專利名稱：一種bac dna指紋分析的標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于BAC-DNA指紋分析的標(biāo)記方法，具體地說是采用普通Taq DNA聚合酶和一種新的熒光分子標(biāo)記的dUTP (Gold 525dUTP)，可以對(duì)酶切后的BAC DNA (細(xì)菌人工染色體DNA)片段進(jìn)行標(biāo)記，然后用于ABI系列的測序儀上進(jìn)行DNA片段分析的方法。
背景技術(shù)：
DNA是地球上各種生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。限制性核酸內(nèi)切酶可以切割DNA分子， 而且每一限制性核酸內(nèi)切酶都有固定的切點(diǎn)序列。由于不同生物群體的DNA序列千差萬別，因而用同一限制性內(nèi)切酶消化后，所得DNA片段的長度分布也是千變?nèi)f化的；同時(shí)DNA 分子中核苷酸排列順序的變化有可能使該酶切位點(diǎn)丟失或增加，或者酶切片段的長度增加或減少。這種酶切片段長度分布的多樣性就稱為限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)，RFLP常用于生物群體的遺傳分析。近年來，基于 RFLP的原理，發(fā)展了一系列的DNA片段分析技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)/限制性片段長度多態(tài)性(PCR/RFLP)，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplification Fragment Length Polymorphism, AFLP)，限制性酶切指紋圖譜(FingerprintMap)等，這些新技術(shù)使DNA片段多態(tài)性分析更為快速和完善，同時(shí)應(yīng)用也越來越廣泛。限制性酶切指紋圖(Fingerprint Map)是指限制性酶切位點(diǎn)在DNA分子上的分布圖，DNA分子上的酶切位點(diǎn)可以作為一種DNA標(biāo)記定位的特征區(qū)域?；谙拗菩悦盖兄讣y重疊群圖譜(Fingerprint Contig Map)是將一套部分重疊的大片段基因組DNA分子(Yeast artificial chromosome YAC, Bacterial artificial chromosomeBAC克隆等的插入片段) 依其在染色體上的位置順序排列，不間斷地覆蓋著染色體上一段完整的區(qū)域。重疊群圖譜是目前最常見的物理圖譜，因?yàn)橹丿B群就是克隆之間的相互重疊關(guān)系，這是物理圖的基本框架，然后借助染色體特異性的分子標(biāo)記可將重疊群定位在染色體上。目前構(gòu)建重疊群物理圖譜主要方法是用毛細(xì)管電泳法來分析BAC DNA(Bacterial artificial chromosome，細(xì)菌人工染色體DNA)片段的大小，一般首先用3-4個(gè)6堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切DNA以產(chǎn)生不同的3'粘性末端，然后用熒光染料標(biāo)記；另外一個(gè)4堿基識(shí)別位點(diǎn)酶消化DNA后產(chǎn)生5'平末端，該酶主要用于增加酶切片斷的數(shù)量。然后酶切產(chǎn)物連同分子內(nèi)標(biāo)在DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳過程中電腦自動(dòng)捕獲熒光信號(hào)得到DNA片段大小的信息，經(jīng)編輯后用FPC軟件進(jìn)行重疊群的組裝(Luo M. C.，Thomas C. , You F. Μ. , Hsiao J. , Ouyang S. , Buell R. , Malandro Μ. , McGuire P. Ε. , Anderson 0. D. ,and Dvorak J. ,2003,High-throughput fingerprinting of bacterial artificial chromosomes using theSNaPshot labeling kit and sizing of restriction fragments by capillary electrophoresis, Genomics, 82 (3) :378-389)。該方法具有序列分析膠的高分辨率，但又免去了序列分析膠法的放射自顯影步驟，省去了目力識(shí)帶及隨之帶來的誤差， 因而具有高通量、自動(dòng)化的特點(diǎn)。
