fù)發(fā)率是大的驚人的。因此，需要更具靶向性的新穎免疫療法，所述免疫療法將更有效，優(yōu)選地不需要匹配的供體。在20世紀90年代引入了供體淋巴細胞輸注(dli)，以用于治療hsct后的急性骨髓性白血病(aml)復(fù)發(fā)。這種方法由以下步驟組成：從原始供體向患有復(fù)發(fā)疾病的aml患者施用淋巴細胞。然而，臨床益處是有限的并僅在少數(shù)具有較小腫瘤負荷的患者中觀察到，并且t細胞介導(dǎo)的gvhd常常進一步惡化結(jié)局。

迫切需要旨在增加nk細胞數(shù)量的具改善的新方法。

所公開的方法和組合物的另外優(yōu)點將部分地在下面的描述中闡述，并且將部分地從描述中理解，或者可以通過實踐所公開的方法和組合物習得。所公開的方法和組合物的優(yōu)點將通過所附權(quán)利要求書中特別指出的要素和組合來實現(xiàn)和獲得。應(yīng)當理解，上述一般描述和以下詳細描述僅僅是示例性和說明性的，并不限制所要求保護的本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文公開了用于增強自然殺傷(nk)細胞的活性的具改善技術(shù)的方法。在某些實施方案中，本文公開的方法導(dǎo)致nk細胞的數(shù)目增加。在某些實施方案中，本文公開的方法導(dǎo)致具有改善活性的nk細胞。在某些實施方案中，本文公開的方法導(dǎo)致具有改善活性的nk細胞的數(shù)目增加。

本文公開了用于增加nk細胞數(shù)目的方法，其包括使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，刺激nk的外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽。外來體可以是體外產(chǎn)生的外來體分泌細胞的細胞外產(chǎn)物。在一些情況下，外來體從飼養(yǎng)細胞分泌。在一些方面，存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽可以包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica/b、ulbp2、icam-1、2b4、bcm1/slamf2、cd155、cd112、ccr7和/或其他歸巢受體、dap12、dap10和/或其他銜接蛋白。在一些情況下，外來體膜不含有il-15。在一些方面，存在于外來體膜中的所述一種或多種刺激肽包括4-1bbl和il-21。刺激肽也可以與一個或多個膜插入肽偶聯(lián)。膜插入肽可以包含對脂質(zhì)雙層具有親和力的cd4或igg的區(qū)段?；蛘撸げ迦腚目梢园ㄈ薴c、gpi、跨膜t細胞受體，或phlip。與一個或多個膜插入肽偶聯(lián)的所述一種或多種刺激肽可以包括由重組dna編碼的融合蛋白。

在一些實施方案中，外來體是由與nk細胞共培養(yǎng)的飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生的。與當前共培養(yǎng)方法相關(guān)的一個缺點是污染的可能性。然而，由于使用所公開的方法時，飼養(yǎng)細胞和nk細胞之間無需直接的細胞間接觸，所以所述細胞可以用尺寸設(shè)定為允許外來體通過的膜分離。因此，本文還公開了一種生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器包括由尺寸設(shè)定為允許外來體通過的膜分離的飼養(yǎng)細胞和nk細胞。此類生物反應(yīng)器可以設(shè)計成具有用分子多孔膜分隔的多個隔室，或者為具有允許外來體穿過但不允許細胞穿過的分子多孔膜的中空纖維類型。這種生物反應(yīng)器設(shè)計可以被并入以作為用于細胞活化、細胞生長或細胞處理的更大裝置或系統(tǒng)的一部分。

本文使用的外來體可以由經(jīng)工程化以改善外來體表達的細胞系產(chǎn)生。在一些情況下，細胞系是白血病細胞系，諸如k562細胞。在一些情況下，細胞系已經(jīng)工程化以表達所述一種或多種刺激肽，諸如4-1bbl和il-21。因此，在一些實施方案中，細胞系包含k562-mb21-41bbl。在一些實施方案中，外來體是由pbmc產(chǎn)生的。在一些情況下，細胞系被艾普斯登-巴爾病毒(epstein-barrvirus)感染，諸如ebv-lcl細胞，或被巨細胞病毒感染，或被共感染。

可以使nk細胞在體外、體內(nèi)或離體地與刺激nk的外來體接觸或暴露于刺激nk的外來體。例如，可以在同種異體移植手術(shù)、單倍體相合移植手術(shù)或體內(nèi)免疫療法程序中使nk細胞與刺激nk的外來體接觸。在一些方面，在同種異體移植、單倍體移植或體內(nèi)免疫療法中使用刺激nk的外來體不會引起移植物抗宿主病(gvhd)。

在一些方面，nk細胞存在于未經(jīng)選擇的外周血單核細胞(pbmc)的群體中。在一些實施方案中，從受試者分離的全血或pbmc離體地接觸所公開的外來體以擴增pbmc內(nèi)的nk細胞。在一些實施方案中，使外來體與來源于誘導(dǎo)的多能干細胞(ipsc)、pbmc、臍帶血、分離的nk祖細胞或它們的任何組合的nk細胞接觸。一旦接觸，可將全血、pbmc、擴增的nk細胞、分離的nk細胞或去除了其他淋巴樣細胞類型的nk細胞產(chǎn)物輸回到受試者體內(nèi)?？梢栽跇藴式M織培養(yǎng)板或燒瓶、封閉袋系統(tǒng)(例如美天旎公司(miltenyi)生產(chǎn)的clinimacsprodigy系統(tǒng)(clinimacsprodigysystem))、中空纖維裝置(terumobct公司生產(chǎn)的量子細胞擴增系統(tǒng)(quantumcellexpansionsystem))、g-rex燒瓶(威爾森沃爾夫公司(wilsonwolf))或其他裝置中用外來體刺激nk細胞或含有nk細胞的細胞群體以進行激活或擴增。

本文公開了用于治療對nk介導(dǎo)的裂解敏感的細胞的方法，包括向細胞施用有效量的包含經(jīng)接觸的nk細胞的組合物。經(jīng)接觸的nk細胞可以通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生：使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，所述至少一種刺激nk的外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中所述外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物。在一些方面，對nk介導(dǎo)的裂解敏感的細胞可能被病毒感染。對nk介導(dǎo)的裂解敏感的細胞可包括惡性細胞，諸如與癌癥相關(guān)的那些細胞，包括但不限于aml細胞、乳腺細胞、膀胱細胞、結(jié)腸和直腸細胞、腎細胞、肺細胞、前列腺細胞、甲狀腺細胞和子宮癌細胞。

公開了用于降低干細胞移植后復(fù)發(fā)風險的方法、以及用于輔助治療方法，所述方法包括施用有效量的包含經(jīng)接觸的nk細胞的組合物，其中經(jīng)接觸的nk細胞是通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生的：使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中該外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物。

公開了用于產(chǎn)生刺激nk細胞的外來體的方法，包括在外來體的膜中包埋一種或多種刺激肽。該等刺激肽可以包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica/b、ulbp2、icam-1、2b4、bcm1/slamf2、cd155、cd112、ccr7和/或其他歸巢受體、dap12、dap10和/或其他銜接蛋白。刺激肽可以任選地與膜插入肽偶聯(lián)。膜插入肽可以包括對脂質(zhì)雙層具有親和力的cd4或igg?；蛘撸げ迦腚倪€可以包括人fc、gpi、跨膜t細胞受體、或phlip。與一個或多個膜插入肽偶聯(lián)的所述一種或多種刺激肽可以包括由重組dna編碼的融合蛋白。在一些方面，刺激nk細胞的外來體可以來自經(jīng)工程化以改善外來體表達的細胞系，該等細胞系包括但不限于細胞系k562-mb15-41bbl或細胞系k562-mb21-41bbl。

公開了用于治療癌癥的方法，其包括施用有效量的包含刺激nk的外來體的組合物，所述外來體包含一種或多種刺激肽。刺激nk的外來體的使用可以包括向受試者施用刺激nk的外來體。在一些方面，刺激nk的外來體的使用可以包括；使刺激nk的外來體離體地接觸nk細胞以獲得經(jīng)接觸的nk細胞群體、以及將該經(jīng)接觸的nk細胞群體施用于受試者。

公開了包含刺激nk的外來體的組合物，所述外來體包含一種或多種刺激肽。該等刺激肽可以包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica/b、ulbp2、icam-1、2b4、bcm1/slamf2、cd155、cd112、ccr7和/或其他歸巢受體、dap12、dap10和/或其他銜接蛋白。刺激肽可以任選地與一個或多個膜插入肽偶聯(lián)。膜插入肽可以包括對脂質(zhì)雙層具有親和力的cd4或igg的區(qū)段?；蛘?，膜插入肽還可以包括人fc、gpi、跨膜t細胞受體、或phlip。與膜插入肽偶聯(lián)的所述一種或多種刺激肽可以包括由重組或轉(zhuǎn)基因dna編碼的融合蛋白。刺激nk的外來體可以來自經(jīng)工程化以改善外來體表達或外來體產(chǎn)生的細胞系，該等細胞系包括但不限于細胞系k562-mb21-41bbl或衍生物。在一些方面，所述組合物還可以包含藥用載體。公開了用于治療癌癥的方法，其包括向受試者施用有效量的用于增強nk細胞的組合物，其中該組合物包含用至少一種刺激nk的外來體修飾的nk細胞，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽。公開了用于治療癌癥的方法，其包括向受試者施用有效量的用于增強nk細胞的組合物，其中該組合物包含用至少一種刺激nk的外來體修飾的nk細胞，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中該等刺激肽包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica/b、ulbp2、icam-1、2b4、bcm1/slamf2、cd155、cd112、ccr7和/或其他歸巢受體、dap12、dap10和/或其他銜接蛋白。公開了用于治療癌癥的方法，其包括向受試者施用有效量的用于增強nk細胞的組合物，其中該組合物包含用至少一種刺激nk的外來體修飾的nk細胞，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，并且其中該組合物還包含膜插入肽。公開了用于擴增nk細胞的方法，其包括向細胞群體施用有效量的包含至少一種刺激nk的外來體的組合物，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽。公開了用于擴增nk細胞的方法，其包括向細胞群體施用有效量的包含至少一種刺激nk的外來體的組合物，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中該等刺激肽包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica/b、ulbp2、icam-1、2b4、bcm1/slamf2、cd155、cd112、ccr7和/或其他歸巢受體、dap12、dap10和/或其他銜接蛋白。公開了用于擴增nk細胞的方法，其包括向受試者施用有效量的用于增強nk細胞的組合物，其中該組合物包含用至少一種刺激nk的外來體修飾的nk細胞，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，并且其中該組合物還包含膜插入肽。公開了用于擴增nk細胞的方法，其包括向受試者施用有效量的用于增強nk細胞的組合物，其中該組合物包含用至少一種刺激nk的外來體修飾的nk細胞，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，并且其中該組合物還包含膜插入肽，其中該膜自插入肽包括人fc、gpi、跨膜t細胞受體或phlip。公開了用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的方法，包括向受試者施用有效量的用于增強nk細胞的組合物，其中該組合物包含用至少一種刺激nk的外來體修飾的nk細胞，該外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，并且其中該組合物還包含膜插入肽。

因此，還公開了在藥用媒介物中包含所公開的外來體的藥物組合物。例如，外來體可以配制成具有合適載體化學組分的可注射劑。

可以將所公開的刺激nk的外來體和/或經(jīng)接觸的nk細胞單獨或與癌癥免疫療法組合施用于受試者，該癌癥免疫療法包括但不限于治療性抗體、癌癥疫苗、免疫檢查點抑制劑以及過繼性細胞治療(act)。

