本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥遺傳基因轉(zhuǎn)化的方法。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)呛瘫究?Gramineae)小麥屬(Triticum) -年生或多年生草本植物，是世界上重要的糧食作物之一。利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良，以提高小麥產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗病蟲(chóng)和抗逆能力，是小麥遺傳育種的一個(gè)新的方向。

自1983年獲得第一株轉(zhuǎn)基因作物以來(lái)，作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物育種已成為常規(guī)育種的有效補(bǔ)充。目前，幾乎所有的作物都開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因研究，育種目標(biāo)涉及到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、兼抗性及多用途等諸多方面，一批抗逆性（如抗病、抗蟲(chóng)、抗除草劑）轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段。由于受到轉(zhuǎn)基因技術(shù)的限制，小麥轉(zhuǎn)基因研究滯后于其它作物，直到1992年Vasil等將GUSlBar基因?qū)胄←溒贩NPavon，并獲得了抗除草劑Basta的再生植株，才宣告世界上首例轉(zhuǎn)基因小麥問(wèn)世。在國(guó)內(nèi)，小麥遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展也很迅速，Cheng等在1997年成功獲得可育的轉(zhuǎn)基因植株，1999年Xia等在中國(guó)首次報(bào)道獲得了穩(wěn)定胚性組織的轉(zhuǎn)基因小麥植株。實(shí)驗(yàn)的成功，表明小麥育種已經(jīng)從傳統(tǒng)的育種方法過(guò)度到了“分子育種”的階段。

近年來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥的研究發(fā)展很快，并取得了一定的成就，但與雙子葉植物相比，甚至與其他禾谷類作物（如水稻和玉米）相比，仍然存在較大的差距(肖興國(guó)等，2000)。目前，小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍處于建立和優(yōu)化階段。這主要是由以下幾個(gè)方面的原因造成的：第一、缺乏有效的離體再生體系。小麥組織培養(yǎng)中植株再生率低和基因型依賴性強(qiáng)的問(wèn)題一直是限制轉(zhuǎn)基因成功及大幅度提高轉(zhuǎn)基因小麥數(shù)量的主要因素；第二、用于基因轉(zhuǎn)化的外植體材料比較少。幼胚是進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要外植體，但往往受到取材季節(jié)的限制；第三、過(guò)分依賴基因槍法。目前轉(zhuǎn)基因小麥90%以上是用基因槍法獲得的，而基因槍法則存在許多缺點(diǎn)，限制了小麥轉(zhuǎn)基因的發(fā)展；第四、對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物特別是轉(zhuǎn)化小麥的機(jī)理缺乏系統(tǒng)和深入的研究；第五、小麥本身是異源六倍體，其基因組較大并且復(fù)雜，導(dǎo)入的外源基因沉默與修飾現(xiàn)象很嚴(yán)重。

盡管以上許多因素延緩了小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，但是隨著多種轉(zhuǎn)基因體系的建立，小麥轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展速度將會(huì)加快。研究方向?qū)?huì)由以基因槍法為主而逐漸轉(zhuǎn)向以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主，同時(shí)各種輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的技術(shù)也將走向成熟，這將有助于優(yōu)化和完善農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種小麥遺傳基因轉(zhuǎn)化的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供一種小麥遺傳基因轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于：小麥遺傳轉(zhuǎn)化的方法包括基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：

(1)基因槍法：基因槍轉(zhuǎn)化是將外源基因在Ca2+或亞精胺等作用下吸附在重金屬金或鎢粒子表面（直徑l u m左右），制成DNA微彈，利用基因槍將微彈高速射入植物受體細(xì)胞，釋放出的DNA分子隨機(jī)整合到植物基因組中，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，從而實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。

現(xiàn)在基因槍法的轉(zhuǎn)化體系已相對(duì)比較成熟，早在1995年就提出了完整的轉(zhuǎn)化體系。因此由基因槍介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化作為改良小麥性狀、提高小麥抗性的主要手段之一被廣為應(yīng)用。在國(guó)內(nèi)，張曉東等人用基因槍法將除草劑抗性基因與小麥lDx5和lDyl0亞基克隆重組質(zhì)粒導(dǎo)入到小麥幼胚和幼穗中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。梁靜靜等利用基因槍法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-Sub5+10導(dǎo)入小麥幼胚，獲得了經(jīng)PCR檢測(cè)證明的轉(zhuǎn)基因植株，Rooke等獲得了lDx5亞基超量表達(dá)的小麥品系（約為自然表達(dá)量的4倍）。

影響基因槍介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，比如：受體材料的類型、生理狀態(tài)、接受和整合外源DNA的能力、金粒制備和轟擊參數(shù)（如微彈速度、射程、金粉用量、轟擊次數(shù)、真空度、質(zhì)粒DNA用量）等。雖然不同材料有所差異，但轟擊時(shí)的金粒用量應(yīng)該在細(xì)胞承受損傷的范圍之內(nèi)，并且保證達(dá)到有效轟擊。另有些研究表明，受體材料轟擊前的預(yù)培養(yǎng)也可以提高基因槍轉(zhuǎn)化效率。