目前采用熒光標(biāo)記BAC DNA片段制作限制性酶切指紋圖的方法主要有兩種1.采用SNaPSiot試劑盒，這是Applied Biosystems公司開發(fā)的一種試劑盒，它帶有4種熒光染料標(biāo)記的 ddNTP,分別是 R6G-ddATP(綠色)，TAMRA-ddCTP(黃色)，RllO-ddGTP(藍(lán)色)，ROX-ddTTP(紅色)；實(shí)驗(yàn)中用4個(gè)6堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切DNA以產(chǎn)生 4種不同的3'粘性末端，然后在FS AmpliTaq DNA聚合酶的作下標(biāo)記用4種熒光染料分別標(biāo)記不同的粘性末端。該方法能得到較多的條帶，結(jié)果較精確；但成本很高，每個(gè)樣品的花費(fèi)在3美元左右。2.采用單色標(biāo)記法，即一種熒光染料標(biāo)記每一個(gè)克隆的所有粘性末端，通常采用HEX-ddATP (綠色)或NED-ddATP (黃色)來標(biāo)記。該方法較SNaPShot試劑盒法簡單，同時(shí)可以在一個(gè)通道(毛細(xì)管)中檢測2個(gè)樣品，雖然檢測到的條帶較前者少，但結(jié)果同樣精確甚至更好(Xu Z. Y.，van den Berg Μ. Α.，Scheuring C.，Covaleda L. , Lu H. , Santos F. Α. , UhmT. , LeeM. , Wu C. , Liu S. , and Zhang H. , 2005, Genome physical mapping fromlarge-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis -.a robustphysical map of Penicillium chrysogenum, Nucleic Acids Research, 33 (5) :50-57)，并且成本較低每個(gè)樣品大約在1美元左右。然而HEX-ddATP和 NED-ddATP非常昂貴并且沒有商品出售，很難得到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用普通Taq DNA聚合酶和一種新的熒光分子標(biāo)記的dUTP (Gold 525dUTP)，可以對(duì)酶切后的BAC DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，然后用于Applied Biosystems公司的 ABI系列測序儀上進(jìn)行DNA片段分析。它是采用單色標(biāo)記法，但可以避免使用SNaPS1Ot試劑盒或HEX-ddATP，NED-ddATP等昂貴的熒光染料和FS AmpliTaq DNA聚合酶，得到更精確的結(jié)果同時(shí)降低了成本，每個(gè)樣品大約4-5元人民幣(0. 6-0. 7美元)。本發(fā)明的主要原理為(1)設(shè)計(jì)一組包括一個(gè)4堿基識(shí)別位點(diǎn)和3-4個(gè)6堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶的組合，酶切BAC DNA產(chǎn)生帶有3'粘性末端的片段；(2)在Taq DNA 聚合酶的作用下，3'粘性末端被相應(yīng)的dNTP補(bǔ)平，在此過程中Gold525dUTP (綠色)被結(jié)合到末端上，同時(shí)該DNA片段的也實(shí)現(xiàn)了熒光標(biāo)記。(3)隨后標(biāo)記了熒光染料的片段被純化，通過毛細(xì)管電泳檢測得到該片段的限制性酶切指紋，實(shí)現(xiàn)片段分析。本發(fā)明涉及一種新的用于BAC DNA指紋分析的標(biāo)記方法，其中的試劑包括如下 (1)-(3)(1)酶切混合液包含IX酶切緩沖液；lmg/ml BSA(牛血清白蛋白)；限制性內(nèi)切酶每種IU ；超純水。其中BSA和限制性內(nèi)切酶使用NewEnglandBioLabs公司產(chǎn)品，酶切緩沖液使用所選的幾種限制性內(nèi)切酶在其中都具有100%活性的緩沖液(如使用Hindlll、XbaI, XhoI和 HeaIII四種限制性內(nèi)切酶時(shí)，則選用Buffer2)。 (2)標(biāo)記用的dNTP混合物混合物內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的摩爾比為dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP =4 4 4 1。其中 dATP、dGTP、dCTP 購自 Promega 公司；Gold 525dUTP 購自 Enzo Life Sciences 公司.