本文公開了用于刺激nk細胞的方法，其涉及使nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，其中刺激nk的外來體載有刺激nk的功能核酸，諸如sirna或mirna。例如，在一些情況下，刺激nk的功能核酸是a2ar、p2yr或其組合的抑制劑(例如，拮抗劑、表達抑制劑或沉默子)。

附圖說明

附圖并入本說明書中并且構(gòu)成本說明書的一部分，示出了所公開的方法和組合物的若干實施方案，并與說明書一起用于解釋所公開的方法和組合物的原理。

圖1是對在同種異體、單倍體、自體同源和直接體內(nèi)情況的癌癥治療中從含有刺激配體(il-21和41bbl)的k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體可如何用來刺激nk細胞的描繪圖式。

圖2a至圖2d示出了從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體的表征。外來體是通過用nanosightns300(馬爾文儀器有限公司(malvem))的視頻顯微鏡進行納米顆粒跟蹤分析來表征的。示出了單幀光散射圖像(圖2a)和粒度分布的分組直方圖(圖2b)。通過用抗il21ab進行蛋白質(zhì)印記分析來在免疫化學上證實il-21的存在(圖2c)。使用結(jié)合抗il-21ab抗體的金納米顆粒(gnp)進行的分析(圖2d)表明存在il-21，其中與結(jié)合同種型對照ab的gnp不具有動態(tài)光散射強度增大相比，使用結(jié)合抗il-21ab抗體的gnp時在外來體樣品中觀察到了動態(tài)光散射強度的時間依賴性增大。

圖3a和圖3b示出了從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體刺激未選擇的pbmc中的nk細胞特異性擴增。未選擇的pbmc是用從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體，以35ng/ml總蛋白培養(yǎng)的。在初始滯后后，nk細胞在20天內(nèi)指數(shù)級地擴增平均270倍(圖3a)，并且總淋巴細胞的相對豐度上升至74％(圖3b)。所有培養(yǎng)物均以兩等份生長，并且標記代表平均值，誤差條代表標準偏差。

圖4示出了用外來體刺激和擴增的nk細胞對k562細胞具有細胞毒性。未選擇的pbmc用從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體，以35ng/ml總蛋白培養(yǎng)，并用于測定對k562細胞的細胞毒性。與用飼養(yǎng)細胞擴增的nk細胞(fc21-nk細胞▲)或用結(jié)合il-21的質(zhì)膜顆粒擴增的nk細胞(pm21-nk細胞■)相比，用外來體擴增的nk細胞(ex21-nk細胞●)的細胞毒性略低。

圖5a至圖5e示出了在培養(yǎng)物中用k562-mb21-41bbl作為飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生的外來體，其中pbmc被nk細胞吸收。k562-mb21-41bbl細胞用alexafluor647(af647)進行外部標記，與pbmc共孵育，然后用10倍物鏡在18小時內(nèi)成像。在數(shù)分鐘至約1小時之后的時間期間(圖5a)，觀察到了af647標記的聚結(jié)。幾小時后(圖5b)，觀察到了細胞內(nèi)內(nèi)體和多泡體的形成。隨后觀察到了無細胞的外來體(圖5c和圖5d)。從來自實時成像的共培養(yǎng)物獲得樣品，并用抗cd3和抗cd56染色，以及用熒光共焦顯微鏡成像(圖5e)。nk細胞已經(jīng)吸收或隨后結(jié)合af647標簽，而t細胞優(yōu)先地不如此做。檢查比所示出的更寬的區(qū)域的統(tǒng)計有效性，并對沿著z軸的10個切片成像以區(qū)分細胞內(nèi)和細胞外事件。箭頭指示培養(yǎng)物中的細胞內(nèi)和細胞外顆?；蛲鈦眢w。

具體實施方式

所公開的方法和組合物可以通過參考對具體實施方案的以下詳細描述和其中所包括的實施例以及參考附圖及其先前和以下描述而更容易地理解。在本文中所引用的所有參考文獻，包括pct/us2013/048678，全文并入本文中。

應(yīng)當理解，所公開的方法和組合物不限于特定的合成方法、特定的分析技術(shù)或特定試劑，除非另有說明，并且因此可以變化。另外應(yīng)當了解，本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實施例的目的，并非旨在進行限制。

供體淋巴細胞輸注介導(dǎo)的移植物抗腫瘤(gvt)效應(yīng)的很大一部分可能是由于自然殺傷(nk)細胞。從供體血液分離的nk細胞的輸注可以產(chǎn)生有益的gvt效應(yīng)，而不引起gvhd。臨床前數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)顯示nk細胞輸注的有效性，導(dǎo)致完全緩解而無任何gvhd。因此，nk細胞輸注，與自體同源移植相結(jié)合或作為獨立治療，為那些沒有匹配供體、經(jīng)歷復(fù)發(fā)或不符合移植資格的患者提供創(chuàng)新的和潛在非常有效的替代方案。

nk細胞的輸注是患有對nk細胞裂解敏感的癌癥(包括血液癌癥(諸如急性骨髓性白血病或多發(fā)性骨髓瘤))和若干種實體瘤(諸如腦腫瘤、尤文肉瘤和橫紋肌肉瘤)的患者的治療選項(harada，saijoetal.2002(harada、saijo等人，2002年)；ruggeri，capannietal.2002(ruggeri、capanni等人，2002年)；miller，soignieretal.2005(miller、soignier等人，2005年)；cho，shooketal.2010(cho、shook等人，2010年))。增加功能性nk細胞的數(shù)目也可以顯著增強用于治療若干種癌癥(包括淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌和乳腺癌等)的治療性抗體的療效(hatjiharissi，xuetal.2007(hatjiharissi、xu等人，2007年)；triulzi，vertuanietal.2010(triulzi、vertuani等人，2010年)；houot，kohrtetal.2011(houot、kohrt等人，2011年)；tai，hortonetal.2012(tai、horton等人，2012年))。然而，這些類型的個性化治療非常昂貴，其中典型的含抗體方案花費數(shù)萬美元。此外，由于在免疫失能的癌癥患者體內(nèi)缺乏免疫細胞參與，所以通常無法實現(xiàn)現(xiàn)有方法的預(yù)期功效(dewan，takadaetal.2009(dewan、takada等人，2009年)；mamessier，sylvainetal.2011(mamessier、sylvain等人，2011年))。

為了作為有效的癌癥治療方法，需要實現(xiàn)達到有效治療劑量的nk細胞擴增程度。若干項研究已經(jīng)表明，當受刺激的細胞因子(諸如il-15或il-21)和用于激活受體的配體(諸如4-1bbl)在刺激物細胞的表面上表達時，nk細胞在體外培養(yǎng)物中指數(shù)級地增殖并且優(yōu)先地在外周血單核細胞(pbmc)的混合物中指數(shù)級地增殖(imai，iwamotoetal.2005(imai，iwamoto等人，2005年)；choandcampana2009(cho和campana等人，2009年)；lee，vernerisetal.2010(lee，vemeris等人，2010年)；somanchi，senyukovetal.2011(somanchi，senyukov等人，2011年))。

對于細胞因子il-15和il-21，與在正常樹突細胞中一樣，膜結(jié)合的白細胞介素的交叉呈遞相較于這些細胞因子的可溶形式更有效地誘導(dǎo)nk細胞的擴增。此外，在這種刺激條件下，nk細胞存活僅需要低濃度的可溶性il-2，從而允許在pbmc混合物中選擇性擴增nk細胞，而沒有可觀察到的t細胞增殖。il-15和il-21細胞因子或高劑量il-2的可溶形式比nk細胞更有效地刺激t細胞增殖。campana及其同事以前發(fā)表的一項研究已經(jīng)表明，在體外培養(yǎng)中，用具有膜結(jié)合的il-15和4-1bbl的k562細胞系刺激nk細胞導(dǎo)致nk細胞有效擴增，而這是在使用單獨表達il-15和4-1bbl分子中的一種的k562細胞時未觀察到的(imai，iwamotoetal.2005(imai、iwamoto等人，2005年)；fujisaki，kakudaetal.2009(fujisaki、kakuda等人，2009年))。然而，nk細胞擴增僅限于若干次分裂，細胞達到衰老并停止增殖，與觀察到的端粒縮短一致。在后續(xù)研究中，發(fā)現(xiàn)用膜結(jié)合的1l-21代替il-15進行刺激刺激了nk細胞的無數(shù)代連續(xù)繁殖，從而允許nk細胞連續(xù)擴增，前提條件是用新鮮的刺激細胞周期性地補充培養(yǎng)物(somanchi，senyukovetal.2011(somanchi，senyukov等人，2011年)；denman，senyukovetal.2012(denman，senyukov等人，2012年))。雖然這些方法允許有效的體外nk細胞擴增，但對活飼養(yǎng)細胞的需要使得該方法難以轉(zhuǎn)用于不具有大型gmp設(shè)施和能力的臨床情況。此外，輸注到患者體內(nèi)的nk細胞將可能由于缺乏飼養(yǎng)細胞的持續(xù)刺激而停止分裂。此外，仍然缺乏關(guān)于體外培養(yǎng)的nk細胞在重新輸注到患者體內(nèi)時按照預(yù)期發(fā)揮功能的信息(miller，2009年)。目前，il-2施用是唯一被fda批準的nk細胞體內(nèi)擴增方法。il-15目前正在i期臨床試驗中作為il-2施用的替代方法進行測試，但是基于臨床前的發(fā)現(xiàn)，如果全身性施用，仍然預(yù)期會有顯著的毒性。因此，這兩種方法都對患者具有顯著的毒性并且還誘導(dǎo)t細胞(包括調(diào)節(jié)性t細胞)的增殖，從而導(dǎo)致nk細胞的短持久性(平均少于21天)。

成功的預(yù)實驗顯示，從供體血液中分離的純化nk細胞的輸注是安全的，并且可以導(dǎo)致完全緩解aml，而沒有g(shù)vhd。為了達到治療劑量，通過每日施用高劑量的il-2在淋巴細胞耗盡的患者中體內(nèi)擴增nk細胞。然而，淋巴細胞耗盡所需的強化調(diào)節(jié)方案和本研究中使用的高劑量il-2導(dǎo)致顯著的毒性和延長的住院治療，并且在許多情況下，nk細胞的體內(nèi)擴增較低。此外，il-2的全身性施用導(dǎo)致抑制nk細胞的數(shù)目和功能的調(diào)節(jié)性t細胞的增殖，從而限制nk細胞在患者體內(nèi)的持久性和效率。因此，需要用于nk細胞的體內(nèi)或離體擴增的替代方法。

nk細胞免疫治療的療效取決于施用給患者的nk細胞的劑量或在輸注后通過體內(nèi)擴增達到的nk細胞的劑量。目前可用的技術(shù)受到以下限制：所述技術(shù)無法達到在患者體內(nèi)實現(xiàn)治療效果所需的nk細胞擴增水平。缺乏更簡單的臨床擴增方案是基于nk細胞的免疫治療進展和廣泛傳播的主要障礙。目前的離體擴增方案使用高劑量細胞因子與在白血病來源的飼養(yǎng)細胞/刺激物細胞系上表達的活化配體的組合，從而對于在在大多數(shù)中心轉(zhuǎn)移到臨床環(huán)境中具有顯著的缺點，并且不適于直接體內(nèi)擴增。使用本文所述的顆粒技術(shù)(包括外來體)消除了對刺激物細胞的需要，從而簡化了方法并允許直接和選擇性的體內(nèi)擴增。

