亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法以及真核細(xì)胞與流程

文檔序號:12346444閱讀:608來源:國知局
在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法以及真核細(xì)胞與流程
本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域
,具體的,本發(fā)明涉及在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法以及真核細(xì)胞。
背景技術(shù)
:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是模式生物,是地球上最好理解的生物系統(tǒng)之一。然而,釀酒酵母內(nèi)部運作的錯綜復(fù)雜性仍使生物工程學(xué)家理不出頭緒,這個酵母繼續(xù)作為實驗原料來貢獻(xiàn)力量。如果科學(xué)家能夠“重新構(gòu)建”模式生物,即重新編碼它們的基因組,使其更簡單且更便于人類的認(rèn)知和修復(fù),以這些生物體為背景的科學(xué)和生物技術(shù)會以加速的步伐前進(jìn)。由此,合成生物學(xué)應(yīng)運而生。目前無論是DNA合成儀還是芯片,其產(chǎn)物均是70nt左右的寡核苷酸,而要合成大片段DNA,則依賴不同的DNA組裝方法。對于5kb以上20kb以下的DNA片段,現(xiàn)有的切分設(shè)計方法是利用基于同源臂(如Gibson組裝)或者酶切連接或者“橋”片段組裝方法的原理將大片段DNA切分為DNA小片段(如750bp),由于技術(shù)限制,過多的片段進(jìn)行組裝成功率非常低,所以這個方法并不能滿足合成更大片段的需求;后來,紐約大學(xué)的JefBoeke團隊針對長度更長的DNA片段提出了如下方法:將染色體切分為多種大小的片段進(jìn)行分步組裝,染色體被依次且分為30kb、10kb、750bp的DNA片段,然后進(jìn)行750bp的OE-PCR,750bp至10kb的Gibson組裝,10kb至30kb的酶切連接,30kb至染色體的單向替換,但是這個方法費時費力、步驟繁雜、錯誤率高。因此,目前合成細(xì)胞中染色體的手段,仍有待改進(jìn)。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此,本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠在靶細(xì)胞中合成染色體的方法。在本發(fā)明的第一方面,本發(fā)明提出了一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例,該方法包括:(1)提供多個一級核酸序列(在本文中,也被稱為“minichunk”),所述多個一級核酸序列是基于所述人工染色體的序列以及所使用的組裝核酸載體的序列而確定的,并且沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述一級核酸序列之間存在一級核酸序列同源區(qū);(2)利用組裝體系,將所述多個一級核酸序列中的至少一部分進(jìn)行組裝,以便獲得多個二級核酸序列(在本文中,也被稱為“chunk”),所述二級核酸序列的至少一部分中含有與所述靶細(xì)胞的染色體同源的野生型同源區(qū)(在本文中,也被稱為“wt-Ho”),并且沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述二級核酸序列之間存在二級核酸序列同源區(qū)(在本文中也被稱為“Ho”);(3)將所述多個二級核酸序列的至少一部分引入靶細(xì)胞,以便使所述二級核酸序列與所述靶細(xì)胞的染色體發(fā)生同源重組,從而在所述靶細(xì)胞的染色體中形成由所述多個二級核酸序列的至少一部分組成的三級核酸序列(在本文中,也被稱為“megachunk”),并且沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述三級核酸序列之間存在三級核酸序列同源區(qū)(在本文中,也被稱為“HoM”);(4)重復(fù)步驟(3)至少一次,以便在所述靶細(xì)胞中形成人工合成半染色體;以及(5)將位于不同靶細(xì)胞的兩條所述人工合成半染色體通過同源重組整合形成人工染色體。由于本發(fā)明將染色體切分為半染色體、三級核酸序列、二級核酸序列、一級核酸序列,通過逐級組裝以及同源重組等方法構(gòu)建人工合成染色體。本發(fā)明的方法能夠極大地縮短在細(xì)胞中尤其是真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞諸如釀酒酵母中構(gòu)建人工染色體的時間,降低成本,提高效率。在本發(fā)明的第二方面,本發(fā)明還提出了一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例,該方法包括:(1)基于染色體的基因組序列,進(jìn)行切分設(shè)計:A.確定左右半合成染色體的整合區(qū),并引入第三酶切位點,用于在合成型序列和sub酶識別位點之間形成雙鍵斷裂;B.將半合成染色體切分為三級核酸序列,進(jìn)而設(shè)計為二級核酸序列,在三級核酸序列中交替使用可篩選標(biāo)志物(在本文中,也被稱為“marker”);C.將二級核酸序列切分為一級核酸序列,相鄰的二級核酸序列擁有二級核酸序列同源區(qū)片段,相鄰的三級核酸序列擁有三級核酸序列同源區(qū)片段;(2)利用前面所述的在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法,在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體。需要說明的是,前面對第一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法的描述,同樣適用于第二種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法,在此不再贅述。在本發(fā)明的第三方面,本發(fā)明提出了一種真核細(xì)胞,根據(jù)本發(fā)明的實施例,所述真核細(xì)胞的染色體之一是通過前面所述的方法構(gòu)建的。由此,能夠有效獲得包含人工染色體的真核細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法設(shè)計大片段DNA或者染色體,會得到設(shè)計好的8-12k的DNA片段(在本文中稱之為chunk),和在這些8-12k的DNA片段基礎(chǔ)上設(shè)計好的2-4kb的DNA片段(在本文中稱之為minichunk)。這些minichunk片段可以使用已有的DNA組裝方法來組裝成為chunk片段,然后這些chunk片段會以4-6個chunk片段為一個單元(在本文中稱之為megachunk)的方式來進(jìn)行在載體上的組裝(如在釀酒酵母等宿主體內(nèi)進(jìn)行同源重組,替換到野生型的染色體上)。這種替換的工作可以分成兩部分并行,再進(jìn)行兩部分的整合,對于染色體來說,可以進(jìn)行從染色體左端和染色體右端的替換,兩端替換到產(chǎn)生指定位置后,可以利用I-SceI、I-CeuI、PI-PspI等核酸酶在帶有抗性標(biāo)記的野生部分和合成部分之間產(chǎn)生雙鍵斷裂,促使合成染色體的左端和右端進(jìn)行同源重組,最終獲得合成染色體。本發(fā)明方法,步驟簡單、實驗周期短、且組裝錯誤率低、費用低。附圖說明圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法將釀酒酵母的染色體分為三個步驟設(shè)計。圖2顯示了Gibson組裝產(chǎn)物SNV的驗證引物設(shè)計,在minichunk之間同源區(qū)的上游或者下游特定范圍內(nèi)設(shè)計引物。