一種高效生產(chǎn)l-谷氨酸氧化酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效生產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶的方法，屬于發(fā)酵工程和酶工程技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] a-酮戊二酸（a-ketoglutarate,簡稱a-KG)作為一種重要的高值精細化學品 (20-25萬元/噸），廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域中。在醫(yī)藥領(lǐng)域中， a-KG能減輕腎病患者的腎臟負擔、減少并發(fā)癥和促進患者手術(shù)后快速恢復(fù)；與精氨酸等 氨基酸復(fù)配，能快速幫助運動員補充能量，廣泛應(yīng)用于功能性營養(yǎng)強化劑；除此以外，由于 a-KG特殊的化學性質(zhì)，被廣泛用于化學合成行業(yè)。隨著a-KG應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，導(dǎo)致 國內(nèi)和國際市場對a-KG的需求不斷增加。從海關(guān)了解到的數(shù)據(jù)，目前國際市場對食品級 a-KG需求量缺口達5萬噸以上，而目前食品級a-KG市場價格為20-25萬元/噸，且面臨 有價無市的窘境。a-KG的生產(chǎn)方法包括：化學合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法。目前， 工業(yè)化生產(chǎn)a-KG主要采用有機合成法，涉及一系列復(fù)雜的化學反應(yīng)過程，從而引起原料 來源、環(huán)境污染等方面一系列問題。同時由于化學法合成a-KG過程中存在嚴重的安全問 題，導(dǎo)致a-KG難以直接用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。因此，如何采用生物技術(shù)法大規(guī) 模制備安全性高的a-KG，是國內(nèi)外學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界所關(guān)注的焦點問題。
[0003] 本研宄室前期構(gòu)建完成一株L-谷氨酸氧化酶生產(chǎn)菌株FMME089,并利用酶法生產(chǎn) a-KG能達到較好的效果，但是此酶的獲得量相對較少，因此利用高密度手段規(guī)?；咝е?備L-谷氨酸氧化酶，降低a-KG生產(chǎn)成本，具有很好的工業(yè)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是利用高密度手段規(guī)模化高效制備L-谷氨酸氧化酶。
[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效表達L-谷氨酸氧化酶的方法。
[0006] 所述方法是以表達L-谷氨酸氧化酶的重組大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，在發(fā)酵罐上進 行分批補料培養(yǎng)生產(chǎn)L-谷氨酸氧化酶；所述分批補料培養(yǎng)是指在分批發(fā)酵過程中，采用 D〇-stat補料方式進行補料或者采用指數(shù)補料和D〇-stat兩種補料方式相結(jié)合的策略進行 補料培養(yǎng)。
[0007] 所述重組大腸桿菌，在本發(fā)明的一種實施方式中，為以E.coliBL21，以pET28a表 達載體，表達來源于StreptomycesghanaensisATCC14672的L-谷氨酸氧化酶的重組菌。
[0008] 所述D〇-stat補料方式，在本發(fā)明的一種實施方式中，是指當發(fā)酵過程的DO突然 升高時開始補料，控制DO關(guān)聯(lián)補料，每當DO高于設(shè)定的參數(shù)值時就進行片刻的補料。從而 將發(fā)酵過程溶氧控制在較低的范圍內(nèi)，比如10-30%。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述D0-Stat設(shè)定的關(guān)聯(lián)參數(shù)為20% -30%中的任 意一個值。
[0010] 所述單獨使用D0-Stat補料的方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，具體是： (1)將重組大腸桿菌種子液按照3-6%的接種量接入發(fā)酵罐中，控制溫度35-40°C，轉(zhuǎn)速 300-500rpm，通氣量l-3vvm，補料前控制DO在30 %以上；（2)補料培養(yǎng)階段：當DO突然升 尚時候開始補料，控制DO關(guān)聯(lián)補料，每當DO尚于設(shè)定的參數(shù)值時就進彳丁片刻的補料；（3) 誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：當菌體達到對數(shù)生長中后期或者穩(wěn)定期時采用終濃度為5g/L-15g/L-的乳 糖進行誘導(dǎo)。
[0011] 所述指數(shù)補料和D〇-stat兩種補料方式相結(jié)合的策略，在本發(fā)明的一種實施方式 中，是指在分批發(fā)酵過程中，當DO突然上升時開始采用比生長速率0. 15-0. 451T1進行指數(shù) 補料，指數(shù)補料過程中維持DO不低于20 %，當達到發(fā)酵罐溶氧限制，補料方式改為D〇-stat 并控制溶氧不高于設(shè)定的參數(shù)值，當菌體〇D_達到30-60時采用乳糖進行誘導(dǎo)。
