專利名稱：一種快速高效分離和純化重組腺病毒相關(guān)病毒的方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及重組腺相關(guān)病毒的分離、濃縮和純化方法，尤其適合大規(guī)模制備重組AAV病毒以用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。
病毒載體在基因轉(zhuǎn)移和基因治療中有廣泛的應(yīng)用。其中腺相關(guān)病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)因具有無致病性、理化性質(zhì)穩(wěn)定、免疫原性弱、可定點(diǎn)整合到真核細(xì)胞染色體中從而介導(dǎo)外源基因的長期穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)而越來越受到關(guān)注，在基因轉(zhuǎn)移和基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
人2型腺相關(guān)病毒(AAV-2)是目前最常用作病毒載體的腺相關(guān)病毒。AAV病毒為輔助病毒依賴性病毒，其感染復(fù)制需要腺病毒或單純皰疹病毒等的輔助。
AAV-2病毒的顆粒直徑為20～24nm，為20面體結(jié)構(gòu)。病毒由20～25％ DNA和75％～80％蛋白質(zhì)組成。在氯化銫溶液中的浮力密度為1.41g/cm3?；蚪M為4.7kb的單鏈DNA?；蚪M兩端各有一段145bp的重復(fù)序列(ITR)，是AAV病毒特有的順式作用元件，為AAV病毒的復(fù)制、整合、拯救、包裝等所必需。ITRs之間為AAV的編碼基因，左邊的為rep基因，編碼4種Rep蛋白Rep78，Rep68，Rep52，Rep40；右邊的為cap基因，編碼3種外殼蛋白VP1，VP2，VP3，分子量依次為87，72，62 KDal。AAV病毒顆粒中VP3、VP2、VP1蛋白的比例約為10∶1∶1。
Samulski RJ等(Cloning of adeno-associated virus into pBR322rescue of intact virusfrom the recombinant plasmid in human cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，792077-2031，1982)將完整的雙鏈AAV DNA克隆于pBR322質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)粒中的AAV前病毒基因組亦具有形成感染性病毒的能力。因此將外源基因表達(dá)單位置于AAV病毒的兩個(gè)ITR之間，而rep和cap基因及輔助病毒的功能則由其它方式反式提供，在細(xì)胞中可獲得含有外源基因的重組AAV病毒。
重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)顆粒的結(jié)構(gòu)與野生型AAV相同。所不同的是，重組AAV病毒顆粒包裝的基因組為單鏈的兩端帶有AAV ITR序列的外源DNA。重組AAV病毒中可容納的外源DNA長度在5.0kb以內(nèi)。
經(jīng)典的rAAV產(chǎn)生方法(Xiao Xiao，Richard Jude Samulski Current Protocols in HumanGenetics，Vectors for Gene Therapy，Unit 12.1，1996)是用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以及輔助病毒如5型腺病毒(Ad5)感染。雙質(zhì)粒中一個(gè)是重組AAV載體質(zhì)粒，另一個(gè)為含有AAV rep-cap基因的輔助質(zhì)粒。由于這種方法操作較復(fù)雜，影響rAAV產(chǎn)生的因素多，難以獲得高滴度的rAAV，不易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。因此許多研究者致力于改進(jìn)重組AAV病毒(rAAV)的產(chǎn)生方法。這些改進(jìn)包括以下幾類1)將repcap基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞株中，建成一種包裝細(xì)胞系。