在進(jìn)行基因槍轟擊后，小麥幼胚能否長(zhǎng)出胚性愈傷組織是轉(zhuǎn)基因小麥成苗的關(guān)鍵因素之一。因?yàn)樾←溣着咴诮?jīng)過(guò)基因槍轟擊后，組織會(huì)受到一定損傷，再生能力會(huì)大大下降，隨著基因型的不同，小麥自身的修復(fù)和抵御傷害的能力也有所不同。所以，選擇良好基因型的小麥幼胚作為轟擊對(duì)象是進(jìn)行基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件。只有具有優(yōu)良基因型的轉(zhuǎn)基因小麥品種才具有廣闊的研究?jī)r(jià)值和生產(chǎn)價(jià)值。同時(shí)金粒制備質(zhì)量的好壞也直接影響到小麥幼胚在轟擊后的成活及轉(zhuǎn)化率。經(jīng)過(guò)充分混勻金粒懸浮液可以減少幼胚損傷和提高轉(zhuǎn)化頻率，而且研究發(fā)現(xiàn)對(duì)子彈渦旋振蕩后再進(jìn)行超聲波振蕩的效果會(huì)更好。利用甘露醇進(jìn)行滲透處理可以增強(qiáng)瞬間表達(dá)效果，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化頻率及提高植株再生率。但不同受體基因型要求的處理的時(shí)間與濃度也不盡相同。

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法：農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤病原菌，主要有根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaterium thizogenis)。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌核外的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，大約長(zhǎng)200kb，包括毒性區(qū)(Vir區(qū))、接合轉(zhuǎn)移區(qū)(Con區(qū))、復(fù)制起始區(qū)(Ori區(qū))和T-DNA區(qū)四部分。其中一半左右的序列參與質(zhì)粒復(fù)制，冠瘦堿代謝和接合功能，對(duì)致瘤不起作用。另外一半序列包括T-DNA區(qū)和毒性區(qū)(Vir region)，T-DNA長(zhǎng)約23kb左右，其兩端邊界處各有一個(gè)25bp的正向重復(fù)序列，在不同農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上高度保守，在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA和Vir能侵染植物的受傷部位T-DNA和Vir能侵染植物的受傷部位，導(dǎo)致受傷部位長(zhǎng)瘤或長(zhǎng)根。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是通過(guò)將其體內(nèi)的一段T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的植物細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。農(nóng)桿菌附著到植物傷口組織上后，通過(guò)二者間的相互作用，農(nóng)桿菌可形成纖維素小纖絲將其固定在植物細(xì)胞壁上，同時(shí)誘導(dǎo)受傷的植物組織釋放一些酚類化合物，如乙酰丁香酮(AS)，羥基乙酰丁香酮(AS-OH)等，這些酚類化合物就作為信號(hào)分子，從而激活其它Vir基因的轉(zhuǎn)錄，并激活根癌帶有目的基因片段的T-DNA插入愈傷組織的染色體中。由于農(nóng)桿菌侵染植物是一個(gè)互相作用的過(guò)程，在對(duì)農(nóng)桿菌感染植物過(guò)程本身因子的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控有一定認(rèn)識(shí)的時(shí)候，一些研究也注意了被感染植物細(xì)胞中有關(guān)的分子過(guò)程。發(fā)現(xiàn)了與T-DNA轉(zhuǎn)入、Vir區(qū)激活有關(guān)的植物蛋白分子，如VirCl促進(jìn)VirD2的酶解作用；邊界特異性內(nèi)切酶T-鏈的核定位；T-DNA轉(zhuǎn)移引導(dǎo)蛋白保護(hù)T-鏈免遭外切酶攻擊等。

本發(fā)明的有益效果為：結(jié)果表明，基因型是影響小麥外植體愈傷組織形成和分化再生的重要因素；接種菌液濃度及侵染時(shí)間、共培養(yǎng)條件等因素，對(duì)小麥外植體愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率有較大影響；獲得的轉(zhuǎn)基因小麥再生植株，為小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究及轉(zhuǎn)基因后代的遺傳分析奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例小麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法：

(1)基因槍法

基因槍轉(zhuǎn)化是將外源基因在Ca2+或亞精胺等作用下吸附在重金屬金或鎢粒子表面（直徑l u m左右），制成DNA微彈，利用基因槍將微彈高速射入植物受體細(xì)胞，釋放出的DNA分子隨機(jī)整合到植物基因組中，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，從而實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。

現(xiàn)在基因槍法的轉(zhuǎn)化體系已相對(duì)比較成熟，早在1995年就提出了完整的轉(zhuǎn)化體系。因此由基因槍介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化作為改良小麥性狀、提高小麥抗性的主要手段之一被廣為應(yīng)用。在國(guó)內(nèi)，張曉東等人用基因槍法將除草劑抗性基因與小麥lDx5和lDyl0亞基克隆重組質(zhì)粒導(dǎo)入到小麥幼胚和幼穗中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。梁靜靜等利用基因槍法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-Sub5+10導(dǎo)入小麥幼胚，獲得了經(jīng)PCR檢測(cè)證明的轉(zhuǎn)基因植株，Rooke等獲得了lDx5亞基超量表達(dá)的小麥品系（約為自然表達(dá)量的4倍）。

