一種降鈣素原單克隆抗體雜交瘤2h4及單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種降鈣素原單克隆抗體雜交瘤2H4及單克 隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 細菌或病毒等經(jīng)由創(chuàng)面、呼吸道、泌尿道、消化道入侵，在嚴重創(chuàng)傷，全身抵抗力 下降，體內(nèi)正常菌群失調(diào)，細菌移位等時，均可引起機體出現(xiàn)嚴重的感染癥狀，是引起臨床 各種并發(fā)癥，如膿毒癥、敗血癥休克，多器官功能障礙癥（multipleorgandysfunction syndr〇me，MODS)，乃至死亡的主要原因。據(jù)美國2001年統(tǒng)計資料顯示，該年僅重度膿 血癥就有75. 1萬例，平均死亡率高達28. 5%，這意味著該年死亡的人數(shù)竟然是愛滋病 (acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)的近三倍。對感染性疾病及其并發(fā)癥能早 期診斷和及時治療，可有效降低死亡率。
[0003] 常規(guī)用于診斷炎癥治療過程的指標如體溫、白細胞分類和計數(shù)、血沉或C反應(yīng) 蛋白（CRP)、血常規(guī)檢查等，，用于感染性疾病的血清學(xué)診斷已沿用多年，因其都不是十 分可靠的指標，是非特異性參數(shù)，所以易引起誤診或漏診。1990年發(fā)現(xiàn)的降鈣素原 (procalcitonin，PCT)經(jīng)證實其在血清中濃度的增高與感染的發(fā)生有密切關(guān)系，能為疾病 的診斷、鑒別，治療方案的選擇，預(yù)后判斷等提供新的實驗室標準。
[0004] 降媽素原（procalcitonin,PCT)是一種由116個氨基酸組成、分子量大約為13KD 的糖蛋白，是降鈣素（calcitonin，CT)的前肽物，無降鈣素樣的激素活性，其分子由降 鈣素、下鈣素和一個含57個氨基酸的N2末端碎片組成。它的半衰期為25-30h，在體內(nèi)穩(wěn)定 性很好。因為在正常及健康的個體中，PCT經(jīng)一系列的酶催化作用最后水解形成CT，故其血 清PCT的濃度極低，僅為10~50pg/ml，一般的方法檢測不到。在全身性細菌、真菌和寄生 蟲感染，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS)、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活動性肝炎、創(chuàng)傷 等患者的血清PCT水平異常增高，其濃度可達正常水平的幾倍甚至上萬倍，其生物學(xué)來源 機制可能為靶細胞（PBMC)等在LPS血類敗血癥相關(guān)因子作用下，應(yīng)急分泌PCT，這種應(yīng)急分 泌超過細胞后轉(zhuǎn)換過程（由PCT分解為CT)或后轉(zhuǎn)換過程缺少必需的水解酶，從而導(dǎo)致實 驗室觀察到的PCT成倍增長，而CT水平不變或稍增高；在病毒感染，自身免疫性疾病，器官 移植排斥反應(yīng)等患者的血清PCT濃度不增加或輕微增加。這就決定了PCT的高度特異性， 因此可用于此類疾病的鑒別診斷；在全身性細菌感染和膿毒癥輔助鑒別診斷、預(yù)后判斷、療 效觀察等方面有很高的臨床價值。
[0005] 因此為了診斷細菌性或非細菌性炎癥反應(yīng)、鑒別診斷膿毒癥和全身炎癥反應(yīng)堆的 嚴重程度，預(yù)防抗生素濫用等，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)抗PCT單克隆抗體，以便開發(fā)一種PCT 的診斷試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗降鈣素原的單克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明另一目的在于提供分泌上述抗降鈣素原單克隆抗體的雜交瘤細胞2H4。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的在于提供上述雜交瘤細胞2H4的制備方法。
[0009] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0010] 本發(fā)明所述的檢測PCT的抗體是用合成PCT抗原多肽作為抗原免疫BALB/c小鼠 獲得，并用細胞融合技術(shù)獲得產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤細胞株2H4,雜交瘤細胞分泌的抗體為 IgGl陽性，輕鏈為k型。所述抗PCT單克隆抗體雜交瘤2H4,于2014年12月16日保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學(xué))，保藏號為CCTCCNO:C2014232。
