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一種基因點突變修復(fù)的方法與流程

文檔序號:12346450閱讀:3475來源:國知局
一種基因點突變修復(fù)的方法與流程

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)基因編輯領(lǐng)域。具體而言,本發(fā)明用于通過基因編輯方法在哺乳動物細(xì)胞中對基因突變進(jìn)行定點修復(fù)與外源基因敲入。



背景技術(shù):

目前基因組定點編輯/修飾的基本原理是利用在靶位點區(qū)自發(fā)或誘發(fā)的DNA雙鏈缺口(double-strain breaks,DSBs),DSBs將激活細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制來進(jìn)行基因組的改造,比如非同源區(qū)的末端連接(Non-homologous end joint,NHEJ)或是同源重組(Homologousrecombination,HR)(附圖1)。

在哺乳動物細(xì)胞內(nèi),DSB自發(fā)產(chǎn)生的概率約低于1/104,如果通過基因工程方法采用spCas9和SaCas9等核酸酶誘發(fā)DSBs,效率可提高至10%以上,且具有位點特異性,因此方便了下一步對內(nèi)源基因靶位點進(jìn)行的基因修復(fù)過程順利進(jìn)行。DSBs激活細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)通路后,會有兩種不同的修復(fù)機(jī)制競爭性的參與DSBs的修復(fù),一種是非同源區(qū)的末端連接NHEJ,一種是同源重組HR。要實現(xiàn)基因組靶位點的精準(zhǔn)編輯,需要依賴胞內(nèi)的同源重組修復(fù)機(jī)制。因此直接提高DSBs修復(fù)過程中同源重組發(fā)生的頻率或抑制非同源區(qū)的末端連接(NHEJ)都有助于提高基因組定點編輯/修飾的效率。

非同源區(qū)的末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)的發(fā)生都有多種蛋白參與其中,其中LIG4蛋白是NHEJ的重要因子,Rad51、Rad52和Brca1則是同源重組修復(fù)過程的重要參與蛋白。因此如果能夠抑制LIG4蛋白的表達(dá)和/或促進(jìn)Rad51、Rad52和Brca1的表達(dá)將有助于提高基因組定點編輯/修飾的效率。

Cas9等核酸酶對基因組的切割需要sgRNA的引導(dǎo),當(dāng)sgRNA的長度為20-21bp時,Cas9可以識別并切割靶位點,從而在靶位點處留下DSBs缺口;當(dāng)sgRNA長度為14-15bp時,Cas9可以識別并結(jié)合靶位點,但卻無法切割該位點。這一特性可被加以改造用于基因轉(zhuǎn)錄的抑制/激活。通過設(shè)計不同長度的sgRNA,我們還可以同時實現(xiàn)靶基因的激活/抑制和靶位點的切割與同源修復(fù)。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明提供了一種基于同源重組的基因編輯方法,包括采用核酸酶對目標(biāo)基因進(jìn)行切割,其特征在于:所述方法中還包括ssgRNA和靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,所述ssgRNA能夠引導(dǎo)核酸酶靶向基因編輯相關(guān)蛋白的編碼核酸但不會發(fā)生切割,所述靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控基因編輯相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。

其中,所述的核酸酶對目標(biāo)基因進(jìn)行同源重組包括采用sgRNA,所述sgRNA能夠引導(dǎo)核酸酶靶向目標(biāo)基因進(jìn)行切割;優(yōu)選所述sgRNA包括3'端的保守間隔相鄰基序,優(yōu)選所述的基序為NGG;優(yōu)選所述sgRNA為18-23bp,優(yōu)選20bp。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的核酸酶選自Cas9和CPF1,所述Cas9優(yōu)選選自SaCas9、SpCas9。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述方法中還包括同源互補(bǔ)修復(fù)模板,優(yōu)選在同源重組的整合位點刪除終止密碼子。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的ssgRNA包括3'端的保守間隔相鄰基序,優(yōu)選所述的基序為NGG;優(yōu)選所述的ssgRNA為14-16bp,更優(yōu)選為14bp、15bp或16bp。