其中的repcap的表達(dá)受其自身的啟動子控制(KenjiTamayose，Yukihiko Hirai，and Takashi Shimada，A new strategy for large-scale preparation ofhigh-titer recombinant adeno-associated virus vectors by using packaging cell lines andsulfalonated cellulose column chromatography， Human Gene Therapy 7507-513，1996)，或換成其它組成型或可誘導(dǎo)啟動子(Inoue N，Russell DW.Packaging cells based on induciblegene amplification for the production of adeno-associated virus vectors.J.Virol 727024-7031，1998)；2)將AAV ITRs和其間的外源基因表達(dá)單位DNA插入腺病毒基因組中，構(gòu)建成一種嵌合型重組腺病毒(Guang-Ping Gao，Guang Qu et al.High-titer adeno-associatedviral vectors from a rep/cap cell line and hybrid shuttle virus Human Gene Therapy 92353-2362，1998；Liu XL，Clark KR，Johnson PR Production of recombinant adeno-associatedvirus vectors using a packaging cell line and a hybrid recombinant adenovirus.Gene Ther 1999Feb；6(2)293-9)。3)將AAV ITRs和其間的外源基因表達(dá)單位DNA置于自主復(fù)制的EBV病毒載體中，轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞中，建成一種攜帶具有自主復(fù)制能力的重組AAV載體質(zhì)粒的細(xì)胞株(顏?zhàn)訚}，姚二梅等，以EBV復(fù)制子為基礎(chǔ)的新型重組AAV載體包裝系統(tǒng)，科學(xué)通報(bào)，42(17)1860-1863，1997)。4)將repcap基因插入腺病毒基因組中，構(gòu)建成一種具有完全輔助功能的重組腺病毒。然而許多實(shí)驗(yàn)證明，這種思路難以實(shí)現(xiàn)?？赡苁怯捎趓ep蛋白對腺病毒的強(qiáng)烈抑制作用使得含有repcap基因的重組腺病毒無法產(chǎn)生。5)用HSV病毒擴(kuò)增子攜帶repcap基因，產(chǎn)生具有完全輔助功能的HSV混合病毒(James E.Conway，Sergei Zolotukhin et al.Recombinant adeno-associated virus type 2 replication andpackaging id entirely supported by a herpes simplex virus type 1 amplicon expressing rep andcap，J Vorol 71(11)8780-8789，1997；舒躍龍，吳小兵，楊天忠，貢惠宇，侯云德，顏?zhàn)訚} 以HSV-1擴(kuò)增子載體構(gòu)建的新型重組AAV載體包裝系統(tǒng) 中國科學(xué)(C輯)28(5)457-462，1998)。6)rAAV病毒體外包裝(無細(xì)胞包裝)(Zhou XH，MuzyczkaN.Invitropackaging of adeno-associated virus DNA，J Virol 72(4)3241-3247，1998)。
我們曾提出了“一株載體細(xì)胞/一株輔助病毒”的生產(chǎn)策略(中國專利申請?zhí)?8120033.8，及99119039.4，伍志堅(jiān)，吳小兵等 具有AAV載體包裝功能的重組HSV的產(chǎn)生，科學(xué)通報(bào)44(5)506-509)用攜帶了AAV病毒rep-cap基因的重組HSV-1病毒(HSV1-rc)感染穩(wěn)定整合了重組AAV載體DNA的載體細(xì)胞株，從病變的細(xì)胞中可獲得大量的rAAV病毒。用rHSV-rc病毒感染載體細(xì)胞株時(shí)，HSV1-rc病毒進(jìn)入細(xì)胞后其DNA大量復(fù)制并最終產(chǎn)生子代病毒。HSV1-rc病毒DNA復(fù)制時(shí)攜帶的rep-cap基因亦同步復(fù)制，從而產(chǎn)生高拷貝的rep-cap基因。Rep基因編碼產(chǎn)生4種Rep蛋白(Rep78，Rep68，Rep52，Rep40)，使重組AAV載體DNA從細(xì)胞基因組上拯救出來并大量復(fù)制最終成為單鏈被包裝到AAV殼粒中；cap基因編碼3種外殼蛋白VP1，VP2，VP3，在細(xì)胞核內(nèi)組裝成殼粒。該方法有效地解決了rAAV的大規(guī)模產(chǎn)生問題。
