專利名稱：使用大顆粒標(biāo)記的高靈敏性免疫測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用一種大顆粒標(biāo)記的高靈敏性免疫測定。
背景技術(shù)：
免疫測定廣泛用于健康護理和其他領(lǐng)域以確定諸如蛋白、激素、DNA、RNA或酶的特定分子的存在與否。一種用于測定體液中的特異性靶標(biāo)(抗原)濃度的公知方法是所謂的“酶聯(lián)免疫測定”(ELISA)。其中將來自樣品的分析物固定于固體支持物上，然后向該固體支持物加入特異于所述分析物的抗體，從而其可以結(jié)合所述分析物。所述抗體連接至酶。然后向所述固體支持物加入可以被酶轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生諸如熒光團的可檢測部分的基底。洗滌步驟后，固體基底經(jīng)過使得可以對可檢測部分進行檢測的處理，例如在熒光讀取器上進行處理。由此，這可以確定所述樣品中是否存在所述分析物。夾心免疫測定包括兩種抗體，其結(jié)合抗原上不同且不重疊的表位。第一抗體(捕獲抗體)接合至固體支持物，然后加入包含抗原的樣品以允許形成抗原與捕獲抗體之間的復(fù)合物。通過洗滌步驟除去未結(jié)合的分子，然后加入標(biāo)記的第二抗體(檢測抗體)，并允許其結(jié)合抗原與捕獲抗體的復(fù)合物，由此形成“夾心”。進行洗滌步驟以除去未結(jié)合的檢測抗體之后，通過測量標(biāo)記的檢測抗體的量來測定靶分子的量。使用許多標(biāo)記技術(shù)，包括熒光、 化學(xué)發(fā)光、放射性或磁性標(biāo)記。在大部分情況下，使用識別靶標(biāo)的不同位點的兩種單克隆抗體。在另一變體中，使用單克隆捕獲抗體和針對抗原上不同表位的親和力純化的多克隆檢測抗體。在健康護理中，測量許多不同分子以診斷或監(jiān)測疾病。例如，測量血糖含量以監(jiān)測糖尿病。葡萄糖是以較高濃度存在于血液中的分子，其濃度為每HiL約幾百μ g至約lmgdi 應(yīng)于每mL約3至6毫摩爾的濃度。測量裝置以手持裝置的形式提供，包括測試帶。相比之下，其他分子，如用于監(jiān)測心力衰竭的生物標(biāo)記NT-proBNP則以明顯較低的濃度存在于血液中。在健康個體中，NT-proBNP在血液中的濃度為約20pg-150pg/mL，對應(yīng)于約M-176皮摩爾/mL。高于500pg/mL的值通常視為是急性充血性心力衰竭(CHF)的指征。目前，測量極低濃度的生物標(biāo)記以診斷疾病(例如心血管疾病)要求實驗室分析、 大樣品體積以及15分鐘至數(shù)小時的時間結(jié)果(time-to-result)延滯。盡管這些測試是小型臺面測試，但是較長的運行時間和大樣品體積使得它們不適合于更高要求的情況，例如醫(yī)院急診部門、診室和救護車，其中要求小樣品體積、易于使用、快速以及高靈敏度。定義本文所用的術(shù)語“抗體”指任何同種型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)的多克隆和/或單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包括但不限于F (ab)和Fv片段、單鏈抗體、嵌合抗體和人源化抗體。本文所用的術(shù)語“分析物”指要確定其濃度或存在的任何分子。靶分子的實例為CN 102549429 A
分子靶標(biāo)，例如肽、蛋白、激素、DNA、RNA和酶。術(shù)語“分析物”和“靶標(biāo)”在本申請中可互換使用。本文所用的術(shù)語“同源”指肽或蛋白與所述肽或蛋白基本上相似。術(shù)語“基本上相似”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。特別地，變體可以是與人群體中最優(yōu)勢的肽同種型的氨基酸序列相比表現(xiàn)出氨基酸交換的同種型或等位基因。優(yōu)選地，這樣的基本上相似的肽與所述肽最優(yōu)勢的同種型的序列相似性為至少70%，優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、97%、98或 99%。基本上相似還指降解產(chǎn)物，如蛋白水解降解產(chǎn)物，其仍然被諸如抗體的結(jié)合部分或被針對各自的全長肽的配體所識別。術(shù)語“變體”還指剪接變體。本文所用的術(shù)語“固體基底”指對相同表位不具有特異性的捕獲部分所結(jié)合的基底。術(shù)語“固體基底，，和“固體支持物”在本申請中可互換使用。本文所用的術(shù)語“結(jié)合部分”分別指表位特異性檢測部分或者對相同表位不具有特異性的捕獲部分。本文所用的術(shù)語“表位特異性檢測部分”指結(jié)合諸如分析物蛋白的給定靶標(biāo)的一個相同表位的至少一個部分。這樣的表位特異性檢測部分例如單克隆抗體、表位特異性適體、表位特異性 anticalin、表位特異性凝集素、表位特異性親和體(affibody)、表位特異性化學(xué)配體或表位特異性肽。術(shù)語“表位特異性檢測部分”和檢測部分在本申請中可互換使用。本文所用的術(shù)語“對相同表位不具有特異性的捕獲部分”指結(jié)合給定靶標(biāo)的不同表位，或者結(jié)合給定靶標(biāo)的相同表位的不同亞區(qū)的至少兩個部分的集合。一個部分結(jié)合給定靶標(biāo)的表位的氨基酸1-10，而結(jié)合相同表位的氨基酸2-11的第二部分的兩個部分因而充當(dāng)本發(fā)明表述中“對相同表位不具有特異性的捕獲部分”。這樣的對相同表位不具有特異性的捕獲部分例如多克隆抗體(盡管以單數(shù)形式使用，其仍然是至少兩種不同抗體的復(fù)數(shù)形式)、親和力純化的多克隆抗體(也是至少兩種不同抗體的復(fù)數(shù)形式)、非表位特異性適體、非表位特異性anticalin、非表位特異性凝集素、非表位特異性親和體、非表位特異性化學(xué)配體或非表位特異性肽。術(shù)語“對相同表位不具有特異性的捕獲部分”和“捕獲部分”在本申請中可互換使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供克服上文所列的局限的免疫測定。本發(fā)明的另一目的是提供促進使用大標(biāo)志物或標(biāo)記的免疫測定。本發(fā)明的又一目的是提供一種檢測樣品中的分析物的方法，其中使用本發(fā)明的免疫測定。本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠根據(jù)本發(fā)明的方法檢測分析物的生物傳感器