圖3顯示了本發(fā)明的方法中染色體組裝的流程原理示意圖。圖4(包括圖4-1、4-2、4-3)顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,synchr07的切分設(shè)計示意圖,其中黑灰和淺灰色方塊分別代表奇數(shù)位和偶數(shù)位的megachunk,深灰和淺灰色橢圓形分別代表抗性篩選標(biāo)記LEU2和URA3,深灰色方塊代表每個megachunk的野生型染色體區(qū)域;圖4-1、4-2、4-3按順序組合在一起是synchr07染色體中的一部分,在此為了更清楚地看清染色體上的切分信息,將圖4分成圖4-1、4-2、4-3。圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,為待拼接DNA小片段B3HO,B4F1,B4F2,B4F3,B4HO的酶切結(jié)果電泳圖,其中黑框中從左到右為B3.HO、B4.F1、B4.F2、B4.F3、B4.Ho使用2k酶進(jìn)行酶切的結(jié)果;根據(jù)設(shè)計的結(jié)果,目標(biāo)片段分別為1063bp、2729bp、2204bp、2773bp、1075bp,載體片段大小分別為2356bp、2356bp、2278bp、2278bp、2374bp。圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,釀酒酵母chr07_B4拼接結(jié)果質(zhì)粒電泳圖,其中黑框中為B4片段的4個單克隆菌提取的質(zhì)粒,從左到右標(biāo)記為B4#2、B4#3、B4#4、B4#5;組裝成功的B4片段連同載體一共12265bp,由此,B4#2、B4#4、B4#5為疑似拼接成功的結(jié)果。圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,chr07_B4的酶切鑒定結(jié)果,其中黑框中為B4片段的10k酶切產(chǎn)物;目標(biāo)片段為9555bp,載體片段為2716bp;3個結(jié)果顯示,質(zhì)粒均被切開,且片段大小均與預(yù)期一致。圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,5個酵母菌落gDNA樣本的PCR初篩電泳結(jié)果。圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,野生型酵母BY4741和初篩正確的編號為1的樣本的全引物PCR復(fù)篩電泳結(jié)果。圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,對單克隆進(jìn)行PCR初次篩選的電泳結(jié)果。圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,對單克隆進(jìn)行PCR二次篩選的電泳結(jié)果。圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施例,PCR二次篩選正確的編號為I7-7的菌株的測序分析結(jié)果。具體實施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖而描述的實施例是示例性的,旨在用于解釋本發(fā)明,而不能理解為對本發(fā)明的限制。為了更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方法,在此對本文中出現(xiàn)的術(shù)語進(jìn)行解釋說明。一級核酸序列:利用染色體切分設(shè)計軟件對染色體進(jìn)行切分設(shè)計后,得到多個一級核酸序列的序列信息。需要說明的是,此處切分設(shè)計的染色體可以是野生型染色體,也可以是經(jīng)過部分改造后合成的染色體。將一級核酸序列的序列信息進(jìn)行合成后,得到一級核酸序列,一級核酸序列可以保存在質(zhì)粒中。一級核酸序列是最小一級的核酸序列,兩個相鄰一級核酸序列之間存在序列的重疊區(qū)(在本文中,也被稱為“一級核酸序列同源區(qū)”),多個一級核酸序列可組裝成二級核酸序列。二級核酸序列:二級核酸序列由多個一級核酸序列通過組裝獲得。二級核酸序列可以保存在質(zhì)粒中。兩個相鄰二級核酸序列之間存在序列的重疊區(qū)(在本文中,也被稱為“二級核酸序列同源區(qū)”),部分二級核酸序列含有與靶細(xì)胞染色體同源的序列(在文本中,也稱為“野生型同源區(qū)”),一個或者多個二級核酸序列在染色體上進(jìn)行同源重組即可形成含有三級核酸序列的染色體。三級核酸序列:三級核酸序列由多個二級核酸序列通過同源重組獲得。兩個相鄰三級核酸序列之間存在序列的重疊區(qū)(在本文中,也被稱為“三級核酸序列同源區(qū)”),擁有一個或者多個三級核酸序列的染色體稱為人工合成半染色體。需要注意的是,在一條人工合成半染色體中,三級核酸序列是指二級核酸序列通過同源重組后成功替換上染色體的那部分序列,而非整個染色體實體。即三級核酸序列只是人工合成半染色體序列的一部分。人工合成半染色體:擁有一個或者多個三級核酸序列的染色體稱為人工合成半染色體,人工合成左臂染色體和人工合成右臂染色體是其中的兩種類型,人工合成左臂染色體是指該人工合成半染色體中包含著絲粒序列的左半部分序列是合成型序列,而右半部分序列則是野生型序列;反之,人工合成右臂染色體是指該人工合成半染色體的左半部分序列是野生型序列,而包含著絲粒序列的右半部分序列是合成型序列。人工合成左臂染色體和人工合成右臂染色體可通過整合獲得人工合成全染色體,人工合成全染色體是指該合成染色體上所有序列均是合成型的。人工合成左臂染色體的合成型序列和人工合成右臂染色體的合成型序列之間有同源區(qū)(在本文中,也被稱為“整合同源區(qū)”)。人工染色體:指的是通過同源重組整合得到的染色體,其序列既可以是合成型也可以是野生型,其中序列均是合成型的稱之為人工合成全染色體。第一酶切位點,也稱為2k酶切位點,對應(yīng)的酶稱為2k酶,是一級核酸序列兩端的酶切位點,用于將一級核酸序列和其所在載體分離??珊Y選標(biāo)志物組裝酶位點,也稱為mar酶切位點,對應(yīng)的酶稱為mar酶,是部分一級核酸序列中的酶切位點,用于將多個一級核酸序列和可篩選標(biāo)志物,組裝成二級核酸序列。第二酶切位點,也稱為10k酶切位點,對應(yīng)的酶稱為10k酶,是二級核酸序列兩端的酶切位點,用于將二級核酸序列和其所在載體分離??珊Y選標(biāo)志物切割酶位點,也稱為sub酶切位點,對應(yīng)的酶稱為sub酶,是部分二級核酸序列中的酶切位點,用于將二級核酸序列中的可篩選標(biāo)志物切割分離,亦用于部分一級核酸序列的組裝中。第三酶切位點,用于人工合成半染色體之間的同源重組整合。體外組裝:指在細(xì)胞體外將核酸片段組裝成更長片段的技術(shù)。體外組裝大體上包含三類:基于酶切鏈接的組裝(如Goldengate組裝),基于序列同源性的組裝(如Gibson組裝),基于序列橋接的組裝(如LCR組裝)。體外組裝的片段一般裝載在質(zhì)粒載體中。體內(nèi)組裝:指在細(xì)胞內(nèi)將核酸片段組裝成更長片段的技術(shù),體內(nèi)組裝一般是基于序列同源性的組裝(如酵母和大腸桿菌的體內(nèi)重組)。體內(nèi)組裝的片段直接裝載在基因組中。