本發(fā)明利用DNA序列特異性的染色體雙鏈DSBs生成技術(shù),通過改造sgRNA并設(shè)計不同長度的sgRNA,輔以靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子來實現(xiàn)高效、精確的基因組定點改造。在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子選自靶向性轉(zhuǎn)錄激活因子或靶向性轉(zhuǎn)錄抑制因子的至少一種,優(yōu)選所述靶向性轉(zhuǎn)錄激活因子選自VP64,優(yōu)選所述靶向性轉(zhuǎn)錄抑制因子選自KRAB。

本發(fā)明利用Cas9與不同長度sgRNA結(jié)合時活性的不同,實現(xiàn)對不同靶位點的差異調(diào)控,通過激活同源重組酶的表達(dá)/抑制NHEJ修復(fù)關(guān)鍵酶的表達(dá),提高同源重組效率從而實現(xiàn)內(nèi)源性基因突變的高效精準(zhǔn)修復(fù)。在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的基因編輯相關(guān)蛋白選自非同源區(qū)末端連接相關(guān)蛋白和同源重組相關(guān)蛋白的至少一種,優(yōu)選所述非同源區(qū)末端連接相關(guān)蛋白選自LIG4,優(yōu)選所述同源重組相關(guān)蛋白選自Rad51、Rad52和Brca1或其組合。

本發(fā)明利用序列特異性的核酸酶(sequence-specific endonuclease)在靶位點處或附近制造一個DSBs;在此基礎(chǔ)上,本發(fā)明利用長度不同的sgRNA和靶向性轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子,激活同源重組相關(guān)蛋白表達(dá),抑制非同源性的末端連接相關(guān)蛋白表達(dá),實現(xiàn)靶位點處高效特異性的同源重組修復(fù)(見附圖2,原理圖)。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述方法中的核酸酶與靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成融合蛋白,優(yōu)選所述融合蛋白包含柔性連接子。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的ssgRNA還偶聯(lián)了RNA適配體序列,所述RNA適配體序列能夠特異性的與關(guān)聯(lián)蛋白結(jié)合,所述靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與所述的關(guān)聯(lián)蛋白形成融合蛋白。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述方法中的核酸酶與第一靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成融合蛋白,優(yōu)選所述融合蛋白包含柔性連接子,所述的ssgRNA還偶聯(lián)了RNA適配體序列,所述RNA適配體序列能夠特異性的與關(guān)聯(lián)蛋白結(jié)合,第二靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與所述的關(guān)聯(lián)蛋白形成融合蛋白。

本發(fā)明中,引入轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的策略可以但不限于,策略1:核酸酶與靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成融合蛋白;或策略2:靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與所述關(guān)聯(lián)蛋白(例如MS2結(jié)合蛋白或PCP結(jié)合蛋白)形成融合蛋白,再與偶聯(lián)了RNA適配體序列(例如MS2或PP7)的ssgRNA結(jié)合;或策略3:在一個方法中同時存在上述兩種策略。

在同源重組的基因編輯方法中,引入轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的策略還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)或常規(guī)技術(shù)將轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(例如VP64或KRAB)引入所述同源重組相關(guān)蛋白(例如選自Rad51、Rad52和Brca1或其組合)啟動子區(qū)的其他可能策略,例如通過融合蛋白的表達(dá),轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)在核酸酶-ssgRNA復(fù)合體上,只要所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有能夠激活或抑制所述同源重組相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄的作用。

另外,申請人在實驗中發(fā)現(xiàn),策略1和3與策略2的結(jié)果相似,這些基因編輯方法均可以大幅度提高了哺乳細(xì)胞中同源重組發(fā)生的效率。其中,策略3相比策略1和2可以更高效激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)此原理,本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計靶向所述同源重組相關(guān)蛋白(例如選自Rad51、Rad52和Brca1或其組合)啟動子區(qū)的ssgRNA并將轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(例如)引入所述同源重組相關(guān)蛋白(例如選自Rad51、Rad52和Brca1或其組合)啟動子區(qū)的任何可能策略也屬于本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述RNA適配體為發(fā)夾結(jié)構(gòu);優(yōu)選所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)選自MS2或PP7,所述關(guān)聯(lián)蛋白選自MS2結(jié)合蛋白或PCP結(jié)合蛋白。例如本發(fā)明利用改造的sgRNA(攜帶有MS2/PP7等特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu),可被MS2結(jié)合蛋白/PCP蛋白等特異性識別),輔以靶向性轉(zhuǎn)錄激活/抑制因子(MS2/PCP-VP64/KRAB),可以激活/抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。

