作為疾病指標(biāo)的免疫球蛋白裂解片段與用于檢測和結(jié)合所述片段的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗體組合物和所述組合物用于檢測與蛋白酶活動相關(guān)的疾病過程的用途。所述試劑用于評價這種蛋白水解裂解所產(chǎn)生的IgG裂解產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及對保留抗原結(jié)合功能但已喪失效應(yīng)子功能的IgG裂解產(chǎn)物有免疫特異性的治療劑。
【專利說明】作為疾病指標(biāo)的免疫球蛋白裂解片段與用于檢測和結(jié)合所述片段的組合物
[0001]本申請是申請日為2008年8月4日，申請?zhí)枮?00880102840.1 (PCT/US2008/072083)，發(fā)明名稱為“作為疾病指標(biāo)的免疫球蛋白裂解片段與用于檢測和結(jié)合所述片段的組合物”的發(fā)明專利申請的分案申請。
【背景技術(shù)】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及診斷和預(yù)后指標(biāo)以及用于檢測它們的方法和試劑。本發(fā)明還涉及監(jiān)測患者疾病自然史的方法。
[0003]相關(guān)領(lǐng)域描述
[0004]在醫(yī)學(xué)上，生物標(biāo)記是可用于檢測疾病進(jìn)展或治療效果的生物化學(xué)物質(zhì)，也就是，診斷或預(yù)后指標(biāo)。一種有效反映疾病自然史和疾病控制的生物標(biāo)記是用于反映糖尿病患者的血糖控制的血紅蛋白Ale。由于血紅蛋白Alc(HbAlc)在血清中的半衰期長，它用作血糖自理想水平偏移和這種偏移的持續(xù)時間的最近記錄。當(dāng)前使用的全身炎性病癥的生物標(biāo)記是 C 反應(yīng)性蛋白(CRP) (Pepys MB 等人，J.Clin.1nvest.1ll ； 1805-1812, 2003) ? CRP 是一種響應(yīng)許多種急性炎性病癥而產(chǎn)生的急性期反應(yīng)物。CRP響應(yīng)細(xì)胞因子信號而在肝臟中合成，所述信號包括TNF和IL-6，它們自身從遠(yuǎn)方的炎癥部位遷移而來。血清中CRP增加發(fā)生于感染、中風(fēng)、血管疾病、心肌梗塞以及幾種其他急性炎性疾患。
[0005]循環(huán)免疫球蛋白，特別是IgG類的那些抗體，是主要的血清蛋白。公知的是，人蛋白酶與炎性疾病、增殖性疾病、轉(zhuǎn)移性疾病以及感染性疾病有關(guān)。如細(xì)菌蛋白酶如谷氨?；鶅?nèi)肽酶(金黃色葡萄球菌(Staph, aureus)或鏈球菌(化膿性鏈球菌(Strep, pyogenes))的免疫球蛋白降解酶那樣，人蛋白酶諸如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶在各蛋白酶特有的殘基處裂解gG重鏈多肽。重鏈的裂解位點聚集在被稱為鉸鏈結(jié)構(gòu)域的區(qū)域周圍，兩條重鏈鏈間二硫鍵出現(xiàn)在該區(qū)域中。鉸鏈以下的區(qū)域構(gòu)成Fe區(qū)，包含負(fù)責(zé)IgG的效應(yīng)子功能的結(jié)合位點。在微生物的情況中，蛋白酶表達(dá)是潛在的附屬致病途徑，允許生物體避免調(diào)理作用(Rooi jakkers等人,Microbes and Infection7:476-484, 2005),以致鉸鏈下游由裂解導(dǎo)致的Fe結(jié)構(gòu)域的蛋白酶解釋放有效地中和會否則導(dǎo)致病理細(xì)胞的靶向和殺傷的功能。因此，特異性蛋白酶的活動可以代表無數(shù)疾病狀態(tài)，包括癌癥、炎性疾病以及感染性疾病。
