本發(fā)明屬于植物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種負(fù)調(diào)控植物對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中遭受著各種各樣的植食性昆蟲(chóng)的威脅，所以植物需要一套非常復(fù)雜的防御體系來(lái)抵抗這些昆蟲(chóng)的侵害。植物的自身免疫被激活時(shí)，會(huì)啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)，激發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)和基因的表達(dá)，先天免疫反應(yīng)包括細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體激發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)和植物?；缘目剐缘鞍?R蛋白)識(shí)別受體，分泌效應(yīng)蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI)。植物的免疫反應(yīng)被激發(fā)后，包括茉莉酸(JA)，水楊酸(SA)，H2O2等在植物體內(nèi)編織起一個(gè)復(fù)雜的防御信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。除此之外，植物還擁有組成型防御體系，包括植物表面的蠟質(zhì)、角質(zhì)層、木質(zhì)素等物理屏障。而構(gòu)成這些防御網(wǎng)絡(luò)的基本單元是植物中的基因，過(guò)表達(dá)或敲除某個(gè)基因可能會(huì)影響到其中的一些防御通路，從而顯示出對(duì)昆蟲(chóng)抗性的增強(qiáng)或減弱。而在植物的功能基因組研究中，突變體對(duì)基因功能的闡釋具有重要的作用，同樣，突變體庫(kù)也適用于研究植物對(duì)昆蟲(chóng)抗性方面的功能。目前，植物如禾本科植物對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)抗性分子機(jī)制的研究還處于初級(jí)階段，發(fā)掘飛虱科昆蟲(chóng)抗性相關(guān)的基因，增強(qiáng)對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)抗性分子機(jī)制的了解，將有助于田間對(duì)于飛虱科昆蟲(chóng)的防治。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種負(fù)調(diào)控植物對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性的基因及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種提高植物抗蟲(chóng)性、降低植物株高、增加 植物分蘗或提高植物產(chǎn)量的方法，所述方法包括：下調(diào)植物體內(nèi)TOM64多肽的表達(dá)或活性；所述的植物的基因組中具有TOM64基因。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的下調(diào)植物體內(nèi)TOM64多肽的表達(dá)或活性的方法包括：在植物的基因組中敲除或沉默TOM64基因；或?qū)⑾抡{(diào)TOM64基因轉(zhuǎn)錄、多肽表達(dá)或多肽活性的下調(diào)劑轉(zhuǎn)入植物中。在另一優(yōu)選例中，所述的敲除或沉默TOM64基因是將外源片段插入在TOM64基因的第9個(gè)外顯子中。在另一優(yōu)選例中，所述的下調(diào)劑是特異性干擾TOM64基因表達(dá)的干擾分子。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是TOM64基因或其轉(zhuǎn)錄本為抑制或沉默靶標(biāo)的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，或能表達(dá)或形成所述dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA的構(gòu)建物。在另一優(yōu)選例中，所述的提高植物抗蟲(chóng)性是提高植物對(duì)于飛虱科昆蟲(chóng)的抗性。在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括：禾本科植物。在另一優(yōu)選例中，所述的TOM64多肽選自下組：(a)如SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白；(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)(如1-30個(gè)；較佳地1-20個(gè)；更佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)與(a)限定的蛋白序列有70％(較佳地80％；更佳地90％；更佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的TOM64的編碼基因包含如下序列：SEQIDNO:1。在本發(fā)明的另一方面，提供一種降低TOM64基因表達(dá)或活性的物質(zhì)的用途，用于提高植物的抗蟲(chóng)性，或用于降低植物株高，或用于增加植物分蘗，或用于提高植物產(chǎn)量，或用于提高植物組織中H2O2的含量；所述的植物的基因組中具有TOM64基因。