直ο這些目的通過獨立權(quán)利要求的測定、方法以及生物傳感器裝置實現(xiàn)。本發(fā)明提供一種檢測樣品中的分析物的免疫測定，所述測定包括多個能夠結(jié)合所述分析物的部分，其中a)對相同表位不具有特異性的捕獲部分被結(jié)合至固體基底，以及b)至少一個表位特異性檢測部分被結(jié)合至可檢測標(biāo)志物；
其中所述表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為大顆粒標(biāo)志物，其具有 ^ 50nm且；^ 5000nm的顆粒大小。重要的是，對相同表位不具有特異性的捕獲部分結(jié)合給定靶標(biāo)的至少兩個不同表位，或者結(jié)合給定靶標(biāo)的相同表位不同亞區(qū)。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將大顆粒標(biāo)志物用于標(biāo)記檢測部分時，特別是在要檢測靶標(biāo)相對較小時，使用結(jié)合靶標(biāo)的不同表位的捕獲部分非常有效地改善了免疫測定的靈敏度。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用大顆粒標(biāo)志物導(dǎo)致表位特異性檢測部分、靶標(biāo)和大顆粒標(biāo)志物的復(fù)合物的轉(zhuǎn)動自由度的喪失。而且，大顆粒標(biāo)志物還降低取決于顆粒半徑的平移和/ 或擴散速度。由于標(biāo)志物的大體積，表位特異性檢測部分、靶標(biāo)和大顆粒標(biāo)志物的復(fù)合物無法像表位特異性檢測部分和具有小標(biāo)志物的靶標(biāo)的復(fù)合物那樣快地移動和轉(zhuǎn)動。在短測定時間的情況下，這是不利的，因為一些捕獲部分不具有足夠的時間來偶聯(lián)與攜帶大顆粒標(biāo)志物的表位特異性檢測部分結(jié)合的靶標(biāo)。因此，并非所有的表位特異性檢測部分、靶標(biāo)和大顆粒標(biāo)志物的復(fù)合物都會偶聯(lián)捕獲部分，并因而偶聯(lián)固體支持物。這些未結(jié)合的復(fù)合物會在洗滌步驟中被除去，從而降低測定的靈敏度。當(dāng)將具有大標(biāo)記的檢測部分用于檢測小靶標(biāo)時，大標(biāo)記的上述效果甚至?xí)黠@，因為這進一步降低表位特異性檢測部分、靶標(biāo)和大顆粒標(biāo)志物的復(fù)合物移動至正確的位置以結(jié)合捕獲部分的自由度。在這一背景下，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將對相同表位不具有特異性的捕獲部分用作捕獲部分時，提供了非常大的幫助。由于對相同表位不具有特異性的捕獲部分結(jié)合分析物的不同表位，所以它們可以采取任何位置或角度來結(jié)合分析物。這意味著檢測部分攜帶的大標(biāo)記所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)動自由度的喪失通過使用對相同表位不具有特異性的捕獲部分得到彌補。如果一個標(biāo)志物攜帶多于一個檢測部分，因而多于一個分析物結(jié)合一個標(biāo)志物，則上述效果甚至?xí)黠@。對相同表位不具有特異性的捕獲部分和檢測部分優(yōu)選結(jié)合分析物或其同源物的不同位點(表位)。在一實施方案中，結(jié)合固體支持物的對相同表位不具有特異性的捕獲部分針對分析物上的至少兩個不同的表位，或者相同表位的至少兩個不同的亞區(qū)。最優(yōu)選的對相同表位不具有特異性的捕獲部分針對> 2且< 10個不同表位或者相同表位的> 2且< 10個不同亞區(qū)。優(yōu)選地，對相同表位不具有特異性的捕獲部分為多克隆抗體。在一優(yōu)選實施方案中，對相同表位不具有特異性的捕獲部分為綿羊多克隆抗體和/或山羊或兔多克隆抗體。在優(yōu)選實施方案中，所述分析物為心激素。更優(yōu)選地，所述心激素為利尿鈉肽。所述肽可以是BNP和/或NT-pro BNP。最優(yōu)選地，所述肽為人BNP和/或人NT-pro BNP。腦利尿鈉肽(BNP)及相關(guān)的分子NT-proBNP是釋放入血流并用于診斷和監(jiān)測心力衰竭的物質(zhì)。測定BNP和/或NT-proBNP對精度有嚴(yán)格要求并且對靈敏度要求很高，因為數(shù)皮摩爾或更高的BNP和/或NT-proBNP的患者血液水平具有重要的臨床結(jié)果。由于心力衰竭的緊急性，期望能夠在短時間內(nèi)給出實驗室質(zhì)量的結(jié)果的測試，所述結(jié)果可以用于現(xiàn)場(point-of-care)情況，例如急診部門或救護車BNP (pre-proBNP)的前肽原具有134個氨基酸，并且包含短信號肽，其被酶促切割以釋放具有108個氨基酸的肽原(proBNP)。肽原被進一步切割成包含proBNP的氨基酸 77-108的BNP，以及N端肽原(NT-proBNP)。NT-proBNP是僅由76個氨基酸殘基組成的小肽，分子量為約8. 5kDa。BNP是32個氨基酸的甚至更小的肽，分子量為約3. 5kDa。當(dāng)靶標(biāo)為人proBNP或人NT-proBNP時，對相同表位不具有特異性的捕獲部分針對至少一個選自 SEQ ID NO 1 的氨基酸殘基 1-12、1-21、5-12、13-27、28-45、39-50、46-60 和 /或61-76的表位。優(yōu)選地，所述表位特異性檢測部分針對至少一個選自氨基酸殘基1-10、5_12、 11-22、13-27 J6-32 和 / 或 61-76 的表位。特別優(yōu)選使用至少兩個表位特異性檢測部分，其中一個檢測BNP表位，而另一個檢測NT pro BNP表位。檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為大顆粒標(biāo)志物。顆粒的大小可以為> 50nm至數(shù)微米，更優(yōu)選> 50nm至；^ 5000nm，例如> 250nm至；^ 5000nm。最優(yōu)選地，粒徑為> 500nm 至< lOOOnrn。術(shù)語“大顆粒標(biāo)記”或“標(biāo)記”以及“大顆粒標(biāo)志物”或“標(biāo)志物”在本申請中可互
