本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種來源于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

L-谷氨酸氧化酶(L-Glutamate oxidase，LGOX)能專一地催化谷氨酸氧化成α-酮戊二酸和過氧化氫，因此，通過過氧化氫含量的變化可以方便地測(cè)定谷氨酸的含量。然而，主要因?yàn)長-谷氨酸氧化酶產(chǎn)品的來源問題還未從根本上得到解決，使得L-谷氨酸氧化酶的價(jià)格還很昂貴，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。

1983年，日本人Kamei等首次從淺紫鏈霉菌(Streptomyces violascens)麥麩培養(yǎng)基抽提物中發(fā)現(xiàn)一種能催化谷氨酸氧化產(chǎn)生α-酮戊二酸和過氧化氫的酶，該酶是典型的氧化酶而不是脫氫酶，NAD+，NADP+不能作為該酶的電子受體，因此將其命名為L-谷氨酸氧化酶(Chem Pharm Bull，1983，31，1307-1314)。該酶的分子量約為60KD，具有黃素蛋白(FAD)的特征性吸收光譜(吸收峰為490nm)，每摩爾酶中含有1個(gè)摩爾的FAD。底物特異性研究表明，在pH5.0-6.5范圍內(nèi)，它能有效地催化L-谷氨酸的氧化，并且對(duì)L-谷氨酰胺、L-酪氨酸和L-組氨酸有微弱的氧化作用；在pH6.8時(shí)，對(duì)L-谷氨酰胺和L-組氨酸的相對(duì)活性分別為L-谷氨酸的32.1％和13.1％，Km值分別3.3和5.0mM。在pH5.0時(shí)，對(duì)L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的Km值分別為1.1mM和10mM。該酶的穩(wěn)定性較好，在pH3.0-7.0范圍內(nèi)，37℃可穩(wěn)定1小時(shí)。

同年，Kusakabe等從另外一株鏈霉菌X-119-6(Streptomyces sp.X-119-6)菌株中分離出特異性更好的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸為底物的Km值僅為0.2mM。該酶分子量大約為140000，由三個(gè)亞基組成，每個(gè)酶分子上結(jié)合有2個(gè)FAD，最適pH為7.0-8.0。該酶耐熱性較強(qiáng)，在pH5.5的條件下，65℃加熱15分鐘不失活；75℃加熱15分鐘，活性為87％；85℃加熱15分鐘，活性仍能保留47％。該酶除催化L-谷氨酸氧化外，僅對(duì)L-天冬氨酸有微弱的催化作用(在pH7.4時(shí)，相對(duì)活性為L-谷氨酸的0.6％)。

1989年，德國Bohmer等從內(nèi)涂鏈霉菌(Streptomyces endus)中分離純化到對(duì)L-谷氨酸完全特異的L-谷氨酸氧化酶。其分子量為90000，由兩個(gè)亞基構(gòu)成，亞基分子量為50000，每個(gè)亞基含有一個(gè)非共價(jià)結(jié)合的FAD。在pH7.0時(shí)對(duì)L-谷氨酸km值為 1.1mM。2001年，臺(tái)灣Chen等從普拉特鏈霉菌NTU3304(Streptomyces platensis NTU3304)純化獲得L-谷氨酸氧化酶，該酶對(duì)L-谷氨酸?；院茫米魃飩鞲衅鲿r(shí)只對(duì)L-谷氨酸反應(yīng)；2000年俄羅斯Sukhacheva等篩選到一株產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的鏈霉菌Streptomyces sp.Z-l1-6，經(jīng)過亞硝酸誘變，酶的比活為50.8U/mg，該酶特異性好，只氧化L-谷氨酸，不受其它氨基酸的影響。2004年，泰國Wachiratianchai等從另一株鏈霉菌Streptomyces sp.18G中純化獲得了一個(gè)新的L-谷氨酸氧化酶，該酶由兩個(gè)亞基組成分子量為120000，最適pH為pH7.0，對(duì)L-谷氨酸底物比較專一，對(duì)D-谷氨酸和D-天冬氨酸的相對(duì)活性只有0.79％和0.53％。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種來源于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體及其制備方法和應(yīng)用，利用DNA分子重排方法和高通量篩選法對(duì)L-谷氨酸氧化酶基因進(jìn)行定向篩選，獲得多個(gè)與酶活性相關(guān)位點(diǎn)，通過多位點(diǎn)突變技術(shù)，將所有突變位點(diǎn)整合到一條基因中，獲得多位點(diǎn)突變體，該多位點(diǎn)突變體對(duì)L-谷氨酸的氧化專一性和比活性均大幅度提高。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示。