在本發(fā)明的第一方面,本發(fā)明提出了一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例,該方法包括:(1)提供多個一級核酸序列,所述多個一級核酸序列是基于所述人工染色體的序列以及所使用的組裝核酸載體的序列而確定的,并且沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述一級核酸序列之間存在一級核酸序列同源區(qū);(2)利用組裝體系,將所述多個一級核酸序列中的至少一部分進(jìn)行組裝,以便獲得多個二級核酸序列,所述二級核酸序列的至少一部分中含有與所述靶細(xì)胞的染色體同源的野生型同源區(qū)(在本文中,也被稱為“wt-Ho”),并且沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述二級核酸序列之間存在二級核酸序列同源區(qū)(在本文中也被稱為“Ho”);(3)將所述多個二級核酸序列的至少一部分引入靶細(xì)胞,以便使所述二級核酸序列與所述靶細(xì)胞的染色體發(fā)生同源重組,從而在所述靶細(xì)胞的染色體中形成由所述多個二級核酸序列的至少一部分組成的三級核酸序列(在本文中,也被稱為“megachunk”),并且沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述三級核酸序列之間存在三級核酸序列同源區(qū)(在本文中也被稱為“HoM”);(4)重復(fù)步驟(3)至少一次,以便在所述靶細(xì)胞中形成所述人工合成半染色體;以及(5)將位于不同靶細(xì)胞的兩條人工合成半染色體通過同源重組整合形成人工染色體。由于本發(fā)明將染色體切分為半染色體、三級核酸序列、二級核酸序列、一級核酸序列,通過逐級組裝以及同源重組等方法構(gòu)建人工合成染色體。因此,本發(fā)明的方法能夠極大地縮短在細(xì)胞中尤其是真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞諸如釀酒酵母中構(gòu)建人工染色體的時間,降低成本,提高效率。在本發(fā)明的實施例中,所述靶細(xì)胞為真核細(xì)胞。在本發(fā)明的實施例中,所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的實施例中,所述酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),通過本發(fā)明的方法,能夠有效地在真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞諸如釀酒酵母細(xì)胞中成功地構(gòu)建人工染色體。在本發(fā)明的實施例中,所述一級核酸序列的長度為2-4Kb。在本發(fā)明的實施例中,每個所述一級核酸序列的兩側(cè)含有第一酶切位點,所述第一酶切位點的選擇是基于所述一級核酸序列的特征確定的。在本發(fā)明的實施例中,所述第一酶切位點的選擇是基于下列原則確定的:i.該第一酶切位點不能出現(xiàn)在該一級核酸序列及其相鄰的一級核酸序列中。ii.在該一級核酸序列兩側(cè)添加上該第一酶切位點后,不會因為甲基化活性而導(dǎo)致該酶在宿主細(xì)胞中的酶切活性降低。iii.在符合前兩條原則的酶的初篩列表中,選擇價格最便宜的酶作為最終選擇的酶。在本發(fā)明的實施例中,所述第一酶切位點對應(yīng)酶(在本文中,也被稱為2k酶)為選自表3所示酶的至少之一,優(yōu)選表3所示酶中最適溫度為37攝氏度的酶的至少之一。表3在本發(fā)明的實施例中,所述一級核酸序列的至少一部分含有可篩選標(biāo)志物組裝酶的識別位點,所述可篩選標(biāo)志物組裝酶的識別位點的選擇是基于所述一級核酸序列的特征和所使用的可篩選標(biāo)志物而確定的,在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物組裝酶為選自表3所示酶的至少之一,優(yōu)選表3所示酶中最適溫度為37攝氏度的酶的至少之一,在本發(fā)明的實施例中,所述一級核酸序列儲存于攜帶抗性基因的核酸載體中。在本發(fā)明的實施例中,所述一級核酸序列同源區(qū)的長度為35~45bp。在本發(fā)明的實施例中,所述一級核酸序列同源區(qū)的Tm值為64~72攝氏度。在本發(fā)明的實施例中,所述一級核酸序列同源區(qū)的Gibbs自由能為至少-8。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),采用這些參數(shù),能夠有效地提高一級核酸序列組裝為二級核酸序列的效率,并且避免不期望的重組事件。在本發(fā)明的實施例中,所述多個一級核酸序列中的至少一部分中含有l(wèi)oxPsym位點。優(yōu)選地,在本發(fā)明的實施例中,所述loxPsym位點距離所述一級核酸序列同源區(qū)的距離為至少40bp。由此,可以避免反向重復(fù)的loxPsym序列可能造成的組裝錯誤。在本發(fā)明的實施例中,所述組裝體系為體外組裝體系,優(yōu)選基于同源臂的組裝體系,更優(yōu)選Gibson組裝體系。在本發(fā)明的實施例中,所述組裝體系為體內(nèi)組裝體系。在本發(fā)明的實施例中,所述二級核酸序列的長度為8-12Kb。在本發(fā)明的實施例中,所述二級核酸序列的兩側(cè)含有第二酶切位點,所述第二酶切位點的選擇是基于所述二級核酸序列的特征和所使用的組裝載體而確定。在本發(fā)明的實施例中,所述第二酶切位點的選擇是基于下列原則確定的:i.該第二酶切位點不能出現(xiàn)在該二級核酸序列及其相鄰的二級核酸序列中。ii.在該二級核酸序列兩側(cè)添加上該酶切位點后,不會因為甲基化活性而導(dǎo)致該酶在宿主細(xì)胞中的酶切活性降低。iii.在符合前兩條原則的酶的初篩列表中,選擇價格最便宜的酶作為最終選擇的酶。在本發(fā)明的實施例中,所述第二酶切位點對應(yīng)酶(在本文中,也被稱為10k酶)為選自表3所示酶的至少之一,優(yōu)選表3所示酶中最適溫度為37攝氏度的酶的至少之一。在本發(fā)明的實施例中,所述二級核酸序列儲存在組裝載體中,所述組裝載體的抗性由組成二級核酸序列的一級核酸序列的載體抗性確定。需要說明的是,在本發(fā)明的實施例中,儲存一級核酸序列的載體為普通載體,沒有明確要求,優(yōu)選地,一級核酸序列儲存于攜帶抗性基因的載體中;組裝二級序列所用的載體(即組裝載體)要和組裝方法配對。在本發(fā)明的一些實施例中,使用組裝體系為Gibson組裝體系,所用的組裝載體為pSBGAA和pSBGAK,其中pSBGAA載體的抗性為Amp,pSBGAK載體的抗性為Kan。在本發(fā)明的實施例中,每個所述二級核酸序列是基于4~6個所述一級核酸序列而形成的。在本發(fā)明的實施例中,所述野生型同源區(qū)與所述二級核酸序列同源區(qū)的長度分別獨立地為800~1200bp。由此,可以提高二級核酸序列在靶細(xì)胞中與野生型染色體間發(fā)生同源重組獲得三級核酸序列,并且進(jìn)一步提高三級核酸序列之間在靶細(xì)胞中發(fā)生重組最終獲得人工染色體的效率。在本發(fā)明的實施例中,所述二級核酸序列同源區(qū)為所述多個一級核酸序列之一。所述一級核酸序列可重復(fù)用于構(gòu)建相鄰兩個二級核酸序列。由此,可以進(jìn)一步降低合成人工染色體的成本。在本發(fā)明的實施例中,所述二級核酸序列同源區(qū)中不含有l(wèi)oxPsym位點。由此,可以避免反向重復(fù)的loxPsym可能造成的替換錯誤。在本發(fā)明的實施例中,所述二級核酸序列同源區(qū)與所述靶細(xì)胞背景DNA的相似性小于0.6,并且相似區(qū)的長度為100bp以下。由此,可以降低同源重組替換時出現(xiàn)錯誤替換的概率,進(jìn)而提高組裝準(zhǔn)確度。在本發(fā)明的實施例中,在組成三級核酸序列的最末端的二級核酸序列中包括可篩選標(biāo)志物。由此,便于確定二級核酸序列與靶細(xì)胞所發(fā)生的同源重組事件。在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物為營養(yǎng)缺陷型。由此,可以進(jìn)一步提高確定二級核酸序列與靶細(xì)胞所發(fā)生的同源重組事件的效率。在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物為URA3或LEU2。由此,可以進(jìn)一步提高確定二級核酸序列與靶細(xì)胞所發(fā)生的同源重組事件的效率。在本發(fā)明的實施例中,沿著所述人工染色體的序列,相鄰兩個所述三級核酸序列的可篩選標(biāo)志物不同。