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的降低TOM64基因表達(dá)或活性的物質(zhì)是特異性干 擾TOM64基因表達(dá)的干擾分子；較佳地，所述的干擾分子是TOM64基因或其轉(zhuǎn)錄本為抑制或沉默靶標(biāo)的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，或能表達(dá)或形成所述dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA的構(gòu)建物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。附圖說(shuō)明圖1、TAIL-PCR分離旁鄰序列示意圖。圖2、抗蟲(chóng)突變體T35的插入位點(diǎn)及抗BPH單株鑒定。(A).突變體T35的T-DNA插入位點(diǎn)；(B).WT和T35苗期單株抗BPH鑒定(n＝8，圖為代表性植株)；(C).熒光定量PCR檢測(cè)T35中突變基因的表達(dá)，材料取自分蘗期葉鞘，數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD(n＝3)，t檢驗(yàn)顯示顯著性差異(**P<0.01,與野生型相比)；(D).WT和T35分蘗期單株抗BPH鑒定(n＝8，圖為代表性植株)；(E).水稻抗BPH分蘗期單株鑒定莖部危害情況(n＝8，標(biāo)尺＝1.5cm)。圖3、TOM64多肽的結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白進(jìn)化樹(shù)分析。(A).TOM64多肽的結(jié)構(gòu)；(B).不同植物中部分TOC64及TOM64的進(jìn)化樹(shù)分析。os-Oryzasativa(水稻)，ob-Oryzabrachyantha(短藥野生稻)，bd-Brachypodiumdistachyon(二穗短柄草)，zm-Zeamays(玉米)，si-Setariaitalica(谷子)，at-Arabidopsisthaliana(擬南芥)，ps-Pisumsativum(豌豆)，mt-Medicagotruncatula(苜蓿)。圖4、tom64突變體的互補(bǔ)驗(yàn)證。(A).PCR鑒定互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株。(B).互補(bǔ)植株抗褐飛虱鑒定(n＝3)。圖5、水稻對(duì)褐飛虱的選擇性(A)及產(chǎn)卵量(B)測(cè)定。數(shù)據(jù)為平均數(shù)(n＝3)，且用t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性差異，與野生型相比都無(wú)顯著性差異。圖6、水稻對(duì)BPH的取食(A)、生長(zhǎng)(B)和存活率(C)測(cè)定。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD(A，n＝5；B和C，n＝3)，t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性差異(**P<0.01，對(duì)比WT)。(C)中突變體在各時(shí)間點(diǎn)于野生型無(wú)顯著性差異。圖7、水稻對(duì)BPH的耐害性測(cè)定。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD(n＝3)，t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性差異(**P<0.01，對(duì)比WT)。圖8、TOM64多肽的亞細(xì)胞定位。圖9、水稻組織H2O2含量的測(cè)定。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD(n＝3)，t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性差異(**P<0.01，對(duì)比WT)。圖10、水稻抗BPH的抗性評(píng)價(jià)，數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD(n＝10)，ANOVA顯著性差異分析，不同的字母代表差異顯著(P<0.05)。圖11、TOM64基因敲除后純系對(duì)水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD(n＝3)，t檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性差異(**P<0.01，對(duì)比WT)。(A)表明TOM64基因被敲除后水稻分蘗提前；(B)表明TOM64基因被敲除后造成水稻變矮；(C)是純系水稻與野生型相比，有效分蘗率沒(méi)有明顯差異；(D)表明TOM64基因被敲除后會(huì)水稻的分蘗數(shù)量顯著增多。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，發(fā)現(xiàn)線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白64(TOM64，TransloconattheOuterenvelopemembraneofMitochondriaprotein64)與植物對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性密切相關(guān)，下調(diào)該基因可賦予植物對(duì)于飛虱科昆蟲(chóng)的抗性。因此，TOM64基因或調(diào)節(jié)TOM64基因的物質(zhì)和方法可應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)植物品種的改良。如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：十字花科植物、禾本科植 物。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科鼠耳芥屬如擬南芥，禾本科稻屬植物如水稻，禾本科小麥屬植物如小麥，禾本科玉米屬植物如玉米等。