若干團體已尋求離體擴增nk細胞的方法。然而，大多數(shù)目前開發(fā)的離體方法依賴于在高濃度的各種細胞因子(主要是il-2)的存在下共培養(yǎng)腫瘤細胞系和nk細胞的體系(如在cho和campana，2009年；suck和koh，2010年中所評論的)。用于觸發(fā)nk細胞增殖的細胞包括受輻照的自體同源或同種異體pbmc、rpmi8866、hfwt、k562、k562-mb15-41bbl(用4-1bbl轉(zhuǎn)染并且膜結(jié)合il-15的k562)、k562-mb21-41bbl以及ebv-lcl(harada，saijoetal.2004(harada，saijo等人，2004年)；imai，iwamotoetal.2005(imai，iwamoto等人，2005年)；berg，lundqvistetal.2009(berg，lundqvist等人，2009年)；fujisaki，kakudaetal.2009(fujisaki，kakuda等人，2009年)；siegler，meyer-monardetal.2010(siegler，meyer-monard等人，2010年))。雖然nk細胞的擴增可能對于這些細胞系中的一些是顯著的(在7-21天內(nèi)為30倍至1萬倍)，但是由于需要花費數(shù)百萬美元的現(xiàn)行藥品優(yōu)良制造方案(cgmp)設(shè)施，飼養(yǎng)細胞的使用對于在大多數(shù)中心中轉(zhuǎn)移到臨床環(huán)境中具有顯著的缺點(在cho和campana，2009年；suck和koh，2010年中所評論的)。此外，飼養(yǎng)細胞的連續(xù)培養(yǎng)是昂貴的，并且需要專業(yè)人員的支持。美國國立衛(wèi)生研究院(nih)先前以細胞治療生產(chǎn)輔助(pact)的形式在用于細胞治療的細胞的制造中提供支持。然而，nk細胞看起來會在低溫貯藏期間失去其活性(pact研討會陳述)。因此，擴增的nk細胞從生產(chǎn)位置到移植中心的貯藏和運輸是成功應(yīng)用該療法的另一個障礙。一個另外的問題是將從這些轉(zhuǎn)化細胞和培養(yǎng)物組分(例如胎牛血清)釋放的活飼養(yǎng)細胞和/或遺傳物質(zhì)輸注到受體患者體內(nèi)的潛在可能性。

美天旎公司(miltenyibiotech)已經(jīng)引入了體外擴增試劑盒，其使用抗體包被的珠粒來交聯(lián)活化nk細胞受體。然而，這種方法需要使用高濃度的il-2。雖然對于實驗室應(yīng)用是有用的，但是因為使用高濃度細胞因子培養(yǎng)的nk細胞在輸注后由于細胞因子撤出而經(jīng)歷快速凋亡，所以該方法不能轉(zhuǎn)用到臨床環(huán)境中(miller，2009年)。

已經(jīng)報道了使用高濃度的il-2擴增pbmc內(nèi)的nk細胞，并在前5天用抗cd3抗體刺激(carlens，gilljametal.2001(carlens，gilljam等人，2001年)；alici，sutluetal.2008(alici，sutlu等人，2008年))?？傮wnk細胞擴增接近1000倍，但大多數(shù)nk細胞實際上是nk樣t細胞(berg和childs，2010年)。因此，所有這些方法對于轉(zhuǎn)移到臨床應(yīng)用存在重大困難，并且這些方法中沒有一種方法可用于直接體內(nèi)擴增。

用于增加nk細胞數(shù)量的方法

公開了用于增加nk細胞數(shù)量的方法，其包括使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，所述至少一種刺激nk的外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中所述外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物。

刺激肽

適用于本文公開的方法的刺激肽可包括但不限于nk細胞活化劑(即，刺激配體)細胞因子、或粘附分子。nk細胞活化劑和刺激肽的示例包括但不限于41bbl、il-2、il-12、il-21、il-18、mica、lfa-1、2b4、bcm/slamf2、ccr7和/或其他歸巢受體。細胞因子的示例包括但不限于il-2、il-12、il-21、以及il-18。粘附分子的實例包括但不限于lfa-1、mica、bcm/slamf2。在本發(fā)明的一個方面，外來體是用于運載刺激肽的媒介物。刺激肽可以存在于外來體膜中。雖然刺激肽是膜結(jié)合的，但其他治療劑或診斷劑可以在質(zhì)膜囊泡的內(nèi)部運輸。

與刺激肽偶聯(lián)的膜插入肽

公開了用于增加nk細胞數(shù)量的方法，其包括使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，所述至少一種刺激nk的外來體包含存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中所述外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物，并且其中所述一種或多種刺激肽可任選地與一種或多種膜插入肽偶聯(lián)。

膜插入肽可以是促進插入到膜中的分子。膜插入肽可以包含對脂質(zhì)雙層具有親和性的cd4或igg的區(qū)段。此外，替代的膜插入肽可以包括人fc、gpi、跨膜t細胞受體、或phlip。膜自插入肽可以是已知插入細胞膜的任何肽。取決于膜自入插肽綴合物的使用，某些膜自插入肽可能是比其他肽更好的選擇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解在不同情況下什么膜自插入肽是理想的。例如，對于體內(nèi)使用，phlip膜自插入肽可能是合適的。phlip膜自插入肽僅在低ph條件下插入膜中。因此，phlip綴合物在正常生理條件下不會插入細胞膜中。然而，注入到腫瘤環(huán)境中之后，phlip綴合物可以插入到腫瘤細胞的細胞膜中，這是因為腫瘤環(huán)境比正常的生理條件更具酸性。這種到腫瘤環(huán)境中的插入允許活化腫瘤區(qū)域中的nk細胞。因此，使用phlip防止不希望地插入到隨機細胞膜中。

膜插入肽可以以各種方式偶聯(lián)到一種或多種刺激肽，并且用于偶聯(lián)肽的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。與刺激肽偶聯(lián)的膜插入肽也可以稱為膜插入肽綴合物。在一些方面，與膜插入肽偶聯(lián)的所述一種或多種刺激肽可以包含由重組dna編碼的融合蛋白，并且這種融合蛋白可以在細菌細胞中產(chǎn)生。在某些實施方案中，融合蛋白可以由綴合或偶聯(lián)至親脂性分子(例如疏水性肽、gpi或人fc)的一種或多種刺激肽組成，以用于錨定到脂質(zhì)體或細胞膜內(nèi)(hunt，rathetal.1997(hunt、rath等人，1997年)；kueng，lebetal.2007(kueng、leb等人，2007年)；paulick，forstneretal.2007(paulick，forstner等人，2007年)；paulick，wiseetal.2007(paulick，wise等人，2007年)；reshetnyak，segalaetal.2007(reshetnyak，segala等人，2007年))。這些融合蛋白的cdna載體可以連接到表達質(zhì)粒內(nèi)，這允許在細菌(大腸桿菌)、昆蟲或哺乳動物細胞中表達。在某些實施方案中，cdna載體可以是用flag或his標記的。細菌細胞可以使用標準cacl轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染，如在sambrooketal.，molecularcloning：alaboratorymanual.2nded.coldspringharborlaboratorypress(1989)(sambrook等人，《分子克隆實驗指南》，第2版，冷泉港實驗室出版社(1989))中所描述的。細菌細胞也可以在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且可以收獲細胞并使用弗氏壓碎器(frenchpress)進行裂解。所關(guān)注的蛋白質(zhì)可以通過親和色譜法從裂解物中純化。棕櫚酸酯綴合的蛋白a和純化的fc融合蛋白可以如文獻中所述通過在4℃以1∶2(w/w)混合而綴合(參見kim&peacock，journalofimmunologicalmethods，1993jan.14；158(1)：57-65(kim和peacock，《免疫學方法雜志》，1993年1月14日；第158卷第1期，第57-65頁)和liuetal.，journalofimmunology，2007mar.1；178(5)；3301-3306(liu等人，《免疫學雜志》，2007年3月1日；第178卷第5期；第3301-3306頁))。然后綴合物可以被直接注入腫瘤內(nèi)或可并入脂質(zhì)體中。

偶聯(lián)的類型和偶聯(lián)方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。如本文所用，術(shù)語″偶聯(lián)″是指膜自插入肽被綴合、連接或以其他方式連接到另一分子實體(諸如肽或蛋白質(zhì))。例如，與刺激肽偶聯(lián)的膜插入肽可以是融合蛋白，其中膜插入肽通過二硫鍵與另一種蛋白質(zhì)偶聯(lián)。偶聯(lián)或綴合可意味膜自插入肽和nk細胞效應(yīng)劑之間存在化學鍵。

在一些方面，一種或多種刺激性肽可以與膜自插入肽或gpi錨定劑偶聯(lián)，以用于原位自組裝。例如，41-bbl和il-21可以與phlip肽偶聯(lián)，所述phlip肽在酸性條件下將其自身插入細胞膜中，從而允許將刺激配體錨定到腫瘤附近的細胞中。刺激肽41bbl、il-2、il-12、il-21、bcm/slamf2、ccr7和/或其他歸巢受體可以在細菌細胞中生產(chǎn)或從市售的來源購買，并且這些蛋白質(zhì)的cdna載體可以任選地連接到ptriex表達質(zhì)粒內(nèi)，此ptriex表達質(zhì)粒使得能夠在細菌(大腸桿菌)、昆蟲或哺乳動物細胞中表達。cdna載體可以編碼flag標簽或his標簽的表達。細菌細胞可以使用標準cacl轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染，并可在lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)?？梢允斋@細胞并使用弗氏壓碎器裂解，然后通過親和層析從裂解物中純化所關(guān)注的蛋白質(zhì)。

在一些實施方案中，phlip可以使用9-芴甲氧羰基化學物、通過固相肽合成制備，并且產(chǎn)物可以通過反相色譜法在c18柱上純化。然后可以通過與交聯(lián)劑如二苯甲酮-4-碘乙酰胺一起孵育來將phlip與刺激性人蛋白配體綴合。洗滌若干次后，可將綴合的phlip蛋白重新懸浮在培養(yǎng)基(例如鹽水)中，并以腫瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)注射?；趤碜袁F(xiàn)有文獻的證據(jù)(imai，iwamotoetal.2005(imai、iwamoto等人，2005年)；liu，breiteretal.2007(liu、breiter等人，2007年)；fujisaki，kakudaetal.2009(fujisaki、kakuda等人，2009年)；somanchi，senyukovetal.2011(somanchi、senyukov等人，2011年)；denman，senyukovetal.2012(denman、senyukov等人，2012年))以及在實驗結(jié)果中呈現(xiàn)的證據(jù)，nk細胞與刺激配體如il-21和41-bbl在這種經(jīng)修飾的腫瘤細胞的表面上的相互作用可以刺激原位nk細胞擴增并觸發(fā)nk細胞對腫瘤的細胞毒性反應(yīng)。這種刺激方法可用于治療實體腫瘤如卵巢癌，其中在酸性ph下原位插入腫瘤細胞的nk刺激配體可以單獨或與nk細胞一起被注入到具有低劑量il-2的患者的腹膜內(nèi)空間中(geller，cooleyetal.2011(geller、cooley等人，2011年))。有強有力的證據(jù)表明表達高水平的fcγiiir(cd16)的細胞毒性淋巴細胞(諸如nk細胞)對于使用治療性抗體進行癌癥治療的療效至關(guān)重要(kute，savageetal.2009(kute、savage等人，2009年)；reim，dombrowskietal.2009(reim、dombrowski等人，2009年)；mamessier，sylvainetal.2011(mamessier、sylvain等人，2011年))。因此，該方法也可與治療性抗體組合使用。