研究中我們發(fā)現(xiàn)，用重組HSV-1病毒HSV1-rc感染未轉(zhuǎn)染AAV載體DNA的BHK-21細(xì)胞，也可以產(chǎn)生大量AAV病毒顆粒。只是這種病毒顆粒為病毒空殼。說明AAV病毒形成病毒顆粒時(shí)是預(yù)裝好病毒空殼后再將基因組DNA包裹到殼粒中。
如何高效地分離和純化大量的rAAV是其應(yīng)用的又一個(gè)關(guān)鍵問題。目前有關(guān)重組AAV分離和純化的報(bào)道較少。傳統(tǒng)的純化方法采用硫酸銨分步鹽析法將rAAV與細(xì)胞碎片分離并使之濃縮，然后用2～3輪氯化銫梯度超離心獲得rAAV組分，最后用透析方法除去氯化銫和其它鹽。這種方法既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又使rAAV的感染性有較大的損失，且回收率低。因此，許多研究者致力于發(fā)展新的純化方法。近年來報(bào)道的柱層析方法(KenjiTamayose，Yukihiko Hirai，and Takashi Shimada，A new strategy for large-scale preparation ofhigh-titer recombinant adeno-associated virus vectors by using packaging cell lines andsulfalonated cellulose column chromatography，Human Gene Therapy 7507-513，1996；SZolotukhin，Bj Byrne et al.Recombinant adeno-associated virus purification using novelmethods improves infectious titer and yield.Gene Therapy 6973-985，1999；Dirk Grimm，Andrea kern et al.Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociatedvirus vectors，Human Gene Therapy 92745-2760，1998)使rAAV的純化過程大大簡化，而且回收率有較大提高。但這些方法亦有成本高、處理大體積樣品能力有限、實(shí)驗(yàn)條件和儀器設(shè)備要求高等缺點(diǎn)。
一般地，重組AAV病毒純化過程可分為以下步驟1)細(xì)胞裂解(無細(xì)胞系統(tǒng)除外)最經(jīng)典的方法是采用反復(fù)凍融3～4次的方法。將含有rAAV病毒的細(xì)胞及培養(yǎng)液收集在一起，在干冰/乙醇浴和37℃水浴中反復(fù)凍融3-4次，目的是破碎細(xì)胞以釋放rAAV。這種方法的缺點(diǎn)是rAAV病毒釋放不全。其它方法還有超聲波破碎細(xì)胞法、脫氧膽酸法等。
2)輔助病毒滅活(無輔助病毒包裝系統(tǒng)除外)利用腺病毒和單純皰疹病毒對熱敏感的特點(diǎn)，一般用56℃水浴30～2hr滅活輔助病毒。
3)重組AAV病毒與細(xì)胞碎片分離一般用低速離心除去細(xì)胞碎片。
4)重組AAV病毒與其它組分分離及濃縮最常采用的方法是氯化銫密度梯度超速離心法。其分離依據(jù)是成熟的AAV病毒顆粒的浮力密度為1.40～1.42g/cm3。最近，等用抗AAV病毒顆粒的單克隆抗體制成親和層析柱，用來分離rAAV獲得很好的純化和濃縮效果。
5)純化的重組AAV的純度和滴度檢測純度的主要檢測方法有HPLC、SDS-PAGE電泳、紫外分光光度分析、電鏡分析等。滴度測定包括物理滴度(particles/ml)和感染滴度(TU/ml)的測定。