換使用。當(dāng)將大顆粒標(biāo)志物用于免疫測定時，會降低表位特異性檢測部分的移動性，從而導(dǎo)致所述大顆粒標(biāo)志物對固體表面的結(jié)合效率的喪失。這種之前未知的效應(yīng)的原因在于限制了結(jié)合大顆粒標(biāo)志物的表位特異性檢測部分的自由度。這意味著由攜帶至少一個表位特異性檢測部分的大顆粒標(biāo)志物與結(jié)合的靶標(biāo)所組成的復(fù)合物的旋轉(zhuǎn)速度明顯受到限制。這可以導(dǎo)致這樣的情況，其中標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物不能結(jié)合表位特異性捕獲部分，因為所述復(fù)合物的旋轉(zhuǎn)角度不允許捕獲部分與各自的靶表位之間的結(jié)合。為此，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，可以有利地使用對相同表位不具有特異性的捕獲部分，例如多克隆抗體。后者允許標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物結(jié)合，而無論旋轉(zhuǎn)角度是多少，由此促進標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物的結(jié)合，所述復(fù)合物的轉(zhuǎn)動自由度由于大標(biāo)志物的大小而降低。在本申請中，當(dāng)使用大顆粒標(biāo)志物時，期望使用對相同表位不具有特異性的捕獲部分，因為所述對相同表位不具有特異性的捕獲部分通過改進所述大顆粒標(biāo)志物對固體表面的結(jié)合效率來增加免疫測定的靈敏度。在本發(fā)明的免疫測定的另一優(yōu)選實施方案中，表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物可以是光學(xué)或非光學(xué)標(biāo)志物。優(yōu)選地，所述光學(xué)標(biāo)志物為至少一種選自光散射標(biāo)志物、酶促標(biāo)志物、熒光標(biāo)志物、發(fā)色基團、電發(fā)光標(biāo)志物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)志物、磷光標(biāo)志物、反射標(biāo)志物和/或放射性標(biāo)志物的標(biāo)志物。熒光標(biāo)志物包括熒光素染料，如5_(和6_)羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基熒光素、5-羧基-2'，4'，5'，7'-四氯熒光素和5羧基熒光素；羅丹明染料，如 5_(和6_)羧基羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明和6-羧基羅丹明X ；酞菁，如甲基亞硝?；?、 磺?；桶被?；偶氮染料；甲亞胺；菁；和黃嘌呤，如甲基、硝基、亞磺基(sulphano)和氨基衍生物；以及琥珀?；鶡晒馑?。其他合適的標(biāo)記為來自菁二聚體和單體的組的熒光團， 例如Τ0Τ0、YOYO、TO-PRO, Cy3、Cy5、Cy5. 5、Cy7，或者諸如LCRed 705的染料可以用作熒光標(biāo)志物。其他熒光標(biāo)志物為熒光蛋白，如GFP等。光散射標(biāo)志物優(yōu)選用于FI1R(受抑全內(nèi)反射)被用作檢測技術(shù)的情況中，后者在下文中進行描述。光散射發(fā)生在，例如當(dāng)光束通過交替分散系時，顆粒或液滴在所有方向上散射一部分光。當(dāng)顆粒與入射光的波長相比非常小時，散射光的強度在所有方向上是均勻的(Rayleigh散射)。對于較大的顆粒(直徑大于約250nm)，強度是角度依賴性的(Mie散射)。這樣的光散射標(biāo)志物例如直徑大于250nm的小球，從而其可以以角度依賴性的方式散射入射光。這些小球是不透明的，從而它們不讓光通過。它們可以例如由染色塑料、金
屬等制成。當(dāng)使用光散射標(biāo)志物時，大小大于250nm的大標(biāo)記是優(yōu)選的。如上文所述，使用大標(biāo)志物會導(dǎo)致結(jié)合大顆粒標(biāo)志物的表位特異性檢測部分的轉(zhuǎn)動自由度降低。在優(yōu)選實施方案中，可檢測標(biāo)志物為磁性標(biāo)志物或者連接至磁性顆粒的標(biāo)志物。 使用磁性標(biāo)志物作為可檢測標(biāo)志物是優(yōu)選的，因為它們通過使用磁驅(qū)動加速反應(yīng)動力學(xué)， 從而減少測定時間。此外，通過利用脈沖的磁驅(qū)動，使用磁性標(biāo)志物有助于改進測定的靈敏度。而且，使用磁性標(biāo)志物允許檢測部分-靶標(biāo)復(fù)合物結(jié)合固體支持物。而且，使用磁性標(biāo)記促進除去結(jié)合或未結(jié)合檢測部分的任何標(biāo)記，所述檢測部分未通過磁場結(jié)合至傳感器表面。這種實施方案避免需要額外的洗滌步驟來鑒定相對于背景結(jié)合的特異性信號。因此，可檢測標(biāo)志物還可以用作操控物質(zhì)，促進檢測部分-靶標(biāo)復(fù)合物結(jié)合固體支持物。優(yōu)選地，可檢測標(biāo)志物作為操控物質(zhì)而起雙重作用。當(dāng)磁性標(biāo)志物被用作可檢測標(biāo)志物時，所述磁性標(biāo)志物可以光學(xué)或磁性進行檢測。優(yōu)選地，所述磁性標(biāo)志物經(jīng)光學(xué)檢測，優(yōu)選通過受抑全內(nèi)反射(FTIR)檢測。本發(fā)明所用的磁性標(biāo)志物或顆粒的性質(zhì)并不重要。合適的磁性標(biāo)記包括完全無機標(biāo)記和包含無機和有機材料(如，聚合物)的標(biāo)記。磁性標(biāo)記可商購自例如Dynaljstapor， Seradyn,并且廣泛用于可得自一些診斷公司的生物學(xué)分析中。磁性標(biāo)記連接至表位特異性檢測部分可以通過本領(lǐng)域已描述的方法進行。例如， 磁性標(biāo)記可以攜帶一個或多個官能團，例如羥基、羧基、醛或氨基。這些官能團通常可以， 例如通過下述方法提供處理未包覆的單分散性、超順磁性標(biāo)記以提供攜帶這些官能團之一的聚合物的表面包覆，例如提供聚氨基甲酸酯以及聚二醇(polyglycol)以提供羥基，或者提供纖維素衍生物以提供羥基，提供丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物以提供羧基，或者提供氨基烷基化的聚合物以提供氨基。表位特異性檢測部分與顆粒的偶聯(lián)可以是不可逆的，但是通過使用交聯(lián)標(biāo)記與表位特異性檢測部分的接頭分子也可以是可逆的。這樣的接頭的實例包括具有蛋白水解識別位點的肽、具有某些限制性內(nèi)切酶識別位點的寡核苷酸、諸如鏈霉抗生物素/生物素的結(jié)合配對(binding partner)、或者包含可還原的二硫基的化學(xué)可逆交聯(lián)基團。各種可逆交聯(lián)基團可以得自Pierce Biotechnology Inc. (Rockford, IL, USA)。非光學(xué)標(biāo)記可以是聲學(xué)標(biāo)記。在本發(fā)明的免疫測定的另一優(yōu)選實施方案中，所述分析物為小肽或蛋白。本文所