[0006]在體內(nèi)病理環(huán)境中，IgG裂解增強(qiáng)，這通過結(jié)合裂解的鉸鏈結(jié)構(gòu)域的天然IgG自身抗體的存在得以證明(Knight 等人，1995 ；Nasu 等人，1980 ；Persselin 和 Stevens, 1985,Terness等人，1995J Imunol.154:6446-6452)。這些自身抗體還結(jié)合由幾種蛋白酶(包括木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)產(chǎn)生的Fab和F(ab’)2片段，對于作為F(ab’)2分子的C末端殘基剩余的下游鉸鏈結(jié)構(gòu)域具有特別強(qiáng)的反應(yīng)性(Terness等人，1995)。已有報道檢測到實際裂解產(chǎn)物(Fick 等人，1985 ；Goldberg 和 Whitehouse.1970 ；ffaller, 1974)，但尚未開發(fā)出能使這些片段作為生物標(biāo)記的強(qiáng)力測定方法，這可能是由于各片段被快速清除導(dǎo)致血清中濃度低，或由于在血液和組織中的大量完整免疫球蛋白當(dāng)中檢測所述片段的技術(shù)問題。過去制備了特異性抗體(Eckle等人，1988.Adv.Exp.Med.Biol.240:531-534)，用于檢測人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白水解裂解的Fe結(jié)構(gòu)域，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中直接檢測到
0.62ug/ml的中位濃度的Fe，但在患有其他類型的關(guān)節(jié)疾病的患者的滑液中沒有檢測到。
[0007]因此，若能夠評估受試者的體液或血液中的IgG裂解產(chǎn)物的類型和數(shù)量，這可用作特定疾病活動的生物標(biāo)記。用于這些測定的特定試劑和方法將可提供用于診斷性和預(yù)后性醫(yī)學(xué)測定的有用工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及用于檢測與蛋白酶活動有關(guān)的疾病過程的試劑以及所述試劑的該用途，所述蛋白酶是疾病病理的表現(xiàn)，并且是限制宿主免疫防御的因子。在本發(fā)明的一方面，涉及所述試劑和所述試劑在檢測抗疾病抗體的測定方法中的用途，所述抗體對于與疾病病理相關(guān)的靶標(biāo)具有特異性。所述試劑用于評價所述蛋白水解裂解導(dǎo)致的IgG分解產(chǎn)物。
[0009]在本發(fā)明的另一個實施例中，本發(fā)明的方法用于檢測IgG裂解產(chǎn)物，所述裂解產(chǎn)物的特征在于:1)在生理條件下具有可與完整哺乳動物IgG相比的分子量；2)在變性但非還原條件下可分離成兩個片段，包括抗原結(jié)合片段和32kDa片段；3)在體外測定中不顯示ADCC活性。在本發(fā)明的檢測IgG裂解產(chǎn)物的方法的一方面，提供了能夠檢測所述裂解產(chǎn)物的特異性試劑，所述試劑為至少一種能夠結(jié)合所述裂解產(chǎn)物的抗體。
[0010]在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了用于產(chǎn)生可用于檢測IgG裂解產(chǎn)物的試劑的序列，所述序列可用于本發(fā)明的抗IgG裂解產(chǎn)物試劑的免疫、淘洗以及選擇。一方面，所述序列選自至少5個連續(xù)的氨基酸組成的組，所述氨基酸選自人IgG鉸鏈區(qū)序列SEQ ID NO:
1、2、3或4,位于蛋白水解裂解位點的氨基末端一側(cè)。在一個實施例中，所述序列選自SEQIDNO:5-11及其N末端截短形式。另一方面，提供了一種基于人IgG分子的蛋白酶水解裂解位點來設(shè)計肽免疫原的方法。
[0011]在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了制備本發(fā)明抗IgG裂解產(chǎn)物抗體的的方法，包括用于重組產(chǎn)生抗IgG裂解產(chǎn)物抗體的核酸序列、載體以及宿主細(xì)胞。在制備抗IgG裂解產(chǎn)物抗體的方法的另一方面，提供了免疫宿主動物，所述動物的血清是本發(fā)明抗體的來源，從中通過所述方法或本領(lǐng)域已知的方法制備所述試劑。
[0012]在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種用于檢測抗IgG裂解產(chǎn)物的試劑盒，其包含本發(fā)明的抗IgG裂解產(chǎn)物抗體。