功能性核酸

本文公開了用于修飾nk細胞功能(例如，nk細胞活化)的方法，包括遞送調(diào)節(jié)nk細胞功能的功能性核酸。該方法可以涉及通過將nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸來將功能性核酸(包括但不限于sirna、shrna或mirna)遞送至nk細胞，其中刺激nk的外來體負載有功能性核酸。例如，在一些情況下，功能性核酸旨在調(diào)節(jié)a2ar、p2yr或它們的組合的表達水平。

功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，所述特定功能為例如結(jié)合靶分子或催化特異性反應(yīng)。功能性核酸分子可以分為以下類別，但這并不意味著限制。例如，功能性核酸包括反義分子、核酸配體、核糖酶，三鏈體形成分子、rnai、以及外部引導(dǎo)序列。功能性核酸分子可以充當靶分子所具有的比活性的影響因子、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和刺激劑，或者功能性核酸分子可以具有與任何其它分子無關(guān)的從頭合成活性。

功能性核酸分子可與任何大分子如dna、rna、多肽或碳水化合物鏈相互作用。因此，功能性核酸可以與mrna或基因組dna相互作用，或者它們可以與多肽相互作用。通常，功能性核酸被設(shè)計為基于靶分子和功能性核酸分子之間的序列同源性來與其他核酸相互作用。在其他情況下，功能性核酸分子和靶分子之間的特異性識別不是基于功能性核酸分子與靶分子之間的序列同源性，而是基于允許特異性識別發(fā)生的三級結(jié)構(gòu)的形成。

反義分子被設(shè)計為通過規(guī)范或非規(guī)范的堿基配對與靶核酸分子相互作用。反義分子和靶分子的相互作用被設(shè)計為通過例如rnaseh介導(dǎo)的rna-dna雜交降解來促進靶分子的破壞?；蛘?，反義分子被設(shè)計為中斷通常將在靶分子上發(fā)生的加工功能，諸如轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。反義分子可以基于靶分子的序列設(shè)計。存在用于通過找到靶分子最容易接近的區(qū)域來優(yōu)化反義效率的許多方法。示例性方法是使用dms和depc的體外選擇實驗和dna修飾研究。反義分子優(yōu)選以小于或等于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的解離常數(shù)(kd)結(jié)合靶分子。有助于反義分子設(shè)計和使用的方法和技術(shù)的代表性樣品可見于美國專利no.5,135,917、no.5,294,533、no.5,627,158、no.5,641,754、no.5,691，317、no.5,780,607、no.5,786,138、no.5,849,903、no.5,856,103、no.5,919,772、no.5,955,590、no.5,990,088、no.5,994,320、no.5,998,602、no.6,005,095、no.6,007,995、no.6,013,522、no.6,017,898、no.6,018,042、no.6,025,198、no.6,033,910、no.6,040,296、no.6,046,004、no.6,046,319、以及no.6,057,437。

核酸配體是優(yōu)選以特異性方式與靶分子相互作用的分子。通常，核酸配體是長度在15至50個堿基范圍內(nèi)的小核酸，該等小核酸折疊成限定的二級和三級結(jié)構(gòu)，例如莖環(huán)或g四分體。核酸配體可以結(jié)合小分子如atp(美國專利no.5,631,146)和茶堿(theophiline)(美國專利no.5,580,737)，以及大分子如逆轉(zhuǎn)錄酶(美國專利no.5,786,462)和凝血酶(美國專利5,543,293)。核酸配體可以來自小于10^-12m的靶分子的kd非常緊密地結(jié)合。優(yōu)選的是，核酸配體以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的kd與靶分子結(jié)合。核酸配體可以以非常高的特異性程度結(jié)合靶分子。例如，已經(jīng)分離了在靶分子與僅在分子上單個位置處不同的另一個分子之間具有大于10,000倍的結(jié)合親和力差異的核酸配體(美國專利no.5,543,293)。優(yōu)選的是，核酸配體與靶分子的kd比與背景結(jié)合分子的kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。當進行例如多肽的比較時，優(yōu)選的是，背景分子是不同的多肽。如何制備和使用核酸配體結(jié)合各種不同靶分子的代表性示例可見于美國專利no.5,476,766、no.5,503,978、no.5,631,146、no.5,731,424、no.5,780,228、no.5,792,613、no.5,795,721、no.5,846,713、no.5,858,660、no.5,861,254、no.5,864,026、no.5,869,641、no.5,958,691、no.6,001,988、no.6,011,020、no.6,013,443、no.6,020,130、no.6,028,186、no.6,030,776、以及no.6,051,698。

核糖酶是能夠在分子內(nèi)或分子間催化化學反應(yīng)的核酸分子。因此核糖酶是催化核酸。優(yōu)選地，核糖酶催化分子間反應(yīng)。存在許多不同類型的核糖酶，所述核糖酶催化基于在天然體系中存在的核糖酶的核酸酶或核酸聚合酶型反應(yīng)，所述天然體系中存在的核糖酶為諸如錘頭核酶(美國專利no.5,334,711、no.5,436,330、no.5,616,466、no.5,633,133、no.5,646,020、no.5,652,094、no.5,712,384、no.5,770,715、no.5,856,463、no.5,861,288、no.5,891,683、no.5,891,684、no.5,985,621、no.5,989,908、no.5,998,193、no.5,998,203；ludwig和sproat所有的國際專利申請no.wo9858058，ludwig和sproat所有的wo9858057，以及l(fā)udwig和sproat所有的wo9718312)、發(fā)夾核酶(例如美國專利no.5,631,115、no.5,646,031、no.5,683,902、no.5,712,384、no.5,856,188、no.5,866,701、no.5,869,339、以及no.6,022,962)、以及四膜蟲核糖酶(例如美國專利no.5,595,873和no.5,652,107)。還有許多核糖酶在天然體系中不存在，但已被工程化用于催化特異性的從頭合成反應(yīng)(例如美國專利no.5,580,967、no.5,688,670、no.5,807,718、以及no.5,910,408)。優(yōu)選的核糖酶切割rna或dna底物，更優(yōu)選切割rna底物。核糖酶通常通過識別和結(jié)合靶底物以及后續(xù)切割來切割核酸底物。這種識別通常主要基于規(guī)范或非規(guī)范的堿基對相互作用。該特性使得核糖酶成為用于核酸靶向特異性切割的特別好的候選物，因為靶底物的識別基于該靶底物序列。如何制作和使用核糖酶來催化各種不同反應(yīng)的代表性示例可見于美國專利no.5,646,042、no.5,693,535、no.5,731,295、no.5,811,300、no.5,837,855、no.5,869,253、no.5,877,021、no.5,877,022、no.5,972,699、no.5,972,704、no.5,989,906、以及no.6,017,756。

三鏈體形成功能性核酸分子是能夠與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當三鏈體分子與靶區(qū)域相互作用時，形成了稱為三鏈體的結(jié)構(gòu)，其中有三條dna鏈依賴于watson-crick和hoogsteen堿基配對兩者形成復(fù)合體。三鏈體分子是優(yōu)選的，因為它們可以以高親和力和特異性結(jié)合靶區(qū)域。三鏈體形成分子優(yōu)選以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的kd結(jié)合靶分子。如何制作和使用三鏈體形成分子來結(jié)合各種不同靶分子的代表性示例可見于美國專利no.5,176,996、no.5,645,985、no.5,650,316、no.5,683,874、no.5,693,773、no.5,834,185、no.5,869,246、no.5,874,566、以及no.5,962,426。

外部引導(dǎo)序列(egs)是結(jié)合靶核酸分子以形成復(fù)合物的分子，并且此復(fù)合物由切割靶分子的rna酶p識別。egs可以設(shè)計成特異性地靶向所選擇的rna分子。rna酶p有助于處理細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運rna(trna)。可以募集細菌rna酶p，以通過使用egs來切割幾乎任何rna序列，該egs導(dǎo)致靶rna：egs復(fù)合物模擬天然trna底物。(wo92/03566byyale，andforsterandaltman，science238：407-409(1990)(wo92/03566，yale和forster和altman，《科學》，第238卷，第407-409頁，1990年))。

類似地，可以利用真核egs/rna酶p指導(dǎo)的對rna的切割來切割真核細胞內(nèi)的期望靶。(yuanetal.，proc.natl.acad.sci.usa89：8006-8010(1992)(yuan等人，《美國國家科學院院刊》，第89卷，第8006-8010頁，1992年)；yale所有的wo93/22434；yale所有的wo95/24489；yuanandaltman，emboj14：159-168(1995)(yuan和altman，《歐洲分子生物學學會雜志》14：159-168(1995))、以及carraraetal.，proc.natl.acad.sci.(usa)92：2627-2631(1995)(carrara等人，《美國國家科學院院刊》，第92卷，第2627-2631頁，1995年)。如何制作和使用egs分子以促進對各種不同靶分子的切割的代表性示例可見于美國專利no.5,168,053、no.5,624,824、no.5,683,873、no.5,728,521、no.5,869,248、以及no.5,877,162。

基因表達也可以通過rna干擾(rnai)以高度特異性方式有效地沉默。此沉默最初在加入雙鏈rna(dsrna)時觀察到(fire，a.，etal.(1998)nature，391：806-11(fire，a.等人，1998年，《自然》，第391卷，第806-11頁)；napoli，c.，etal.(1990)plantcell2：279-89(napoli，c.等人，1990年，《植物細胞》，第2卷，第279-89頁)；hannon，g.j.(2002)nature，418：244-51(hannon，g.j.，2002年，《自然》，第418卷，第244-51頁))。一旦dsrna進入細胞，其就被rna酶iii樣酶dicer切割成長度為21至23個核苷酸的雙鏈小干擾rna(sirna)，該sirna在3′末端上含有2個核苷酸懸垂(elbashir，s.m.，etal.(2001)genesdev.，15：188-200(elbashir，s.m.等人，2001年，《基因與發(fā)育》，第15卷，第188-200頁)；bernstein，e.，etal.(2001)nature，409：363-6(bernstein，e.等人，2001年，《自然》，第409卷，第363-6頁)；hammond，s.m.，etal.(2000)nature，404：293-6(hammond，s.m.等人，2000年，《自然》，第404卷，第293-6頁))。在atp依賴性步驟中，sirna變成整合到多亞基蛋白復(fù)合物中，該多亞基蛋白復(fù)合物通常稱為rnai誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(risc)，其將sirna引導(dǎo)至靶rna序列(nykanen，a.，etal.(2001)cell，107：309-21(nykanen，a.等人，2001年，《細胞》，第107卷，第309-21頁))。在一些時刻，sirna雙鏈體解開，并且看起來反義鏈保持與risc結(jié)合并通過內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶的組合引導(dǎo)互補mrna序列的降解(martinez，j.，etal.(2002)cell，110：563-74(martinez，j.等人，2002年，《細胞》，第110卷，第563-74頁))。然而，irna或sirna的效應(yīng)或其用途不限于任何類型的機制。