在本發(fā)明的實施例中,針對兩條人工合成半染色體,其中一條人工合成半染色體的最右端的二級核酸序列包含可篩選標(biāo)志物URA3,另一條人工合成半染色體的最左端的二級核酸序列包含可篩選標(biāo)志物URA3。由此,可以在篩選和整合時,能夠使用正篩和反篩(FOA篩選)。在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物的序列為所述多個一級核酸序列之一。攜帶可篩選標(biāo)志物的一級核酸序列可重復(fù)用于構(gòu)建攜帶可篩選標(biāo)志物的二級核酸序列。由此,可以進(jìn)一步降低合成人工染色體的成本。在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物的序列位于非必須的、功能已知或者功能未定義的編碼序列中。由此,可以提高經(jīng)過改造的靶細(xì)胞的存活率。在本發(fā)明的實施例中,在包含所述可篩選標(biāo)志物的二級核酸序列中,不包含自主復(fù)制起始位點(ARS)。由此,可以降低篩選的假陽性率。在本發(fā)明的實施例中,所述多個二級核酸序列的至少一部分中含有可篩選標(biāo)志物切割酶識別序列。由此,可以在實踐操作中,通過對可篩選標(biāo)志物切割酶(在本文中,也被稱為sub酶)進(jìn)行切割來替換可篩選標(biāo)志物。在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物切割酶為選自表3所示酶的至少之一。在本發(fā)明的實施例中,所述多個一級核酸序列的一部分含有所述第一酶切位點、第二酶切位點或者可篩選標(biāo)志物切割酶識別序列。在本發(fā)明的實施例中,針對兩條人工合成半染色體,其中一條人工合成半染色體的最右端的二級核酸序列含有第三酶切位點,另一條人工合成半染色體的最左端的二級核酸序列中含有第三酶切位點。需要說明的是,在引入第三酶切位點時,第三酶切位點對應(yīng)酶必須滿足以下條件:整個靶細(xì)胞基因組中沒有該酶的識別序列。以防止第三酶切位點對應(yīng)酶對靶細(xì)胞基因組產(chǎn)生作用。在本發(fā)明的實施例中,所述第三酶切位點位于所述二級核酸序列同源區(qū)與其他區(qū)域之間。由此,可以通過產(chǎn)生雙鍵斷裂提高同源重組效率。在本發(fā)明的實施例中,所述第三酶切位點為選自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI位點的至少之一,優(yōu)選I-SceI位點。由此,能夠有效實現(xiàn)在合成型序列和sub酶識別位點之間形成雙鍵斷裂,從而提高同源重組效率。在本發(fā)明的實施例中,每個所述三級核酸序列是基于4~6個所述二級核酸序列而形成的。在本發(fā)明的實施例中,所述三級核酸序列的長度為40~60Kb。在本發(fā)明的實施例中,所述三級核酸序列同源區(qū)為所述多個一級核酸序列之一。由此,可以進(jìn)一步降低合成人工染色體的成本。在本發(fā)明的第二方面,本發(fā)明還提出了一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例,該方法包括:(1)基于染色體的基因組序列,進(jìn)行切分設(shè)計:A.確定左右半合成染色體的整合區(qū),并引入第三酶切位點,用于在合成型序列和sub酶識別位點之間形成雙鍵斷裂;B.將半合成染色體切分為三級核酸序列,進(jìn)而設(shè)計為二級核酸序列,在三級核酸序列中交替使用可篩選標(biāo)志物;C.將二級核酸序列切分為一級核酸序列,相鄰的二級核酸序列擁有二級核酸序列同源區(qū)片段,相鄰的三級核酸序列擁有三級核酸序列同源區(qū)片段;(2)利用前面所述的在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法,在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體。在本發(fā)明的實施例中,4-6個所述二級核酸序列組成1個所述三級核酸序列。在本發(fā)明的實施例中,4-6個所述一級核酸序列組成1個所述二級核酸序列。在本發(fā)明的實施例中,所述第三酶切位點為選自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI位點的至少之一,優(yōu)選I-SceI位點。由此,能夠有效實現(xiàn)在合成型序列和sub酶識別位點之間形成雙鍵斷裂,從而提高同源重組效率。在本發(fā)明的實施例中,所述可篩選標(biāo)志物為LEU2和URA3。需要說明的是,前面對第一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法的描述,同樣適用于第二種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法,在此不再贅述。在本發(fā)明的第三方面,本發(fā)明提出了一種真核細(xì)胞,根據(jù)本發(fā)明的實施例,所述真核細(xì)胞的染色體之一是通過前面所述的任意一種在靶細(xì)胞中構(gòu)建人工染色體的方法構(gòu)建的。在本發(fā)明的實施例中,所述細(xì)胞為酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的實施例中,所述酵母為釀酒酵母。根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法設(shè)計大片段DNA或者染色體,會得到設(shè)計好的8-12k的DNA片段(在本文中稱之為chunk),和在這些8-12k的DNA片段基礎(chǔ)上設(shè)計好的2-4kb的DNA片段(在本文中稱之為minichunk)。這些minichunk片段可以使用到已有的DNA組裝方法來組裝成為chunk片段,然后這些chunk片段會以4-6個chunk片段為一個單元(在本文中稱之為megachunk)的方式來進(jìn)行在載體上的組裝(如在釀酒酵母等宿主體內(nèi)進(jìn)行同源重組,替換到野生型的染色體上)。這種替換的工作可以分成兩部分并行,再進(jìn)行兩部分的整合,對于染色體來說,可以進(jìn)行從染色體左端和染色體右端的替換,兩端替換到產(chǎn)生指定位置后,可以利用第三酶切位點對應(yīng)的酶在帶有抗性標(biāo)記的野生部分和合成部分之間產(chǎn)生雙鍵斷裂,促使合成染色體的左端和右端進(jìn)行同源重組,最終獲得人工合成染色體。需要說明的是,本發(fā)明的方法重在針對大片段DNA、所使用的組裝載體和篩選標(biāo)記(此處包含抗性篩選和營養(yǎng)缺陷篩選)的特征,以及實驗上對包括Gibson組裝和同源重組替換在內(nèi)的組裝流程的改用經(jīng)驗,為實驗人員提供成熟的大片段DNA或者染色體的合成、組裝、替換、驗證方案。該切分設(shè)計方法可使用SegMan(由深圳華大基因研究院提供,該軟件的軟件著作權(quán)申請證書登記號為:2015SR026088,通過參照將其全文并入本文)來實施,也可以通過其他可實現(xiàn)等同功能的軟件來實施。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例,本發(fā)明的方法的核心分為三部分:染色體至半染色體的設(shè)計,半染色體至8-12kb片段(即chunk)的設(shè)計,chunk至2-4kb片段(即minichunk)的設(shè)計。在實驗上,則是minichunk經(jīng)組裝成(可通過基于同源臂、酶連、“橋”片段連接的各種組裝方法)chunk,然后chunk從染色體兩端以4-6個chunk為單位(即megachunk)開始組裝或者替換(可通過同源重組替換、酶切連接組裝替換)至載體上(載體可以是質(zhì)粒、人工染色體、野生染色體等)。最后采取雙向策略,將兩個攜帶有人工合成半染色體的載體進(jìn)行基于第三酶切位點的同源重組整合,得到整條人工合成染色體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例,以人工合成釀酒酵母的一條染色體為例展示切分技術(shù)方案:將釀酒酵母的染色體分為三個步驟設(shè)計:A.