(3)標(biāo)記混合液7μ L 體系中包括 IOXPCR buffer 2 μ 1 ；25mM MgCl2L 6 μ 1 ；12. 5 μ M 帶有 Gold 525dUTP 的 dNTP 混合物 0. 05 μ 1 ;5U/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 16 μ 1 ；超純水3^9μ1。其中Taq DNA聚合酶及其10 X PCR buffer和MgCl2購自Promega公司。本發(fā)明建立了一種新的熒光分子標(biāo)記DNA片段的方法，可以對(duì)酶切后的BAC DNA 或者普通DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，然后用于ABI 310,3100,3130或3730等ABI系列測序儀上進(jìn)行DNA片段分析。本方法與SNaPSiot試劑盒相比，主要優(yōu)勢在于沒有使用R6G_ddATP、 TAMRA-ddCTP、R110_ddGTP、ROX-ddTTP 四種熒光染料和 FS AmpliTaqDNA 聚合酶等昂貴試劑，成本大大降低；另外SNaPShot試劑盒需用EcoR I、Xba I、BamH I,XhoI和HeaIII五種限制性內(nèi)切酶，而本方法一般需要3-4種內(nèi)切酶即可。同時(shí)由于SNaPS1Ot試劑盒使用的五種限制性內(nèi)切酶難以找到合適的緩沖液使得每種內(nèi)切酶都完全發(fā)揮作用，容易產(chǎn)生星號(hào)活性和不完全酶切，使得得到的片段的真實(shí)性受到影響；再者，由于內(nèi)切酶和染料顏色種類多，得到的片段數(shù)量多，使得最后片段分析和組裝的復(fù)雜性大大增加，結(jié)果的準(zhǔn)確性受到影口向(Xu Z. Y.，van denBerg Μ. Α.，Scheuring C.，Covaleda L，Lu H.，Santos F. Α.，Uhm Τ.， LeeM. ，Wu C. ，LiuS. ，and Zhang H. ，2005，Genome physical mapping from large-insert clones byfingerprint analysis with capillary electrophoresis :a robust physical map of Penicilliumchrysogenum, Nucleic Acids Research，33 (5) :50-57)。本方法使用 3-4種內(nèi)切酶和一種熒光染料，大大簡化了實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確。與HEX-ddATP或NED_ddATP標(biāo)記法相比，本方法同樣也是采用單色標(biāo)記法，但 HEX-ddATP、NED-ddATP類的熒光染料和FS AmpliTaq DNA聚合酶價(jià)格昂貴并且不易得到； 而本方法所用的Gold 525dUTP和TaqDNA聚合酶價(jià)格相對(duì)便宜且容易得到。另外使用 HEX-ddATP或NED-ddATP標(biāo)記法時(shí)，一般是一根毛細(xì)管同時(shí)分離兩個(gè)樣品(Wu C，Sun S，Lee M-K, Xu Z, Ren C, Santos, TS, Zhang H-B :ffhole-genome Physical Mapping :An Overview on Methods for DNA Fingerprinting. In The Handbook of Plant Genome Mapping Genetic and Physical Mapping. Edited by :Meksem K and Kahl G. Wiley-VCH Verlag GmbH, ffeinheim, Germany ；2005 :257-284)，兩種樣品雖然是不同顏色的熒光染料標(biāo)記，但仍容易互相干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，而本方法中，一根毛細(xì)管每次只運(yùn)行一個(gè)樣品，不會(huì)受其他樣品干擾，因此本方法降低成本的同時(shí)會(huì)到更精確的結(jié)果。本方法主要用于制作BAC DNA限制性酶切指紋構(gòu)建物理圖譜，當(dāng)前物理圖的構(gòu)建已成為基因組學(xué)研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域。特別是為那些由于缺乏合適的作圖群體而不能建立起遺傳圖的物種提供了一個(gè)重要的從事基因組學(xué)研究的平臺(tái)，也為全基因組測序組裝和比較基因組學(xué)的研究提供了重要的工具。另外本方法也可以用于其它DNA片段分析研究工作。