[0013]本發(fā)明的又一個實施例是一種進(jìn)行抗IgG裂解特異性抗體給藥來治療患者以恢復(fù)對于IgG裂解產(chǎn)物的效應(yīng)子功能的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1描繪了典型的哺乳動物IgG類抗體的多種結(jié)構(gòu)域，顯示了它們與鉸鏈和被確定為Fab、F(ab’)2以及Fe的的胃蛋白酶和木瓜蛋白水解裂解產(chǎn)物的關(guān)系。
[0015]圖2顯示了四種單獨的Agilent Biosizing微毛細(xì)管電泳分析,為在人IgGl κ抗體Mab I在37 °C下被I % w/w的人MMP-3 (A)、鏈球菌IdeS (B)、葡萄球菌谷氨?；鶅?nèi)肽酶I (C)以及人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(D)各蛋白酶消化過程中各時間的凝膠圖像。各凝膠上的標(biāo)準(zhǔn)品(泳道I)對應(yīng)于完整的人/鼠嵌合IgGl和已知的裂解片段。
[0016]圖3顯示了鉸鏈區(qū)周圍的人IgGl重鏈的序列，主要的蛋白水解裂解的位置由箭頭表不。
[0017]圖4是蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)，顯示了生物素化的鼠/人IgG被創(chuàng)傷滲出物降解的時程。
[0018]圖5的柱狀圖顯示了用綴合的F(ab’)2降解產(chǎn)物免疫的家兔中產(chǎn)生的抗血清的相對特異性，所述裂解產(chǎn)物由三種不同的蛋白酶MMP_3、V8以及IdeS產(chǎn)生:TCPPCPAP，其為對應(yīng)于MMP-3裂解位點的SEQ ID NO:1的殘基7_14 ;TCPPCPAPE，其為對應(yīng)于谷氨?；鶅?nèi)肽酶位點的SEQ ID NO:1的殘基7-15 ;以及TCPPCPAPELLG，其為對應(yīng)于IdeS位點的SEQ ID NO:1的殘基7-18。顯示了三種家兔多克隆抗鉸鏈肽抗體制品各自與Mab3 IgGlK的F(ab’)2片段的ELISA反應(yīng)性。？(&13’)2片段是用人重組麗?-3、葡萄球菌谷氨?；鶅?nèi)肽酶1以及來自化膿性鏈球菌的重組IdeS來產(chǎn)生。家兔抗體制品的混合匯集物表現(xiàn)了與各Mab3 F (ab ’)2片段幾乎等同的反應(yīng)性。條形對應(yīng)于三個重復(fù)孔的均值土標(biāo)準(zhǔn)差。
[0019]圖6是家兔多克隆抗體制品與抗體消化物的蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)性。通過SDS-PAGE分離完整的Mab3人IgGl或已經(jīng)使用MMP-3、谷氨酰基內(nèi)肽酶(V8)或IdeS部分消化的Mab3人IgGl，然后進(jìn)行免疫印跡分析。(A):使用抗人IgG(H+L)抗體[泳道1-4]或抗...LLG家兔多克隆抗體[泳道6-10]進(jìn)行印跡。(B):使用抗...PAP抗體[泳道2-5]或抗...APE抗體[泳道7-10]進(jìn)行印跡。切下印跡，然后與通過小圖A泳道5和小圖B泳道6的抗體一起溫育，以使得可用單獨的抗血清進(jìn)行檢測。
[0020]圖7是使用RAH-1試劑對來自5名類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑液中IgG降解的分析樣品進(jìn)行顯影的蛋白質(zhì)印跡，并與來自使用MMP-3、谷氨酰基內(nèi)肽酶(V8)以及IdeS進(jìn)行的單克隆IgGl的體外蛋白水解消化物的 樣品進(jìn)行比較。
[0021]圖8顯示了不同蛋白水解裂解片段完整IgG、scIgG以及F(ab’)2隨時間推移的血清濃度；這是在指定的純化片段注射至小鼠之后使用山羊抗人IgG(H+L)檢測的。
[0022]圖9是在來自經(jīng)診斷患有圖中所示疾病的患者的人血清樣品中通過試劑RAH-1檢測到的scIgG各數(shù)值的點圖，與正常人血清樣品組中相比較，其中線條表示各組的均值。
[0023]圖10顯示了使用改進(jìn)形式的ELISA用試劑RAH-1檢測到的10個類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)個體和同樣數(shù)量的健康正常對照的稀釋血清中scIgG的濃度；RA組中的“⑵”表示在兩個分開的個體中獲得的相同數(shù)值。