在所述多位點(diǎn)突變體編碼的氨基酸序列上共有9處突變位點(diǎn)，其中，突變1位點(diǎn)為D32A即第32位上的天冬氨酸被替換為丙氨酸；突變2位點(diǎn)為H54P即第54位上的組氨酸被替換為脯氨酸；突變3位點(diǎn)為Y144F即第144位的酪氨酸被替換為苯丙氨酸；突變4位點(diǎn)為G155D即第155位上的甘氨酸被替換為天冬氨酸；突變5位點(diǎn)為T166K即第166位上的蘇氨酸被替換為賴氨酸；突變6位點(diǎn)為T319K即第319位上的蘇氨酸被替換為賴氨酸；突變7位點(diǎn)為A362V即第362位上的丙氨酸被替換為纈氨酸；突變8位點(diǎn)為S567F即第569位的絲氨酸被替換為苯丙氨酸；突變9位點(diǎn)為K600R即第600位上的賴氨酸被替換為精氨酸。具體地，所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 65所示。

本發(fā)明所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體的制備方法，其包括如下步驟：

(1)DNA分子重排

通過基因合成方法合成來源于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，以合成 的L-谷氨酸氧化酶基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增L-谷氨酸氧化酶基因，回收1974bp的基因片段，以DNase I進(jìn)行不完全酶解，并回收小片段；

再對(duì)回收的酶解片段進(jìn)行無引物PCR擴(kuò)增，然后以無引物PCR產(chǎn)物為模板，SDLG1、SDLG49為引物擴(kuò)增重排L-谷氨酸氧化酶基因片段，并回收1974bp基因片段。

(2)高比活L-谷氨酸氧化酶基因高通量篩選

將回收的重排L-谷氨酸氧化酶基因片段經(jīng)BamHI和Sac I雙酶切后，構(gòu)建入原核表達(dá)載體pG251(CN1338515)啟動(dòng)子和t1t2終止子之間，電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α獲得突變體表達(dá)文庫，而后進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，涂板于含有氨芐青霉素抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得抗性轉(zhuǎn)化子。

以40個(gè)抗性轉(zhuǎn)化菌落為一個(gè)單元，挑入40孔細(xì)菌培養(yǎng)板。利用溶菌酶破碎細(xì)胞，加入酶測(cè)定液，挑取顯黃色的加樣孔，對(duì)該加樣孔中的40個(gè)單菌進(jìn)行再一輪的篩選，并對(duì)篩選出的突變單菌進(jìn)行比活以及對(duì)谷氨酸底物的專一性測(cè)定，從中挑選5個(gè)比活性高且谷氨酸底物專一的突變體。

對(duì)上述5個(gè)突變基因進(jìn)行DNA序列分析，顯示其氨基酸突變有9個(gè)位點(diǎn)即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R。

(3)多位點(diǎn)突變

以L-谷氨酸氧化酶基因?yàn)槟０?，按照多位點(diǎn)突變技術(shù)將上述9個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，獲得本發(fā)明的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體。

進(jìn)一步，步驟(3)中，以氨基酸突變了3個(gè)位點(diǎn)：D32A、Y144F、K600R的L-谷氨酸氧化酶基因?yàn)槟０妫瑢⑵浒被岬?4、155、166、319、362、567位進(jìn)行突變，完成9個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，所述突變所用引物如下：