影響基因槍介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素有很多，比如：受體材料的類型、生理狀態(tài)、接受和整合外源DNA的能力、金粒制備和轟擊參數(shù)（如微彈速度、射程、金粉用量、轟擊次數(shù)、真空度、質(zhì)粒DNA用量）等。雖然不同材料有所差異，但轟擊時(shí)的金粒用量應(yīng)該在細(xì)胞承受損傷的范圍之內(nèi)，并且保證達(dá)到有效轟擊。另有些研究表明，受體材料轟擊前的預(yù)培養(yǎng)也可以提高基因槍轉(zhuǎn)化效率。

在進(jìn)行基因槍轟擊后，小麥幼胚能否長(zhǎng)出胚性愈傷組織是轉(zhuǎn)基因小麥成苗的關(guān)鍵因素之一。因?yàn)樾←溣着咴诮?jīng)過(guò)基因槍轟擊后，組織會(huì)受到一定損傷，再生能力會(huì)大大下降，隨著基因型的不同，小麥自身的修復(fù)和抵御傷害的能力也有所不同。所以，選擇良好基因型的小麥幼胚作為轟擊對(duì)象是進(jìn)行基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件。只有具有優(yōu)良基因型的轉(zhuǎn)基因小麥品種才具有廣闊的研究?jī)r(jià)值和生產(chǎn)價(jià)值。同時(shí)金粒制備質(zhì)量的好壞也直接影響到小麥幼胚在轟擊后的成活及轉(zhuǎn)化率。經(jīng)過(guò)充分混勻金粒懸浮液可以減少幼胚損傷和提高轉(zhuǎn)化頻率，而且研究發(fā)現(xiàn)對(duì)子彈渦旋振蕩后再進(jìn)行超聲波振蕩的效果會(huì)更好。利用甘露醇進(jìn)行滲透處理可以增強(qiáng)瞬間表達(dá)效果，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化頻率及提高植株再生率。但不同受體基因型要求的處理的時(shí)間與濃度也不盡相同。

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法:

農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤病原菌，主要有根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaterium thizogenis)。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌核外的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，大約長(zhǎng)200kb，包括毒性區(qū)(Vir區(qū))、接合轉(zhuǎn)移區(qū)(Con區(qū))、復(fù)制起始區(qū)(Ori區(qū))和T-DNA區(qū)四部分。其中一半左右的序列參與質(zhì)粒復(fù)制，冠瘦堿代謝和接合功能，對(duì)致瘤不起作用。另外一半序列包括T-DNA區(qū)和毒性區(qū)(Vir region)，T-DNA長(zhǎng)約23kb左右，其兩端邊界處各有一個(gè)25bp的正向重復(fù)序列，在不同農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上高度保守，在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA和Vir能侵染植物的受傷部位T-DNA和Vir能侵染植物的受傷部位，導(dǎo)致受傷部位長(zhǎng)瘤或長(zhǎng)根。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是通過(guò)將其體內(nèi)的一段T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的植物細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。農(nóng)桿菌附著到植物傷口組織上后，通過(guò)二者間的相互作用，農(nóng)桿菌可形成纖維素小纖絲將其固定在植物細(xì)胞壁上，同時(shí)誘導(dǎo)受傷的植物組織釋放一些酚類化合物，如乙酰丁香酮(AS)，羥基乙酰丁香酮(AS-OH)等，這些酚類化合物就作為信號(hào)分子，從而激活其它Vir基因的轉(zhuǎn)錄，并激活根癌帶有目的基因片段的T-DNA插入愈傷組織的染色體中。由于農(nóng)桿菌侵染植物是一個(gè)互相作用的過(guò)程，在對(duì)農(nóng)桿菌感染植物過(guò)程本身因子的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控有一定認(rèn)識(shí)的時(shí)候，一些研究也注意了被感染植物細(xì)胞中有關(guān)的分子過(guò)程。發(fā)現(xiàn)了與T-DNA轉(zhuǎn)入、Vir區(qū)激活有關(guān)的植物蛋白分子，如VirCl促進(jìn)VirD2的酶解作用；邊界特異性內(nèi)切酶T-鏈的核定位；T-DNA轉(zhuǎn)移引導(dǎo)蛋白保護(hù)T-鏈免遭外切酶攻擊等。

結(jié)果表明，基因型是影響小麥外植體愈傷組織形成和分化再生的重要因素；接種菌液濃度及侵染時(shí)間、共培養(yǎng)條件等因素，對(duì)小麥外植體愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率有較大影響；獲得的轉(zhuǎn)基因小麥再生植株，為小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究及轉(zhuǎn)基因后代的遺傳分析奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

利用本發(fā)明所述的技術(shù)方案，或本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案的啟發(fā)下，設(shè)計(jì)出類似的技術(shù)方案，而達(dá)到上述技術(shù)效果的，均是落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。