[0011] 本發(fā)明中PCT的氨基酸序列為AGM62655. 1，如SEQ ID NO :1所示。
[0012] 本發(fā)明中PCT的抗原多肽序列如SEQIDNO:2所示。
[0013] 所述的保藏號為CCTCCNO:C2014232的雜交瘤細胞株2H4的制備方法是：PCT抗 原多肽與馬來酰胺活化的匙孔血藍載體蛋白KLH偶聯(lián)，經(jīng)脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混 合免疫BALB/c小鼠，期間進行兩次以上免疫，取血清效價大于1:105的BALB/c小鼠脾細 胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規(guī)方法用50%PEG-4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細胞，用PCT抗原多肽包被ELISA板，進行ELISA篩選；經(jīng)過多次 有限稀釋，最后獲得穩(wěn)定分泌抗PCT單克隆抗體的雜交瘤細胞株，標記為2H4。應(yīng)用此株雜 交瘤細胞以1X106/只的量注入石蠟預(yù)處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察 10-14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ProteinGSepharoseFastFlow 純化單克隆抗體，以SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度，純度達到90%以上。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特色如下：
[0015] 本發(fā)明以合成的PCT抗原多肽包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活性， 并用此純化抗體對病人血清進行Western-blot證明該抗體可以識別天然PCT蛋白。
[0016] 本發(fā)明的單克隆抗體其免疫原是偶聯(lián)了KLH的合成PCT抗原多肽，其肽序列全長 27個氨基酸。
[0017] 本發(fā)明針對PCT合成短肽制備出的單克隆抗體對檢測PCT蛋白具有較高的特異 性和靈敏度，該抗體的應(yīng)用將為PCT的功能研宄和開發(fā)基于PCT的診斷試劑奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明單抗2H4對病人血清免疫印跡的結(jié)果。泳道1 :上樣為正常人血清； 泳道2, 3 :上樣為細菌感染病人血清；泳道M:蛋白Marker。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1本發(fā)明單克隆抗體的制備和鑒定
[0020] 1、單抗2H4的制備
[0021] 1)PCT抗原多肽的設(shè)計、制備及載體偶聯(lián)
[0022] 根據(jù)GenBank上的人PCT序列（登錄號：AGM62655. 1)獲得人PCT蛋白序列，含有 116個氨基酸。用TMHMM軟件分析PCT蛋白的跨膜域，IEDB軟件分析PCT蛋白免疫原性、 親疏水性及表面可及性，結(jié)果表明人PCT蛋白34-60aa有27個氨基酸抗原性、親水性及表 面可及性較強（圖1)。經(jīng)過上述分析，最終篩選多肽序列為：VQMKASELEQEQEREGSSLDSPRS KRC(34-60aa，SEQIDN0:2)。該短肽（PCT-P1)及C端偶聯(lián)匙孔血藍載體蛋白KLH的短肽 (PCT-P1-KLH)由上海吉爾生化公司合成。
[0023] 2)免疫小鼠
[0024] 將合成肽PCT-P1-KLH與弗氏完全佐劑按1:1混勻500y1乳化后，皮下多點注射 6-8周齡雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接種劑量為50yg，三周后抗原與弗氏不完全 佐劑按1:1混勻500y1乳化后皮下多點注射，每只小鼠抗原接種劑量為50yg，間隔三周后 50yg不加佐劑腹腔注射，共免疫4次。
[0025] 3)免疫血清效價測定
[0026] 采用間接ELISA法測定免疫血清效價。取50yg合成肽PCT-P1溶解于10ml0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C過夜。使用PBS(含有0. 05 % (V/V)Tw