H54P突變引物：

54Z：GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA

54F：TGGGGGGTGGGGCCGAGGCGGC

G155D突變引物：

155Z：TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC

155F:GTCGCTGCCGGTGGAGGGGCCCA

T166K突變引物：

166Z：CGTACCCCCGGTGACGTACAAC

166F：GTTGTACGTCACCGGGGGTACG

T319R突變引物：

319Z：CGCAGCGACATCAACCCCAAG

319F:CTTGGGGTTGATGTCGCTGCG

A362V突變引物：

362Z：ACGACCCCAGCCGCGACGTC

362F：GACGTCGCGGCTGGGGTCGT

S569F突變引物：

569Z：GACGCCGCGCGCTGGGACTTG

569F:CAAGTCCCAGCGCGCGGCGTC

本發(fā)明制備得到的L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體能夠在大腸桿菌中大量表達(dá)，可應(yīng)用于檢測(cè)食物中L-谷氨酸的含量。

本發(fā)明對(duì)來自淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因進(jìn)行定向篩選，獲得9個(gè)與酶活性相關(guān)位點(diǎn)，通過多位點(diǎn)突變技術(shù)，將所有突變位點(diǎn)整合到一條基因中，獲得高比活L-谷氨酸氧化酶多位點(diǎn)突變體，測(cè)試結(jié)果顯示：改造后的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體對(duì)L-谷氨酸的氧化專一性和比活性均大幅度提高。

本發(fā)明所述的術(shù)語與其一般概念相同。

所述的“核苷酸”和“引物”序列均為5’端至3’端。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明制備的L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體對(duì)L-谷氨酸的氧化專一性和比活性均大幅度提高，具體是其比活性提高了至少3-4倍。

本發(fā)明制備的L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體可靈敏檢測(cè)食物中L-谷氨酸的含量，對(duì)商品化的L-谷氨酸檢測(cè)特異性可達(dá)到99％，靈敏度達(dá)到0.05mg/l。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例5的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體SDLGOXM在大腸桿菌中表達(dá)的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但所述實(shí)施例不限制本 發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1 來源于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因DNA分子重排(DNA Shuffling)

1.1來源于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因合成

通過基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因(SDLDOX)，所用的引物如下：

SDLG1：GGATCCATGACTGAAACTCCACGTGATAATTCTGCAAC TCGTGCACGTTGGCAAACTTGT(SEQ ID NO.1所示)

SDLG2：CATCAGGACCAACAAGAAGCAGTTCACGTGCCAGCTT GAGACAAGTTTGCCAACGTGCAC(SEQ ID NO.2所示)

SDLG3：GCTTCTTGTTGGTCCTGATGACAAGGATCTGAAACTGT CCTATCTGCATACTCTGATTGA(SEQ ID NO.3所示)

SDLG4：CTTCTTACGTGGATGATGAGTTGGACCCAG ACGACCAG TATCAATCAGAGTATGCAGATA(SEQ ID NO.4所示)

SDLG5：CTCATCATCCACGTAAGAAGATCCTGGTCATTGGTGCT GGTATCACTGGTCTGGTTGCTG(SEQ ID NO.5所示)

SDLG6：ATGATAGTGACATCGTAACCAGCATCCTTGAGCAGACG ACCAGCAACCAGACCAGTGATA(SEQ ID NO.6所示)

SDLG7：GGTTACGATGTCACTATCATTGAGGCAAACGAATCTCG TGTTGGTGGTCGTATCAAGACT(SEQ ID NO.7所示)

SDLG8：CAGCATCATCGAATGGCTGATGATGCTTGG TTGCACGG AAAGTCTTGATACGACCACCAA(SEQ ID NO.8所示)

SDLG9：TCAGCCATTCGATGATGCTGCACAGTACGCTGAGGCTG GTGCAATGCGTCTGCCTGACTT(SEQ ID NO.9所示)

SDLG10：AAGACCCAGCTTGTCAACCAGTGCCAGAACCAGTGGA TGGAAGTCAGGCAGACGCATTGC(SEQ ID NO.10所示)