另一方面,本發(fā)明還提供了一種用于基因編輯的組合物,包括ssgRNA和靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,所述ssgRNA能夠引導(dǎo)核酸酶靶向基因編輯相關(guān)蛋白的編碼核酸但不會發(fā)生切割,所述靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控基因編輯相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。

其中,所述組合物還包括核酸酶、sgRNA、同源互補(bǔ)修復(fù)模板或其組合。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,本發(fā)明提供了一種用于基因編輯的組合物,包括核酸酶、核酸酶與靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成的融合蛋白、sgRNA、ssgRNA和同源互補(bǔ)修復(fù)模板,所述ssgRNA能夠引導(dǎo)核酸酶靶向基因編輯相關(guān)蛋白的編碼核酸但不會發(fā)生切割,所述靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控基因編輯相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,本發(fā)明提供了一種用于基因編輯的組合物,包括提供核酸酶、sgRNA、RNA適配體序列與ssgRNA的偶聯(lián)分子、同源互補(bǔ)修復(fù)模板、靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與RNA適配體關(guān)聯(lián)蛋白的融合蛋白,所述ssgRNA能夠引導(dǎo)核酸酶靶向基因編輯相關(guān)蛋白的編碼核酸但不會發(fā)生切割,所述靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控基因編輯相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,本發(fā)明提供了一種用于基因編輯的組合物,包括提供核酸酶與第一靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成的融合蛋白、sgRNA、RNA適配體序列與ssgRNA的偶聯(lián)分子、同源互補(bǔ)修復(fù)模板和第二靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與RNA適配體關(guān)聯(lián)蛋白的融合蛋白,所述ssgRNA能夠引導(dǎo)核酸酶靶向基因編輯相關(guān)蛋白的編碼核酸但不會發(fā)生切割,所述靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控基因編輯相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子選自靶向性轉(zhuǎn)錄激活因子或靶向性轉(zhuǎn)錄抑制因子的至少一種,優(yōu)選所述靶向性轉(zhuǎn)錄激活因子選自VP64,優(yōu)選所述靶向性轉(zhuǎn)錄抑制因子選自KRAB。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述的基因編輯相關(guān)蛋白選自非同源區(qū)末端連接相關(guān)蛋白和同源重組相關(guān)蛋白的至少一種,優(yōu)選所述非同源區(qū)末端連接相關(guān)蛋白選自LIG4,優(yōu)選所述同源重組相關(guān)蛋白選自Rad51、Rad52和Brca1或其組合。

另一方面,本發(fā)明還提供了一種RNA適配體序列與ssgRNA的偶聯(lián)分子,所述的ssgRNA部分能夠引導(dǎo)核酸酶靶向基因編輯相關(guān)蛋白的編碼核酸但不會發(fā)生切割,所述RNA適配體序列部分能夠特異性的與關(guān)聯(lián)蛋白結(jié)合;優(yōu)選所述的ssgRNA部分包括3'端的保守間隔相鄰基序,優(yōu)選所述的基序為NGG;優(yōu)選所述的ssgRNA部分為14-16bp,優(yōu)選為14bp、15bp或16bp。

在本發(fā)明的一些具體實施例中,所述RNA適配體為發(fā)夾結(jié)構(gòu);優(yōu)選所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)選自MS2或PP7,所述關(guān)聯(lián)蛋白選自MS2結(jié)合蛋白或PCP結(jié)合蛋白。

另一方面,本發(fā)明還提供了一種試劑盒,包括本發(fā)明中所述的任一種所述的組合物或任一種所述的偶聯(lián)分子。

另一方面,本發(fā)明還提供了本發(fā)明中任一種所述的基因編輯方法或任一種所述的組合物或任一種所述的偶聯(lián)分子用于基因編輯的用途。

在本發(fā)明中,所述的基因來自于微生物、植物、動物、細(xì)胞、哺乳動物或人。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明大幅度提高了哺乳細(xì)胞中同源重組發(fā)生的效率;

本發(fā)明在不導(dǎo)入外源基因的情況下提高了同源重組效率,能夠避免現(xiàn)有的提高同源重組技術(shù)例如小分子化合物等易于產(chǎn)生染色體組不穩(wěn)定性等缺點。