短干擾rna(sirna)是可以誘導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而降低或甚至抑制基因表達的雙鏈rna。在一個示例中，sirna在sirna和靶rna兩者之間的序列同一性區(qū)域內(nèi)觸發(fā)同源rna分子(諸如mrna)的特異性降解。例如，wo02/44321公開了當與3′懸垂末端堿基配對時能夠序列特異性降解靶mrna的sirna，該專利文獻以引用方式并入以用于制備這些sirna的方法。使用合成的短雙鏈rna可以在哺乳動物細胞中實現(xiàn)序列特異性基因沉默，該合成的短雙鏈rna模擬由酶dicer產(chǎn)生的sirna(elbashir，s.m.，etal.(2001)nature，411：494498(elbashir，s.m.等人，2001年，《自然》，第411卷，第494-498頁))(ui-tei，k.，etal.(2000)febslett479：79-82(ui-tei，k.等人，2000年，《歐洲生化學會聯(lián)合會快報》，第479卷，第79-82頁))。sirna可以是化學或體外合成的，或者可以是在細胞內(nèi)將短雙鏈發(fā)夾樣rna(shrna)加工成sirna的結(jié)果。合成sirna通常使用算法和常規(guī)dna/rna合成儀進行設(shè)計。供應(yīng)商包括ambion公司(德克薩斯州奧斯汀(austin，texas))、chemgenes公司(馬薩諸塞州亞什蘭(ashland，massachusetts))、dharmacon公司(科羅拉多州拉斐特(lafayette，colorado))、glenresearch公司(弗吉尼亞州斯特林(sterling，virginia))，mwbbiotech公司(德國埃伯斯貝格(esbersberg，germany))、proligo公司(科羅拉多州博爾德)和qiagen公司(荷蘭文托(vento，thenetherlands))。也可以使用試劑盒(諸如ambion公司的sirna構(gòu)建試劑盒(ambion’ssirnaconstructionkit))體外合成sirna。

從載體產(chǎn)生sirna更通常地是通過短發(fā)夾rna(shrna)的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的。用于產(chǎn)生包含shrna的載體的試劑盒是可得的，例如，imgenex公司的genesuppressor^tm構(gòu)建試劑盒和invitrogen公司的block-it^tm可誘導(dǎo)型rnai質(zhì)粒和慢病毒載體。本文公開了基于本文公開的炎性介質(zhì)的序列如上所述設(shè)計的任何shrna。

nk細胞

公開了用于增加nk細胞數(shù)目的方法，其包括使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，所述至少一種刺激nk的外來體包括存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中所述外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物，并且其中nk細胞存在于未選擇的外周血單核細胞(pbmc)的群體中。

人nk細胞是由cd56或cd16的表達限定并且不存在t細胞受體(cd3)的外周血淋巴細胞的一個子集(ljunggrenandmalmberg2007(ljunggren和malmberg，2007年)；woanandreddy2007(woan和reddy，2007年))。nk細胞感知和殺傷缺乏主要組織相容性復(fù)合體(mhc)i類分子的靶細胞。nk細胞活化受體包括天然細胞毒性受體(nkp30、nkp44和nkp46)\以及凝集素樣受體nkg2d和dnam-1等等。它們的配體在應(yīng)激的、轉(zhuǎn)化的或感染的細胞上表達，而不在正常細胞上表達，從而使得正常細胞對nk細胞殺傷具有抗性(bottino，castriconietal.2005(bottino，castriconi等人，2005年)；gasser，orsulicetal.2005(gasser，orsulic等人，2005年)；lanier2005(lanier，2005年))。nk細胞活化通過抑制性受體如殺傷性免疫球蛋白(ig)樣受體(kir)、nkg2a/cd94和白細胞ig樣受體-1(lir-1)負調(diào)控。一種抑制性受體的結(jié)合可能足以防止靶裂解(bryceson，ljunggrenetal.2009(bryceson，ljunggren等人，2009年))。因此，nk細胞有效地靶向表達許多應(yīng)激誘導(dǎo)配體、以及少數(shù)mhci類配體的細胞。

nk細胞通過各種不同方法有效地破壞腫瘤細胞、應(yīng)激細胞和病毒感染的細胞。第一種方法是通過直接接合靶細胞、滲透靶細胞的膜，然后注入切割和活化若干種凋亡蛋白的蛋白質(zhì)，從而啟動靶細胞的程序性細胞死亡(細胞凋亡)。nk細胞的表面還含有能夠結(jié)合和活化受體的蛋白質(zhì)配體，所述受體為例如腫瘤壞死因子(tnf)相關(guān)的細胞凋亡誘導(dǎo)配體(trail)的蛋白質(zhì)配體，該蛋白質(zhì)配體在靶細胞上開啟關(guān)于凋亡性程序化細胞死亡的內(nèi)部信號。當被刺激時，nk細胞也可以分泌細胞因子如infγ和tnfα，所述細胞因子不僅抑制病毒和腫瘤，而且還發(fā)信號通知對其他免疫細胞的侵入。nk細胞的這種廣泛和多模式的抗癌活性使其受到醫(yī)療領(lǐng)域的極大關(guān)注。

由于nk細胞在免疫系統(tǒng)中具有突出的作用，所以增加nk細胞數(shù)目的能力提供了治療機會，所述治療機會在使用少量nk細胞時是不可能的或不太有效的。

外來體

如本文所公開的，用于增加nk細胞的數(shù)目的方法包括使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸。本文利用的外來體包括存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，并且所述外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物。在某些實施方案中，外來體由經(jīng)工程化以改善外來體形成或釋放的細胞系產(chǎn)生；此類細胞系包括但不限于細胞系k562-mb15-41bbl或細胞系k562-mb21-41bbl。外來體是由許多不同類型的細胞分泌的天然媒介物，并且存在于各種體液中(用tex(腫瘤來源的外來體)產(chǎn)生的t細胞免疫調(diào)節(jié)和nk(自然殺傷)細胞活性(whitesidetl，biochemsoctrans.2013feb1；41(1)：245-51(whitesidetl，《生物化學協(xié)會學報》，2013年2月1日，第41卷第1期，第245-51頁))。外來體的分泌通過高度調(diào)節(jié)的過程起作用，并且所產(chǎn)生的顆粒的粒度在30nm至100nm之間。外來體由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，并且在特定外來體中存在的蛋白質(zhì)的種類取決于產(chǎn)生它們的細胞。在特定外來體中存在的蛋白質(zhì)的種類和組成決定了外來體如何發(fā)信號通知、影響以及與其他細胞相互作用。外來體已被表征為調(diào)節(jié)免疫細胞和腫瘤細胞，并且可用于操縱免疫細胞和腫瘤細胞的生物活性。

與其他較大粒度的質(zhì)膜顆粒相比，外來體的較小尺寸將可能增加外來體穿過生理屏障的擴散和外來體的生物分布。此外，由于外來體的尺寸較小，靜脈內(nèi)注射外來體是可能的，這可以改善nk細胞擴增和在循環(huán)系統(tǒng)中的生物分布。

在一些情況下，外來體的直徑為30nm至100nm。

外來體的使用

公開了用于增加nk細胞數(shù)目的方法，其包括使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，所述至少一種刺激nk的外來體包括存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中所述外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物，并且其中nk細胞體外、體內(nèi)或離體地與刺激nk的外來體接觸。nk細胞可以在同種異體移植手術(shù)，單倍體相合移植手術(shù)或體內(nèi)免疫療法程序中與刺激nk的外來體接觸。在一些方面，在同種異體移植、單倍體相合移植或體內(nèi)免疫療法中使用刺激nk的外來體不會引起移植物抗宿主病(gvhd)。

治療方法

公開了用于治療對nk介導(dǎo)的裂解敏感的細胞的方法，所述方法包括施用有效量的包含經(jīng)接觸的nk細胞的組合物，其中經(jīng)接觸的nk細胞是通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生的：使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，該外來體包括存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中該外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物。在一些方面，對nk介導(dǎo)的裂解敏感的細胞可能被病毒感染。所述對nk介導(dǎo)的裂解敏感的細胞可包括aml細胞、乳腺細胞、膀胱細胞、結(jié)腸和直腸細胞、腎細胞、肺細胞、前列腺細胞、甲狀腺細胞、以及子宮癌細胞。

公開了用于降低干細胞移植后復(fù)發(fā)風險以及提供輔助治療的方法，所述方法包括施用有效量的包含經(jīng)接觸的nk細胞的組合物，其中經(jīng)接觸的nk細胞是通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生的：使至少一個nk細胞與至少一種刺激nk的外來體接觸，該外來體包括存在于外來體膜中的一種或多種刺激肽，其中該外來體是分泌外來體的細胞的胞外產(chǎn)物。

擴增的nk細胞、用于增加nk細胞數(shù)目的組合物和/或方法可用作用于具有對nk細胞介導(dǎo)的裂解敏感的癌癥的患者以及已經(jīng)經(jīng)歷造血干細胞移植的患者的治療方法。nk細胞擴增組合物和方法可以用于增加干細胞移植后細胞毒性nk細胞的量，以增加對殘留腫瘤細胞的清除和/或用于復(fù)發(fā)預(yù)防。nk細胞擴增組合物和方法也可用于治療具有病毒感染的患者。

nk細胞擴增組合物和方法可用作nk細胞輸注后的治療方法，以增加細胞毒性nk細胞的數(shù)目和體內(nèi)持久性，從而增強nk細胞治療的療效(即，達到緩解和/或保持緩解的患者數(shù)目)。

含有或不含有nk細胞擴增組合物的nk細胞將與治療性抗體組合用于治療各種癌癥，以增加應(yīng)答治療性抗體治療的患者的數(shù)目并實現(xiàn)緩解和/或保持緩解，所述癌癥包括但不限于淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌、結(jié)腸癌、頭頸腫瘤、以及乳腺癌。

擴增nk細胞的方法有利于治療癌癥、治療病毒感染、研究nk細胞、治療多發(fā)性硬化癥、免疫監(jiān)視、以及治療移植物抗宿主病。任何nk細胞相關(guān)疾病都可以通過nk細胞的擴增來治療或影響。例如，可以用所公開的組合物治療已知具有增多的活化t細胞的疾病(諸如多發(fā)性硬化癥)，因為這些組合物導(dǎo)致靶向和殺傷活化t細胞的nk細胞的擴增。因此，所公開的組合物可用于減少活化的t細胞。

產(chǎn)生外來體的方法

公開了用于產(chǎn)生刺激nk細胞的外來體的方法，包括在外來體的膜中包埋一種或多種刺激肽。該等刺激肽可以包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica/b、ulbp2、icam-1、2b4、bcm1/slamf2、cd155、cd112、ccr7和/或其他歸巢受體、dap12、dap10和/或其他銜接蛋白。刺激肽可以任選地與一個或多個膜插入肽偶聯(lián)。膜插入肽可以包括對脂質(zhì)雙層具有親和力的cd4或igg。此外，替代的膜插入肽可以包括人fc、gpi、跨膜t細胞受體、或phlip。與所述一個或多個膜插入肽偶聯(lián)的所述一種或多種刺激肽可以包括由重組dna編碼的融合蛋白。在一些方面，刺激nk細胞的外來體可以來自經(jīng)工程化以改善外來體表達的細胞系：例如，刺激nk細胞的外來體可以來自細胞系k562-mb21-41bbl。