SDLG11：TGGTTGACAAGCTGGGTCTTGGTCGTCGTCAGTTCTAC AACGTTGATGTTGGTCCATCTA(SEQ ID NO.11所示)

SDLG12：TAGGTGACAGGTGGAACAGGAACCTCAGGACCAGAA CCAG TAGATGGACCAACATCAACG(SEQ ID NO.12所示)

SDLG13：CCTGTTCCACCTGTCACCTACACCTCCTTCACTGGTCA GACTTGGACCAATGGTGATGAC(SEQ ID NO.13所示)

SDLG14：AAGAGTTACCACGCTTGTCAGGTTCACGGAAGTCAGG AGAGTCATCACCATTGGTCCAAG(SEQ ID NO.14所示)

SDLG15：TGACAAGCGTGGTAACTCTTGGATTCGTGCTAACCGT GTTCAGGTTCGTCGTGCTGACTA(SEQ ID NO.15所示)

SDLG16：GAGATGGAAACCCTCGTTGATACGCTCAGGAGATGCA GTATAGTCAGCACGACGAACCTG(SEQ ID NO.16所示)

SDLG17：TCAACGAGGGTTTCCATCTCACTGGTGATG AGGTTCG TGCACCTGTTGTCAAGATGGTTG(SEQ ID NO.17所示)

SDLG18：ACATCAGAGTAGTAGTCACGAACAGACTCCAGTGCAT CATCAACCATCTTGACAACAGGT(SEQ ID NO.18所示)

SDLG19：CGTGACTACTACTCTGATGTTGTTGATGGCAAGCGTG TCAACAAGCCTTT CGATGAGTGG(SEQ ID NO.19所示)

SDLG20：AACCGTCGAAGTCACGGATGACACGTGCCCAACCCTC AACCCACTCATCGAAAGGCTTGT(SEQ ID NO.20所示)

SDLG21：CATCCGTGACTTCGACGGTTACTCCATGGGTGGTTTC CTGCGTGATCATGCTGGTCTCTC(SEQ ID NO.21所示)

SDLG22：GGTGTTCTCCAGAGTACCAACAGCCTCGATTGCCTCG TCAGAGAGACCAGCATGATCACG(SEQ ID NO.22所示)

SDLG23：TTGGTACTCTGGAGAACACCTCCTCTCGTCTGCATCT CTCCTTCTTCCACTCCTTCCTGT(SEQ ID NO.23所示)

SDLG24：ATCTCCCAGTAACGAACAGTTGGATTGATGTCAGAAC GAGACAGGAAGGAGTGGAAGAAG(SEQ ID NO.24所示)

SDLG25：ACTGTTCGTTACTGGGAGATCCCTGGTGGTTCTTGGC GTCTGCCACATGCACTCCATGAG(SEQ ID NO.25所示)

SDLG26：GGATCATACGATGACCAAGACGAACCTCATCACGCAG ACCCTCATGGAGTGCATGTGGCA(SEQ ID NO.26所示)

SDLG27：TCTTGGTCATCGTATGATCCGTCTCGAATACCATGAT CCATCTCGTGATGCTGATCCTGA(SEQ ID NO.27所示)

SDLG28：GACAGTGACACCCCAACCATCAGGACCAACAGCAGT ACCCTCAGGATCAGCATCACGAGA(SEQ ID NO.28所示)

SDLG29：ATGGTTGGGGTGTCACTGTCGAAACTGTTGCTGAGAA CGATCCACAGGCACCTCCTCGTC(SEQ ID NO.29所示)

SDLG30：GAGAATGGAATGGTGACGATTGCCAGGTCAGCAGTCC AACGACGAGGAGGTGCCTGTGGA(SEQ ID NO.30所示)

SDLG31：ATCGTCACCATTCCATTCTCTGCACTGCGT TTCGTCG AGATCGTTCCATCCATGTCCTAC(SEQ ID NO.31所示)

SDLG32：CAGAGTCGTAGTGAGTCTCGACGATAGCACGACGCTT CTTGTAGGACATGGATGGAACGA(SEQ ID NO.32所示)