確定左右半合成染色體的整合區(qū),并引入I-sceI,用于在合成型序列和sub酶識別位點之間形成雙鍵斷裂;B.將半合成染色體切分為megachunk,進(jìn)而設(shè)計為chunk,在megachunk中交替使用篩選標(biāo)記物(比如LEU2和URA3),多個chunk(比如4-6個)組成一個megachunk;C.將chunk切分為minichunk,多個minichunk(比如4-6個)組成一個chunk,同時還有兩個特殊的minichunk的設(shè)計,相鄰chunk擁有的同源區(qū)設(shè)計為Ho片段,相鄰megachunk擁有的同源區(qū)設(shè)計為HoM片段。本發(fā)明的方法考慮了大量目標(biāo)DNA或者染色體、所使用的組裝載體和抗性篩選標(biāo)記的特征,如單個染色體的局部與整個宿主背景DNA的同源性,非必須的、功能已知或者功能未定義的編碼序列、ARS、引入的loxpSym序列的位置,載體和抗性標(biāo)記的酶切位點,染色體的局部Tm值和MinimalGibbsFreeEnergy等。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例,本發(fā)明的方法涉及的參數(shù)如下:一、基本參數(shù)1、megachunk的長度為40kb-60kb,chunk的長度為8-12kb,minichunk的長度為2-4kb;染色體左端和右端的syn同源區(qū)長度為2000-5000bp,chunk之間的syn同源區(qū)和wt同源區(qū)的長度為800-1200bp,minichunk之間的同源區(qū)為35bp-45bp,minichunk之間同源區(qū)的Tm值范圍為64-72℃,最小Gibbs自由能大于-8。二、同源臂參數(shù)1.chunk之間同源區(qū)與宿主(以釀酒酵母為例)背景DNA的相似性小于0.6,相似區(qū)長度小于100bp,以降低同源重組替換時,出現(xiàn)替換錯誤的概率。2.chunk之間同源區(qū)不含有l(wèi)oxpSym位點,minichunk之間同源區(qū)距離loxPsym位點至少40bp,以避免反向重復(fù)的loxPsym可能造成的未知的組裝錯誤。酶參數(shù):3.第一酶切位點、第二酶切位點對應(yīng)酶、可篩選標(biāo)志物組裝酶和可篩選標(biāo)志物切割酶在酶切后都留有5’單鏈或者平末端(或者都留有3’單鏈或者平末端),使得酶切后進(jìn)行同源重組替換時,不會引入scar單核苷酸突變。上述第一酶切位點、第二酶切位點對應(yīng)酶,以及可篩選標(biāo)志物切割酶均可選自表3所示酶的至少之一。4.設(shè)計可篩選標(biāo)志物切割酶,使得共用的minichunk——HoM片段能被重復(fù)利用;5.第一酶切位點、第二酶切位點對應(yīng)酶、可篩選標(biāo)志物組裝酶以及可篩選標(biāo)志物切割酶的最適溫度盡量在37℃附近,盡量使用低價且沒有甲基化沉默活性的酶。三、特殊參數(shù)1.在染色體左右端的最后一個chunk的合成型序列和sub酶識別位點之間插入第三酶切位點,例如I-sceI位點,以便于左右臂整合。第三酶切位點可將合成型序列和sub酶識別位點分開,產(chǎn)生雙鍵斷裂,增大同源重組率。2.可篩選標(biāo)記物的插入位置在非必須的、功能已知或者功能未定義的編碼序列中。使得可篩選標(biāo)志物的插入不會影響到生物體的基本生長。3.攜帶可篩選標(biāo)志物的chunk中沒有ARS,以避免在同源重組替換的實驗過程中,沒有替換上去的chunk片段能夠自我復(fù)制,使得細(xì)胞具有該可篩選標(biāo)志物的抗性,增加篩選的假陽性率。4.Megachunk之間的同源區(qū)設(shè)計為標(biāo)記HoM的minichunk,chunk之間的同源區(qū)設(shè)計為標(biāo)記Ho的minichunk。5.設(shè)計插入可篩選標(biāo)志物切割酶的酶切位點,使得可篩選標(biāo)志物成為minichunk,可以重復(fù)利用,進(jìn)一步降低合成成本。另外,根據(jù)本發(fā)明實施例的方法考慮了大量目標(biāo)DNA或者染色體、所使用的組裝載體和抗性篩選標(biāo)記的特征,如單個染色體的局部與整個宿主背景DNA的同源性,非必須的、功能已知或者功能未定義的編碼序列、ARS、引入的loxpSym序列的位置,載體和抗性標(biāo)記的酶切位點,染色體的局部Tm值和MinimalGibbsFreeEnergy(最小Gibbs自由能)等。另外,根據(jù)本發(fā)明的實施例,還可以對Gibson組裝產(chǎn)物的SNV進(jìn)行驗證,具體步驟包括:在每個chunk的minichunk之間的同源區(qū)的上游或者下游設(shè)計引物,以便于利用第一代測序技術(shù)sanger測序來進(jìn)行驗證。由此,根據(jù)本發(fā)明的實施例,切分設(shè)計方法能夠采用雙向策略將大片段DNA或者染色體切分設(shè)計為8-12kb大小的DNA和2-4kb大小的DNA片段。相比現(xiàn)有的方法,這種切分設(shè)計方法的步驟簡單、實驗周期短,且組裝錯誤率低、費用低。在實驗上,則是minichunk經(jīng)組裝成(可通過基于同源臂的各種組裝方法)chunk,然后chunk從染色體兩端以多個chunk為單位(即megachunk)開始組裝或者替換(可通過同源重組替換)至載體上(載體可以是質(zhì)粒、人工染色體、野生染色體等)。替換采取雙向策略,最終將兩個攜帶有人工合成半染色體的載體進(jìn)行基于第三酶切位點的同源重組整合,獲得整條人工合成染色體。通常而言,針對較大的DNA片段,如染色體規(guī)模的片段來說,現(xiàn)有的切分設(shè)計方法是將染色體切分為30kb、10kb、750bp、70nt的DNA片段,然后進(jìn)行70nt至750bp的OE-PCR,750bp至10kb的Gibson組裝,10kb至30kb的酶切連接,30kb至染色體的單向替換。從以上步驟可看到,若采用現(xiàn)有的切分設(shè)計方法,一個1Mb的染色體從頭到尾進(jìn)行合成、組裝、替換,需要4個核心步驟,需要做至少30870個70nt至750bp的OE-PCR、至少1470個750bp至10kb的Gibson組裝、至少105個10kb至30kb的酶切連接和至少35個30kb至染色體的單向替換。再結(jié)合上必須的質(zhì)控、除錯、篩選等,步驟非常繁雜而且耗時耗力。而根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法將70nt至2kb-4kb的組裝這一步轉(zhuǎn)交給DNA合成方,直接使用2kb-4kb大小的片段(即minichunk)至8-12kb大小的片段(即chunk)進(jìn)行組裝,接著拋棄10kb至30kb酶切連接一步,直接進(jìn)行以4-6個chunk為單位(即megachunk)的同源重組替換;該組裝和替換均從染色體兩端同時進(jìn)行,加上最后的左右端同源重組整合,總共是3個核心步驟。以釀酒酵母的合成型7號染色體來說,長約1.03Mb的synchr07只需要485個minichunk至chunk的Gibson組裝和129個chunk至染色體的替換。即便加上質(zhì)控、除錯、篩選和后續(xù)的同源重組整合,步驟大幅減少,使用的時間精力也大幅下降。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法,所需要的人工成本,實驗物料儀器成本、水電儲存等成本能夠得到大幅降低。另外根據(jù)本發(fā)明實施例的方法,在minichunk的設(shè)計中,也對minichunk的重復(fù)利用進(jìn)行特殊設(shè)計。一,將megachunk之間的和chunk之間的同源區(qū)(約1kb)設(shè)計為共用的minichunk,用于上下兩個相鄰chunk的組裝;二,將marker作為一個共用的minichunk來使用,在對應(yīng)chunk的組裝中重復(fù)被利用。