圖1為使用本標(biāo)記方法實(shí)施例中得到的3個(gè)BAC DNA(a,b, c)的酶切指紋片段峰圖 (在GeneMapper4. O軟件下顯示)，綠色峰為熒光染料Gold 525發(fā)出的熒光被ABI 3130x1 測序儀檢測得到的信號(hào)。
具體實(shí)施方式
下列實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1.配制dNTP混合物取四種脫氧核糖核酸dATP (IOOmM)，dGTP (IOOmM), dCTP (IOOmM), Gold 525dUTP (25mM)，等體積混合，稀釋至12. 5 μ M (對(duì)Gold 525dUTP而言)，四種脫氧核糖核酸的摩爾比為 dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP = 4 4 4 1。分裝成小管，_20°C 避光保存。2待檢樣品BAC DNA的提取按照文獻(xiàn)(薩姆布魯克、拉塞爾著，黃培堂譯.2002.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版).科學(xué)出版社，345-347)所描述的方法進(jìn)行。具體為A.將BAC文庫接種到96深孔板中培養(yǎng)過夜，用Eppendorf 5810R離心機(jī) 3250rpm 4°C離心lOmin，棄上清液；B.每個(gè)樣品懸浮于 60 μ L 溶液 I 中(0. 25mM Tris ρΗ8· 0 ； IOmM EDTA 0. Iml ；50mM 葡萄糖)置冰上5min ；C.加入 120 μ L 溶液 II(200mMNa0H ；1% SDS)，輕輕混勻，置冰上 5min ；D.加入60 μ L溶液III (3M醋酸鉀；28. 5%冰醋酸pH4. 8)，輕輕混勻，置冰上 IOmin ；E.將樣品以 3250rpm 4°C離心 30mm ；F.取上清并與0. 6倍體積的異丙醇混合，置-80°C 30min ；G. 3250rpm 4°C離心 30mins，棄上清；H.沉淀加 200 μ L70%冷(_20°C左右)乙醇，3250rpm 4°C離心二次，每次 15min ；I.空氣干燥DNA，溶于10 μ LTE緩沖液中，即為待測樣品BAC-DNA，_20°C保存。3. BAC DNA的酶切和標(biāo)記A.在 IOyLBAC DNA (0. 5-1. 5 μ g/μ L)樣品中加入 3yL 酶切混合物 (1. 3μ IlOXbuffer 2,0. 13 μ 1100mg/ml BSA，限制性內(nèi)切酶 Hind III、Xba I、XhoI 禾口 Hea III，每種1U，前面三種試劑都為New England BioLabs公司產(chǎn)品；加超純水補(bǔ)足3 μ 1)，混合均勻，37°C水浴放置酶切2h，置于冰上；B.每樣品加入 7μ L 標(biāo)記混合物(10XPCR buffer 2 μ 1 ；25mM MgC121. 6μ 1 ； 12. 5μΜ dNTPmix(dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP = 4 :4:4: 1)0. 05 μ 1 ；5U/ μ ITaqDNA聚合酶0. 16 μ 1 ；超純水3. 29 μ 1), 65°C水浴放置lh，置于冰上；C.每樣品加2 μ 1的醋酸鈉(5. 2Μ，ρΗ5. 2)和70 μ 1無水乙醇，混合均勻，置_80°C 或-20°C放置 30min ；D. 3250rpm 4°C離心 30min 沉淀 DNA ；E.倒去上清，加0. 2ml 70%冷(_20°C左右)乙醇4°C 3250rpm離心二次，每次 15min ；F.倒去上清后，DNA沉淀在超凈臺(tái)中干燥15-30min。4.片段分析檢測在每個(gè)樣品中加入9. 85 μ L去離子甲酰胺和0. 15 μ L Rox 500 Size Standard (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，在金屬浴上 95°C變性 3_5min，然后按照操作要求在Applied Biosystems公司的ABI 3130x1測序儀上進(jìn)行片段分析。得到的BAC DNA酶切指紋片段在GeneMapperi 0軟件下顯示如附圖1所示。圖1為使用本標(biāo)記方法實(shí)施例中得到的3個(gè)BAC DNA(a, b, c)的酶切指紋片段峰圖(在GeneMapperi 0軟件下顯示)，綠色峰為熒光染料Gold 525發(fā)出的熒光被ABI 3130x1測序儀檢測得到的信號(hào)。 其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、速度快、高通量而且成本低。