SDLG33：CGAGACTCACTACGACTCTGCAACTAAGGTCCTGCTG GAGTTCTCTCATCGTTGGTGGGA(SEQ ID NO.33所示)

SDLG34：GATACGCTCCAGTTCCTCACGCCAGTCATCCTCAGTG AACTCCCACCAACGATGAGAGAA(SEQ ID NO.34所示)

SDLG35：GTGAGGAACTGGAGCGTATCGCACCTGGTGTCTACGA GTACTATCGTCTTGGTCCTGAGG(SEQ ID NO.35所示)

SDLG36：GCCTCAGCAAGAGTTGGCATACGTGCAGGTTCACCAG CAGCCTCAGGACCAAGACGATAG(SEQ ID NO.36所示)

SDLG37：ATGCCAACTCTTGCTGAGGCTGATGCTGGT CTGCTTG GTG CTGCTGTCAA GGACTCTGGT(SEQ ID NO.37所示)

SDLG38：GTGGCATGGTAGAACCAATCTGACGCATCT CCTCAGT GAC ACCAGAGTCC TTGACAGCAG(SEQ ID NO.38所示)

SDLG39：GATTGGTTCTACCATGCCACTGCGTGGTCC TGCACTG CGT CCTGCTACTC ACTCTTTCGG(SEQ ID NO.39所示)

SDLG40：GTACATGAAACGGTTTGGATTGTCAGTTGC AGAACCA CCA CCGAAAGAGT GAGTAGCAGG(SEQ ID NO.40所示)

SDLG41：ATCCAAACCG TTTCATGTACTACCCATCTC ATCGTGT CGA GGGTTCTACT GGTGGTGTCG(SEQ ID NO.41所示)

SDLG42：CAACGAGCAGCATCATCAGACCAGGAGTAG GATGCG AGGACGACACCACC AGTAGAACCC(SEQ ID NO.42所示)

SDLG43：GGACTCTATGCGTTCTGCTGAACGTTACGTCTACGCA CTGCGTAACCTTC AGGCACTGCA(SEQ ID NO.43所示)

SDLG44：AGCACCACGACCAGTGAAGAAGACCTCGAT ACGACG ACCATGCAGTGCCT GAAGGTTACG(SEQ ID NO.44所示)

SDLG45：TCTTCACTGGTCGTGGTGCT ACCAAGTCTT GGGCACG TGATCCTTACGCA TTCGGTGAGG(SEQ ID NO.45所示)

SDLG46：AGGTGGAAAGAGGTCATCTGGTGTGCAGTG TAGATTG CAGCCTCACCGAA TGCGTAAGGA(SEQ ID NO.46所示)

SDLG47：CAGATGACCTCTTTCCACCTGGATGCATCT CGTCCTG AAGGTCCTGTCCACTTCGCTGGT(SEQ ID NO.47所示)

SDLG48：GTGCACCCTCGATCCATGCGTGCTTCAGAGAGGTGTG TTC ACCAGCGAAG TGGACAGGAC(SEQ ID NO.48所示)

SDLG49：GAGCTCTTAGGCAGTATGAACCTCCAGTGCACCCTCG ATCCATGCG(SEQ ID NO.49所示)

利用PCR進(jìn)行L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因擴(kuò)增，在100μl反應(yīng)體系中，SDLG2-SDLG48共47個(gè)引物的添加量為2ng，外側(cè)引物SDLG1和SDLG49添加量為30ng。以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)為Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增條件依次為：94℃預(yù)熱1min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，10min，使用的，共25個(gè)循環(huán)。

PCR結(jié)束后，1％(w/v)瓊脂糖膠回收，取10μl直接與T/A克隆載體相連(寶生物工程(大連)有限公司)，4℃連接過夜。高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽性克隆。