以synchr07為例,總共有127個Ho或者HoM片段,以平均長度900bp來算,這點總共節(jié)省了114.3kb的合成成本;兩種marker總共使用了23次,以平均長度700bp來算,這點總共節(jié)省了14.7kb的合成成本。上述兩點節(jié)省的成本占總合成成本的8%左右。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法,步驟簡單、實驗周期短、且組裝錯誤率低、費用低。在根據(jù)本發(fā)明的實施例的方法中,除去了10kb至30kb的酶切連接的步驟,同時對組裝的minichunk之間的同源區(qū)附近設(shè)計引物,通過sanger測序進(jìn)行質(zhì)控,從根本上解決了組裝錯誤率的兩大錯誤來源問題,使得組裝錯誤率較低。實施例:本實施例通過染色體切分設(shè)計、minichunk至chunk的組裝、chunk至megachunk的體內(nèi)替換、左右臂同源重組整合,共4個部分,構(gòu)建釀酒酵母合成型7號染色體,具體如下:一、釀酒酵母合成型7號染色體(synchr07)切分設(shè)計方案。使用切分設(shè)計軟件SegMan(由深圳華大基因研究院提供,該軟件的軟件著作權(quán)申請證書登記號為:2015SR026088,通過參照將其全文并入本文)來進(jìn)行釀酒酵母合成型7號染色體(釀酒酵母野生型7號染色體數(shù)據(jù)可通過SGD數(shù)據(jù)庫(http://www.yeastgenome.org/)獲得,可根據(jù)需要對其進(jìn)行多種序列的修改后,即可獲得釀酒酵母合成型7號染色體的數(shù)據(jù))的切分設(shè)計。具體操作方法參照軟件使用說明書。發(fā)明人通過對目標(biāo)染色體序列進(jìn)行切分得到標(biāo)記為A1-Y5的129個chunk的genbank格式和fasta格式的信息文件,也得到在chunk的基礎(chǔ)上設(shè)計的485個minichunk的genbank格式和fasta格式的信息文件。Chunk設(shè)計的結(jié)果如圖4所示(部分)。圖4顯示了synchr07的切分設(shè)計示意圖。黑灰和淺灰色方塊分別代表奇數(shù)位和偶數(shù)位的megachunk,深灰和淺灰色橢圓形分別代表抗性篩選標(biāo)記LEU2和URA3,深灰色方塊代表每個megachunk的野生型染色體區(qū)域。通過該圖可以獲得chunk設(shè)計的直觀了解。表1顯示了切分設(shè)計好的Bmegachunk的chunk信息,表2顯示了切分設(shè)計好的B4chunk的minichunk信息。表1表2二、以chunkB4的所有minichunk為例進(jìn)行minichunk至chunk的Gibson組裝1.制備待拼接的minichunk質(zhì)粒B3HO,B4F1,B4F2,B4F3,B4HO1.1取出12mL圓底培養(yǎng)管,各倒入液體LB培養(yǎng)基5mL,分別加對應(yīng)的抗生素(如minichunk質(zhì)粒攜帶的是KanR抗性,則加入卡那霉素)至50μg/mL。接種10μL菌液至圓底培養(yǎng)管中,在37℃下200rpm搖培過夜。1.2用1.5mL離心管12000rpm離心1min收集菌體2次,使用天根快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,用50μLTBbuffer溶解DNA。使用Nanodrop2000測定所提質(zhì)粒DNA的濃度,要求DNA濃度≥120ng/μL。2.進(jìn)行minichunk質(zhì)粒的酶切回收2.1取1μLDNA電泳檢測。瓊脂糖凝膠濃度為1%,6μLWide-RangeDNAMarker,電壓為130V,電泳時間為1h。2.2在1.5mL離心管中,配制以下體系對minichunk質(zhì)粒進(jìn)行酶切,在酶的最適溫度反應(yīng)3h:minichunk對應(yīng)的2k酶(見B4的信息,表2)1μL對應(yīng)2k酶的緩沖液2μL模板DNA(minichunk質(zhì)粒)2μgddH2O補足20μL2.3取1μL酶切產(chǎn)物電泳檢測。瓊脂糖凝膠濃度為1%,6μLWide-RangeDNAMarker,電壓為130V,電泳時間為1h。圖5為待拼接minichunkB3HO,B4F1,B4F2,B4F3,B4HO的酶切結(jié)果電泳圖。圖5紅框中從左到右為B3.HO、B4.F1、B4.F2、B4.F3、B4.Ho使用2k酶酶切的結(jié)果。根據(jù)設(shè)計的結(jié)果,目標(biāo)片段分別為1063bp、2729bp、2204bp、2773bp、1075bp,載體片段大小分別為2356bp、2356bp、2278bp、2278bp、2374bp。2.4使用QIAquickPCRPurificationKit純化回收酶切產(chǎn)物,用15μLEBbuffer溶解DNA。使用Nanodrop2000測定所回收DNA的濃度,將回收的DNA放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.進(jìn)行Gibson組裝并轉(zhuǎn)化3.1設(shè)用于拼接的minichunk條數(shù)為N,編號為F1-FN;minichunk質(zhì)粒的總長度為Y,minichunk長度為X,回收的DNA濃度為C,則minichunk濃度為CN=X/Y×C;組裝載體pSBGAK濃度為CV(Gibson組裝體系及其載體,來自NEB提供的GibsonMasterMix),在1.5mL離心管按下表配制拼接反應(yīng)體系:ERMix14μL拼接載體10/CVF150/C1F250/C2……FN50/CNddH2O補至20μL3.2將配好的拼接體系在Thermomixer中50℃反應(yīng)1h。3.3用冰盒取適量的冰,從-80℃冰箱拿1管大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,迅速放在冰上。取10μL拼接反應(yīng)液,加入到1.5mL離心管中,放在冰上預(yù)冷。待感受態(tài)細(xì)胞融化后,取50μL感受態(tài)細(xì)胞加入到離心管中,吹吸3次與拼接反應(yīng)液混勻,冰浴30min。期間調(diào)Thermomixer至42℃,打開搖床調(diào)至37℃200rpm。將離心管迅速放入Thermomixer中,42℃熱激90sec。迅速取出離心管放回冰上,冰浴4min。在超凈臺上,加700μLSOC液體培養(yǎng)基到離心管中,將離心管放入搖床,37℃200rpm培養(yǎng)45min。取出離心管,12000rpm離心30sec,在超凈臺中去掉600μL上清液,用余下的上清液吹吸混勻沉淀,涂在對應(yīng)抗性的平板上。(篩選平板對應(yīng)的氨芐西林工作濃度為50μg/mL,卡那霉素的工作濃度為30μg/mL。)3.9將涂好的平板在超凈臺上晾干,37℃培養(yǎng)過夜。4.對Gibson產(chǎn)物進(jìn)行鑒定4.1取5個12mL圓底培養(yǎng)管,分別倒入4mLLB液體培養(yǎng)基,加氨芐西林至50μg/mL。取出轉(zhuǎn)化平板,用10μL移液器吸頭挑5個單克隆,分別接種到5個圓底培養(yǎng)管中,在37℃下200rpm培養(yǎng)過夜。4.3用1.5mL離心管12000rpm離心1min收集菌體1次,使用天根快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,用50μLTBbuffer溶解DNA。4.4取2μLDNA電泳檢測。瓊脂糖凝膠濃度為1%,6μLWide-RangeDNAMarker,電壓為130V,電泳時間為1h。圖6所示為釀酒酵母chr07_B4拼接結(jié)果質(zhì)粒電泳圖。圖6黑框中為B4片段的4個單克隆菌提取的質(zhì)粒,從左到右標(biāo)記為B4#2、B4#3、B4#4、B4#5。