本發(fā)明提供了在哺乳動物中進(jìn)行準(zhǔn)確、精細(xì)基因編輯的方法。

本發(fā)明提供了可在哺乳動物里同時對多個基因進(jìn)行突變修復(fù)的方法。

附圖說明

圖1示出的是DSB介導(dǎo)的基因修飾方法的圖

圖2示出的是體系示意的圖。

a.當(dāng)ssgRNA長度為14bp時,Cas9不具備核酸酶活性。通過三種策略可以實現(xiàn)14bp ssgRNA對特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控:策略一,構(gòu)建Cas9-VP64/KRAB的融合蛋白,輔以14bp ssgRNA可以激活/抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄;策略二,使用野生型Cas9,在ssgRNA序列中添加MS2/PCP等RNA適配體序列,再輔以MS2/PCP-VP64/KRAB融合蛋白,可以激活/抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄;策略三,構(gòu)建Cas9-VP64/KRAB的融合蛋白,在ssgRNA序列中添加MS2/PCP等RNA適配體序列,再輔以MS2/PCP-VP64/KRAB融合蛋白,可以更高效的激活/抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)此原理,設(shè)計靶向LIG4/RAD51/RAD52/BRCA1的ssgRNA,可以調(diào)控系列基因的表達(dá)。

b.在具體實施中,本發(fā)明的方法被應(yīng)用到GFP報告基因的修復(fù)(詳見實驗流程),外源的GFP表達(dá)載體中GFP編碼區(qū)存在終止密碼子而無法翻譯生成綠色熒光蛋白。只有精確的定點修復(fù),才有可能實現(xiàn)預(yù)期的GFP表達(dá),而通過流式細(xì)胞分選檢測GFP陽性細(xì)胞的比例,可以定量定點修復(fù)的效率。本方法還被應(yīng)用到U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中內(nèi)源TP53基因突變的修復(fù),通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)、提取細(xì)胞基因組和PCR測序的方式,可以對基因突變定點修復(fù)的效率進(jìn)行檢測(詳見實驗流程)。

圖3示出的是敲入載體構(gòu)建的圖

圖4示出的是基因編輯效率比較的圖

圖5示出的是BFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中基因突變修復(fù)效率比較

圖6示出的是內(nèi)源TP53基因突變修復(fù)效率比較

具體實施方式

下面通過具體實施方式及實驗數(shù)據(jù)對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。盡管為了清楚的目的,在下文中使用了專用術(shù)語,但這些術(shù)語并不意味著定義或限制本發(fā)明的范圍。

在本發(fā)明中,術(shù)語“靶位點”即在目標(biāo)基因組中任何一段欲加以改造或修復(fù)的DNA序列。靶位點附近的DNA序列,允許外源序列在靶位點處的整合,包括但不限于基因敲入(knock-in)。在具體實施方式中,目標(biāo)DNA序列是雙鏈的DNA序列,包括,但不限于,細(xì)胞的染色體基因組中的DNA序列、細(xì)胞染色體基因組外的DNA序列(例如線粒體基因組)、質(zhì)粒、病毒等的DNA序列。

在本發(fā)明中,術(shù)語“定點重組”是指,將外源序列通過非隨機(jī)的方式整合到特定的靶位點處,包括整合到某特定靶位點的5’上游、3’下游或者靶位點之間。

在本發(fā)明中,術(shù)語“外源DNA序列”是指,期望被定點重組到靶位點處的DNA序列。外源DNA序列可以是靶位點處不存在或被改變的序列。

在本發(fā)明中,“sgRNA”是指向?qū)NA,可引導(dǎo)核酸酶靶向目標(biāo)基因進(jìn)行切割;所述sgRNA可以包括3'端的保守間隔相鄰基序,例如基序為NGG;所述sgRNA的長度可以為18-23bp之間。

在本發(fā)明中,“ssgRNA”是指長度為14-16bp的向?qū)NA,在ssgRNA的引導(dǎo)下,Cas9可以識別并結(jié)合靶位點,但卻無法切割靶位點。

在本發(fā)明中,“適配體”、“適體”、“結(jié)合適體(aptamer)”具有相同含義,是指是經(jīng)過一種體外篩選技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的能特異結(jié)合蛋白或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸,也可以是RNA,也可以是DNA,長度一般為25~60個核苷酸。

具體實施例

實施例1GFP報告基因改造,恢復(fù)GFP綠色熒光蛋白的表達(dá)