[0024]圖11顯示了靶向作為肽類似物的人IgGl鉸鏈的裂解片段和在指定殘基處終止的抗體片段(見圖3)的家兔單克隆抗體的相對反應(yīng)性。
[0025]圖12顯示了三種不同的靶向人IgGl鉸鏈裂解片段的家兔單克隆抗體在對用IdeS消化IgGl而產(chǎn)生的F(ab’)2恢復(fù)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞裂解(CDC)時的濃度依賴性，與所制備的抗裂解肽類似物的家兔多克隆抗體(rb poly)相比較。
[0026]序列表簡沭
[0027]
SEQ ID NO:~I描述
【權(quán)利要求】
1.一種抗體組合物，其包含至少一種特異性結(jié)合IgG蛋白酶裂解產(chǎn)物的抗體，所述裂解產(chǎn)物的特征在于:a)在非變性條件下具有與完整哺乳動物IgG相當(dāng)?shù)姆肿恿?，和b)在變性但非還原條件下可分離成兩個片段，包括135 kDa的抗原結(jié)合片段和含有CH2的片段，以及c)其中，所述試劑不與完整IgG反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物,其包含多克隆抗血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其包含至少一種單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其特異性結(jié)合人IgGl中由選自以下的蛋白酶產(chǎn)生的蛋白酶特異性裂解位點:MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纖溶酶、組織蛋白酶G、胃蛋白酶、IdeS或來自金黃色葡萄球菌的谷氨?；鶅?nèi)肽酶I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其包含通過用多肽來免疫動物或篩選抗體文庫而產(chǎn)生的抗體，所述多肽包括通過如下步驟制備的裂解產(chǎn)物類似物肽: a)鑒定抗體重鏈的被蛋白酶所裂解的一對殘基的N末端殘基； b)鑒定包含至少5個位于蛋白酶裂解位點上游的連續(xù)氨基酸殘基的肽序列，其中所述蛋白酶裂解位點的N末端殘基將變成所確定的序列的C末端；以及 c)制備用于所述免疫或篩選的足夠量的肽溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的抗體組合物，其含有至少一種特異性結(jié)合這樣的多肽的抗體，所述多肽包含選自SEQ ID NO:1、2、3或4的人IgG鉸鏈區(qū)序列的至少5個連續(xù)的氨基酸，所述序列位于蛋白酶裂解位點的氨基末端一側(cè)的上游。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體組合物，其中所述多肽包含至少IgGl的鉸鏈核心，所述鉸鏈核心被定義為殘基-T-C-P-P-C- (SEQ ID NO:1的殘基7-11)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體組合物，其中所述肽是人IgGl下游鉸鏈和鄰接的CH2結(jié)構(gòu)域的12-mer肽類似物，其具有序列TCPPCPAPELLG (SEQ ID NO:1的殘基7-18)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其特異性結(jié)合裂解產(chǎn)物肽類似物，所述類似物包括具有選自SEQ ID NO:8-11的氨基酸序列的肽及其N末端截短形式，包括至少5個氨基酸和含有位于IgG蛋白酶裂解位點的N末端一側(cè)的上游的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其特異性結(jié)合具有選自SEQID NO:8_11的氨基酸序列的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物，其特異性結(jié)合具有選自如下的氨基酸序列的多肽:(a)包含位于IgGl MMP-3裂解位點的氨基末端一側(cè)氨基酸序列的肽(TCPPCPAP，SEQID NO:1的殘基7-14) ； (b)或包含谷氨?；鶅?nèi)肽酶IgGl裂解位點的肽(TCPPCPAPE，SEQID NO:1 的殘基 7-15);或(c)包含 IdeS IgGl 裂解位點的肽(TCPPCPAPELLG, SEQ ID NO:I的殘基7-18)。