1.2PCR擴(kuò)增L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因及回收

以合成的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因?yàn)槟０?，SD1，SD2為引物擴(kuò)增(SDLDOX)基因，SD1：5’GAGAGAGGATCCATGACTGAAACT CCACGTGATAATTC3’(SEQ ID NO.50所示)；SD2：5’GAGAGAGAGCTCTTAGGCAGTATGAACCTCCAGTG3’(SEQ ID NO.51所示)反應(yīng)條件為：94℃10min預(yù)變性，94℃變性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)，1％Agrose電泳，透析袋法回收1974bp的基因片段。

DNase I降解DNA及回收小片段

回收L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因片段以DNase I緩沖液(50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/L MgCl₂)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃處理15分鐘。70℃處理10分鐘。10％丙烯酰胺電泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl 10×無引物PCR緩沖液(Primerless PCR Buffer)(50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。

無引物PCR(Primerless PCR)

進(jìn)行Primerless PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/LMgCl2+Taq2U+ddH2O to 50μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30s，40℃30s，72℃30s，共45個(gè)循環(huán))，2％Agrose電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

有引物PCR(Primer PCR)

進(jìn)行PrimerPCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系：5μl Primerless PCR產(chǎn)物+SDLG10.2ng+SDLG49 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH2O to50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35個(gè)循環(huán)，1％Agrose電泳檢測(cè)，回收1974bp基因片段。

實(shí)施例2 高比活性L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因篩選

將實(shí)施例1中回收重排的L-谷氨酸氧化酶基因片段，經(jīng)BamH I和SacI雙酶切后，構(gòu)建入原核表達(dá)載體pG251(CN1338515)啟動(dòng)子和t1t2終止子之間，該載體帶有氨芐青霉素抗性基因。電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α獲得突變體表達(dá)文庫，庫容達(dá)到10⁸，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega公司)進(jìn)行質(zhì)粒提取。

取1μl大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α涂布在含有100mg/L氨芐青霉素抗生素培養(yǎng)基，經(jīng)過16小時(shí)的37℃培養(yǎng)，挑選抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行L-谷氨酸氧化酶活性篩選。具體篩庫方法如下：轉(zhuǎn)化子挑入40孔細(xì)菌培養(yǎng)板，加入含細(xì)菌溶菌酶(1mg/ml)和蛋白酶Fator-Xa(1mg/ml)pH8.0磷酸緩沖液50μl，37℃放置10min，轉(zhuǎn)入溫度設(shè)置在70℃的烘箱內(nèi)，處理30分鐘后，加入酶測(cè)定液200μl，反應(yīng)10分鐘，觀察培養(yǎng)板中的顏色反應(yīng)，挑取顯黃色的加樣孔，測(cè)定550nm吸光度。

篩選分兩步完成，先40個(gè)菌落為一個(gè)單元調(diào)取到一個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)板孔中，然后將現(xiàn)色較強(qiáng)的菌再分別調(diào)取到一個(gè)40孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，調(diào)取現(xiàn)色較強(qiáng)的菌落。抽提現(xiàn)色菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行回轉(zhuǎn)大腸桿菌，調(diào)取菌落培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，Tris-HCl緩沖液懸浮菌體，1ml菌液中加入含細(xì)菌溶菌酶(1mg/ml)和蛋白酶Fator-Xa(1mg/ml)pH8.0磷酸緩沖液100μl，37℃放置10min，加入酶測(cè)定液400μl,反應(yīng)10分鐘，測(cè)定550nm吸光度。通過反復(fù)篩選，共獲得5個(gè)比活性較強(qiáng)的突變體，分別命名為 SDLGOXM1-M5。

酶測(cè)定液：用水配制11mg/ml L-谷氨酸溶液0.5ml，并調(diào)至pH7.0，用0.1M pH7.0的磷酸鉀鹽緩沖液配制121.5μg/ml的4-氨基安替比林溶液1.0ml、0.26μl/ml的N，N-二甲基苯胺溶液l.4ml，60u/ml過氧化物酶溶液0.1ml。臨用時(shí)混勻，共2mL。L-谷氨酸溶液底物在其他混合液37℃預(yù)處理2min后加入。