1)改造ssgRNA,獲得帶有特定RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ssgRNA

在ssgRNA(SpCas9和SaCas9)的特定位點接入獨特的RNA發(fā)夾如MS2/PP7,這類發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被MS2結(jié)合蛋白/PCP蛋白所特異性識別。

有PP7發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ssgRNA全序列為:

ccggtgagaccgagagagggtctcagttttagagctagcgagggagcagacgatatggcgtcgctccctcgttagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgcgagggagcagacgatatggcgtcgctccctcgtaagtggcaccgagtcggtgctttttgaattc

帶有MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ssgRNA全序列為:

ccggtgagaccgagagagggtctcagttttagagctaggccaacatgaggatcacccatgtctgcagggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccaacatgaggatcacccatgtctgcagggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttt

以上ssgRNA全序列均在南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2)GFP基因靶位點處潛在的Cas9識別位點分析

本實驗中,GFP報告基因改造的目標(biāo)是替換終止密碼子,恢復(fù)GFP綠色熒光蛋白的表達(dá)。對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因的操作是在GFP編碼區(qū)終止密碼子附近引入DNA雙鏈斷裂(DSBs),之后通過同源修復(fù)模板加以修復(fù)。因此首先必須于靶位點區(qū)即GFP編碼區(qū)終止密碼子附近確定整合位點。在本發(fā)明方案中,即選定Cas9識別位點,整合位點可選在識別位點中間,以達(dá)到破壞識別位點,保證整合序列不被繼續(xù)切割。

如上所言,在特定DNA序列上有效產(chǎn)生DSBs可以有多種策略,包括基因工程改造過的I-sceI、I-AniI、FoxI、Cas9以及一些合成多核苷酸,如LNA、PNA等。本實驗采用spCas9和SaCas9,與配套的改造過的ssgRNAs聯(lián)用。根據(jù)序列分析,發(fā)現(xiàn)GFP編碼區(qū)終止密碼子附近有潛在的spCas9識別位點(序列如下):

GFP終止密碼子(ATG)附近序列圖,標(biāo)注識別位點

ATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCtagGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGC

小寫字母tag為終止密碼子

斜體字母區(qū)域為spCas9識別位點,劃橫線區(qū)域“agG”為PAM序列

3)設(shè)計同源互補(bǔ)修復(fù)模板(donor DNA template)

同源互補(bǔ)修復(fù)模板設(shè)計如圖3,在ssgRNA靶位點的上下游各有100-200bp的同源序列(上下游同源臂)。在整合位點處刪除終止密碼子序列。整體連入T載體經(jīng)過擴(kuò)增提取質(zhì)粒成為外源供體。

外源供體構(gòu)建體:

100bp上游同源重組臂—100bp下游同源重組臂

具體序列為:

gacgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgtttttgagctcccaacgcg

4)構(gòu)建MS2/PCP-VP64/KRAB融合蛋白表達(dá)載體

為將轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子準(zhǔn)確定位至DSBs修復(fù)相關(guān)的基因位點,須在ssgRNA中連入特定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)如MS2或PP7,之后構(gòu)建MS2/PCP與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如VP64或KRAB的融合蛋白表達(dá)載體,此處MS2蛋白可識別ssgRNA中的MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu),PCP則可以識別PP7發(fā)夾結(jié)構(gòu)。為此構(gòu)建MS2/PCP-VP64/KRAB融合蛋白表達(dá)載體,將MS2/PCP的編碼序列分別與VP64和KRAB融合,連接在帶有EF1alpha啟動子的表達(dá)載體中,保證讀碼框一致可讀通。

5)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系確定DNA模板的修復(fù)效率

實驗組采用帶有終止密碼子突變的GFP表達(dá)載體,spCas9表達(dá)載體,GFP特異性的sgRNA(20bp),帶有MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)靶向LIG4/RAD52/RAD51/BRCA1的ssgRNA(14bp)、MS2-KRAB(對應(yīng)LIG4)/VP64(對應(yīng)RAD52/RAD51/BRCA1)融合蛋白通過Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)293細(xì)胞系,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后,通過流式細(xì)胞分選(flow cytometry)檢測GFP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