如本文所用，所述的“飛虱科昆蟲(chóng)”包括但不限于：褐飛虱(Brownplanthopper，BPH)，白背飛虱(whitebackplanthopper,WBPH)及灰飛虱(smallbrownplanthopper,SBPH)。在本發(fā)明中，“TOM64多肽(蛋白)”指具有SEQIDNO:2序列的多肽，還包括具有與TOM64多肽相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。任何與所述的TOM64多肽同源性高(比如與SEQIDNO:2所示的序列的同源性為70％或更高；優(yōu)選的，同源性為80％或更高；更優(yōu)選的，同源性為90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有TOM64多肽相同功能的蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。來(lái)源于水稻以外其它物種的與SEQIDNO:2所示的序列的同源性較高的TOM64多肽也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明TOM64多肽或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的TOM64基因優(yōu)選獲自禾本科植物如水稻，但是獲 自其它植物的與水稻TOM64基因高度同源(如具有70％以上，如80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。本發(fā)明涉及的TOM64基因在理論研究和植物改良中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這個(gè)序列可以被應(yīng)用于特定植物如水稻的抗蟲(chóng)性研究；并且，其還與調(diào)控植物的分蘗、株高、產(chǎn)量性狀相關(guān)。本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調(diào)節(jié)所述植物中TOM64多肽的表達(dá)。一方面，本發(fā)明還提供了一種提高植物抗蟲(chóng)性、降低植物株高、增加植物分蘗、提高植物產(chǎn)量的方法，所述的方法包括：降低所述植物中TOM64多肽的表達(dá)(包括使TOM64多肽不表達(dá)或低表達(dá))或活性。在得知了所述的TOM64多肽的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)調(diào)節(jié)所述的TOM64多肽的表達(dá)。比如可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來(lái)降低TOM64多肽的表達(dá)或使之缺失表達(dá)，比如將攜帶反義TOM64基因的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，使得細(xì)胞或植物組織不表達(dá)或降低表達(dá)TOM64多肽。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，提供了一種降低植物中TOM64多肽的表達(dá)的方法，所述的方法包括：(1)將干擾TOM64基因表達(dá)的干擾分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。較佳地，所述方法還包括：(iii)選擇出轉(zhuǎn)入了所述載體的植物細(xì)胞、組織或器官；和(iv)將步驟(iii)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植物。作為本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，提供了一種降低植物中TOM64多肽的表達(dá)的方法，所述的方法包括：在植物的基因組中敲除或沉默TOM64基因。例如，所述的敲除或沉默TOM64基因可以是將外源片段插入在TOM64基因的外顯子中。其它抑制TOM64基因或其同源基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域周知的。在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明人通過(guò)大規(guī)模突變體庫(kù)的抗褐飛虱篩選，最終獲得了抗性株系，進(jìn)而鑒定分離了其突變基因，并對(duì)其中的一個(gè)抗蟲(chóng)突變體及其相關(guān)基因的功能進(jìn)行了研究驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)田間及室內(nèi)鑒定，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一株水稻基因缺失突變體T35高抗褐飛虱。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，該突變體編碼TOM64基因。TOM64基因的沉默是由于T-DNA插入到該基因的第9個(gè)外顯子部位，造成轉(zhuǎn)錄終止，從而導(dǎo)致該基因的沉默?？瓜x(chóng)機(jī)理分析表明，該基因的突變主要是提高了水稻對(duì)褐飛虱的耐受性。當(dāng)將突變基因進(jìn)行回復(fù)后，互補(bǔ)株系則失去了對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性，進(jìn)一步證明，只有當(dāng)該基因的表達(dá)被沉默后可以提高水稻對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該基因定位于線粒體，提高了水稻組織中的H2O2含量，從而提高了水稻對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性。TOM64突變體對(duì)褐飛虱的抗性可以從原有的高感水平(7-9級(jí))，提高到中抗水平(3-5級(jí))。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。