權(quán)利要求
1.一種BAC DNA指紋分析的標(biāo)記方法，其特征在于1)將BACDNA樣品采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得酶切的BAC DNA片段；2)采用一種熒光標(biāo)記的dUTP和TaqDNA聚合酶對(duì)酶切后的BAC DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，然后即可用于ABI測序儀上進(jìn)行DNA片段分析。
2.按照權(quán)利要求1所述的標(biāo)記方法，其特征在于步驟1)將BACDNA樣品采用2_6種不同種類的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得酶切的BAC DNA片段。
3.按照權(quán)利要求2所述的標(biāo)記方法，其特征在于2-6種不同種類的限制性內(nèi)切酶包括1種4堿基識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切酶和1-5種6堿基識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切酶。
4.按照權(quán)利要求1所述的標(biāo)記方法，其特征在于步驟2)中的dUTP為Gold525dUTP。
5.按照權(quán)利要求1所述的標(biāo)記方法，其特征在于DBAC DNA的酶切和標(biāo)記的具體過程為A.在10μ L濃度為0. 5-1. 5 μ g/ μ L BAC DNA樣品中加入3 μ L酶切混合物(10 X限制性內(nèi)切酶buffer 1. 3μ 1 ； lOOmg/mlBSAO. 13 μ 1 ；相應(yīng)的2-6種不同種類的限制性內(nèi)切酶每種IU ；加超純水補(bǔ)足3 μ 1)，混合均勻，37 °C水浴放置酶切1. 5-2. 5h，置于冰上；B.每樣品加入7yL標(biāo)記混合物(10XPCRbuffer 2μ 1 ；25mM MgCl2L 6 μ 1 ；含有 12. 5 μ M Gold 525dUTP 的 dNTP 混合物 0. 05 μ 1 ;5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶 0. 16 μ 1 ；超純水 3. 29 μ 1)，65°C水浴孵育45min-l. 5h，置于冰上；C.每樣品加2μ1的醋酸鈉(5. 2Μ，ρΗ5. 2)和70 μ 1無水乙醇，混合均勻，置_80°C 或-20°C放置 30min ；D.3250-4000rpm 4°C離心 30min 沉淀 DNA ；E.倒去上清，加0.2ml 70%冷乙醇4°C 3250rpm離心二次，每次15min ；F.倒去上清后，DNA沉淀在超凈臺(tái)中干燥15-30min；2)指紋分析檢測在每個(gè)樣品中加入9. 85 μ L去離子甲酰胺和0. 15 μ LSize Mandard，在金屬浴上95°C 變性3-5min，然后按照操作要求在ABI系列測序儀上進(jìn)行片段分析。
6.按照權(quán)利要求5所述的標(biāo)記方法，其特征在于該方法中所使用的dNTP混合物中的四種脫氧核糖核酸的摩爾比為dATP dGTP dCTP Gold 525dUTP = 4 :4:4: 1。
全文摘要
本發(fā)明屬于DNA片段分析技術(shù)，具體地說是采用普通的Taq DNA聚合酶和一種新的熒光分子標(biāo)記的dUTP(Gold 525 dUTP)，可以對(duì)酶切后的BAC DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，然后用于ABI系列測序儀上進(jìn)行DNA指紋片段分析的方法。所用主要試劑包括限制性內(nèi)切酶、限制性內(nèi)切酶緩沖液、Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶緩沖液、包含熒光染料Gold 525 dUTP的dNTP混合物。該方法可用于包括BAC DNA指紋分析在內(nèi)的所有DNA片段分析。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、速度快、高通量而且成本低。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102399856SQ20101028013
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者張曉軍, 李富花, 王兵, 相建海, 趙翠, 郇聘 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所