本發(fā)明提出了一種分離純化rAAV病毒的新方法，其特點(diǎn)是簡便快速、純化效果好、rAAV病毒的回收率高、成本低且易于放大至工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。本發(fā)明提出的rAAV病毒分離純化方法主要由以下步驟組成1)rAAV的大量產(chǎn)生用HSV1-rc為輔助病毒感染含有目的基因的AAV載體細(xì)胞株，待細(xì)胞出現(xiàn)完全CPE變化并漂浮起來時(shí)(約48～72hr)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物(細(xì)胞及培養(yǎng)液)作為粗制裂解液，測量其體積；
2)輔助病毒滅活及細(xì)胞裂解用氯仿處理原料液可達(dá)到滅活輔助病毒HSV1-rc和裂解細(xì)胞的雙重目的，但對AAV病毒沒有影響。有感染性的單純皰疹病毒顆粒有雙層脂質(zhì)外膜及鑲嵌在其中多種病毒糖蛋白，該層被膜是HSV病毒感染細(xì)胞所必需的。氯仿可以溶解脂質(zhì)，并使大量蛋白變性。用氯仿處理可100％滅活HSV病毒，同時(shí)可以高效裂解細(xì)胞膜和核膜。AAV病毒顆粒具有氯仿抗性，用氯仿處理對其結(jié)構(gòu)和感染活性沒有影響。
3)細(xì)胞碎片和變性蛋白的去除在細(xì)胞裂解液中加固體氯化鈉至終濃度1.0～1.2mol/L，攪拌溶解。11000g離心10～15min。將上清移入一干凈三角燒瓶中瓶中，估算其體積。棄去離心的沉淀和下層氯仿。加氯化鈉可促使AAV病毒顆粒與細(xì)胞碎片分離，也是下一步用聚乙二醇沉淀AAV病毒所必需。
4)在上清中加入固體聚乙二醇8000至終濃度6～12％，攪拌溶解。4℃放置1小時(shí)以上至過夜。12000g離心10～15min。將上清傾入另一干凈燒瓶中，盡量讓上清流盡。沉淀用適量的PBS2+溶解，加DnaseI和RNase消化AAV病毒顆粒之外的殘余DNA和RNA。加等體積的氯仿抽提，12000g離心5min，在無菌操作下小心吸出上層水相，移入無菌管中。該液體即為濃縮和純化的rAAV病毒液。
本發(fā)明提出的rAAV純化方法獲得的rAAV病毒純度可達(dá)到＞99％。從2×109cells(5只110×288mm轉(zhuǎn)瓶)粗制裂解液中制備的rAAV滴度可達(dá)到1014-15particles/ml，感染滴度可達(dá)＞1012-13TU/ml。rAAV的回收率＞90％。獲得的rAAV可用于體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步純化后可獲得臨床級的AAV產(chǎn)品。
該病毒液進(jìn)一步純化可采用雙液相萃取方法。用PEG/鹽系統(tǒng)或PEG/Dex系統(tǒng)。最終用透析去除PEG和鹽，用超濾除菌。
進(jìn)一步純化亦可采用柱層析(包括分子篩層析、親和層析)或氯化銫超速離心，及透析和超濾等方法。
本發(fā)明提出的rAAV純化方法尤其適合于用單純皰疹病毒為輔助病毒產(chǎn)生的rAAV的純化，亦適合于用無輔助病毒生產(chǎn)系統(tǒng)及體外包裝系統(tǒng)獲得的rAAV的純化。
實(shí)施例1用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)rAAV-GFP病毒將報(bào)告基因GFP插入通用型AAV載體pSNAV-1中，構(gòu)建成重組AAV載體pSNAV-1/GFP。將pSNAV-1/GFP用Lipofectamine(GIBCO BRL)轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入BHK-21細(xì)胞(購自ATCC，用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液37％培養(yǎng))中，加G418 800μg/ml選擇培養(yǎng)10～15d。獲得混合細(xì)胞克隆的載體細(xì)胞。將該載體細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至4只35cm2的方形玻璃培養(yǎng)瓶中，長滿(約有8×107個(gè)細(xì)胞)后用胰酶消化，接種到1只轉(zhuǎn)瓶(110×288mm)中，37℃低速轉(zhuǎn)動(1轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)。培養(yǎng)液體積為200ml/轉(zhuǎn)瓶。