[0012] 所述誘導(dǎo)，在本發(fā)明的一種實施方式中，誘導(dǎo)溫度為25-30°C。
[0013] 所述誘導(dǎo)，在本發(fā)明的一種實施方式中，誘導(dǎo)時間為8_16h。
[0014] 所述溶氧限制，就是發(fā)酵罐設(shè)備所能達到的最大溶氧量。在本發(fā)明的一種實施方 式中，是指在最高轉(zhuǎn)速800-900rpm、通氣量3vvm下能達到的最大溶氧。
[0015] 所述兩種補料方式結(jié)合的方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，具體是：將重組大腸 桿菌種子液按照3-6 %的接種量接入發(fā)酵罐中，控制溫度35-40°C，轉(zhuǎn)速300-500rpm，通氣 量l-3vvm，補料前控制DO在30 %以上；（2)指數(shù)補料培養(yǎng)階段：當DO突然上升時開始采用 比生長速率0. 15-0. 451T1進行指數(shù)補料，指數(shù)補料過程中維持DO高于20 %; (3)D〇-stat補 料階段：當達到發(fā)酵罐溶氧限制，補料方式改為DO-stat并控制溶氧不高于設(shè)定的參數(shù)值； (3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：當菌體0D_達到30-60時，采用終濃度為5g/L-15g/L的乳糖進行誘導(dǎo)， 誘導(dǎo)溫度為25-30°C。
[0016] 所述DO-stat設(shè)定的參數(shù)值，在本發(fā)明的一種實施方式中，為20% -30%中的任意 一個值。
[0017] 所述兩種補料方式結(jié)合的方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，具體是：以4%的接 種量轉(zhuǎn)接到含發(fā)酵罐中，初始發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速300rpm、溫度37°C、通氣量lvvm，當DO突然上 升是開始采用比生長速率〇. 251T1進行補料，補料過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速維持DO高于30%， 4h后達到發(fā)酵罐溶氧限制，補料方式改為DO-stat并控制溶氧不高于30%，當菌體濃度為 0D6Q(I= 40時采用終濃度10g/L的乳糖進行誘導(dǎo)，于25-30°C下誘導(dǎo)12h。
[0018] 所述方法中，對于發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以根據(jù)現(xiàn)有的 大腸桿菌培養(yǎng)基，選擇適合產(chǎn)酶的培養(yǎng)基或者是進一步對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。
[0019] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種按所述方法得到的L-谷氨酸氧化酶或重組大腸 桿菌菌體。
[0020] 本發(fā)明的第三個目的是提供L-谷氨酸氧化酶或重組大腸桿菌菌體在轉(zhuǎn)化生產(chǎn) a_酮戊二酸方面的應(yīng)用。
[0021] 所述應(yīng)用，在本發(fā)明的一種實施方式中，是以L-谷氨酸或谷氨酸鈉為底物，在 pH7. 0-9. 0,溫度35-42°C下，轉(zhuǎn)化18-24h，催化生產(chǎn)a-酮戊二酸。
[0022] 所述底物在本發(fā)明的一種實施方式中，其濃度為110_135g/L。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：1、應(yīng)用本發(fā)明方法得到的L-谷氨酸氧化酶酶活達35U/mL以 上，最高可達156U/mL，實現(xiàn)了L-谷氨酸氧化酶的高效表達；2、發(fā)酵得到的發(fā)酵液可以直接 用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)a-KG，底物轉(zhuǎn)化率可達98. 7%且全細胞轉(zhuǎn)化投入的菌液體積僅為搖瓶水平 的 1/50。
【附圖說明】
[0024]圖1:乳糖優(yōu)化條件的優(yōu)化；
[0025] 圖2:分批發(fā)酵發(fā)酵曲線；
[0026]圖 3 :DO_stat發(fā)酵曲線；
[0027] 圖4 :指數(shù)發(fā)酵和DO-stat相結(jié)合發(fā)酵曲線；
[0028] 圖5 :最終確定高密度策略的發(fā)酵曲線。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1乳糖誘導(dǎo)條件優(yōu)化
[0030] 以本實驗室構(gòu)建的重組菌FMME089 (PanqingNiu,Enzymaticproductionofa-ke toglutaricacidfromL-glutamicacidviaL-glutamateoxidase,JournalofBiotechnolo gy，2014, 56-62)為出發(fā)菌種，優(yōu)化乳糖誘導(dǎo)條件。
[0031] 1)將重組菌株接種于LB培養(yǎng)基中，0D6QQ為0. 5-0. 6之間時，分別加入l、3、5、7g/L 的乳糖37°C誘導(dǎo)4h，比較LG0X的表達量。發(fā)現(xiàn)5g/L的乳糖誘導(dǎo)效果最好酶活達到4. 53U/ mL(圖 1A)。
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