Dock2基因片段作為豬免疫性狀的分子標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)現(xiàn)屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及D0CK2基因片段作為豬免疫性 狀的分子標(biāo)記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國養(yǎng)豬歷史悠久，養(yǎng)豬經(jīng)驗(yàn)和品種資源極為豐富，養(yǎng)豬數(shù)量穩(wěn)居世界榜首，并推 動(dòng)了世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。然而，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展也面臨著很多挑戰(zhàn)，其中突出的問題是對某些 疫病的控制能力尚低，在疾病監(jiān)測、診斷、預(yù)防和撲滅等環(huán)節(jié)仍存在很多問題，因此，在養(yǎng)殖 生產(chǎn)過程中的疾病問題是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵性問題之一。生豬養(yǎng)殖過程中疾病的爆發(fā) 可直接導(dǎo)致生豬的死亡，出欄率降低，進(jìn)而影響生豬養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。于此同時(shí)，為了預(yù)防 疾病而大量使用藥物一方面增加養(yǎng)殖成本，另一方面也導(dǎo)致了病菌耐藥性出現(xiàn)而使得養(yǎng)殖 場疾病的防治更加艱難，藥物大量使用也使得豬肉食品安全問題突出。因此，在生豬養(yǎng)殖過 程中的疾病防控，直接關(guān)系到這一產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和豬肉食品市場。盡量避免大量使用藥物，尋 找抗病新策略，從培育抗病品系入手，是改善養(yǎng)豬行業(yè)行情的熱門研究方向。
[0003] 外來種豬在育成的過程中生長性狀受到強(qiáng)烈選擇，有研究表明生長與免疫存在 負(fù)相關(guān)（唐國慶等，豬抗病育種研究進(jìn)展.中國畜牧獸醫(yī)，2002, 29(6) :29-32;嚴(yán)燕等， 豬遺傳抗性與抗病育種研究進(jìn)展.豬業(yè)科學(xué)，2007, 6:58-61.)，中外豬種在抗病、抗逆 性狀中存在明顯差異（唐利洲等，MHC基因?qū)Φ胤奖Ｗo(hù)豬種抗病選育的應(yīng)用前景.畜牧 與飼料科學(xué)，2010,31(2):142-143 ;施啟順等，不同豬種E.coli Fl 8受體基因的多態(tài) 性.遺傳學(xué)報(bào)，2003,30(3):221-224.)。本申請人利用全基因組信息進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn) D0CK2 (Dedicator of Cytokinesis2)基因在中外豬種中基因頻率存在顯著差異，這表明該 基因受到了強(qiáng)烈選擇。功能分析發(fā)現(xiàn)，D0CK2基因的第3內(nèi)含子區(qū)在物種間高度保守，其中 一個(gè)高度保守的CEBP β轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在一個(gè)A/G多態(tài)，在中國地方豬品種中G等位 基因頻率很高，外來豬品種中A等位基因頻率很高。
[0004] 大量的研究表明D0CK2基因在機(jī)體免疫抗病中發(fā)揮重要作用。D0CK2 屬于造血細(xì)胞特異表達(dá)的CDM蛋白家族成員（Nishihara, T等，Non-adherent cell-specific expression of D0CK2,a member of the human CDM-family proteins. Biochem，1999, 1452:179-187.);研究表明CDM蛋白家族在細(xì)胞表面延伸過程起重要 作用（Y. C. Wu 等,C. elegans phagocytosis and cell-migration protein CED_5is similar to human D0CK180. Nature，1998, 392:501-504·)。功能研究表明 D0CK2 主要通 過激活Rac促進(jìn)免疫細(xì)胞偽足形成，促進(jìn)免疫細(xì)胞迀移，而免疫細(xì)胞迀移在機(jī)體免疫作用 中發(fā)揮重要功能（Lauffenburger，D.A 等，Cell migration:a physically integrated molecular process.Cell，1996,84:359-369 ;Yoshinori Fukui 等,Haematopoietic cell-specific CDM family protein D0CK2is essential for lymphocyte migration. Nature，2001，412:826-831.)