3d后將該轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞用胰酶消化傳入5只轉(zhuǎn)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后(約有2×109個(gè)細(xì)胞)，將培養(yǎng)液傾出，加輔助病毒HSV-rc/ΔUL2(在HSV1病毒基因組的UL2基因的XbaI位點(diǎn)中插入AAV repcap基因，中國專利申請?zhí)? 98120033.8)5～10ml(MOI＝0.5～2)，低速轉(zhuǎn)動(1轉(zhuǎn)/分鐘)吸附病毒1～2hr。加200ml/轉(zhuǎn)瓶無血清1640培養(yǎng)液37℃低速轉(zhuǎn)動(1轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)。待細(xì)胞完全病變、容易脫落時(shí)，蓋緊瓶蓋劇烈振搖，將瓶壁上的細(xì)胞全部洗脫至培養(yǎng)液中。收集合并5轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)物，估算其體積，分裝至500-ml三角燒瓶中，250ml/瓶。用于下一步純化。實(shí)施例2用本發(fā)明提出的純化方法純化rAAV接實(shí)施例1。在每一只三角瓶中加入氯仿25ml(10∶1 v/v)，置于37℃搖床中劇烈振搖1～1.5hr。取出在室溫下靜置10min。加DNase和RNase至終濃度1μg/ml。輕輕混勻，室溫下消化30～60min。加入固體氯化鈉至終濃度1mol/L，振搖溶解。4℃ 12000rpm離心15min。取出上層水相，棄去氯仿和沉淀。加PEG8000至終濃度10％ (w/v)。振搖溶解。4℃放置過夜。4℃ 11000rpm/min離心15min。將上清倒入干凈容器中。將離心管倒扣在吸水紙上，讓上清盡量流盡。用5ml PBS2+緩沖液將各離心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脫下來合并，將其分裝至1.5-ml塑料離心管中(0.6ml/管)，加等體積的氯仿抽提。4℃12000g離心5min，在無菌操作下小心吸出上層水相，移入無菌管中。該液體即為濃縮和純化的rAAV-GFP病毒液。該病毒液體積比初始體積濃縮了200倍。實(shí)施例3AAV空殼病毒顆粒的生產(chǎn)和純化用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞。細(xì)胞長滿后加輔助病毒HSV-rc/ΔUL2用與實(shí)施例1相同的方法獲得病變細(xì)胞培養(yǎng)物。用本發(fā)明提出的rAAV純化方法提取該培養(yǎng)物的AAV病毒。獲得的病毒液進(jìn)行電鏡觀察(附圖三)，可見大量病毒顆粒，顆粒中心密度較高，表明為病毒空殼。該結(jié)果說明用輔助病毒HSV-rc/ΔUL2感染沒有轉(zhuǎn)染AAV載體DNA(不含ITR序列)的BHK細(xì)胞可有效地產(chǎn)生AAV病毒空殼顆粒。實(shí)施例4rAAV病毒滴度和純度檢測接實(shí)施例2。用地高辛標(biāo)記(Boehringer Mannhein試劑盒)的GFP探針點(diǎn)雜交方法檢測純化的病毒液中rAAV-GFP病毒的滴度(particles/ml)。取10ul純化的病毒液用PBS2+緩沖液稀釋10倍。加DNase和RNase至終濃度1ug/ml37℃消化1hr。沸水浴5min之后置于冰浴中。用dilution buffer 10倍比系列稀釋后點(diǎn)膜，1ul/點(diǎn)。120℃烤膜30min。68℃預(yù)雜交1hr。加探針68℃雜交過夜。洗膜，顯色。結(jié)果第1～4點(diǎn)明確陽性，第5點(diǎn)弱陽性。假設(shè)點(diǎn)雜交方法檢測DNA的靈敏度為106分子，計(jì)算病毒滴度＝104～5×106×10×1000＝1014～15particles/ml。用SDS-PAGE電泳法檢測純化的病毒液中AAV病毒的純度。灌制SDS-PAGE分離膠和積層膠。分離膠濃度為10％。分別取純化的病毒液和最后一步氯仿抽提前的病毒液20ul，加2×loading buffer 20ul。沸水浴3min。每孔加樣10ul，200V電泳1hr。電泳完畢后用考馬斯亮藍(lán)R250染色液(在45ml甲醇45ml水和10ml冰醋酸中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250)染色，用相應(yīng)的脫色液脫色。蛋白質(zhì)分子量Markers的大小依次為97400，66200，42700，31000，14400Dal(Promega)。電泳結(jié)果見說明書附