7用的術(shù)語“小肽或蛋白”指具有> 20且彡180個氨基酸殘基的肽或蛋白。BNP具有例如32 個氨基酸殘基(3. 47kD)，而NT-proBNP具有76個氨基酸殘基(8. 46kD)。類似地，術(shù)語“小肽或蛋白”指分子量彡2且彡17kDa的肽或蛋白。當(dāng)具有大標(biāo)記的檢測部分用于檢測小靶標(biāo)時，對于理解本發(fā)明的上述大標(biāo)記的效果的重要性甚至是更明顯的。當(dāng)使用大標(biāo)志物與小靶標(biāo)的組合時，比大標(biāo)志物用于檢測大靶標(biāo)的情況更明顯地限制轉(zhuǎn)動自由度。因此，檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物需要更多的時間移動至正確的位置以結(jié)合捕獲部分，并由此結(jié)合固體支持物。因此，在使用短測定時間的情況下，甚至更小的靶蛋白會偶聯(lián)至固體支持物。這些未結(jié)合的靶蛋白會在洗滌步驟中除去，這導(dǎo)致測定的靈敏度降低。在要求小樣品體積、易于使用、快速以及高靈敏度的情況下，這是不利的。優(yōu)選地，所述肽為心激素。更優(yōu)選地，所述心激素為利尿鈉肽。所述肽可以是BNP 和/或NT-pro BNP。特別地，所述肽為人BNP和/或人NT-proBNP。如上文所述，NT-proBNP為僅由76個氨基酸殘基組成的小肽，分子量為約8. 5kDa。 BNP為32個氨基酸的甚至更小的肽，分子量為約3. 5kDa。當(dāng)要求包含NT-proBNP或BNP的大顆粒結(jié)合固體傳感器表面以通過這種小肽進行檢測時，這種性質(zhì)是非常不利的。如上文所述，但偶聯(lián)至大標(biāo)志物時，諸如NT-proBNP和/ 或BNP的小靶蛋白要求更多的時間以移動至正確的位置來結(jié)合捕獲部分，并因而結(jié)合固體支持物，因為檢測部分-靶標(biāo)復(fù)合物的轉(zhuǎn)動自由度在這種情況下是高度受限的。在這一背景下，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，使用諸如多克隆抗體的對相同表位不具有特異性的捕獲部分來測定NT-proBNP是非常有利的。使用對相同表位不具有特異性的捕獲部分允許標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物的結(jié)合，而無論旋轉(zhuǎn)角度是多少，由此促進標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物的結(jié)合，所述復(fù)合物的轉(zhuǎn)動自由度由于標(biāo)志物的大尺寸和 NT-proBNP的小尺寸而降低。在一實施方案中，所述分析物包含于樣品中。術(shù)語“樣品”在本文中以廣泛的含義使用，并旨在包括大范圍的生物學(xué)材料以及源自或提取自這樣的生物學(xué)材料的組合物。優(yōu)選地，所述分析物包含于體液或組織樣品中，并且測量所述樣品中的分析物的量。在一優(yōu)選實施方案中，可以測量組織、細胞和體液樣品中的分析物，即優(yōu)選體外進行。優(yōu)選地，測量體液樣品中感興趣的分析物。本發(fā)明的組織樣品指獲得自死或活的人或動物體的任何類型的組織。組織樣品可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得，例如通過活組織檢查或刮除術(shù)。本發(fā)明的體液包括血液、血清、血漿、淋巴、腦液、唾液、粘液、精液、糞便、脊髓液、 尿和/或痰或者上述體液的任何部分。特別地，體液是選自血液、血清、血漿、尿、唾液和/或痰中的至少一種。體液樣品可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法獲得。示例性樣品包括全血、紅細胞、白細胞、血棕黃層(buffy coat)、毛發(fā)、指甲和角質(zhì)層材料、拭子(包括但不限于口腔拭子、喉嚨拭子、 陰道拭子、尿道拭子、宮頸拭子、直腸拭子、病灶拭子、膿腫拭子、鼻咽拭子、鼻拭子等)、淋巴液、羊水、腦脊液、腹膜積液、胸腔積液、囊腫液體、滑液、玻璃體液、房水、粘液囊液體、洗眼水、眼抽吸物、血漿、血清、肺灌洗物、肺抽吸物、身體任何組織的活組織檢查材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，獲得自上述示例性樣品的裂解物、提取物或材料也視為樣品。組織培養(yǎng)細胞(包括移植材料、原代細胞、次級細胞系等)以及得自任何細胞、組織或器官的裂解物、提取物、上清或材料也在本文所用的術(shù)語生物學(xué)材料的含義之內(nèi)。上文所列舉的并非是完全的。在本發(fā)明的具體實施方案中，將樣品預(yù)處理以促進用檢測方法檢測所述樣品。例如，預(yù)處理所述樣品導(dǎo)致靶標(biāo)的半分離或分離通常是可理解的。許多方法和試劑盒可以用于預(yù)處理各種類型的樣品。最優(yōu)選的樣品是血液。表位特異性檢測部分可以是單克隆抗體、親和力純化的多克隆抗體、表位特異性適體、表位特異性anticalin、表位特異性凝集素、表位特異性親和體、表位特異性化學(xué)配體或表位特異性肽。最優(yōu)選的表位特異性檢測部分是單克隆抗體。通過使用全部結(jié)合相同表位的檢測部分，可以在介質(zhì)中避免形成復(fù)合物。當(dāng)使用大顆粒標(biāo)記時，多于一個檢測部分可以結(jié)合至一個標(biāo)記顆粒。在檢測部分結(jié)合不同表位的情況下，不同的檢測部分-標(biāo)記復(fù)合物可以結(jié)合多于一個靶標(biāo)。這可以導(dǎo)致形成最后可能沉淀的大復(fù)合物。對相同表位或相同表位的亞區(qū)具有特異性的檢測部分避免這個問題，因為它們總是結(jié)合相同表位。檢測部分可以通過任何合適的方式連接至大顆粒標(biāo)記。這種連接可以通過任何合適的方法完成，例如共價連接或非共價連接或吸附。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Ademtech方法可以用于將磁性標(biāo)記連接至表位特異性檢測部分。在該方法中，在EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)_碳二亞胺)的存在下，檢測部分如濃度例如為20ug抗體/mg磁性標(biāo)記的單克隆抗體偶聯(lián)至25個羧基化的磁性標(biāo)記。