。Rac屬于Rho家族，具有GTP酶活性，Rac激活會(huì)引起免疫 細(xì)胞表面肌動(dòng)蛋白纖維絲的組裝，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞表面形成偽足和褶皺，促使免疫細(xì)胞 往高濃度趨化因子部位遷移（Alan Hall, Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science, 1998, 279:1995 ；Hiroshi Nishihara 等,D0CK2associates with CrkL and regulates Racl in human leukemia cell lines.Blood, 2002, 100:3968-3974.)〇 另 外，D0CK2還能夠通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，影響淋巴細(xì)胞歸巢和免疫突觸形成； D0CK2缺陷的受體因在器官移植中MHC抗原遞呈存在障礙，從而降低免疫排斥反應(yīng) (Hongsi Jiang 等，Deletion of D0CK2, a regulator of the actin cytoskeleton in lymphocytes, suppresses cardiac allograft rejection. · JEM, 2005, 202:1121-1130.)〇 D0CK2基因突變會(huì)抑制體內(nèi)Racl活化，從而減低T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞在趨化因子 誘導(dǎo)時(shí)的迀移能力；而當(dāng)侵入性病毒感染D0CK2基因突變的外周血單核細(xì)胞時(shí)，IFN-a 和IFN-λ分泌顯著減少。在D0CK2缺陷的成纖維細(xì)胞中，病毒復(fù)制增加，被病毒感染 的細(xì)胞的死亡的發(fā)生也增加 （Kerry Dobbs，B.S.等，Inherited D0CK2deficiency in patients with early-onset invasive infections.The New England Journal of Medicine, 2015, 372:2409-2422.)。這些研究都表明D0CK2在機(jī)體免疫抗病中發(fā)揮重要作 用。
[0005] 本發(fā)明申請中，申請人克隆了 D0CK2基因的第3內(nèi)含子片段，鑒定了一個(gè)與豬免 疫性狀密切相關(guān)的功能突變位點(diǎn)，為豬免疫性狀的的標(biāo)記輔助選擇提供了新的SNP分子標(biāo) 記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于通過PCR擴(kuò)增D0CK2基因第3內(nèi)含子片段，利用CRS-PCR-RFLP 技術(shù)，在杜洛克X二花臉F2代群體中進(jìn)行分型，分型結(jié)果與該群體的免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析， 進(jìn)而鑒定與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為豬的抗病育種提供了新的分子標(biāo)記。
[0007] 申請人通過基因克隆的方法，得到D0CK2基因第3內(nèi)含子序列，其核苷酸序列如序 列表SEQ ID N0:1所述。在該序列的35bp處存在一個(gè)A35-G35等位基因的堿基突變，通過 在正向引物倒數(shù)第四位堿基位置引入突變，使得A35-G35形成BstZ17I-RFLP多態(tài)。申請人 將該基因片段作為檢測豬免疫性狀的分子標(biāo)記。
[0008] 為了擴(kuò)增D0CK2基因第3內(nèi)含子序列，申請人設(shè)計(jì)了如下所示的引入酶切位點(diǎn)的 引物對：
[0009] 正向引物：5 ' -AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3 '（見序列表 SEQ ID NO : 2)
[0010] 反向引物：5' -ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC-3'（見序列表 SEQ ID NO :3)。
[0011] 同時(shí)申請人制備了檢測上述與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的引物對，該引物對的 DNA序列如下所示：
[0012] 正向引物：5 ' -AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3 '（見序列表 SEQ ID NO : 2)