圖1。電泳結(jié)果顯示，用本發(fā)明提出的純化方法獲得的純化的rAAV病毒液電泳表現(xiàn)為三條帶(lanel)，其大小分別與3種AAV外殼蛋白的大小相符合(野生型AAV-2外殼蛋白VP1為87kDal，VP2為72kDal，VP3為62KDal，)，占總蛋白99％以上；氯仿抽提可極為有效地去除雜蛋白，卻不損失AAV病毒蛋白；經(jīng)對lanel進(jìn)行計(jì)算機(jī)掃描處理，求出三條蛋白帶的強(qiáng)度比，恰好為10∶1∶1，與AAV-2病毒顆粒的VP3、VP2和VP1的比例相吻合。實(shí)施例5rAAV病毒的電鏡分析將實(shí)施例2中純化的rAAV-GFP病毒液經(jīng)負(fù)染后在電鏡下觀察，可見大小均勻一致、清晰可辨的實(shí)心病毒顆粒。粒徑約為20～24nm。見說明書附圖2。實(shí)施例6rAAV-GFP感染性滴度的測定用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液37℃，5％ CO2培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。在24孔板上接種HeLa細(xì)胞，5×105細(xì)胞/孔。培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液；取10ul純化的病毒液稀釋至1ml，以10倍比系列稀釋，每孔加不同稀釋度的病毒液0.5ml，37℃培養(yǎng)1hr。每孔加5型腺病毒(Ad5)50ul(MOI＝5)，及培養(yǎng)液0.5ml。37℃培養(yǎng)36hr后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中某孔的綠色細(xì)胞數(shù)n(10＜n＜100)。計(jì)算rAAV-GFP病毒滴度n×稀釋倍數(shù)×1000/5＝n×109×200＝2n×1011TU/ml。估算rAAV-GFP的感染滴度為2×1012～13TU/ml之間。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提出的rAAV病毒純化方法由以下步驟組成a)用氯仿破碎細(xì)胞、滅活HSV輔助病毒及使大量細(xì)胞蛋白變性沉淀；b)用DNaseI和RNase處理細(xì)胞裂解液以降解核酸；c)加NaCl促使rAAV與細(xì)胞碎片分離，離心去除細(xì)胞碎片；d)用PEG/NaCl沉淀rAAV；e)用氯仿抽提去除雜蛋白和殘余的PEG；f)透析除鹽；g)用密度梯度離心法或親和層析法進(jìn)一步純化rAAV。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，將a、c、d、e步驟單獨(dú)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，將a、c、d、e步驟與其它方法配合使用。
4.本發(fā)明提出的方法用于rAAV的大量分離和純化制備。
5.本發(fā)明提出的方法用于AAV病毒空殼的大量分離和純化制備。
6.用本發(fā)明制備的rAAV用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。
全文摘要
本發(fā)明利用AAV病毒顆粒具有抗氯仿處理的特點(diǎn),提出了一種用PEG/NaCl系統(tǒng)和氯仿快速而高效分離和純化rAAV病毒的方法。該方法適合于大規(guī)模分離和純化rAAV病毒和生產(chǎn)工藝化。尤其適用于以HSV病毒為輔助病毒產(chǎn)生的rAAV的純化,也可用于無輔助病毒包裝系統(tǒng)或無細(xì)胞體外包裝系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV的純化。經(jīng)本發(fā)明純化的rAAV病毒可用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。
文檔編號C12N15/861GK1272538SQ9912372
公開日2000年11月8日 申請日期1999年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月17日
發(fā)明者吳小兵, 董小巖, 侯云德 申請人:北京東康龍病毒生物技術(shù)工程研究中心