外來體是由許多不同類型的細胞分泌的天然媒介物，并且存在于各種體液中(whiteside2013(whiteside，2013年))。外來體由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，并且在特定外來體中存在的蛋白質(zhì)的種類取決于產(chǎn)生它們的細胞。因此，表達刺激肽的細胞系和/或與膜插入肽偶聯(lián)的刺激肽可以產(chǎn)生具有嵌入在外來體膜中的一種或多種刺激肽的外來體。

可以使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來制備外來體。例如，細胞分泌的外來體可以通過過濾從細胞培養(yǎng)基中分離(圖1)?？梢允褂糜糜谥苽渫鈦眢w的常規(guī)方案。

用于治療癌癥的方法和外來體組合物

公開了用于治療癌癥的方法，其包括施用有效量的包含刺激nk的外來體的組合物，所述外來體包括一種或多種刺激肽。刺激nk的外來體的使用可以包括向受試者施用刺激nk的外來體(圖1)。在一些方面，刺激nk的外來體的使用可以包括；使刺激nk的外來體離體地接觸nk細胞以獲得經(jīng)接觸的nk細胞群體，以及將該經(jīng)接觸的nk細胞群體施用于受試者(圖1)。

公開了包含刺激nk的外來體的組合物，所述外來體包括一種或多種刺激肽。所述一種或多種刺激性肽可以包括4-1bbl、il-2、il-12、il-18、il-21、mica、2b4、bcm1/slamf2、ccr7和/或其他歸巢受體。刺激肽可任選地與一個或多個膜插入肽偶聯(lián)。膜插入肽可以包含對脂質(zhì)雙層具有親和力的cd4或igg的區(qū)段?；蛘撸げ迦腚目梢园ㄈ薴c、gpi、跨膜t細胞受體、或phlip。與膜插入肽偶聯(lián)的所述一種或多種刺激肽可以是由重組dna編碼的融合蛋白。刺激nk的外來體可以來自經(jīng)工程化以改善外來體表達的細胞系。刺激nk的外來體可以來自細胞系k562-mb21-41bbl。在一些方面，所述組合物還可以包含藥用載體。

可以發(fā)生用包含包括一種或多種刺激肽的刺激nk的外來體的組合物治療癌癥，這是因為在這些組合物存在下nk細胞的擴增或數(shù)目增加。nk細胞的擴增導(dǎo)致更多的nk細胞能夠靶向和殺傷腫瘤細胞，從而減少腫瘤細胞并最終治療癌癥或預(yù)防復(fù)發(fā)。

本文公開的包含包括一種或多種刺激肽的刺激nk的外來體的組合物可提供預(yù)防效果。已知nk細胞提供免疫監(jiān)視。因此，施用導(dǎo)致nk細胞擴增的組合物允許更多的nk細胞提供免疫監(jiān)視并在癌癥發(fā)生之前靶向和殺傷癌前細胞。

在一些方面，刺激nk的外來體的使用可以包括通過直接注射刺激nk的外來體來向受試者施用刺激nk的外來體，以引起體內(nèi)nk細胞擴增。

在一些方面，刺激nk的外來體的使用可以包括將所公開的組合物在體外或離體地施用于細胞群體，以及然后將這些經(jīng)處理的細胞施用于受試者。例如，包含刺激nk的外來體的組合物可以施用至來自通過單采血液成分術(shù)從供體分離的pbmc的nk細胞，并且可以在同種異體或單倍體相合移植手術(shù)中將經(jīng)接觸的nk細胞輸注到患者體內(nèi)(圖1)。該組合物也可以施用至來自通過單采血液成分術(shù)從患者分離的pbmc的nk細胞，并且可以將經(jīng)接觸的nk細胞輸注到患者體內(nèi)(圖1)。

施用

所公開的組合物可以體外或體內(nèi)施用。在一些方面，所述方法包括體外和體內(nèi)施用的組合。所述組合物可以在藥學上可接受的載體中體內(nèi)施用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，術(shù)語″藥學上可接受的″包括在生物學上或其他方面不是不期望的材料，即可以將所述材料與外來體或膜自插入肽綴合物一起施用于受試者，而不引起任何不期望的生物效應(yīng)或不與含有其的藥物組合物中的任何其他成分以有害的方式相互作用。自然地選擇載體以使活性成分的任何降解最小化，并且使對受試者的任何不良副作用最小化，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。

本文公開的組合物可以口服、非腸道(例如靜脈內(nèi))施用、通過肌內(nèi)注射施用、通過腹膜內(nèi)注射施用、通過瘤內(nèi)注射施用、鼻內(nèi)施用、體外施用、局部施用等，包括局部鼻內(nèi)施用或用吸入劑施用。如本文所用，″局部鼻內(nèi)施用″包括通過兩個鼻孔中的一個或兩個將組合物遞送到鼻和鼻腔通道內(nèi)，并且可以包括用噴涂機制或液滴機制進行遞送，或通過質(zhì)膜囊泡的霧化。通過吸入劑施用組合物可以是通過用噴霧或液滴機制進行遞送而經(jīng)鼻或經(jīng)口的。也可以通過插管法直接遞送到呼吸系統(tǒng)的任何區(qū)域(例如肺)。所需組合物的精確量將根據(jù)受試者的物種、年齡、體重和一般狀況、所治療的病癥的嚴重程度、所使用的具體組合物、其給藥模式等而在不同受試者之間變化。在給定本文的教導(dǎo)的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以僅使用常規(guī)實驗來確定適當?shù)牧俊?/p>

藥用載體

本文所公開的組合物可以與藥學上可接受的載體在治療學上結(jié)合使用。

合適的載體及其制劑描述于例如remington：thescienceandpracticeofpharmacy(19thed.)ed.a.r.gennaro，mackpublishingcompany，easton，pa.1995(《雷明頓：藥物科學與實踐》，第19版，a.r.gennaro編輯，麥克出版公司，賓夕法尼亞州伊斯頓，1995年)。通常，在制劑中使用適當量的可藥用的鹽以使制劑等滲。藥學上可接受的載體的示例包括但不限于鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的ph優(yōu)選為約5至約8，更優(yōu)選約7至約7.5。其他載體包括緩釋制劑，諸如含有抗體的半透性固體疏水性聚合物基質(zhì)，所述基質(zhì)為成形制品形式，例如膜、脂質(zhì)體或微粒。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見的是，根據(jù)例如給藥途徑和所施用組合物的濃度，某些載體可能是更優(yōu)選的。

藥用載體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。這些藥用載體最典型地將是用于向人類施用藥物的標準載體，包括溶液如生理ph下的無菌水、鹽水以及緩沖溶液等。組合物可以肌內(nèi)或皮下施用。其他化合物將根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所使用的標準方法施用。

除了所選擇的分子之外，藥物組合物還可以包括載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。藥物組合物還可以包括一種或多種活性成分，諸如抗微生物劑、消炎藥、麻醉劑等。

藥物組合物可以以多種方式施用，具體取決于需要局部還是全身性治療、以及將治療的區(qū)域?？梢跃植康?包括經(jīng)眼地、經(jīng)陰道地、經(jīng)直腸地、鼻內(nèi)給藥)、口服、通過吸入或非腸道地施用，所述非腸道施用為例如通過靜脈滴注、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射。所公開的抗體可以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或鼻內(nèi)施用。

非腸道施用的制劑包括無菌水性溶液或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、以及可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非腸道媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格氏液、或固定油。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營養(yǎng)補充劑，電解質(zhì)補充劑(諸如基于林格氏葡萄糖的那些)等等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、以及惰性氣體等。

用于局部給藥的制劑可以包括膏劑、洗劑、霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴劑、液劑和粉劑。常規(guī)的藥用載體、水性、粉末或油性基料、增稠劑等可能是必要或期望的。

用于口服施用的組合物包括粉末或顆粒劑、水或非水介質(zhì)中的懸浮劑或溶液劑、膠囊劑、小藥囊或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是所需的。

一些組合物可以潛在地作為藥學上可接受的酸或堿加成鹽施用，所述酸或堿加成鹽是通過與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有機酸(諸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和富馬酸)反應(yīng)，或通過與無機堿(諸如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀)和有機堿(諸如單烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺)反應(yīng)形成的。

聯(lián)合治療

公開了治療癌癥、病毒感染、多發(fā)性硬化和移植物抗宿主病的方法，其包括將所公開的組合物中的一種與用于所治療的疾病或病癥的已知治療劑聯(lián)合施用于受試者。例如，公開了用于治療癌癥的方法，其包括聯(lián)合施用有效量的包含刺激nk的外來體的組合物以及已知的癌癥治療劑，所述刺激nk的外來體包括一種或多種刺激肽，所述已知的癌癥治療劑為諸如但不限于化學治療劑、免疫治療劑、放射療法或疼痛治療劑。

存在兩種不同類型的免疫療法：被動免疫療法使用免疫系統(tǒng)的組分來指導(dǎo)針對癌細胞的靶向細胞毒性活性，而不必在患者體內(nèi)啟動免疫應(yīng)答，而主動免疫療法主動觸發(fā)內(nèi)源性免疫應(yīng)答。被動策略包括使用由b細胞響應(yīng)于特異性抗原產(chǎn)生的單克隆抗體(mab)。20世紀70年代雜交瘤技術(shù)的發(fā)展和對腫瘤特異性抗原的鑒定允許對可以特異性地靶向腫瘤細胞以由免疫系統(tǒng)破壞腫瘤細胞的mab的藥物開發(fā)。到目前為止，mab是免疫療法的最大成功案例；2012年排名前三的暢銷抗癌藥物是mab。mab包括利妥昔單抗(美羅華，基因工程科技公司(rituxan，genentech))，其與在b細胞惡性腫瘤(諸如非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)等)表面上高度表達的cd20蛋白結(jié)合。利妥昔單抗經(jīng)fda批準與化學療法一起聯(lián)合用于治療nhl和慢性淋巴細胞白血病(cll)。另一種重要的mab是曲妥單抗(赫塞?。换蚬こ炭萍脊?herceptin；genentech))，其通過靶向her2的表達來改革對her2(人表皮生長因子受體2)陽性乳腺癌的治療。

產(chǎn)生最佳的″殺傷″cd8t細胞應(yīng)答也需要t細胞受體活化加共刺激，這可以通過連接腫瘤壞死因子受體家族成員(包括ox40(cd134)和4-1bb(cd137))來提供。ox40是特別受關(guān)注的，因為用激活(激動劑)抗ox40mab進行治療增強了t細胞分化和細胞溶解功能，從而導(dǎo)致了對各種腫瘤增強的抗腫瘤免疫力。

在一些實施方案中，將所公開的疫苗與過繼細胞療法(act)聯(lián)合使用，所述act為諸如嵌合抗原受體(car)、t細胞受體(tcr)、以及腫瘤浸潤淋巴細胞(til)。