實(shí)施例3 高比活L-谷氨酸氧化酶基因突變體獲取

利用逐步序列測(cè)定方法對(duì)實(shí)施例2中所篩選獲得的5個(gè)高比活L-谷氨酸氧化酶基因全序列進(jìn)行DNA測(cè)序，顯示有21個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生了變化T27C，T33A，A95C，A158C，A431T，G464A，C497A，T633A，T714C，C744A，C956A，C957G，C1085T，T1293C，T1410G，A1440C，T1479A，C1588A，C1701T，A1728T，A1799G推導(dǎo)的氨基酸變化有9個(gè)(D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R)，具體結(jié)果如表1所示。

表1 L-谷氨酸氧化酶基因突變體的核苷酸及氨基酸變化

以突變了3個(gè)位點(diǎn)的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因SDLGOXM2為模版，將其它6個(gè)篩選的突變位點(diǎn)進(jìn)行全部突變，完成9位點(diǎn)突變。突變所用引物如下。

H54P突變引物：

54Z：GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA(SEQ ID NO.52所示)

54F：TGGGGGGTGG GGCCGAGGCG GC(SEQ ID NO.53所示)

G155D突變引物：

155Z：TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC(SEQ ID NO.54所示)

155F：GTCGCTGCCG GTGGAGGGGC CCA(SEQ ID NO.55所示)

T166K突變引物：

166Z：CGTACCCCCGGTGACGTACAAC(SEQ ID NO.56所示)

166F：GTTGTACGTC ACCGGGGGTA CG(SEQ ID NO.57所示)

T319R突變引物：

319Z：CGCAGCGACATCAACCCCAAG(SEQ ID NO.58所示)

319F：CTTGGGGTTGATGTCGCTGCG(SEQ ID NO.59所示)

A362V突變引物：

362Z：ACGACCCCAGCCGCGACGTC(SEQ ID NO.60所示)

362F：GACGTCGCGG CTGGGGTCGT(SEQ ID NO.61所示)

S569F突變引物：

569Z：GACGCCGCGCGCTGGGACTTG(SEQ ID NO.62所示)

569F：CAAGTCCCAG CGCGCGGCGT C(SEQ ID NO.63所示)

取1μl L-谷氨酸氧化酶基因擴(kuò)增片段為模板，以SD1和54F；54Z和155F；155Z和166F；166Z和319F；319Z和362F；362Z和569F；569Z和SD2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后，片斷用10％丙烯酰胺膠回收，將上述7個(gè)回收片斷取10-100ng為模板混合，以SD1和SD2為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱1min；94℃30s，60℃30s，72℃，4min。共25個(gè)循環(huán)。

PCR結(jié)束后，酚、氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀。各加入SacI和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片斷。將酶切處理好片段進(jìn)行定向克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選轉(zhuǎn)化子。序列測(cè)定獲得9個(gè)突變的L-谷氨酸氧化酶基因SDLGOXM，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示，編碼的氨基酸序列上共有9處突變點(diǎn)，其中，突變1位點(diǎn)為D32A：第32位上的天冬氨酸被替換為丙氨酸；突變2位點(diǎn)為H54P：第54位上的組氨酸被替換為脯氨酸；突變3位點(diǎn)為Y144F：第144位的酪氨酸被替換為苯丙氨酸；突變4位點(diǎn)為G155D：第155位上的甘氨酸被替換為天冬氨酸；突變5位點(diǎn)為T166K：第166位上的蘇氨酸被替換為賴氨酸；突變6位點(diǎn)為T319K：第319位上的蘇氨酸被替換為賴氨酸；突變7位點(diǎn)為A362V：第362位上的丙氨酸被替換為纈氨酸；突變8位點(diǎn)為S567F：第569位的絲氨酸被替換為苯丙氨酸；突變9位點(diǎn)為K600R：第600位上的賴氨酸被替換為精氨酸。