I.材料與方法1、植物材料的種植培養(yǎng)田間高通量抗蟲(chóng)篩選所用水稻(Oryzasativa)抗蟲(chóng)品種RHT(RathuHeenati)或IR56，感蟲(chóng)品種TN1(TaichungNative1)；T-DNA插入突變體庫(kù)的野生型為中花11(ZH11)，突變體由中科院上海生命科學(xué)研究院植物分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。田間植物材料種植于在上海松江五厙農(nóng)場(chǎng)，所有突變體材料種植于專門供試轉(zhuǎn)基因植物材料的圍墻內(nèi)。2、所用質(zhì)粒pCAMBIA2300：購(gòu)自Cambia公司，其菌株抗性和植株抗性均為Kmr，用于構(gòu)建突變體的互補(bǔ)(回復(fù))載體。PA7-GFP：購(gòu)自Promega公司，用于構(gòu)建融合載體，研究基因的亞細(xì)胞定位。3、田間及室內(nèi)抗蟲(chóng)鑒定提前一周整理好足夠多的田間土地，分壟，每壟寬1.2m，長(zhǎng)12m，壟間距30cm。將野生型、抗蟲(chóng)對(duì)照、感蟲(chóng)對(duì)照和突變體種子分裝于可滲水的小袋中，催芽2-3天后，均勻的播種于打好線的壟地上，每個(gè)突變體播種10-15粒，突變體旁邊分別種植抗蟲(chóng)對(duì)照(RHT或IR56)和感蟲(chóng)對(duì)照(TN1)。兩周后觀察長(zhǎng)苗狀況，每行突變體留至少3株單株水稻，避免多粒種子的植株合并在一起，每隔數(shù)日關(guān)注水稻的長(zhǎng)勢(shì)。田間不噴灑農(nóng)藥，任褐飛虱遷入繁殖，在水稻生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期觀察各突變體的受害情況。若遇到褐飛虱較少的年份，待成株期時(shí)，將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的褐飛虱人工均勻的釋放于供試田間。待TN1全部枯死，對(duì)突變體進(jìn)行抗蟲(chóng)評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。抗性級(jí)別低于ZH11的突變體即為抗蟲(chóng)突變體，高于ZH11的突變體為感蟲(chóng)突變體。表1、水稻成株期對(duì)褐飛虱抗性鑒定評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)抗性級(jí)別植株癥狀(TN1死亡時(shí)考察)抗性水平0植株生長(zhǎng)健康，無(wú)葉片受害免疫(Im)1植株開(kāi)始部分黃化高抗(HR)3多數(shù)植株變黃，部分植株明顯黃化抗蟲(chóng)(R)5多數(shù)植株黃萎，少數(shù)枯死中抗(MR)7半數(shù)以上植株枯死中感(MS)9全部植株枯死感蟲(chóng)(S)4、水稻基因組DNA的提取使用CTAB法(2％CTAB，1.4MNaCl，20mMEDTA，100mM/LTris.HCl，PH8.0)。a)取水稻葉片放入1.5mL的離心管中，用液氮冷凍后用研磨機(jī)磨碎后加入600μL的CTAB抽提液。b)65℃加熱45min(輕柔混勻)。c)加入等體積氯仿，混勻，室溫靜置10min。d)12000rpm，離心15min，取上清至新的EP管。e)加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30min。f)12000rpm離心10min，棄上清，70％乙醇洗滌沉淀兩次。g)離心棄上清后，干燥，用適量的水溶解。h)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。5、突變體旁鄰序列的獲得(TAIL-PCR)用水稻葉片基因組DNA作為PCR模板，進(jìn)行三輪PCR反應(yīng)。第一輪PCR：以提取的基因組DNA為模板，使用T-DNA上的引物NTL1和隨機(jī)引物。第二輪PCR：以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，使用T-DNA上的NTL2引物和隨機(jī)引物。第三輪PCR：以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，使用T-DNA上的NTL3引物和隨機(jī)引物(圖1)。第三輪PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，有條帶的樣品切膠回收后直接測(cè)序，或連接到克隆載體上再進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果先與T-DNA左邊界序列比對(duì)，將比對(duì)正確的序列切除后，剩余序列在NCBI或水稻基因組網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)上進(jìn)行比對(duì)，確定插入位點(diǎn)。Tail-PCR程序見(jiàn)表1。6、T-DNA與表型的共分離選取突變體的雜合子的后代種子，催芽后播種，待水稻苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，各剪取2cm左右長(zhǎng)的水稻葉片，提取DNA。用插入位點(diǎn)兩側(cè)以及T-DNA上的引物檢測(cè)每株苗的純、雜或無(wú)插入的狀態(tài)。待水稻苗恢復(fù)3天，罩上塑料罩子，按照苗期單株鑒定的方法進(jìn)行抗蟲(chóng)鑒定。根據(jù)抗蟲(chóng)鑒定的結(jié)果分析表型與T-DNA的共分離情況。7、突變體的互補(bǔ)驗(yàn)證(回復(fù)突變)選取目的基因起始密碼子ATG上游2kb的自身啟動(dòng)子序列，與基因的 cDNA的編碼序列一起插入pCAMBIA2300載體，啟動(dòng)子連入選用的酶切位點(diǎn)是KpnI和BamHI，編碼序列的連接酶切位點(diǎn)是BamHI和XbaI。