術(shù)語″腫瘤浸潤淋巴細胞″或″til″是指已經(jīng)離開血流并遷移到腫瘤中的白血細胞。可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種來實現(xiàn)淋巴細胞的擴增，所述淋巴細胞包括腫瘤浸潤性淋巴細胞，諸如t細胞。例如，在飼養(yǎng)淋巴細胞和白介素-2(il-2)、il-7、il-15、il-21或它們的組合的存在下，可以使用非特異性t細胞受體刺激來快速擴增t細胞。非特異性t細胞受體刺激可以例如包括約30ng/ml的okt3，okt3為一種小鼠單克隆抗cd3抗體(可購自新澤西州拉里坦的ortho-mcneil(r)公司(ortho-mcneil(r)，raritan，n.j.)或德國貝爾吉施格拉德巴赫的美天旎生物技術(shù)公司(miltenyibiotec，bergischgladbach，germany)?；蛘撸梢栽趖細胞生長因子(諸如約200-4001u/ml，如3001u/ml的il-2或il-15，優(yōu)選為il-2)的存在下，通過用一種或多種抗原(包括其抗原性部分，諸如表位或癌細胞，其可任選地表達自載體，諸如人白細胞抗原a2(hla-a2)結(jié)合肽，例如約0.3μm的mart-1：26-35(27l)或gp100：209-217(210m))體外刺激外周血單核細胞(pbmc)來迅速擴增t細胞。體外誘導(dǎo)的t細胞通過用脈沖到表達hla-a2的抗原呈遞細胞上的相同癌癥抗原進行再刺激來迅速擴增?；蛘?，t細胞可以例如用經(jīng)輻射的自體同源淋巴細胞或用經(jīng)輻射的hla-a2+同種異體淋巴細胞和il-2再刺激?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過在與腫瘤細胞共培養(yǎng)后測量細胞因子釋放(例如，干擾素-γ)，來測試擴增的til的特異性腫瘤反應(yīng)性。在一個實施方案中，自體同源act方法包括在細胞快速擴增之前富集所培養(yǎng)的cd8+t細胞的til。在il-2中培養(yǎng)til后，使用例如cd8微珠分離(例如，使用clinimacs+cd8微珠系統(tǒng)(美天旎生物技術(shù)公司))，t細胞中耗盡cd4+細胞并富集cd8+細胞。在一些實施方案中，將促進自體同源t細胞的生長和活化的t細胞生長因子與自體同源t細胞同時或在自體同源t細胞之后施用于哺乳動物。t細胞生長因子可以是促進自體同源t細胞生長和活化的任何合適的生長因子。合適的t細胞生長因子的示例包括白介素(il)-2、il-7、il-15、il-12和il-21，其可以單獨使用或以各種組合使用，諸如il-2和il-7，il-2和il-15，il-7和il-15，il-2、il-7和il-15，il-12和il-7，il-12和il-15、或il-12和il2。

許多抗癌藥物也可與本發(fā)明的方法和組合物聯(lián)合使用。以下是可以與輻射結(jié)合使用的抗癌(抗腫瘤)藥物的不完全列表：阿西維辛；阿柔比星；鹽酸阿可達佐；阿克羅寧(acrqnine)；阿多來新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌(ametantroneacetate)；氨魯米特；安吖啶；阿納托唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；芐替哌；比卡魯胺；鹽酸必?？?；雙奈法德；比折來新；硫酸博萊霉素；布喹那鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素；卡普睪酮；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉑；卡氮芥；鹽酸卡米諾霉素；卡折來新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西羅霉素；順鉑；克拉屈濱；甲磺酸克立那托(crisnatolmesylate)；環(huán)磷酰胺；阿糖孢苷；達卡巴嗪；更生霉素；鹽酸柔紅霉素；地西他濱；右奧馬鉑；地扎胍寧；甲磺酸地扎胍寧(dezaguaninemesylate)；地吖醌；多西他賽；阿霉素；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬；枸櫞酸屈洛昔芬；屈他雄酮丙酸酯；達佐霉素；依達曲沙；鹽酸依氟鳥氨酸；依沙蘆星；恩洛鉑；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表柔比星；厄布洛唑；鹽酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑；乙碘油i131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜寧；鹽酸法屈唑；法扎拉濱；芬維a胺；氟尿苷；磷酸氟達拉濱；氟二氧嘧啶；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；金au198(goldau198)；羥基脲；鹽酸伊達比星；異環(huán)磷酰胺；伊莫福新；異丙鉑；鹽酸伊立替康；醋酸蘭瑞肽；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉；環(huán)己亞硝脲；鹽酸洛索蒽醌；馬索羅酚；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美法侖；美諾立爾；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星(mitocarcin)；絲裂紅素(mitocromin)；絲林霉素；米托馬星；絲裂霉素；絲裂帕菌素；米托坦；鹽酸米托蒽醌；霉酚酸；諾考達唑；諾加霉素；奧馬鉑；奧昔舒侖；紫杉醇；培門冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；鹽酸吡羅蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆鈉；甲基絲裂霉素；潑尼氮芥；鹽酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；羅谷亞胺；沙芬戈；鹽酸沙芬戈；賽氮芥；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸鈉；司帕霉素；鹽酸鍺螺胺；螺莫司?。宦葶K；鏈黑菌素；鏈脲菌素；氯化鍶sr-89；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉烷；紫杉烷二帖；替可加蘭鈉；喃氟啶；鹽酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替羅昔??；睪丸酯；硫咪嘌呤；硫鳥嘌呤；噻替派；噻唑羧胺核苷；替拉扎明；鹽酸拓撲替康；枸櫞酸托瑞米芬；醋酸曲托龍；磷酸曲西瑞賓；三甲曲沙；三甲曲沙葡糖醛酸脂；曲普瑞林；鹽酸妥布氯唑；烏拉莫司汀；烏瑞替哌；伐普肽；維替泊芬；硫酸長春堿；硫酸長春新堿；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定(vinepidinesulfate)；硫酸長春甘酯(vinglycinatesulfate)；硫酸長春羅新(vinleurosinesulfate)；酒石酸長春瑞濱(vinorelbinetartrate)；硫酸長春羅定(vinrosidinesulfate)；硫酸長春利定(vinzolidinesulfate)；伏氯唑；折尼鉑；凈司他??；鹽酸佐柔比星。

在一些方面，癌癥治療劑和刺激nk的外來體可以配制在相同的組合物中。在一些方面，癌癥治療劑和刺激nk的外來體可以配制在不同的組合物中。

包含包括一種或多種刺激肽的刺激nk的外來體的組合物和癌癥治療劑可以同時或在不同時間施用。在一些方面，在將該已知的治療劑用于所治療的疾病或病癥之前或之后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天時施用包括一種或多種刺激肽的刺激nk的外來體。在一些方面，在將該已知的治療劑用于所治療的疾病或病癥之前或之后的1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月時施用包括一種或多種刺激肽的刺激nk的外來體。

裝置

公開了包含刺激nk的外來體的裝置，所述外來體包括一種或多種刺激肽。例如，在單采血液成分術(shù)期間使用的容器可以包含包括一種或多種刺激肽的刺激nk的外來體。因此，在單采血液成分術(shù)期間，通過容器的細胞可以孵育或放置成與刺激nk的外來體接觸，從而允許刺激nk細胞并最終使nk細胞擴增。

試劑盒

上述材料以及其他材料可以任何合適的組合封裝在一起作為可用于執(zhí)行或協(xié)助執(zhí)行所公開的方法的試劑盒。如果給定試劑盒中的試劑盒組分被設(shè)計和調(diào)適成在所公開的方法中一起使用，則該試劑盒是有用的。

所公開的試劑盒還可以包括刺激肽。試劑盒還可以含有用于制備刺激nk的外來體的組分。

定義

需注意，如本文和所附權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式″一″、″一個″和″該″包括多個指代物，除非上下文另外明確指出。因此，例如，提到″一個外來體″包括多個這樣的外來體，提及″該刺激肽″是指本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的一種或多種刺激肽及其等同物等等。

″外來體″是指由活細胞產(chǎn)生或分泌的膜囊泡。該術(shù)語不包括來源于游離脂質(zhì)組分的合成脂質(zhì)體或通過加工破碎的細胞脂質(zhì)膜形成的質(zhì)膜囊泡。該術(shù)語還包括微泡、附睪小體(epididimosome)、阿爾戈體(argosome)、外來體樣囊泡、promininosome、dex、tex、四醚脂質(zhì)體(archeosomes)和癌小體(oncosome)，只要它們由細胞產(chǎn)生或分泌。在一些實施方案中，當多泡體與質(zhì)膜融合時，囊泡從細胞釋放。在一些情況下，囊泡直接從質(zhì)膜釋放。

″刺激nk的外來體″或″刺激nk細胞的外來體″或″nk刺激性外來體″是指能夠刺激nk細胞的產(chǎn)生或數(shù)目增加和/或增強nk細胞的活性(包括但不限于增強至將通過nk細胞的細胞毒性活性裂解的靶細胞的歸巢/靶向)的外來體?！宕碳k的外來體″或″刺激nk細胞的外來體″或″nk刺激性外來體″可以包含一種或多種刺激肽。

″質(zhì)膜囊泡″是指來自細胞的質(zhì)膜制品或人工制備的質(zhì)膜或脂質(zhì)體。

″膜插入肽″是能夠插入或錨定至細胞膜的肽。

″刺激肽″是指與存在于nk細胞表面上的活化受體結(jié)合的刺激配體。刺激肽也是指引起nk細胞增殖、刺激、粘著或活化的藥劑。刺激肽可以是細胞因子、粘著分子或nk細胞活化劑。本文所用的″調(diào)節(jié)″是指增加或減少。調(diào)節(jié)導(dǎo)致相較于正常功能的任意差異。例如，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)是指增加或減少免疫細胞。

″任選″或″任選地″是指隨后描述的事件、情況或材料可能發(fā)生或存在也可能不發(fā)生或不存在，并且所述描述包括該事件、情況或材料發(fā)生或存在的情況和該事件、情況或材料不發(fā)生或不存在的情況。

在此所用的″接觸″意味著使一個或多個實體接近，以使得該等實體可以發(fā)揮對彼此的作用?！褰佑|″可能涉及或可能不涉及物理接觸?！褰佑|″、″經(jīng)接觸的″及其各種版本還包括通過直接或間接的相互作用暴露于、影響，其中所述效應(yīng)可以或可以不由相互作用介導(dǎo)，與相互作用一致，或作為相互作用的結(jié)果，所述相互作用包括但不限于細胞或分子相互作用。

如本文所用，術(shù)語″受試者″是指所公開的組合物可以施用于其以例如用于實驗、診斷和/或治療目的的任何生物體。典型的受試者包括動物(例如哺乳動物，諸如非人靈長類動物和人類；禽類；家養(yǎng)動物或農(nóng)場動物，諸如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實驗室動物，諸如小鼠、大鼠和豚鼠；兔；魚；爬行動物；動物園動物和野生動物)。通常，″受試者″是動物，包括哺乳動物如人類和靈長類動物；等等。受試者也可以指細胞或細胞系。

在本文中，范圍可被表示為從″約″一個具體的值，和/或到″約″另一個具體的值。當表達這樣的范圍時，除非上下文另外明確地指出，還特別地設(shè)想和考慮公開了從這一個具體的值和/或至這另一個具體的值的范圍。類似地，當值通過使用先行詞″約″被表示為近似值時，應(yīng)當理解，除非上下文另外明確指出，該特定值形成應(yīng)被視為公開的另一個特別涵蓋的實施方案。將進一步理解，每個范圍的端值相對于另一端值以及獨立于另一端值都是重要的，除非上下文另有明確指示。最后，應(yīng)當理解，包含在明確公開的范圍內(nèi)的所有單獨值和值的子范圍也是特別設(shè)想的，并且應(yīng)被視為公開的，除非上下文另有明確指示。無論在特定情況下是否明確地公開了這些實施方案中的一些或全部，上述情況是適用的。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與所公開的方法和組合物所屬的領(lǐng)域中的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明的方法和組合物，但是特別有用的方法、裝置和材料如所述。本文引用的出版物及其所引用的材料由此特別地以引用方式并入。本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)被解釋為承認本發(fā)明由于先前的發(fā)明而無權(quán)提前提出此類公開內(nèi)容。不承認任何參考文獻構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。對參考文獻的討論說明了作者的主張，并且申請人保留對所引用文檔的準確性和相關(guān)性提出質(zhì)疑的權(quán)利。將清楚地理解，盡管在本文中提及了許多出版物，但是此類引用并不構(gòu)成對這些文獻中的任何文獻構(gòu)成本領(lǐng)域普通知識的一部分的承認。