對照組中同樣采用相同量的帶有終止密碼子突變的GFP表達(dá)載體,spCas9表達(dá)載體,GFP特異性的sgRNA(20bp),帶有MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)無靶向的ssgRNA、MS2-KRAB(對應(yīng)LIG4)/VP64(對應(yīng)RAD52/RAD51/BRCA1)融合蛋白通過Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)293細(xì)胞系,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后,通過流式細(xì)胞分選(flow cytometry)檢測GFP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例(圖4)

我們利用點突變的BFP構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,通過BFP點突變的修復(fù)可產(chǎn)生GFP綠色熒光蛋白對修復(fù)的效率做定量的統(tǒng)計。我們發(fā)現(xiàn)抑制NHEJ通路Lig4可以顯著提高同源重組修復(fù)的效率(圖5左)。而促進(jìn)同源重組修復(fù)的通路組分Rad51/52也可顯著促進(jìn)同源重組修復(fù)的效率(圖5右)。提示如將抑制Lig4表達(dá)與促進(jìn)Rad51/52表達(dá)聯(lián)合使用則可以進(jìn)一步提升基因突變同源重組修復(fù)效率。

實施例2人TP53基因點突變修復(fù)的實驗設(shè)計

1)選用U-251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,測序結(jié)果顯示該細(xì)胞系的TP53基因攜帶有R273H(CGT->CAT)純合點突變。為修復(fù)該點突變,在該位點附近設(shè)計特異性靶向TP53基因的sgRNA(SaCas9)(圖6)。

其具體序列:

agagaccggcgcacagaggaa

PAM:gagaat

2)設(shè)計修復(fù)模板:模板選用DNA單寡核苷酸鏈,序列為actgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggcgtgataggcgaacggaagaggaaaacctccgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggag。TP53的sgRNA識別位點處引入同義突變以避免修復(fù)后的位點被SaCas9繼續(xù)切割而引入插入/缺失突變。

3)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞系驗證突變修復(fù)效率:實驗組中轉(zhuǎn)入攜帶有TP53特異性靶向sgRNA的SaCas9表達(dá)載體、同源修復(fù)模板、puromycin篩選質(zhì)粒和修復(fù)因子表達(dá)載體(帶有MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)靶向LIG4/RAD52/RAD51/BRCA1的ssgRNA(14bp)、MS2-KRAB(對應(yīng)LIG4)/VP64(對應(yīng)RAD52/RAD51/BRCA1)融合蛋白),對照組中轉(zhuǎn)入攜帶有TP53特異性靶向sgRNA的SaCas9表達(dá)載體、同源修復(fù)模板、puromycin篩選質(zhì)粒和對照載體。通過PEI共轉(zhuǎn)U-251細(xì)胞系,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后,加入2ug/ml的puromycin繼續(xù)培養(yǎng)48小時,提取細(xì)胞基因組,采用TP53特異性引物通過PCR實驗擴(kuò)增修復(fù)區(qū)域,送測序分析修復(fù)效果(圖6,因子1:Rad51+MS2-VP64;因子2:Rad52+MS2-VP64;因子3:Brca1+MS2-VP64;因子4:LIG4+MS2-KRAB)。

4)實驗結(jié)果分析

通過對外源GFP突變基因的修復(fù)系統(tǒng)測試,我們發(fā)現(xiàn)Rad52重組酶可有效的提高同源重組效率至50%以上(參見圖4),此結(jié)果將大大增加基因突變的修復(fù)效率,此研究內(nèi)容及思路尚無任何國際研究論文發(fā)表,屬國際首創(chuàng)的發(fā)現(xiàn)。

在第二部分對內(nèi)源癌基因的突變修復(fù)實驗中,我們進(jìn)一步驗證,Rad52可有效促進(jìn)TP53基因突變的修復(fù),此修復(fù)測試實驗尚未用流式細(xì)胞分選陽性細(xì)胞,即用PCR測序的方法得到了非常均一的突變修復(fù)測序峰圖,說明修復(fù)效率很高,可達(dá)到體內(nèi)修復(fù)突變癌基因以及其他在體基因突變修復(fù)及基因編輯的要求。

以上,基于本發(fā)明的實施方式進(jìn)行了說明,但本發(fā)明不限定于此,本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白,在本發(fā)明的主旨的范圍內(nèi)能夠以進(jìn)行變形和變更的方式實施,這樣的變形和變更的方式,理應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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