專利名稱：寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法及其使用該發(fā)酵液有效控制煙草黑脛病的方法。
背景技術(shù)：
黑胚病nicotiana Breda ofe/fea/ )是我國烤煙的常見病害,發(fā)病率高，分布廣泛，危害嚴(yán)重。除黑龍江省之外，全國各地均有發(fā)生，常年發(fā)病面積占當(dāng)年烤煙種植面積的18%，嚴(yán)重影響烤煙的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。目前，化學(xué)農(nóng)藥是防治煙草黑脛病的主要手段。黑脛病病原菌的小種甚多，對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的敏感性不一樣，且容易產(chǎn)生抗藥性，多種化學(xué)藥劑對(duì)黑脛病的防治效果隨施藥時(shí)間的延長而降低。此外，這些化學(xué)藥劑的殘效期長，殘留量高，影響煙葉安全性。所以，在烤煙栽培中，安全、高效地防治煙草黑脛病是迫切需要解決的生產(chǎn)問題。 寡懺腐霉(Pythium能有效抑制番爺葡萄灰霉病、黃瓜的種腐和苗期猝倒病等多種病原真菌的生長繁殖。在歐洲發(fā)達(dá)國家，人們已制備出對(duì)人畜和環(huán)境無毒且高度安全的寡雄腐霉卵孢子制劑，廣泛應(yīng)用于綠色水果和蔬菜生產(chǎn)。但寡雄腐霉形成卵孢子，人工產(chǎn)孢困難，限制了寡雄腐霉的普遍應(yīng)用，目前，北京比奧瑞生物科技有限公司從捷克引進(jìn)了寡雄腐霉卵孢子制劑(菌株oligandrum DV 74),為寡雄腐霉防病制劑的后續(xù)開發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。眾所周知，卵孢子的萌發(fā)和菌絲生長與環(huán)境條件密切相關(guān)。作為一種微生物制劑，大田應(yīng)用寡雄腐霉卵孢子時(shí)，氣溫、濕度、光照(尤其是紫外線強(qiáng)度)、降雨、營養(yǎng)環(huán)境等均影響卵孢子的萌發(fā)和菌絲生長。此外，田間條件易于變化，難以提供寡雄腐霉卵孢子萌發(fā)和菌絲生長的合適環(huán)境，故卵孢子制劑在實(shí)際應(yīng)用中穩(wěn)定性極差。通過發(fā)酵工程生產(chǎn)其具有生防作用的次生代謝產(chǎn)物，在田間應(yīng)用時(shí)不僅可以提高防治效果，還可克服微生物菌劑效果不穩(wěn)定的常見缺點(diǎn)。因此，利用優(yōu)良高產(chǎn)寡雄腐霉菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件制備生防發(fā)酵液可能更好、更可靠地防治煙草黑脛病。迄今為止，國內(nèi)外尚無寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法及發(fā)酵液的施用方法，為有效控制煙草黑脛病提供技術(shù)支持。本發(fā)明選用北京比奧瑞生物科技有限公司從捷克引進(jìn)的“多利維生.寡雄腐霉”卵孢子制劑(菌株oligandrum DV 74),該產(chǎn)品已在歐盟、美國、加拿大、巴西等國家正式登記，并于2009年在我國農(nóng)業(yè)部登記(登記號(hào)LS20091213)，還獲得歐洲FiBL和美國OMRI有機(jī)認(rèn)證。本發(fā)明所述的一種寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(I)寡雄腐霉菌種的獲得
將“多利維生.寡雄腐霉”卵孢子制劑用無菌水稀釋10，105倍，改進(jìn)馬丁氏(Martin)瓊脂培養(yǎng)基100° C溶化搖勻，取5 mL培養(yǎng)基于25 mL試管中，121° C蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至45° C，每支試管加入16.5 mL 1%孟加拉紅無菌水溶液和15 mL 1%鏈霉素?zé)o菌水液，搖勻，傾斜放置制備斜面；接入稀釋后的寡雄腐霉卵孢子，25° C暗培養(yǎng)1(Γ12天，挑選出寡雄腐霉菌絲，并用上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法擴(kuò)繁菌絲；
改進(jìn)馬丁氏(Martin)瓊脂培養(yǎng)基I g KH2PO4、O. 5 g MgSO4 · 7H20、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酒石酸銨、I g琥拍酸、20 g瓊脂、1000ml水、ρΗ5· 5-6. O ;
(2)寡雄腐霉發(fā)酵液的制備
(2. I)培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基2%玉米粉，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始ΡΗ5. 5-6. O ;二級(jí)罐培養(yǎng)基同種子罐培養(yǎng)基；發(fā)酵罐培養(yǎng)基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始ρΗ5. 5-6. O ； (2. 2)液體發(fā)酵種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的種子罐培養(yǎng)基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風(fēng)量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)48小時(shí)；二級(jí)罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的二級(jí)罐培養(yǎng)基，將種子罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入二級(jí)罐中，在通風(fēng)量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土1°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的發(fā)酵罐培養(yǎng)基，將二級(jí)罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，在通風(fēng)量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)12(Tl40小時(shí)；
(2. 3)過濾濃縮發(fā)酵液放入緩存罐，用板框壓濾機(jī)壓濾；濾液打入另一個(gè)緩存罐，真空刮板濃縮5倍，蒸發(fā)溫度4(T42°C，即得發(fā)酵液。上述方法步驟(I)中，在3-5 ° C條件下，菌絲可保存3個(gè)月，多代擴(kuò)繁，長期自主保存做為菌種，在進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，取出擴(kuò)繁用于液體發(fā)酵的菌種。本發(fā)明所得寡雄腐霉發(fā)酵液的施用方法為