組裝成功的B4片段連同載體一共12265bp,由此,B4#2、B4#4、B4#5為疑似拼接成功的結(jié)果。4.5根據(jù)電泳結(jié)果,選2-3個大小正確的質(zhì)粒,在DNA大片段兩段選擇合適的酶切位點(即表1chunk質(zhì)粒的酶),按下表配制反應(yīng)體系進(jìn)行酶切鑒定,在酶的最適溫度下反應(yīng)3h:限制酶0.5μL10×buffer2μLDNA2μLddH2O15.5μL4.6取10μL酶切產(chǎn)物電泳檢測。瓊脂糖凝膠濃度為1%,6μLWide-RangeDNAMarker,電壓為130V,電泳時間為1h。圖7所示為chr07_B4的酶切鑒定結(jié)果。圖7黑框中為B4片段的10k酶切產(chǎn)物。目標(biāo)片段為9555bp,載體片段為2716bp。3個結(jié)果顯示,質(zhì)粒均被切開,且片段大小均與預(yù)期一致。由此,B4片段(8-12kb片段)已組裝成功。三、以B1-B5(5個10kb片段)替換至synchr07A(50kb部分)為例,進(jìn)行chunk至megachunk的酵母同源重組替換1.提取質(zhì)粒1.1在12mL圓底培養(yǎng)管中加入5mLLB液體培養(yǎng)基和加5μL對應(yīng)的抗生素(例如質(zhì)粒的抗性是KanR,則加入卡那霉素)。每管接10μL菌液,每個菌株接2管,在37℃下200rpm搖培過夜。1.2用2mL離心管12000rpm離心1min收集菌體3次,使用天根快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,用50μLTBbuffer溶解DNA。使用Nanodrop2000測定所提質(zhì)粒DNA的濃度,-20℃冰箱保存。1.3取0.5μL質(zhì)粒DNA與2μL10×loadingbuffer,吹吸混勻,點樣,點3μLλ-HindIIIDNAMarker;1.2%瓊脂糖,120V電泳40min,染膠10min(質(zhì)粒濃度<400ng/μL時取1μL電泳,>400ng/μL時取0.5μL電泳)。2.酶切回收2.1在1.5mL離心管中,配制以下20μL體系,對chunk質(zhì)粒進(jìn)行酶切,在酶的最適溫度反應(yīng)3h,每個質(zhì)粒切2管:Chunk質(zhì)粒對應(yīng)的酶(見B的信息,表1)1μL限制性酶對應(yīng)的緩沖液2μLchunk質(zhì)粒DNA3-4μgddH2O加ddH2O補足20μL2.2取1μL酶切產(chǎn)物與2μL10×loadingbuffer,吹吸混勻,點樣,點3μLλ-HindIIIDNAMarker;1.2%瓊脂糖,120V電泳40min,染膠10min。使用Qiagen凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物(將相同的兩管酶切產(chǎn)物放到同一個管中以增加產(chǎn)物的量),用20μLEBbuffer溶解DNA。使用Nanodrop2000測定所回收DNA的濃度,-20度冰箱保存。3.酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化3.1取出12mL圓底培養(yǎng)管,加入4mLYPD液體培養(yǎng)基和10μL菌液,在30℃下200rpm搖培過夜進(jìn)行復(fù)蘇。3.2在錐形瓶中加入50mLYPD液體培養(yǎng)基,接種過夜培養(yǎng)的菌液,在30℃下200rpm搖培至OD值介于0.6-1.0之間。3.3將50mL菌液倒入50mL離心管中,3000rpm離心5min。去除上清,懸空加入50mL滅菌水,顛倒混勻,3000rpm離心5min。去除上清,懸空加入20mL0.1mol/L的醋酸鋰溶液,顛倒混勻,3000rpm離心5min。去除上清,加入1mL的0.1mol/L的醋酸鋰溶液,將菌體吹打混勻,至此,酵母感受態(tài)細(xì)胞制備完成。3.4在1.5mL離心管中加入100μL的酵母感受態(tài)細(xì)胞,然后依次加入2.2中酶切回收的DNA片段各200-500ng,25μLssDNA,41μL1mol/L的醋酸鋰溶液,312μL50%PEG3350,將菌體吹打混勻或振蕩混勻,置于30℃培養(yǎng)箱放置30min,加入50μLDMSO,稍微振蕩混勻后,將離心管置于42℃的金屬浴鍋上放置15min,取出離心管,3000rpm離心2min,小心吸去上清,加入1mL5mM的CaCl2溶液吹打混勻,3000rpm離心1min,仔細(xì)去除上清,加入100μL5mM的CaCl2溶液,將菌體吹打混勻。3.5在SC-Ura平板上倒上滅菌的玻璃珠,在平板中央滴上100μL5mM的CaCl2溶液,然后在平板的CaCl2溶液中央加入15μL樣品,用玻璃珠將液體涂布均勻,稍稍晾干后,將平板放置到30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-3天。4.鑒定同源重組替換產(chǎn)物4.1將3.5的平板上的菌影印到滅菌的天鵝絨布上,再通過絨布將拷貝的菌落分別轉(zhuǎn)移到SC-Ura和SC-Leu培養(yǎng)基的選擇平板上,30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。4.2取出培養(yǎng)好的選擇平板,挑選出在SC-Ura平板上菌落飽滿而在SC-Leu平板上菌落扁平的菌,用牙簽將這些克隆涂布到SC-Ura的選擇平板上,30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜后,再次將拷貝的菌落分別轉(zhuǎn)移到SC-Ura和SC-Leu培養(yǎng)基的選擇平板上,30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。4.3再次挑選出在SC-Ura平板上菌落飽滿而在SC-Leu平板上菌落扁平的菌,將菌體從平板上掛下來,分別加入到1.5mL離心管中,加入100μLSDS將菌體吹打混勻,然后加入玻璃珠和100μLPCI。將裝有上述溶液的離心管在振蕩器上振蕩3min,然后加入100μL滅菌水,繼續(xù)振蕩混勻10s。將上述溶液的離心管,12000rpm離心10分鐘,用150μL體積吸取上層清液到干凈的1.5mLEP管中,做好標(biāo)記,-20℃冰箱保存。即得酵母的gDNA。4.6為了鑒定上一步得到的gDNA是否正確,我們從每一個替換的10kb片段上各選取一對合成型引物和一對野生型引物。關(guān)于引物的說明:在設(shè)計釀酒酵母合成型7號染色體序列時,由于設(shè)計的基因編碼區(qū)域序列與野生型基因序列不同,并且序列之間的差異大于33%,因此,以這些具有差異的序列作為模板,使用引物設(shè)計軟件即可設(shè)計出對應(yīng)的合成型引物和野生型引物。配制以下體系,對gDNA進(jìn)行PCR鑒定。gDNA0.5μLrTaq酶0.1μL10Xbuffer1.25μLdNTPMix1.5μL正向引物F0.5μL反向引物R0.5μLddH2O補足12.5μL圖8是5個酵母菌落gDNA樣本的PCR初篩電泳結(jié)果圖。在每一個進(jìn)行替換的chunk(B1、B2、B3、B4、B5)上,各挑選1對合成型引物和1對野生型引物進(jìn)行PCR。圖中每一個樣本的B1、B2、B3、B4、B5均各有兩條泳道,左邊泳道是野生型引物擴增結(jié)果、右邊泳道是合成型引物擴增結(jié)果。野生型引物擴增均沒有產(chǎn)物條帶,合成型引物擴增均有產(chǎn)物條帶的樣本是正確的,即編號為1、2、3、5的樣本初篩結(jié)果是正確的。4.7PCR程序:94℃,5min;94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;72℃,10min;12℃,∞。30個循環(huán)。4.8取1μLPCR產(chǎn)物電泳檢測。瓊脂糖凝膠濃度為1.5%,6μLDL2000DNAMarker,電壓為130V,電泳時間為40min,染膠10min。