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化突變體的愈傷組織，由于突變體中T-DNA具有潮霉素抗性，故選用卡那抗性的轉(zhuǎn)基因載體，并用卡那霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株即為突變體的互補(bǔ)植株。苗期單株抗蟲(chóng)鑒定的方法鑒定互補(bǔ)植株能否回復(fù)突變體的表型。8、水稻對(duì)BPH的耐害性鑒定將待測(cè)品系(野生型和突變體)催芽后播種，每個(gè)小方盒內(nèi)種植兩株同品系的水稻苗，生長(zhǎng)6周左右，選取生長(zhǎng)一致的植株，去次生分蘗，恢復(fù)三天后罩上透明塑料罩子，每個(gè)罩子里面(兩株苗)接種25頭BPH的一齡若蟲(chóng)，對(duì)照植株也罩上透明塑料罩子，但不接蟲(chóng)。待感蟲(chóng)品種(WT)開(kāi)始變?yōu)辄S褐色時(shí)，取出并收集所有BPH，在60℃烘箱中干燥48h后，稱取質(zhì)量。同時(shí)，植株從小盒子里移出，洗凈根部泥土，75℃烘箱中干燥60h后，稱取質(zhì)量。根據(jù)公式計(jì)算耐蟲(chóng)系數(shù)(TI)：TI＝[(Wc-Wt)/Wc]/BPH，其中，Wc為沒(méi)有接蟲(chóng)的植株的干重，Wt為接蟲(chóng)后的植株的干重，BPH為在每株水稻苗上收集的BPH的干重。耐蟲(chóng)系數(shù)越低，水稻對(duì)BPH的耐害性越強(qiáng)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。9、TOM64多肽的亞細(xì)胞定位(1)亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建將TOM64基因去掉終止密碼子的編碼區(qū)序列通過(guò)XhoI和SpeI兩個(gè)酶切位點(diǎn)連接到PA7-GFP載體中GFP的前面，形成PA7-TOM64-GFP的融合載體。(2)水稻原生質(zhì)體的制備a)種子消毒及培養(yǎng)。ZH11種子在75％酒精中1min；然后用2.5％次氯酸鈉洗20min；用無(wú)菌水至少清洗5次。播種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，在12h/12h光照/黑暗，26℃環(huán)境下，發(fā)芽3天，暗下培養(yǎng)7天得到ZH11的黃化苗。b)剪刀截取40-60顆水稻幼苗的莖和葉鞘，握成一束，用鋒利刀片切成0.5mm左右長(zhǎng)條。c)剪切好的小條迅速轉(zhuǎn)移至0.6M甘露醇(mannitol)中，暗下放置10min。d)棄去甘露醇，將小條塊浸在酶消化液中，暗下，輕微震蕩(60-80rpm)4-5hr。酶解液：1.5％CellulaseR-10，0.75％MacerozymeR-10，0.6Mmannitol，10mMMES.KOH(pH5.7)，10mMCaCl2，0.1％BSA。e)酶消化之后，加入等體積的W5溶液，用手用力搖晃10s。W5溶液：154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，2mMMES.KOHatpH5.7。f)將以上混合液通過(guò)40μm尼龍過(guò)濾膜過(guò)濾，至一圓底管；用W5溶液清洗濾膜上方的水稻小條塊3-5次，過(guò)濾通過(guò)尼龍膜。g)吊桶式轉(zhuǎn)頭離心1500rpm，3min，收集原生體。h)用W5清洗一次原生質(zhì)體，離心原生質(zhì)體。i)用MMG溶液重懸。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)約2×106細(xì)胞/mL。MMG溶液：0.4Mmannitol，15mMMgCl2，4mMMES.KOH(pH5.7)。j)FDA染色觀察原生質(zhì)體及其活力。(3)水稻原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化a)將5-10μg質(zhì)粒與100μL原生體(約2×105個(gè)細(xì)胞)混合。b)加入110μl新配制的PEG溶液?；旌弦涸谑覝亍迪路胖?0-20min。PEG溶液：40％(W/V)PEG4000，0.2Mmannitol，0.1MCaCl2。c)輕輕緩慢加入440μlW5溶液。輕輕翻轉(zhuǎn)管子使之混勻。離心1500rpm，3min。收集原生質(zhì)體。d)輕輕用1mlWI溶液重懸原生質(zhì)體。WI溶液：0.5Mmannitol，20mMKCl，4mMMES(pH5.7)。e)將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至六孔板。暗下在室溫放置6-16h。(4)MitotrackerRed染色所用試劑為MitoRedCMXRos(Invitrogen，M7512)，染色嚴(yán)格根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。10、水稻組織H2O2含量的測(cè)定水稻葉鞘樣品在液氮中研磨至粉，稱取0.3g樣品于2ml離心管中，加1ml去離子水充分混勻，13600g離心10分鐘，上清液即為待測(cè)樣品。H2O2含量測(cè)定使用的是AmplexRedHydrogenPeroxide/PeroxidaseAssaykit(Invitrogen，A22188)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。11、TOM64基因缺失對(duì)水稻產(chǎn)量性狀的影響為了分析TOM64基因缺失對(duì)水稻產(chǎn)量性狀的影響，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)雜交后代進(jìn)行分離篩選，獲得了TOM64基因缺失的純系種子，并種植在室內(nèi)和田間，對(duì)其產(chǎn)量相關(guān)的性狀進(jìn)行了觀察和測(cè)定。