當(dāng)靶標(biāo)為人proBNP或人NT-proBNP時，對相同表位不具有特異性的捕獲部分針對至少一個選自 SEQ ID NO 1 的氨基酸殘基 1-12、1-21、5-12、13-27、28-45、39-50、46-60 和 /或61-76的表位。優(yōu)選地，所述表位特異性檢測部分針對至少一個選自氨基酸殘基1-10、5_12、 11-22,13-27,26-32 和 / 或 61-76 的表位。特別優(yōu)選地，使用至少兩個表位特異性檢測部分，其中一個檢測BNP表位，而另一個檢測NT pro BNP表位。在一優(yōu)選實施方案中，所述固體基底的形狀基本上選自珠、條帶、載片和/芯片。 而且，表面可以是平坦、彎曲、多孔或結(jié)構(gòu)化的，例如當(dāng)使用光學(xué)檢測技術(shù)時以實現(xiàn)用于增強靈敏度的結(jié)構(gòu)化光學(xué)表面。固體基底可以是傳感裝置的表面。通常，傳感裝置的表面是致密、均勻的表面。表面可以是傳感器表面，即涉及檢測的表面?；蛘?，傳感器可以位于附近，例如在傳感裝置的表面之下，這允許檢測接近檢測表面的標(biāo)記。所述傳感裝置可以是適合于檢測標(biāo)記的任何傳感裝置。合適的傳感裝置可以是非光學(xué)傳感裝置或光學(xué)傳感裝置。非光學(xué)傳感裝置能夠檢測非光學(xué)信號，例如但不限于磁性信號、磁阻和/或霍爾效應(yīng)。光學(xué)傳感裝置能夠檢測光學(xué)信號，例如反射、吸收、散射、熒光、 放射性、化學(xué)發(fā)光、RAMAN和/或FI1R。受抑全內(nèi)反射是發(fā)生在這樣的情況下的現(xiàn)象倏逝波延伸穿過分離介質(zhì)進入更高折射率的材料所占據(jù)的區(qū)域，能量可以流過邊界。這種現(xiàn)象類似于量子力學(xué)的隧道或能壘穿越。當(dāng)以這種方式穿越邊界傳遞時，“全內(nèi)反射”不再是完全的，因為折射波以損失內(nèi)反射波的情況下傳遞。在實際中，當(dāng)全反射發(fā)生時，光束直射玻璃片。然而，部分光進入玻璃片并產(chǎn)生倏逝場。接近玻璃片的散射標(biāo)志物導(dǎo)致倏逝場中的光散射，由此可以通過諸如CCD相機的單獨裝置檢測。本申請人在上述發(fā)明中首次公開受抑全內(nèi)反射技術(shù)在診斷測定中的用途。據(jù)證實，這種方法提供高靈敏度、短測定時間，并且僅要求小樣品體積。這對于要求快速和高靈敏度的現(xiàn)場情況具有優(yōu)勢。在具體的實施方案中，檢測設(shè)備能夠檢測非光學(xué)信號，例如聲學(xué)信號(石英晶體微量天平OiCM)、表面聲波(SAW)或體聲波(BAW)等)。這樣的聲學(xué)信號可以由諸如脂質(zhì)體的囊泡、膠束或泡產(chǎn)生。這樣的囊泡可以填充有液體、氣體、氣態(tài)前體和/或固體或溶質(zhì)材料。取決于要檢測的信號的性質(zhì)，檢測表面可以是檢測設(shè)備的組成部分(傳感器表面)或者可以允許檢測其表面上標(biāo)記的存在。在一實例中，反射性標(biāo)記如發(fā)光或熒光標(biāo)記包埋于或連接至所用的標(biāo)記。可以利用輻射源，例如通過允許光學(xué)檢測這樣的標(biāo)記的聚焦激光束或通過倏逝場激發(fā)來激發(fā)熒光標(biāo)記。檢測可以以任何合適的方式進行，例如利用共焦檢測或利用高NA透鏡。熒光標(biāo)記的使用允許通過利用激發(fā)和/或發(fā)射波長不同的不同熒光團來多路操作。光學(xué)檢測還可以通過表面增強拉曼光譜(SERRQ來完成。SERRS是一種通過將光學(xué)標(biāo)記的分子或物質(zhì)吸附于諸如銀顆粒的膠體標(biāo)記上來檢測分子或物質(zhì)的超靈敏方法。光學(xué)標(biāo)記為合適的染料分子(例如，羅丹明)，其在膠體顆粒為可控方式時導(dǎo)致等離子體和染料共振。已知，例如磁性標(biāo)記帶有金屬包覆存在。如果，靶標(biāo)如抗原(結(jié)合部分，即抗體與之結(jié)合)偶聯(lián)至此類銀包覆的磁性標(biāo)記，同時所述靶標(biāo)還偶聯(lián)至合適的染料，則靶標(biāo)特異性結(jié)合部分會導(dǎo)致所述染料連接至所述銀包覆的磁性標(biāo)記。磁驅(qū)動會導(dǎo)致形成簇/柱，其會導(dǎo)致染料共振。SERRS可以在倏逝場中驅(qū)動至非結(jié)合傳感器表面后被檢測。在這樣的情況下，結(jié)合部分檢測可以在省略洗滌步驟的單室中完成，因為所述檢測是是表面特異性的，并且不被來自的溶液的未結(jié)合染料所干擾。在另一實例中，可以使用磁性傳感器，例如霍爾傳感器、磁阻傳感器，如GMR、TMR或AMR傳感器。在一具體實例中，磁性傳感可以利用這樣的事實，特定的頻率可以用于施加的AC磁場。在低頻方案中，即頻率低于100Hz，磁性傳感器原件的Ι/f噪聲占主導(dǎo)。Ι/f噪聲由電流的點對點波動引起，并且與頻率的逆元(inverse) 成比例。在磁阻傳感器中，Ι/f來自自由層的磁性波動。當(dāng)產(chǎn)生的AC磁場的頻率為IOOHz 或更高時，占主導(dǎo)的Ι/f噪聲與現(xiàn)有技術(shù)相比明顯降低，從而導(dǎo)致改進的信噪比(SNI )。當(dāng) AC磁場的頻率進一步升高至熱白(Nyquist)噪聲水平大于Ι/f噪聲水平時，這是有利的。 在fc >> 50kHz的某些區(qū)域，GMR傳感器的熱白噪聲占主導(dǎo)。白噪聲水平限制了理論上可實現(xiàn)的檢測極限。如上文所述，可以通過本領(lǐng)域已知的任何直接或間接方法來確保檢測檢測表面上的磁性標(biāo)記。具體的檢測方法基于標(biāo)記的磁性性質(zhì)如GMR，或者基于磁性標(biāo)記的光學(xué)性質(zhì)如用受抑全內(nèi)反射(FTIR)檢測。整合于一次性流動室柱的小型GMR傳感器芯片適合于進行本發(fā)明的方法，并且可以檢測1500 μ m2芯片表面上3個300nm標(biāo)記的標(biāo)記密度。在另一優(yōu)選實施方案中，所述固體基底包含至少一種選自膠乳、塑料、金、硅、氮化硅和/或玻璃的材料。對相同表位不具有特異性的捕獲部分可以以任何合適的方式連接至固體支持物。 連接可以通過任何合適的方法進行，例如共價連接、或非共價連接或吸附。例如，對相同表位不具有特異性的捕獲部分可以通過噴墨印刷、微接觸印刷、浸涂(在本體溶液中)和/或滴涂(從納米或微米滴管)結(jié)合至固體支持物。在本發(fā)明的一實施方案中，接合至磁性標(biāo)記的表位特異性檢測部分和結(jié)合至傳感器表面的對相同表位不具有特異性的捕獲部分存在于柱中。由于用于測定的試劑已經(jīng)存在于該柱中，所以使用者僅需要通過樣品如何加入樣品流體，其再分散所述試劑和標(biāo)記以產(chǎn)生預(yù)期的緩沖條件。