在本說明書的整個說明和權(quán)利要求書中，詞語″包括″及其變型形式，諸如″含有″和″包含″是指″包括但不限于″，而非意圖排除例如其他添加物、部件、整數(shù)或步驟。具體地，在被敘述為包括一個或多個步驟或操作的方法中，特別設(shè)想每個步驟包括所列出的事物(除非該步驟包括限制性術(shù)語，諸如″由...組成″)，這意味著每個步驟并非旨在排除例如該步驟中未列出的其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟。

公開了可用于所公開的方法和組合物、可以與所公開的方法和組合物一起使用、可用于制備所公開的方法和組合物、或是所公開的方法和組合物的材料、組合物和組分。這些和其他材料在本文中公開，并且應(yīng)當理解，當這些材料的組合、子集、相互作用、分組等被公開時，盡管可能未明確地公開對這些化合物的每一各種個別和集合組合和置換的具體提及，但是每一組合和置換都是在本文中具體預(yù)期和描述的。例如，如果公開和討論了膜自插入肽綴合物，并且討論了可以對包括膜自插入肽綴合物在內(nèi)的許多分子進行的許多修改，則特別地涵蓋膜自插入肽綴合物的每一種組合和置換以及可能的修改，除非明確地指出為相反的。因此，如果公開了一類分子a、b和c以及一類分子d、e和f，并且公開了組合分子的一個示例a-d，則即使沒有單獨地列舉每一個，每一個都單獨且全部地被考慮。因此，在此示例中，組合a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f中的每一個都是特別考慮的，并且應(yīng)當被視為從a、b和c；d、e和f；以及示例性組合a-d的公開內(nèi)容公開。同樣，這些的任何子集或組合也被特別考慮并公開。因此，例如，a-e、b-f和c-e的子組是被特別考慮的，并且應(yīng)當被視為從a、b和c；d、e和f；以及示例性組合a-d的公開內(nèi)容公開。此概念適用于本申請的所有方面，包括但不限于制備和使用所公開的組合物的方法中的各步驟。因此，如果存在可以執(zhí)行的多種附加步驟，則應(yīng)當理解，可以利用所公開方法的任何具體實施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合來執(zhí)行這些附加步驟中的每一個，并且每個這樣的組合被特別地考慮并且應(yīng)當被視為公開的。

實施例

實施例1：用粗制外來體制劑擴增nk細胞

結(jié)果

如本文所證實的，通過使用來源于k562-mb21-41bbl刺激細胞培養(yǎng)物的外來體可以發(fā)生nk細胞的擴增。k562-mb21-41bbl的培養(yǎng)物經(jīng)選擇以分離外來體，因為這些細胞據(jù)報道非常穩(wěn)健地擴增nk細胞，并且不需要在培養(yǎng)起始之前從外周血單核細胞(pbmc)混合物中分離nk細胞。此外，通過抗體染色可以容易地追蹤刺激配體41bbl和mbil21的存在，以確認這些分子在飼養(yǎng)細胞上的表達以及它們在分離的外來體中的存在。

進行本實驗以測試源自刺激細胞培養(yǎng)物的外來體是否以與刺激細胞相似的方式支持nk細胞的擴增。當在24天的時期中pbmc在培養(yǎng)中暴露于50u/ml的il-2并降低從k562-mb21-41bbl囊泡的培養(yǎng)基中分離的粗制外來體的濃度時，pbmc混合物中nk細胞的含量增加(圖4)。外來體的濃度由嵌入在外來體中的蛋白質(zhì)的濃度表示。粗制外來體制劑可能含有來自培養(yǎng)物的某些物質(zhì)，該等物質(zhì)抑制外來體的較高濃度培養(yǎng)生長。但是，當稀釋時，粗制的外來體制劑更有效。在所使用的外來體為稀釋濃度(50μg/ml)時，觀察到nk細胞擴增約240倍，其中nk細胞的百分比增加至高于70％。因此，此實驗表明nk細胞可以使用嵌入有刺激配體的外來體在pbmc混合物內(nèi)選擇性擴增，而無需飼養(yǎng)細胞。

材料和方法

分別從圣裘德兒童研究醫(yī)院(st.judechildren’sresearchhospital)的dariocampana醫(yī)生(dr.dariocampana)和md安德森癌癥中心(mdanderson)的deanlee醫(yī)生(dr.deanlee)獲得細胞系k562-mb15-41bbl和k562-mb21-41bbl(k562-克隆9.mbil21)。所使用的k562細胞系購自美國的組織培養(yǎng)物保藏中心(atcc)。根據(jù)以下方法進行刺激nk細胞的粗制外來體的制備。將k562-mb21-41bbl細胞在補充有10％fbs的rpmi培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)物放大至1l。在放大后，用2微摩爾莫能菌素處理k562-mb21-41bbl培養(yǎng)物。通過以1,000xg離心沉淀細胞來從細胞培養(yǎng)物中回收培養(yǎng)基。將回收的培養(yǎng)基用0.45μm過濾器過濾，然后使用100kda的mwco膜濃縮。使用bca測定來確定嵌入在外來體和培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)的組合的表觀蛋白質(zhì)濃度。

將通過ficol-paque密度梯度法從血液中分離的pbmc在補充有10％fbs、50u/ml的il-2并降低外來體的濃度的scgmcellgro培養(yǎng)基中生長。將細胞在含有5％co2的潮濕氣氛中保持于37℃。從第5天開始，每隔一天更換一次培養(yǎng)基，用新鮮的培養(yǎng)基替換一半的培養(yǎng)基，并且通過培養(yǎng)基置換去除的外來體被替換。每隔一天計數(shù)細胞，并檢查培養(yǎng)物含量。

實施例2：外來體的表征

從k562-mb21-41bbl細胞的培養(yǎng)物中分離刺激nk細胞的外來體。將細胞培養(yǎng)至約1×10⁶個細胞/ml的密度，洗滌，重懸于無血清rpmi中并用2μm莫能菌素處理。通過在1000xg離心10分鐘去除細胞，然后濾過0.22μm的pes膜。然后使用100,000kda的mwco膜，通過超濾濃縮經(jīng)過濾的培養(yǎng)基。

圖2a至圖2d示出了從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體的表征。將外來體重懸于pbs中，并通過用nanosightns300(馬爾文儀器有限公司(malvern))的視頻顯微鏡進行納米顆粒跟蹤分析(nta)來表征。nta基于對光散射強度和擴散動力學的分析來確定粒徑。示出了單幀光散射圖像(圖2a)和粒度分布的分組直方圖(圖2b)。通過用抗il21抗體進行蛋白質(zhì)印記分析來在免疫化學上證實il-21的存在(圖2c)。使用結(jié)合抗il-21抗體的金納米顆粒(gnp)進行的分析(圖2d)表明存在il-21，其中與結(jié)合同種型對照ab的gnp不具有動態(tài)光散射強度增大相比，使用結(jié)合抗il-21抗體的gnp時在外來體樣品中觀察到了動態(tài)光散射強度的時間依賴性增大。

圖3a和圖3b示出了從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體刺激未選擇的pbmc中的nk細胞特異性擴增。將初始濃度為100,000個nk細胞/ml的未選擇pbmc與從k562-mb21-41bbl細胞的培養(yǎng)物中分離的外來體在補充有10％fbs的scgm培養(yǎng)基中以35ng/ml的總蛋白進行培養(yǎng)。在初始滯后后，nk細胞在20天內(nèi)指數(shù)級地擴增平均270倍(圖3a)，并且總淋巴細胞的相對豐度上升至74％(圖3b)。每隔一天用含有外來體的新鮮培養(yǎng)基補充培養(yǎng)物。從不具有轉(zhuǎn)基因表達的mbil-21和4-1bbl的常規(guī)非轉(zhuǎn)化k562的培養(yǎng)物分離的外來體不誘導(dǎo)nk細胞的擴增。所有培養(yǎng)物均以兩等份生長，并且標記代表平均值，誤差條代表標準偏差。

測定用外來體擴增的nk細胞對k562cml腫瘤細胞的細胞毒性。將k562細胞用tfl4染料預(yù)標記。將靶腫瘤細胞以0.5×10⁶個k562細胞/ml與nk細胞以指定的e∶t比在37℃、5％co2氣氛中共培養(yǎng)2小時。然后將細胞離心并重懸于含有annexinv-fitc的annexinv標記緩沖液中，并在4℃孵育15分鐘。將標記的細胞稀釋至250μl，并通過流式細胞術(shù)在accuri儀器(bdbioscience公司)上進行分析。圖4示出了用外來體刺激和擴增的nk細胞對k562細胞具有細胞毒性。未選擇的pbmc用從k562-mb21-41bbl細胞培養(yǎng)物分離的外來體，以35ng/ml總蛋白培養(yǎng)，并用于測定對k562細胞的細胞毒性。為了比較，nk細胞也用k562-mb21-41bbl飼養(yǎng)細胞以及pm21-顆粒(200μg/ml)擴增。與用飼養(yǎng)細胞擴增的nk細胞(fc21-nk細胞▲)或用結(jié)合il-21的質(zhì)膜顆粒擴增的nk細胞(pm21-nk細胞■)相比，用外來體擴增的nk細胞(ex21-nk細胞●)的細胞毒性略低。

用視頻顯微鏡證實在pbmc與k562-mb21-41bbl飼養(yǎng)細胞的共培養(yǎng)物中存在外來體。圖5a至5e示出在培養(yǎng)中用k562-mb21-41bbl作為飼養(yǎng)細胞以及10倍過量的pbmc(100,000個nk細胞/ml)和飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生外來體，然后在配有活細胞成像平臺的perkinelmerultraview顯微鏡系統(tǒng)(perkinelmerultraviewmicroscopysystem)上用10倍物鏡在18小時內(nèi)成像。在數(shù)分鐘至約1小時之后的時間期間(圖5a)，觀察到了af647標記的聚結(jié)。幾小時后(圖5b)，觀察到了細胞內(nèi)內(nèi)體和多泡體的形成。隨后觀察到了無細胞的外來體(圖5c和圖5d)。從來自實時成像的共培養(yǎng)物獲得樣品，并用抗cd3和抗cd56染色，以及用熒光共焦顯微鏡成像(圖5e)。nk細胞已經(jīng)吸收或隨后結(jié)合af647標簽，而t細胞優(yōu)先地不如此做。檢查比所示出的更寬的區(qū)域的統(tǒng)計有效性，并對沿著z軸的10個切片成像以區(qū)分細胞內(nèi)和細胞外事件。

應(yīng)當理解，所公開的方法和組合物不限于所描述的特定方法、方案和試劑，因為它們可以變化。還應(yīng)當理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求書限制。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到或能夠使用不超過常規(guī)實驗來探知本文所述的方法和組合物的具體實施方案的許多等同物。此類等同物旨在由以下權(quán)利要求書涵蓋。