實(shí)施例1、水稻基因缺失突變體T35顯示了對(duì)褐飛虱(BPH)較強(qiáng)的抗性本發(fā)明人從田間初步篩選到的水稻抗褐飛虱突變體中，挑選部分突變體進(jìn)行了室內(nèi)單株抗蟲(chóng)鑒定，發(fā)現(xiàn)有些突變體對(duì)褐飛虱并未顯示出較好的抗性，但有一株編號(hào)T35的突變體(2012年田間鑒定褐飛虱抗性級(jí)別：3級(jí))，室內(nèi)單株抗蟲(chóng)鑒定顯示，無(wú)論是苗期還是分蘗期，相對(duì)于野生型ZH11，突變體T35都表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗性(圖2B，D，E)。旁鄰序列的分析顯示，該突變體的T-DNA插入在水稻基因LOC_Os02g51580的第9個(gè)外顯子中(該基因共有13個(gè)外顯子)(圖2A)。熒光定量PCR的分析結(jié)果顯示，此基因在突變體中未檢測(cè)到表達(dá)(圖2C)。由此證明，該突變體是基因功能缺失突變體，突變體顯示了對(duì)褐飛虱非常強(qiáng)的抗性。也即，該突變體是基因組中敲除了TOM64基因的植物。實(shí)施例2、T35突變基因編碼水稻的TOM64多肽如前所述，T35突變體中缺失的基因由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，全長(zhǎng)8864bp，其全長(zhǎng)cDNA長(zhǎng)度為2212bp(KOME登錄號(hào)：AK069965)。該基因編碼一個(gè)614個(gè)氨基酸的蛋白。其N端(氨基酸20-38)有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，中間是一個(gè)具有酰胺酶活性的功能域(氨基酸75-462)，C端是一個(gè)三肽重復(fù)序列的TPR結(jié)構(gòu)域(氨基酸532-564)(圖3A)。這是植物特有的質(zhì)體(葉綠體或線粒體)外膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子TOC64(葉綠體)或TOM64(線粒體)的結(jié)構(gòu)。通過(guò)BLASTP(Altschuletal.，1990)程序在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步的同源性分 析，本發(fā)明人在短藥野生稻(Oryzabrachyantha)，谷子(Setariaitalica)，玉米(Zeamays)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等中都找到了該蛋白的同源蛋白，與水稻來(lái)源的該蛋白的同源率分別為89％，76％，74％和53％，證明該基因在單子葉植物中相對(duì)保守，與雙子葉植物擬南芥中TOM64的同源性差異略大。對(duì)一些具有酰胺酶結(jié)構(gòu)域的蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析顯示此類蛋白在葉綠體、線粒體和胞質(zhì)中都有分布(圖3B)。T35突變體中缺失的蛋白是水稻的線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子蛋白TOM64。TOM64基因的cDNA序列(SEQIDNO:1)：ATGGACTCCTCGGCGCGATCGGGCGGCGGAGGCACCGGCGGGTACACCAGCACTCGCGTGTGGATGGTCGCGGGCGTCGCCATCGCCGGCGCCATCGTCTTCGTGGAGGCCGCGCGGCGCAGGCGCCGGTGGCTGCGGGACAGGTCCGAGGTTCCCCCCGATTTCGGCGCCTTCTGCTACCGCTTCGAGATCGCCCCGGCGCCGCAGCCTCCGCCTCCCGCCGCGCGCCAGCTACTCTCGGGCCTCACATTCGCGGCCAGCGACAACTTCGAGATCGAGGGCTATGTGGCTGGGTTTGGGAATCCGGACTGGAAGAGGACTCACAAGGCAGCCACGCGCACGGCGGTTCCTGTCACGATGCTGCAGAAGCAGGGGGGCACCTACGTTGGTAGCACAGTCATGGATGAGCTCGGATTTGGTGTTTCTGGAGGAAATTTACACAATGGAACACCAATCAACCCAGCATCTCCATCACTCTTCCCTGGTGGATCATGCAGTGGTTCTGCTGTGGCAGTTTCTGCACAACTTGTCGACTTTGCTCTTGGTACTGATACAACTGGTGATGTAAGAATTCCAGCATGCTTCTGTGGTGTACTTTGTTTCAAGTCCTCTCATGGGGTTGTATCTACTCTTGGGACCATTGCAAACTCTCAAAGTTTAGACACGATTGGATGGTTTGCACGAGATCCAAGTGTTCTGCATCGTGTTGGAGATGTTCTTTTACCAGCTGCTACAGGTGGGCTTACGCAAACAAGGCAGTTATTTTTTGCTGACGATTGCTTTCAGTTGCTGAAGGTCCCCAACGAGAAAACAGTAAATGTCATAGAAAATGCTATCCAGACATTACCAGGATATCAGCCACCTAAGCACATCAATATTGGTGAGTATATCAGTTCACATGTACCTAGCCTGAAGGATTTTTGTGAACCCACTGTGGAGATGCTCGAAGGAATGTCAGCCTTGAAAGCACTCTCAACAGTTATGCTGTTATTACAGAGATATGAATTCAAGACAAACCACGAGGATTGGGTTAATACTGTAAAACCCAAGCTTGGGCTTGATACCTCTACTCGTGTGCTACAAGCTGTCAATTCGAAAAGTGATAACATCAAATCTTTATACATTGTACGAAATGAATTGCGAGCTGCACTCAAGAATCTTTTAAAGGATACTGGAATTTTAGTTCTGCCAACCACAGCTGGATATCCTTTAAAGAGGAATGCAAGGCAAAGACTTTCACCTGGGTTTGAAGATAGAATGAGTGCATTTGTAGGCATTGCTACACTTTCAGGCTGCTGTCAGGCTGTGATTCCCTTAGGAAGTCACAATGATCATCCTATATCTCTTTCATTGCTAGCAGCACATGGATCAGACAAATTCCTTCTTCGCAATGTCTTGTATATGTTTTCTTCCATCAAAGAACAAGTCGTTTTGGCGTCCAAGTTGGTAACTGCACCAGTAATCAATAGAGATGCTGATTTTGGTGCAGCAGAGTTGTTGAAAGAGAAGGGAAATAGTGCTTTCAAAGGACGAAAATGGAGCAAGGCGGTTGAATTTTATTCTGATGCTATCAAATTGAATGGCACAAATGCAACATATTACAGCAATAGAGCAGCTGCCTATCTGGAACTTGGCCGTTATAAGCAAGCTGAAGCAGATTGTGAGCAGGCCTTACTCTTGGATAAAAAGAATGTTAAAGCATATCTACGACGAGGGATCGCAAGAGAAGCTGTTCTGAATCACCAAGAAGCTCTTCAAGATATCAGGCATGCTTTAGCTTTGGAGCCACAGAACAAAGCAGGCCTTTTGGCAGAGAGAAGGCTGCAGAAAAAACTAAGGTGATOM64多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:2)：MDSSARSGGGGTGGYTSTRVWMVAGVAIAGAIVFVEAARRRRRWLRDRSEVPPDFGAF CYRFEIAPAPQPPPPAARQLLSGLTFAASDNFEIEGYVAGFGNPDWKRTHKAATRTAVPVTMLQKQGGTYVGSTVMDELGFGVSGGNLHNGTPINPASPSLFPGGSCSGSAVAVSAQLVDFALGTDTTGDVRIPACFCGVLCFKSSHGVVSTLGTIANSQSLDTIGWFARDPSVLHRVGDVLLPAATGGLTQTRQLFFADDCFQLLKVPNEKTVNVIENAIQTLPGYQPPKHINIGEYISSHVPSLKDFCEPTVEMLEGMSALKALSTVMLLLQRYEFKTNHEDWVNTVKPKLGLDTSTRVLQAVNSKSDNIKSLYIVRNELRAALKNLLKDTGILVLPTTAGYPLKRNARQRLSPGFEDRMSAFVGIATLSGCCQAVIPLGSHNDHPISLSLLAAHGSDKFLLRNVLYMFSSIKEQVVLASKLVTAPVINRDADFGAAELLKEKGNSAFKGRKWSKAVEFYSDAIKLNGTNATYYSNRAAAYLELGRYKQAEADCEQALLLDKKNVKAYLRRGIAREAVLNHQEALQDIRHALALEPQNKAGLLAERRLQKKLR實(shí)施例3、TOM64基因?qū)ν蛔凅w遺傳互補(bǔ)后的抗蟲(chóng)表型本發(fā)明人又進(jìn)一步通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)突變體的抗蟲(chóng)表型進(jìn)行了驗(yàn)證。將TOM64基因的啟動(dòng)子連同其編碼區(qū)連入pCAMBIA2300載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化tom64突變體。通過(guò)RNA的檢測(cè)，本發(fā)明人成功得到了三個(gè)獨(dú)立的互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因水稻株系(R1，R2和R3)(圖4A)。進(jìn)一步的抗褐飛虱鑒定顯示轉(zhuǎn)入TOM64基因的互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的抗性明顯低于tom64突變體，與野生型相當(dāng)(圖4B)，證明了此突變體抗BPH的表型是由于TOM64基因的缺失導(dǎo)致的。實(shí)施例4、tom64突變體的抗蟲(chóng)機(jī)制研究植物的抗蟲(chóng)性可以通過(guò)三個(gè)方面來(lái)實(shí)現(xiàn)：非嗜性(不選擇性)、抗生性和耐蟲(chóng)性(耐害性)。在突變體tom64和野生型ZH11間的選擇性測(cè)試結(jié)果顯示，在釋放褐飛虱1到96h的時(shí)間內(nèi)，褐飛虱在野生型及突變體上的數(shù)目接近，且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都無(wú)顯著性差異(圖5A)。另外，產(chǎn)卵量的測(cè)試結(jié)果顯示褐飛虱在突變體上的產(chǎn)卵量比其在野生型中略有增多，但無(wú)顯著性差異(圖5B)。這說(shuō)明突變體tom64對(duì)褐飛虱的抗性不是通過(guò)非嗜性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。蜜露(褐飛虱排泄物)的排泄量可以提示褐飛虱的取食量。通過(guò)測(cè)定褐飛虱的蜜露排泄量，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在野生型水稻中取食的褐飛虱，其蜜露量明顯多于褐飛虱取食突變體產(chǎn)生的蜜露量(圖6A)。另外，相比野生型，突變體也顯著抑制了褐飛虱的生長(zhǎng)速率(圖6B)。但是，對(duì)在不同植株上褐飛虱死亡率的測(cè)定卻沒(méi)有顯著差異(圖6C)。這些結(jié)果說(shuō)明突變體tom64可以抑制褐飛虱的取食及生長(zhǎng)，但TOM64的 缺失對(duì)褐飛虱不足以致死，由此說(shuō)明，突變體抗褐飛虱在一定程度上是通過(guò)抗生性實(shí)現(xiàn)的。之前的表型鑒定顯示突變體對(duì)褐飛虱的抗性相對(duì)于野生型有非常顯著的提高。