無水試劑優(yōu)選包含測定以及具有表位特異性檢測部分的磁性標(biāo)記所需的緩沖組分。無水試劑的組分可以分別沉積和干燥于柱的不同位置，或者一起沉積和干燥于相同位置。所述試劑可以通過包括冷凍干燥在內(nèi)的幾種干燥技術(shù)來沉積。冷凍干燥防止形成晶體，并允許所述試劑干燥成無定形的玻璃態(tài)，其易于在加入流體時再分散。所述柱優(yōu)選地適合于檢測大顆粒標(biāo)記。最優(yōu)選地，所述柱適合于光學(xué)檢測磁性標(biāo)記。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測樣品中的分析物的方法，其中使用本發(fā)明的免疫測定。優(yōu)選地，可檢測標(biāo)志物用光學(xué)或非光學(xué)檢測方法來檢測。在另一優(yōu)選實施方案中， 可檢測標(biāo)志物用至少一種選自抑全內(nèi)反射(FTIR)、發(fā)光測量、熒光測量、吸光度測量、重量測量和/或玻璃放射性測量的方法來檢測。而且，優(yōu)選地，可檢測標(biāo)志物為磁性標(biāo)志物，和/或可檢測標(biāo)志物用FIlR檢測。在本發(fā)明所述方法的具體實施方案中，靶標(biāo)-結(jié)合部分相互作用的優(yōu)化通過磁驅(qū)動來實現(xiàn)，在測定期間施加朝向檢測表面的磁場和/或向攜帶表位特異性檢測部分的磁性標(biāo)記使用脈沖磁驅(qū)動力以確保與檢測表面接觸的優(yōu)化。磁性標(biāo)記可以以不同方式操作來優(yōu)化與固定結(jié)合部分的接觸。在具體實施方案中，測定中的磁驅(qū)動通過以下步驟進行。在第一步驟中，在“收集”步驟中，使具有表位特異性檢測部分的標(biāo)記快速吸引 (attract)至傳感器表面。這通過施用傳感器表面的方向的磁場來確保。在具體實施方案中，磁場確保磁性標(biāo)記到達傳感器表面，例如在表面上至少達到50 %、75 %或90 %的單層形成，優(yōu)選100 %的單層形成。在第二步驟中，除去磁力，并允許標(biāo)記以基本上不受阻礙的移動和轉(zhuǎn)到自由度沿表面移動。在一定的時間后發(fā)生擴散，并且在具體實施方案中，再次施用第一步驟的定向磁場。這些步驟可以重復(fù)幾次以確保具有結(jié)合至表位特異性檢測部分的靶標(biāo)的磁性標(biāo)記結(jié)合至檢測表面上的非表位特異性檢測部分。通過交替開/關(guān)磁場獲得脈沖驅(qū)動。在本文所述的磁驅(qū)動條件的替代實施方案中，檢測表面的轉(zhuǎn)動和移動不僅是在不存在磁場的條件下的被動擴散的結(jié)果，而且是通過施加確保磁性標(biāo)記沿檢測表面移動的一個或多個磁場的主動保證。在具體實施方案中，允許磁性標(biāo)記沿檢測表面移動的磁力通過所述標(biāo)記的脈沖驅(qū)動來確保。這可以涉及，例如交替垂直于檢測表面或平行于檢測表面的磁場的方向，或者具有不同朝向的不同磁場的組合。每個脈沖的時間和持續(xù)時間基于標(biāo)記大小來設(shè)計，以最佳地允許所述標(biāo)記沿結(jié)合表面以其軸進行至少一次完整的轉(zhuǎn)動。在具體實施方式
中，驅(qū)動力主要垂直于表面，因為與傳感器表面平行的強力可以特異性地除去結(jié)合的磁性標(biāo)記。
在本文所述的方法中，任選地在磁性標(biāo)記與檢測表面通過磁驅(qū)動接觸后，施用使所述標(biāo)記遠離所述檢測表面的磁力以確保除去未結(jié)合的標(biāo)記。通過這種方式，不再需要額外的除去磁性標(biāo)記的洗滌步驟。據(jù)發(fā)現(xiàn)，涉及磁性標(biāo)記在檢測表面上移動和轉(zhuǎn)動的交替脈沖驅(qū)動的方法比僅涉及將標(biāo)記吸引至檢測表面的恒定磁力的方法明顯更有效。脈沖驅(qū)動還降低標(biāo)記不可逆地聚集的可能性，因為標(biāo)記互相接觸的時間也減少了。優(yōu)選的驅(qū)動方案由約1分鐘的樣品與柱和磁性標(biāo)記的溫育，然后約4分鐘的脈沖驅(qū)動和約10秒的通過頂部線圈除去標(biāo)記組成。免疫測定可以通過任何合適的測定形式進行。例如，免疫測定可以作為夾心測定、 競爭性免疫測定或者作為抑制測定的方式進行。所述測定還可以作為競爭性測定形式進行，其中肽或蛋白最主要的同種型與固定于大顆粒標(biāo)記上的所述肽或蛋白的同源物競爭固體支持物上的多克隆結(jié)合位點。當(dāng)將 NT-proBNP用作靶標(biāo)時，NT-pro BNP與固定于大顆粒標(biāo)記上的NT-pro BNP同源物競爭固體支持物上的多克隆結(jié)合位點。在一優(yōu)選實施方案中，所述測定以一步形式進行，其包括以下步驟a)向疑似包含分析物的樣品加入綴合至檢測部分的磁性顆粒；b)將所述樣品與顆粒暴露于包含捕獲部分的傳感器表面；和c)允許形成檢測部分、分析物和捕獲部分的復(fù)合物；d)除去未結(jié)合的顆粒；以及e)檢測結(jié)合的檢測部分的數(shù)目。在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測樣品中的分析物的方法，其中使用本發(fā)明的免疫測定。合適的分析物的水平或濃度可以表示疾病狀況、疾病或并發(fā)癥的存在或不存在，因而允許診斷和/或監(jiān)測所述疾病狀況、疾病或并發(fā)癥。具體地，所述方法用于診斷和/或監(jiān)測心力衰竭。測定時間可以<5分鐘。樣品體積可以< 30 μ L，例如彡IyL至< 30 μ L。用于這些目的的標(biāo)記或標(biāo)志物為上文所述的標(biāo)記。優(yōu)選地，所述標(biāo)志物為磁性標(biāo)記。然而，這些磁性標(biāo)記的具有較大的大小，優(yōu)選在彡50nm且彡5000nm的范圍內(nèi)。而且，本發(fā)明提供一種能夠根據(jù)本發(fā)明的方法檢測樣品中的分析物的生物傳感器裝置。這樣的生物傳感器最優(yōu)地適合于移動使用，例如手持裝置，并允許快速檢測僅為小濃度的分析物。在另一方面，本發(fā)明提供一種適合于檢測分析物的試劑盒，其包括a)結(jié)合至固體基底的對相同表位不具有特異性的捕獲部分，以及b)結(jié)合至可檢測標(biāo)志物的表位特異性檢測部分；其中所述表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為大顆粒標(biāo)志物，其具有 ^ 50nm且；^ 5000nm的顆粒大小。應(yīng)當(dāng)理解，關(guān)于本發(fā)明的免疫測定所列的優(yōu)選實施方案也適用于上文所述的試劑
品.ο