[0013] 反向引物：5' - ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC - 3'（見序列表 SEQ ID NO :2)。
[0014] 申請人提供了一種豬免疫性狀的分子標(biāo)記的制備方法，其包括下列步驟：
[0015] 1)提取豬耳樣組織基因組DNA ;
[0016] 2)對D0CK2基因第3內(nèi)含子片段進(jìn)行擴(kuò)增、純化與測序；
[0017] 3)利用CRS - PCR - RFLP方法對該片段在突變位點(diǎn)進(jìn)行分型；
[0018] 4)利用SAS 9. 1軟件進(jìn)行基因型與豬免疫性狀間的關(guān)聯(lián)分析。
[0019] 更詳細(xì)的技術(shù)方案請參見說明書的《【附圖說明】》及《【具體實(shí)施方式】》中的實(shí)施例。
[0020] 本發(fā)明應(yīng)用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對序列表SEQ ID NO : 1所示的第35位堿基突 變進(jìn)行了檢測，并初步進(jìn)行其基因型與豬免疫性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為豬免疫性狀 的分子標(biāo)記輔助選擇提供了 一個(gè)新的分子標(biāo)記。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有的有益效果：
[0022] 本發(fā)明可通過在體外CRS-PCR-RFLP檢測豬的基因型，作為非診斷目的的評價(jià)豬 的免疫能力，與目前ELISA、流式細(xì)胞儀等方法相比，本發(fā)明更簡便、檢測更準(zhǔn)確、成本更低 廉、速度也更快。
【附圖說明】
[0023] 序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的D0CK2基因內(nèi)含子，即本發(fā)明制備的分子標(biāo) 記的核苷酸序列。序列長度為116bp，在該序列的35bp處存在一個(gè)A/G等位基因突變（35bp 處的堿基"G"為突變后的堿基）。
[0024] 序列表SEQ ID NO :2是本發(fā)明克隆的D0CK2基因內(nèi)含子和本發(fā)明分子標(biāo)記的正向 引物序列。序列長度為34bp。
[0025] 序列表SEQ ID NO :3是本發(fā)明克隆的D0CK2基因內(nèi)含子和本發(fā)明分子標(biāo)記的反向 引物序列。序列長度為22bp。
[0026] 圖1 :本發(fā)明的總體技術(shù)流程示意圖。
[0027] 圖2 :本發(fā)明克隆的D0CK2基因內(nèi)含子序列PCR產(chǎn)物電泳圖譜，附圖標(biāo)記說明：泳 道2-11為擴(kuò)增個(gè)體，泳道1的M為DL 2000。
[0028] 圖3 :D0CK2基因內(nèi)含子序列BstZ17I-RFLP的三種基因型（AA GG AG)電泳圖譜， 附圖標(biāo)記說明：泳道2-9為酶切個(gè)體，泳道1的M為DL 500。
[0029] 圖4 :是本發(fā)明克隆的D0CK2基因內(nèi)含子和本發(fā)明分子標(biāo)記的核苷酸序列。圖中 序列的35bp處存在一個(gè)A/G等位基因突變（35bp處的英文字母"R"為突變位點(diǎn)）。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1豬D0CK2基因內(nèi)含子序列的克隆
[0031] (1)利用苯酚抽提法提取杜洛克X二花臉F2代群體的耳樣組織總DNA
[0032] 1)將杜洛克X二花臉F2代群體（廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司提供）的耳樣 組織在液氮中磨碎，加入等體積IXSET(ImL),蛋白酶K(10ng/mL)至終濃度200ug/mL，十二 烷基硫酸鈉（即SDS，10% )至終濃度0. 5%，搖勻。55°C水浴溫育過夜消化。
[0033] 2)將消化后的組織樣加入等體積的Tris飽和酚，緩慢顛倒離心管15min，于低溫 冷凍離心機(jī)中4°C、IlOOOrpm離心10min，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，注意標(biāo)上 相應(yīng)的記號。
[0034] 3)加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（體積比25 :24 :1)，緩慢顛倒離心管10min， 于低溫離心機(jī)中4°C、IlOOOrpm離心10min，小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)干凈的離心管中。
[0035] 4)