進(jìn)一步的耐害性實(shí)驗(yàn)分析表明，tom64突變體的耐蟲(chóng)系數(shù)顯著低于野生型ZH11的耐蟲(chóng)系數(shù)(圖7)，而耐蟲(chóng)系數(shù)越低，耐害性越強(qiáng)，證明突變體對(duì)褐飛虱的耐害性有了較明顯的提高。綜上抗蟲(chóng)機(jī)制的分析，證明突變體tom64對(duì)褐飛虱的抗性是通過(guò)抗生性和耐害性兩方面同時(shí)發(fā)揮作用的。實(shí)施例5、TOM64基因的亞細(xì)胞定位亞細(xì)胞的定位對(duì)研究蛋白功能具有重要指導(dǎo)作用。擬南芥TOM64被發(fā)現(xiàn)特異定位于線粒體中。本發(fā)明人利用水稻PA7-TOM64-GFP融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)觀察其亞細(xì)胞定位。將對(duì)照載體PA7-GFP和融合載體分別轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PA7-GFP在細(xì)胞膜以及胞質(zhì)中泛在表達(dá)，而融合蛋白在胞質(zhì)中隨機(jī)分布(圖8A)。進(jìn)一步與線粒體的特異性染料Mitotracker共染，發(fā)現(xiàn)二者的熒光可以很好的共定位(圖8B)，證明水稻的TOM64多肽也是僅特異的定位于線粒體中，與預(yù)測(cè)一致。實(shí)施例6、TOM64基因的缺失提高了水稻組織H2O2的含量TOM64是線粒體外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)分子，其缺失會(huì)影響一系列線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體。而線粒體進(jìn)行氧化呼吸作用，是植物產(chǎn)生活性氧的主要細(xì)胞器之一。本發(fā)明人在褐飛虱取食前后，分別測(cè)定了水稻葉鞘中H2O2的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型水稻ZH11中H2O2的含量在褐飛虱取食前后沒(méi)有明顯變化，而突變體中H2O2的含量可在褐飛虱取食6h的時(shí)候被顯著誘導(dǎo)(圖9)。更重要的是，無(wú)論在褐飛虱取食前后，突變體tom64中H2O2的含量都要顯著高于野生型中的含量(圖9)。而H2O2是水稻抗性防御反應(yīng)中的一個(gè)重要分子。這說(shuō)明TOM64的缺失顯著提高了水稻組織中H2O2的含量，提示由此提高了水稻對(duì)褐飛虱的抗性。實(shí)施例7、突變體及野生型對(duì)褐飛虱抗性的評(píng)價(jià)為了進(jìn)一步驗(yàn)證水稻抗褐飛虱的表型，本發(fā)明人分別對(duì)野生型(wt)、突變體(mutant)、雜合突變體后代(Co-M，Co-WT，Co-H)以及三個(gè)互補(bǔ)的轉(zhuǎn)基因株系(R1、R2、R3)進(jìn)行了苗期室內(nèi)的抗褐飛虱級(jí)別評(píng)價(jià)，當(dāng)感蟲(chóng)對(duì)照TN1全部死亡時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)為秧苗未被害；1級(jí)，第一葉部分發(fā)黃；3級(jí)，第一葉及第二葉部分發(fā)黃；5級(jí)，顯著發(fā)黃，植株有些矮化；7級(jí)，植株萎縮或嚴(yán)重矮化；9級(jí)，植株死亡。結(jié)果顯示，野生型ZH11、3個(gè)互補(bǔ)的轉(zhuǎn)基因株系以及共分離的雜合體和野生型，它們的抗性級(jí)別都為7-9，突變體tom64以及共分離的純和突變體的抗性級(jí)別為3-5，抗蟲(chóng)對(duì)照IR56的抗性級(jí)別為1-3(圖10)。這些結(jié)果充分證明，TOM64基因的缺失在提高水稻對(duì)BPH抗性中起著關(guān)鍵的作用。實(shí)施例8、TOM64基因缺失對(duì)水稻產(chǎn)量性狀的影響為了進(jìn)一步確定TOM64基因缺失對(duì)水稻產(chǎn)量性狀的影響，本發(fā)明人通過(guò)將突變體tom64自交的方式獲得了TOM64基因缺失(即基因被敲除)的純系，將其種植在室內(nèi)和田間，并對(duì)其產(chǎn)量相關(guān)的性狀進(jìn)行了觀察和測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TOM64基因被敲除后水稻分蘗提前(圖11A)，水稻植物明顯變矮(圖11B)。TOM64基因被敲除植株與野生型水稻相比，二者的有效分蘗率沒(méi)有顯著差異(圖11C)。由于TOM64基因缺失的純系全部分蘗數(shù)顯著增多，因此，TOM64基因被敲除后水稻的有效分蘗數(shù)量顯著增多。而且，本發(fā)明人比較發(fā)現(xiàn)，TOM64基因缺失的純系水稻的千粒重和每穗的粒數(shù)沒(méi)有顯著差異，而分蘗數(shù)的增加促進(jìn)了單株水稻的穗的增加，因此，敲除該基因?qū)μ岣咚井a(chǎn)量具有作用?？偨Y(jié)1、本發(fā)明證明tom64突變體提高了水稻對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)(包括褐飛虱)的抗性。2、抗蟲(chóng)機(jī)理研究表明該基因突變抑制了飛虱科昆蟲(chóng)的取食量，從而提高了水稻對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的耐害性。3、TOM64基因缺失顯著提高了水稻組織中H2O2的含量，因此提高了水 稻對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性。4、tom64突變體對(duì)飛虱科昆蟲(chóng)的抗性可以從原始的高感水平(7-9級(jí))，提高到中等抗性水平(3-5級(jí))。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3