4.9經(jīng)電泳檢測正確的樣品,按照上述體系,選取全部的PCRTaq,再次進(jìn)行PCR和電泳檢測。圖9是野生型酵母BY4741和初篩正確的編號為1的樣本的全引物PCR復(fù)篩電泳結(jié)果圖。其中,圖9中,上圖為野生型酵母BY4741的PCR結(jié)果,下圖為編號為1的樣本的PCR結(jié)果。對于上下兩部分(即上圖和下圖)PCR結(jié)果,又細(xì)分為野生型引物和合成型引物的PCR結(jié)果。每一個泳道則是對應(yīng)產(chǎn)物的ID。對于野生型酵母BY4741來說,野生型引物擴增后均有條帶而合成型引物擴增均無條帶是正常的對照;對于編號為1的樣本來說,野生型引物擴增后均無條帶而合成型引物擴增均有條帶證明該樣本已經(jīng)替換成功。經(jīng)鑒定正確的樣品,挑取其在平板上對應(yīng)的克隆,在YPD培養(yǎng)基中,30℃搖培過夜,在滅菌的超凈臺中,取500μL過夜培養(yǎng)的酵母菌液加入滅菌的EP管中,加入等體積50%的甘油,吹打混勻,做好標(biāo)記,-80℃冰箱保存。四、以酵母7號人工合成左臂染色體和人工合成右臂染色體的同源重組整合為例進(jìn)行人工合成左臂染色體和人工合成右臂染色體的整合1.半合成菌株雜交挑人工合成左臂染色體和人工合成右臂染色體單克隆各1個,共同接種至3mLYPD液體培養(yǎng)基中,30℃200rpm搖培過夜,取適量菌液涂SC-Lys-Met培養(yǎng)基平板,30℃培養(yǎng)直至長出單克隆。2.染色體整合2.1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化在雜交平板上挑Lys+Met+單克隆,使用醋酸鋰法(可參照:Schiestl,R.H.andGietz,R.D.(1989)Highefficiencytransformationofintactyeastcellsusingsinglestrandednucleicacidsasacarrier.Curr.Genet.,16,339–346.)將I-SceI表達(dá)載體pRS413-ISceI(由美國約翰霍普金斯大學(xué)JefDBoeke教授提供)轉(zhuǎn)入二倍體合成染色體菌株中,涂SC-His培養(yǎng)基平板,30℃培養(yǎng)直至長出單克隆。2.2誘導(dǎo)整合在轉(zhuǎn)化平板上挑His+單克隆,接種至3mLSC-His液體培養(yǎng)基中,30℃200rpm搖培過夜;1/10接種至SC-His(棉籽糖)液體培養(yǎng)基中,搖培至對數(shù)中期(OD600=0.4);離心收集菌體,用SC-His(半乳糖)液體培養(yǎng)基重懸菌體,搖培誘導(dǎo)2h;接適量菌液至3mLYPD液體培養(yǎng)基中,30℃200rpm搖培過夜。3誘導(dǎo)產(chǎn)孢3.1誘導(dǎo)產(chǎn)孢取1mL誘導(dǎo)菌液,涂SPOR產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板,室溫放置1d,30℃誘導(dǎo)產(chǎn)孢7-10d。3.2孢子篩選在產(chǎn)孢平板上用黃槍頭刮適量菌體至25μL酵母細(xì)胞壁裂解酶Zymolyase-100T溶液(1mg/mL,緩沖液為1mol/L的山梨醇)中,37℃處理30-50min;處理結(jié)束后加500μLddH2O,渦旋混勻,取適量菌液涂SC+FOA培養(yǎng)基平板,30℃至長出單克隆。將SC+FOA平板影印到SC-LEU平板,30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。4PCR鑒定對比SC-LEU的克隆情況,在SC+FOA平板上挑LEU-的單克隆,在合成染色體上megachunkA和megachunkY挑一對合成型、野生型引物對單克隆進(jìn)行PCR初次篩選(方法同上述鑒定同源重組替換產(chǎn)物中的步驟4.6),再在其他的每個megachunk(B到X)上挑一對合成、野生引物對單克隆進(jìn)行PCR二次篩選,得到篩選后的菌株。圖10是PCR初次篩選的電泳結(jié)果圖。圖中每一個樣本各有兩條泳道,左邊泳道是合成型引物擴增結(jié)果、右邊泳道是野生型引物擴增結(jié)果。如圖可知,8個樣本中4、5、6、7四個樣本是正確的。圖11是PCR二次篩選的電泳結(jié)果圖。圖中每一個樣本各有兩條泳道,左邊泳道是合成型引物擴增結(jié)果、右邊泳道是野生型引物擴增結(jié)果。如圖可知,4、5、6、7四個樣本中樣本7是完全正確的(標(biāo)記為I7-7)。5.測序鑒定對PCR二次篩選正確的編號為I7-7的菌株進(jìn)行基因組的提取、建庫,以及使用iontorrent公司的PGM測序儀進(jìn)行測序。圖12是測序分析的結(jié)果一覽。從上到下分別是測序深度,染色體的位置(坐標(biāo)軸),PCRtag類型(淺灰色代表合成型,深灰色代表野生型),loxPsym位點信息(淺灰色代表存在,無則代表不存在),各個chunk的相對位置。PCRtag類型均是合成型,loxPsym位點均是存在狀態(tài),synchr07左右兩個半染色體整合完畢。其中,上述實施例中所使用的培養(yǎng)基配方如下:YPD培養(yǎng)基:酵母粉10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L。SPOR培養(yǎng)基:醋酸鉀10g/L,酵母粉1.25g/L,葡萄糖1g/L,瓊脂粉20g/L。SC+FOA培養(yǎng)基:5-FOA1g/L,-5氨基酸混合粉末2g/L,酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L,硫酸銨5g/L,葡萄糖20g/L,100×Ura10mL/L,50×Leu20mL/L,100×Met10mL/L,100×Lys10mL/L,333×His3mL/L;瓊脂粉30g/L。SC-His(葡萄糖)養(yǎng)基:-5氨基酸混合粉末2g/L,酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L,硫酸銨5g/L,葡萄糖20g/L,100×Ura10mL/L,50×Leu20mL/L,100×Met10mL/L,100×Lys10mL/L。SC-His(棉籽糖)養(yǎng)基:-5氨基酸混合粉末2g/L,酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L,硫酸銨5g/L,棉籽糖20g/L,葡萄糖1g/L,100×Ura10mL/L,50×Leu20mL/L,100×Met10mL/L,100×Lys10mL/L。SC-His(半乳糖)養(yǎng)基:-5氨基酸混合粉末2g/L,酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L,硫酸銨5g/L,半乳糖20g/L,100×Ura10mL/L,50×Leu20mL/L,100×Met10mL/L,100×Lys10mL/L。-5氨基酸混合粉末:腺嘌呤1.5g,丙氨酸6g,精氨酸6g,天冬氨酸6g,天冬酰胺6g,半胱氨酸6g,谷氨酸6g,谷氨酰胺6g,甘氨酸6g,異亮氨酸6g,苯丙氨酸6g,脯氨酸6g,絲氨酸6g,蘇氨酸6g,色氨酸6g,酪氨酸6g,纈氨酸6g。100×Ura:尿嘧啶2.24g/L。50×Leu:亮氨酸13g/L。100×Met:甲硫氨酸7.5g/L。100×Lys:賴氨酸18.3g/L。333×His:組氨酸21g/L。在本說明書的描述中,參考術(shù)語“一個實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外,在不相互矛盾的情況下,本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。當(dāng)前第1頁1 2 3 
當(dāng)前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1