參照下文所述的實施方案的描述，本發(fā)明的這些和其他方面會更加明顯。在附圖中圖1示出本發(fā)明的免疫測定10的原理。所述測定包括捕獲部分，其包含至少兩個部分11、12，其對分析物13的相同表位不具有特異性。所述捕獲部分結(jié)合至固體基底14。 所述測定還包括至少一個表位特異性檢測部分15，其結(jié)合至可檢測標(biāo)志物16。所述兩個部分11、12對分析物的相同表位不具有特異性，但是屬于相同的多克隆抗體。所述表位特異性檢測部分為單克隆抗體。表位特異性檢測部分15所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物16為大顆粒標(biāo)志物，其顆粒大小為> 50nm且彡5000nm。其可以是光學(xué)或非光學(xué)標(biāo)志物，例如光散射標(biāo)志物。而且，所述標(biāo)志物可以充當(dāng)操控物質(zhì)，例如如果其具有磁性特性。如虛線箭頭所示，由于標(biāo)志物的大尺寸， 標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物具有有限的轉(zhuǎn)動自由度。然而，這使得可以使用對相同表位不具有特異性的捕獲部分，所述捕獲部分包含至少兩個部分11、12，其對分析物13的相同表位不具有特異性。因此，標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物可以結(jié)合基底，即使其不具有相對于所述基底固定的轉(zhuǎn)動角度。這增加了測定的速度和靈敏度，并使得其可用于這樣的應(yīng)用，其中a)使用大標(biāo)志物(如光散射標(biāo)志物)b)檢測小分析物(如NT-proBNP或BNP)c)分析要快速進行(緊急裝置，特別是手持裝置所要求)，以及d)分析物僅少量存在(pg/ml-ng/ml級別，對于NT-proBNP和BNP正是如此)。圖2示出存在于現(xiàn)有技術(shù)的免疫測定中的問題。其中，免疫測定20僅包含一種類型的表位特異性捕獲部分21，即對分析物22的表位具有特異性的單克隆抗體。單克隆抗體21結(jié)合至固體基底23。所述測定還包括至少一個表位特異性檢測部分對，其結(jié)合至可檢測標(biāo)志物25。復(fù)合物僅能結(jié)合表位特異性捕獲部分21，如其具有正確的轉(zhuǎn)動角度(見圖 2的左邊部分)。由于標(biāo)志物的大尺寸，標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物具有有限的轉(zhuǎn)動自由度。因此，在標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物的轉(zhuǎn)動角度不正確的情況下，所述復(fù)合物無法結(jié)合至固體基底23。這降低所述測定的速度和靈敏度，特別是滿足上文所述的條件 a)-d)中的至少一個的情況下。圖3示出根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的磁性方法的示意圖。在這種情況下，標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物具有磁性性質(zhì)，這是由于標(biāo)志物是磁性的(其雙重地充當(dāng)標(biāo)志物和處理物質(zhì))，或者向所述復(fù)合物加入磁性物質(zhì)。在步驟a)中，標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物31通過磁驅(qū)動器33所施加的磁場被吸引至固體基底32。而且，不攜帶分析物的標(biāo)志物/檢測部分34被吸引至固體基底及其所結(jié)合的標(biāo)志物/檢測部分35，例如通過非特異性結(jié)合不同的靶標(biāo)。固體基底具有捕獲部分，所述捕獲部分包含至少兩個部分36、37，其對標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物31 中結(jié)合的分析物的相同表位不具有特異性。在步驟b)中，標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物31結(jié)合至部分36、37，即使它們具有相對于基底不同的旋轉(zhuǎn)角度。自由標(biāo)志物/檢測部分34和具有結(jié)合的不同靶標(biāo)的標(biāo)志物/檢測部分35也由于磁力而結(jié)合至固體基底。在步驟c)中，反向磁性驅(qū)動器的磁場，從而排斥所有未特異性結(jié)合固體基底的所有磁性物質(zhì)。因此，自由標(biāo)志物/檢測部分34和具有結(jié)合的不同靶標(biāo)的標(biāo)志物/檢測部分 35被釋放，而特異性結(jié)合至基底的標(biāo)志物/檢測部分/靶標(biāo)復(fù)合物31則被保留，并且可以例如通過FIlR技術(shù)來檢測。圖如示出每個標(biāo)志物41可以攜帶多于一個表位特異性檢測部分42，如單克隆抗體。這可以導(dǎo)致攜帶多于一個分析物43的標(biāo)志物/檢測部分/分析物復(fù)合物。圖4b示出如果標(biāo)志物44攜帶多于一個檢測部分所發(fā)生的情況，其中每個部分45、 46、47結(jié)合分析物的不同表位，如多克隆抗體。如虛線箭頭所示，這可以導(dǎo)致形成大復(fù)合物， 其隨后沉淀。因此，在本發(fā)明中優(yōu)選使用表位特異性檢測部分，如單克隆抗體。圖5示出利用針對NT-pro BNP的表位1_21的綿羊多克隆NT-pro BNP抗體作為捕獲部分的NT-pro BNP的劑量應(yīng)答曲線。根據(jù)本發(fā)明的定義，所述捕獲部分對相同表位不具有特異性，因為它們結(jié)合給定靶標(biāo)的相同表位的不同亞區(qū)。測量用受抑全內(nèi)反射技術(shù)進行。進一步細節(jié)參見實驗部分。由此可見，所述方法的速度和靈敏度是優(yōu)異的。4分鐘的脈沖磁驅(qū)動和IOs的磁性標(biāo)志物除去的溫育步驟后，可以檢測NT-pro BNP納克分數(shù)濃度。