12.—種人IgG蛋白酶裂解位點肽類似物，其由選自SEQ ID NO:8_11的氨基酸序列組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的肽，其通過N末端與匙孔鑛血藍(lán)蛋白(KLH)共價連接。
14.一種用根據(jù)權(quán)利要求12所述的肽類似物免疫的動物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的動物，其中所述動物是家兔。
16.一種使用根據(jù)權(quán)利要求15所述的被免疫動物制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物的方法，其中，通過在人IgG親和基質(zhì)上預(yù)吸附而從所述動物血清純化所述試劑。
17.—種通過分析受試者的組織樣品來檢測所述受試者的疾病過程的方法，其中所述方法包括檢測蛋白水解裂解的IgG，所述裂解的IgG的特征在于，a)在生理條件下具有與完整哺乳動物IgG相當(dāng)?shù)姆肿恿浚蚥)在變性但非還原條件下可分離成兩個片段，包括135kDa的抗原結(jié)合片段和25 kDa的片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述疾病選自關(guān)節(jié)炎疾病、惡性病、感染性疾病和血管疾病。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述樣品是滑液。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述樣品是血液或其分級制品。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述檢測離體進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述檢測程序選自ELISA、免疫組織化學(xué)染色以及蛋白質(zhì)印跡。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述檢測是對除血液分級制品以外的組織樣品進(jìn)行。
25.—種試劑盒，其包含用于檢測受試者的組織中的疾病標(biāo)記的試劑，所述試劑包含至少一種特異性結(jié)合裂解的IgG的抗體`，所述抗體能夠檢測有如下特征的IgG裂解產(chǎn)物:a)在非變性條件下具有與完整哺乳動物IgG相當(dāng)?shù)姆肿恿?，和b)在變性但非還原條件下可分離成兩個片段，包括135 kDa的抗原結(jié)合片段和含有CH2的片段，以及c)其中所述試劑與完整IgG不反應(yīng)。
26.一種使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物治療具有病理狀態(tài)的受試者的方法，所述病理狀態(tài)的特征是釋放能夠產(chǎn)生IgG裂解產(chǎn)物的蛋白酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗體識別人IgGl中由選自以下的蛋白酶產(chǎn)生的蛋白酶特異性裂解位點:MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纖溶酶、組織蛋白酶G、胃蛋白酶、IdeS或來自金黃色葡萄球菌的谷氨?；鶅?nèi)肽酶I。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體組合物用于恢復(fù)用以治療病理狀況的抗體的效應(yīng)子功能的用途，其中所述用以治療病理狀態(tài)的抗體經(jīng)受一種或多種蛋白酶的裂解。
【文檔編號】C07K16/06GK103497254SQ201310054803
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2008年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2007年8月10日
【發(fā)明者】R.喬丹, D.D.佩特羅恩, M.瑞安 申請人:詹森生物科技公司