實(shí)施例4 高比活L-谷氨酸氧化酶活性測(cè)定

利用BamH I和Sac I進(jìn)行雙酶切SDLGOXM基因后，通過T4DNA連接酶將該基因與載體pET-32a(NEB公司)16℃連接，得到重組質(zhì)粒pET-SDLGOXM，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司)，將菌液涂布于含有50μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落，接種于50ml液體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)到菌液的濃度達(dá)到OD600為0.6時(shí)加入終濃度為1mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)12h。9000rpm離心去上清，收集濕細(xì)胞。取濕細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，再懸浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸鈉緩沖液中(1g濕細(xì)胞/10ml緩沖液)得懸浮液，用超聲波處理懸浮液(功率為400W，超聲4s，間歇6s，重復(fù)99輪)，9000rpm離心取上清，即得粗酶液。用鎳離子交換柱Ni-NTA agrose(Qiagen公司)對(duì)其進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，獲得L-谷氨酸氧化酶前體蛋白，然后加入1mg/ml Factor Xa蛋白酶(New England Biolabs公司)在4℃下處理6h，即得有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白，如圖1所示，L-谷氨酸氧化酶多位點(diǎn)突變體SDLDOXM在大腸桿菌中表達(dá)。其中，圖1中，中間：表達(dá)的全蛋白經(jīng)鎳離子交換柱Ni-NTA純化；右：表達(dá)蛋白經(jīng)過1mg/ml Factor Xa蛋白酶酶切后產(chǎn)物。

測(cè)定液：用水配制11mg/ml L-谷氨酸溶液0.5ml,并調(diào)至pH7.0，用0.1mol/L pH7.0的磷酸鉀鹽緩沖液配制121.5μg/ml的4-氨基安替比林溶液1.0ml、0.26μl/ml的N，N-二甲基苯胺溶液l.4ml，60u/ml過氧化物酶溶液0.1ml。臨用時(shí)混勻，共3mL。底物在其他混合液37℃預(yù)處理2min后加入。

測(cè)定方法：上述3mL測(cè)定液于37℃恒溫水預(yù)熱3分鐘，加入合適濃度的粗酶液0.1mL，反應(yīng)l0分鐘，置沸水浴中煮沸30秒鐘終止反應(yīng)，冷卻后測(cè)定550nm吸光度。

酶活力單位定義及酶活力計(jì)算：在上述反應(yīng)條件下每分鐘釋放1μmol過氧化氫所需酶量為1單位。

結(jié)果表明，突變L-谷氨酸氧化酶SDLGOXM對(duì)L-谷氨酸的Km值為0.28mM，比野生型酶的Km值小0.17mM，表明該酶對(duì)L-谷氨酸的親和性更高；該突變L-谷氨酸氧化酶SDLGOXM比活性為126.5U/mg，比野生型酶比活高4.24倍。

實(shí)施例5 高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體專一性、靈敏度檢測(cè)

測(cè)試方法同實(shí)施例4，分別以L-谷氨酸L-glutamate，D-谷氨酸D-glutamate，L-谷氨酰胺L-glutamine，L-天冬氨酸L-aspartate，L-天冬酰胺L-Asparagine，L-甘氨酸L-glycine，L-精氨酸L-arginine，L-酪氨酸L-proline，L-組氨酸L-histidine，L-蘇氨酸L-Tyrosine，L-半胱氨酸L-cysteine作為反應(yīng)底物，測(cè)定突變L-谷氨酸氧化酶氨基酸 專一性，研究發(fā)現(xiàn)：該高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體SDLGOXM對(duì)L-谷氨酸表現(xiàn)比較專一，對(duì)L-谷氨酸的酶活性達(dá)到99％，對(duì)其他氨基酸相對(duì)酶活性只有1％。

將L-谷氨酸按比例稀釋，利用高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體SDLGOXM檢測(cè)L-谷氨酸的最小稀釋倍數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)檢測(cè)L-谷氨酸的最小濃度為0.05mg/l，由此說明本發(fā)明得到的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位點(diǎn)突變體SDLGOXM可靈敏檢測(cè)食物中L-谷氨酸的含量。