具體實施例方式盡管在附圖和上述描述中示例和描述了本發(fā)明，但是這樣的示例和描述應(yīng)當(dāng)視為描述性或示例性，而非限制性的。本發(fā)明并不限于公開的實施方案。根據(jù)附圖、公開以及所附權(quán)利要求書的研究，本領(lǐng)域技術(shù)人員在實施本發(fā)明中應(yīng)當(dāng)理解和完成公開的實施方案的其他變體。在權(quán)利要求書中，詞語“包含”不排除其他元素或步驟，并且不定冠詞“一個(a)”或“一個(an)”不排除復(fù)數(shù)?；ハ嗖煌膹膶贆?quán)利要求中所用的某些度量并不表示這些度量的組合不是有利的。權(quán)利要求書中任何參考符號不應(yīng)當(dāng)理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1利用磁性標(biāo)記檢測NT-proBNP1.材料 針對NT-proBNP的表位1-21的多克隆NT-proBNP抗體· NT-pro BNP 標(biāo)準(zhǔn)品(Hytest 8NT1) 用15C4Hytest MAb抗體包覆的500nm磁性顆粒2.方法針對表位1-21的多克隆NT-pro BNP綿羊抗體是多克隆抗體，其以PBS中的 150ug/mL抗體的濃度噴墨印刷于聚合物生物芯片的表面。將覆蓋有用40ug 15C4Hytest MAb抗體/mg磁性顆粒的溶液官能化的Ademtech SA的顆粒涂層的直徑為500nm的氧化鐵顆粒稀釋于測定緩沖液。將NT-pro BNP標(biāo)準(zhǔn)品(Hytest 8NT1)稀釋于測定緩沖液。將磁性標(biāo)記和NT-pro BNP溶液以1 1稀釋，并將1 μ L暴露于傳感器表面。測量用受抑全內(nèi)反射技術(shù)進行。傳感器表面的磁性納米顆粒用倏逝場檢測，所述倏逝場通過LED光的校準(zhǔn)束產(chǎn)生，其波長為625nm，入射角相對于正常為70°，即相對于傳感器表面20°的角度。反射光通過成像透鏡(f = 7. 5mm, Anteryon)到 CCD 相機上(Marlin F080B/C, Allied Vision Technologies) 0根據(jù)納米顆粒對傳感器表面的結(jié)合來計算每個點的信號，對20像素χ 20
14像素的面積平均。在納米顆粒的結(jié)合之前，通過將反射光強度與測量的光強度相關(guān)聯(lián)來測定信號。 使用的驅(qū)動方法由4分鐘的脈沖驅(qū)動和IOs的通過頂部線圈除去標(biāo)記組成。在插入柱中之前將溶液溫育30s以允許顆粒結(jié)合cTnl分子。將約10 μ L的流體插入柱中后，顆粒被吸引至傳感器表面達22 ，同時將磁場交替改變(3 ·104Α/πι)。這導(dǎo)致包含NT pro BNP 的顆粒結(jié)合至包含抗NT proBNP抗體的表面。在最后的步驟中，關(guān)閉底部的磁體，并打開上方的磁體O · 104A/m)以將未結(jié)合的顆粒離開傳感器表面?？倻y定時間為約5分鐘。結(jié)果示于圖1中。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測樣品中的分析物的免疫測定，所述測定包括多個能夠結(jié)合所述分析物的部分，其中a)對相同表位不具有特異性的捕獲部分被結(jié)合至固體基底，以及b)至少一個表位特異性檢測部分被結(jié)合至可檢測標(biāo)志物；并且其中所述表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為大顆粒標(biāo)志物，具有 ^ 50nm且；^ 5000nm的顆粒大小。
2.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為光學(xué)或非光學(xué)標(biāo)志物。
3.權(quán)利要求1或2所述的免疫測定，其中所述可檢測標(biāo)志物作為操控物質(zhì)而起雙重作用。
4.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述分析物為肽或蛋白，其具有a) 20且< 180個氨基酸殘基，和/或b)≤2且≤17kDa的分子量。
5.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述分析物為腦利尿鈉肽(BNP)和/或 NT-proBNPo
6.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述樣品為體液或組織樣品。
7.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述表位特異性檢測部分為單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述捕獲部分為多克隆抗體。
9.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述固體基底的形狀基本上選自珠、條帶、載片和 /芯片°
10.權(quán)利要求1所述的免疫測定，其中所述固體基底包含至少一種選自膠乳、塑料、金、 硅、氮化硅和/或玻璃的材料
11.一種用于檢測樣品中的分析物的方法，其中使用前述權(quán)利要求中任一項所述的免疫測定。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可檢測標(biāo)志物用光學(xué)或非光學(xué)檢測方法來檢測。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中a)所述可檢測標(biāo)志物為磁性標(biāo)志物，和/或b)所述可檢測標(biāo)志物用FIlR來檢測。
14.一種能夠根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項所述的方法檢測樣品中的分析物的生物傳感器。
15.一種適合于檢測樣品中分析物的試劑盒，其包括a)結(jié)合至固體基底的對相同表位不具有特異性的捕獲部分，以及b)結(jié)合至可檢測標(biāo)志物的表位特異性檢測部分；其中所述表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為大顆粒標(biāo)志物，其具有≥50nm 且≤ 5000nm的顆粒大小。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中的分析物的免疫測定，所述測定包括多個能夠結(jié)合所述分析物的部分，其中對相同表位不具有特異性的捕獲部分被結(jié)合至固體基底，以及至少一個表位特異性檢測部分被結(jié)合至可檢測標(biāo)志物；并且，其中所述表位特異性檢測部分所結(jié)合的可檢測標(biāo)志物為大顆粒標(biāo)志物，其具有≥50nm且≤5000nm的顆粒大小。
文檔編號G01N33/543GK102549429SQ201080040907
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月14日
發(fā)明者D·W·C·德克斯, M·F·W·C·馬滕斯, M·H·黑夫蒂, T·H·埃弗斯, W·U·迪特默 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司