在煙草黑脛病高發(fā)期前7-10天，在我國西南地區(qū)一般為71月降雨后的高溫高濕期，將濃縮的寡雄腐霉發(fā)酵液兌水稀釋5 10倍，灌根f 2次，每次每株煙苗50 mL,間隔1(Γ 5天。本發(fā)明所得寡雄腐霉發(fā)酵液對(duì)煙草黑脛病菌有明顯的抑制作用，對(duì)黑脛病菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)到80. 5%和52. 9%。在離體葉片試驗(yàn)中，發(fā)酵液對(duì)中感紅花大金元的防效高達(dá)74. 2%，對(duì)易感紅花大金元防效也能達(dá)到71. 4% ；溫室盆栽試驗(yàn)中，接種煙草黑脛病菌前24h施用發(fā)酵液防治效果為65. 1%，接種后24h施用發(fā)酵液的防治效果為60. 1% ；在田間試驗(yàn)中，施用發(fā)酵液防治煙草黑脛病的效果為57. 5飛6. 3%，施用孢子粉防治煙草黑脛病的效果(Γ25. 4%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
I.寡雄腐霉發(fā)酵設(shè)備簡單、通用，資源消耗少，工業(yè)化生產(chǎn)要求低，一般微生物發(fā)酵工廠即可滿足生產(chǎn)。2.與寡雄腐霉卵孢子制劑相比，利用寡雄腐霉發(fā)酵液防治煙草黑脛病效果好而穩(wěn)定，受環(huán)境條件影響小，施用方法簡單，實(shí)用性強(qiáng)，容易推廣。3.成本低廉，寡雄腐霉卵孢子制劑進(jìn)口價(jià)格高昂，用本發(fā)明方法生產(chǎn)發(fā)酵液，施用成本僅為寡雄腐霉孢子制劑的20%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
I、培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基2%玉米粉(磨細(xì)過100目篩，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 5 ;二級(jí)罐培養(yǎng)基同種子罐培養(yǎng)基；發(fā)酵罐培養(yǎng)基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 5。2、發(fā)酵液制備種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至35°C的種子罐培養(yǎng)基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風(fēng)量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)48小時(shí)；二級(jí)罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至35°C的二級(jí)罐培養(yǎng)基，經(jīng)轉(zhuǎn)移管道將種子罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入二級(jí)罐中，在通風(fēng)量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至35°C的發(fā)酵罐培養(yǎng)基，經(jīng)轉(zhuǎn)移管道將二級(jí)罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，在通風(fēng)量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C ±1°C的條 件下培養(yǎng)12(Γ140小時(shí)；發(fā)酵液經(jīng)放料管道進(jìn)入緩存罐，經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾；濾液打入另一個(gè)緩存罐，再進(jìn)行真空刮板濃縮5倍(蒸發(fā)溫度4(T42°C)，即制備獲得發(fā)酵液。3、施用在四川省某煙地于2012年8月3日和8月13日分別用兌水稀釋5倍的寡雄腐霉發(fā)酵液灌根，每株50mL，防治煙草黑脛病的效果為66. 3 %，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做為對(duì)照無防治效果。實(shí)施例2:
I、培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基2%玉米粉(磨細(xì)過100目篩，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始pH6. O ;二級(jí)罐培養(yǎng)基同種子罐培養(yǎng)基；發(fā)酵罐培養(yǎng)基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH6. O。2、發(fā)酵液制備種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至33°C的種子罐培養(yǎng)基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風(fēng)量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土1°C的條件下培養(yǎng)48小時(shí)；二級(jí)罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至32°C的二級(jí)罐培養(yǎng)基，經(jīng)轉(zhuǎn)移管道將種子罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入二級(jí)罐中，在通風(fēng)量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至31°C的發(fā)酵罐培養(yǎng)基，經(jīng)轉(zhuǎn)移管道將二級(jí)罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，在通風(fēng)量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)12(Γ140小時(shí)；發(fā)酵液經(jīng)放料管道進(jìn)入緩存罐，經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾；濾液打入另一個(gè)緩存罐，再進(jìn)行真空刮板濃縮5倍(蒸發(fā)溫度4(T42°C)，即制備獲得發(fā)酵液。3、施用在貴州省某煙地于2012年7月20日和8月4日分別用兌水稀釋8倍的寡雄腐霉發(fā)酵液灌根，每株50mL，防治煙草黑脛病的效果為57. 5%，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做為對(duì)照的防治效果為25. 4%。實(shí)施例3:
I、培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基2%玉米粉(磨細(xì)過100目篩，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 7 ;二級(jí)罐培養(yǎng)基同種子罐培養(yǎng)基；發(fā)酵罐培養(yǎng)基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 7。2、發(fā)酵液制備種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至30°C的種子罐培養(yǎng)基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風(fēng)量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)48小時(shí)；二級(jí)罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至30°C的二級(jí)罐培養(yǎng)基，經(jīng)轉(zhuǎn)移管道將種子罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入二級(jí)罐中，在通風(fēng)量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至30°C的發(fā)酵罐培養(yǎng)基，經(jīng)轉(zhuǎn)移管道將二級(jí)罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，在通風(fēng)量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C ±1°C的條件下培養(yǎng)12(Γ140小時(shí)；發(fā)酵液經(jīng)放料管道進(jìn)入緩存罐，經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾；濾液打入另一個(gè)緩存罐，再進(jìn)行真空刮板濃縮5倍(蒸發(fā)溫度4(T42°C)，即制備獲得發(fā)酵液。3、施用在重慶市某煙地于2012年7月25日和8月5日分別用兌水稀釋10倍的寡雄腐霉發(fā)酵液灌根，每株50mL，防治煙草黑脛病的效果為59. 4%，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做為對(duì)照的防治效果為15 . 7 %。
權(quán)利要求
1.一種寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法，其特征在于通過以下步驟實(shí)現(xiàn) (1)寡雄腐霉菌種的獲得 將“多利維生.寡雄腐霉”卵孢子制劑用無菌水稀釋10，105倍，改進(jìn)馬丁氏(Martin)瓊脂培養(yǎng)基100° C溶化搖勻，取5 mL培養(yǎng)基于25 mL試管中，121° C蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至45° C，每支試管加入16.5 mL 1%孟加拉紅無菌水溶液和15 mL 1%鏈霉素?zé)o菌水液，搖勻，傾斜放置制備斜面；接入稀釋后的寡雄腐霉卵孢子，25° C暗培養(yǎng)1(T12天，挑選出寡雄腐霉菌絲，并用上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法擴(kuò)繁菌絲； 改進(jìn)馬丁氏(Martin)瓊脂培養(yǎng)基I g KH2PO4、0. 5 g MgSO4 7H20、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酒石酸銨、I g琥拍酸、20 g瓊脂、1000ml水、pH5. 5-6. 0 ; (2)寡雄腐霉發(fā)酵液的制備 (2. I)培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基2%玉米粉，1%葡萄糖，0. 25%酒石酸銨，0. 1%琥珀酸，余量為水，初始PH5. 5-6. 0 ;二級(jí)罐培養(yǎng)基同種子罐培養(yǎng)基；發(fā)酵罐培養(yǎng)基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，0. 5%酒石酸銨，0. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 5-6. 0 ； (2. 2)液體發(fā)酵種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的種子罐培養(yǎng)基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風(fēng)量為1:0. 1，罐壓0. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養(yǎng)48小時(shí)；二級(jí)罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的二級(jí)罐培養(yǎng)基，將種子罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入二級(jí)罐中，在通風(fēng)量為1:0. 25，罐壓0. 05Mpa，30°C 土1°C的條件下培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的發(fā)酵罐培養(yǎng)基，將二級(jí)罐中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐中，在通風(fēng)量為1:0. 5，罐壓0. 05Mpa，30°C ± 1°C的條件下培養(yǎng)12(Tl40小時(shí)； (2. 3)過濾濃縮發(fā)酵液放入緩存罐，用板框壓濾機(jī)壓濾；濾液打入另一個(gè)緩存罐，真空刮板濃縮5倍，蒸發(fā)溫度4(T42°C，即得發(fā)酵液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種寡雄腐霉發(fā)酵液制備方法及其使用該發(fā)酵液有效控制煙草黑脛病的方法，利用“多利維生．寡雄腐霉”卵孢子制劑(菌株P(guān)ythiumoligandrumDV74)獲得寡雄腐霉菌種，再經(jīng)液體發(fā)酵和過濾濃縮等步驟得到。與寡雄腐霉卵孢子制劑相比，利用寡雄腐霉發(fā)酵液防治煙草黑脛病效果好而穩(wěn)定，受環(huán)境條件影響小，施用方法簡單，實(shí)用性強(qiáng)；成本低廉，施用成本僅為寡雄腐霉孢子制劑的20%；寡雄腐霉發(fā)酵設(shè)備簡單、通用，資源消耗少，工業(yè)化生產(chǎn)要求低，一般微生物發(fā)酵工廠即可滿足生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102796674SQ20121033261
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者黃建國, 趙建, 袁玲 申請(qǐng)人:西南大學(xué)