本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種動物模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

小鼠疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中起到了關(guān)鍵作用，特別是在評價藥物治療效果及治療方式的選擇上具有重要價值。

基因敲除是自80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。這是一項復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)，又稱為“基因打靶”技術(shù)，到目前為止，利用該技術(shù)已構(gòu)建了數(shù)千種基因突變小鼠模型。然而這項傳統(tǒng)的基因敲除方法因流程復(fù)雜、耗時長、費用大，近些年來，大家都在尋找一種更快速、更經(jīng)濟且適用性強的新方法。

粘多糖貯積癥II型(Mucopolysaccharidosis type II，MPS II，MIM309900)，又稱Hunter綜合征，是一種X連鎖隱性遺傳病，由于基因突變導(dǎo)致溶酶體酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在體內(nèi)大量沉積，尿中大量排出硫酸皮膚素(dermatin sulfate B，DS)、硫酸已酰肝素(heparitin sulfate，HS)?；颊叱錾鷷r表現(xiàn)一般正常，但隨著越來越多的粘多糖貯積在體內(nèi)，MPS II病程進行性加重，癥狀典型，預(yù)后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPS II與IDS基因發(fā)生突變高度相關(guān)。由于發(fā)病率極低，又被稱為“孤兒病”。目前，世界上該疾病的研究及治療仍比較困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對當(dāng)前動物模型構(gòu)建時存在的過程復(fù)雜、條件苛刻、費用巨大，以及當(dāng)前粘多糖貯積癥II型研究中缺少可研究的動物模型的問題，本發(fā)明提供了一種粘多糖貯積癥II型動物模型的構(gòu)建方法，由該方法獲得的動物模型，以及該動物模型在研究粘多糖貯積癥II型中的用途。

第一方面，本發(fā)明提供了一種粘多糖貯積癥II型動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)針對小鼠IDS基因設(shè)計靶點，合成寡核苷酸鏈，合成的寡核苷酸鏈經(jīng)退火與pUC57-T7-sgRNA質(zhì)粒進行連接，獲得sgRNA表達載體；

(2)獲得小鼠受精卵；

(3)將轉(zhuǎn)錄好的Cas9mRNA和sgRNA混合均勻得到RNA混合物，將RNA混合物顯微注射至小鼠受精卵的細(xì)胞質(zhì)，隨后將存活的受精卵植入雌性小鼠體內(nèi)，繁殖獲得F0代小鼠；

(4)提取F0代小鼠的基因組DNA，作為模板，采用包含sgRNA作用靶點的引物，進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)酶切，選擇突變小鼠，從而確定Founder小鼠；

(5)Founder小鼠與野生型雄性小鼠交配獲得F1代小鼠。

前述的構(gòu)建方法，步驟(1)中合成如下兩對寡核苷酸鏈：

ms Ids E5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；

ms Ids E5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT。

前述的構(gòu)建方法，在步驟(2)中，以4-5周齡的雌性小鼠為供體，腹腔注射PMSG和hCG進行超數(shù)排卵，隨后與雄性小鼠交配，次日獲得小鼠受精卵。

前述的構(gòu)建方法，步驟(4)中，包含sgRNA作用靶點的引物是：

ms Ids E5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；

ms Ids E5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。

前述的構(gòu)建方法，步驟(4)中，PCR反應(yīng)的體系是50μL，PCR反應(yīng)的條件是：95℃預(yù)變性5min，隨后95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，隨后72℃延伸10min。

前述的構(gòu)建方法，步驟(4)中，采用T7核酸內(nèi)切酶進行酶切。

前述的構(gòu)建方法，步驟(4)中，選擇突變小鼠之后，先通過TA克隆、測序進一步檢測確定突變，之后再確定Founder小鼠。

前述的構(gòu)建方法，還包括粘多糖貯積癥II型動物模型的基因型鑒定，包括步驟：提取F1代小鼠的基因組DNA；設(shè)計包含sgRNA作用靶點的引物，并以提取的F1代小鼠的基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，對PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進行測序。

前述的構(gòu)建方法，所述包含sgRNA作用靶點的引物是：

ms Ids E5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；

ms Ids E5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。

前述的構(gòu)建方法，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系是50μL，反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性5min，隨后95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，隨后72℃延伸10min。

前述的構(gòu)建方法，還包括粘多糖貯積癥II型動物模型的表型分析，包括步驟：分別提取F1代小鼠和雄性野生型小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟四種組織，制作成組織切片，對組織切片阿爾新藍染色，并將F1代小鼠的組織切片與雄性野生型小鼠的組織切片進行比較。

第二方面，本發(fā)明提供了第一方面的構(gòu)建方法構(gòu)建的粘多糖貯積癥II型動物模型。

前述的粘多糖貯積癥II型動物模型，X染色體的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的核苷酸18956-18975bp缺失，其序列是AACTCCACGCCAATCTGCTT。

第三方面，本發(fā)明提供了第一方面的構(gòu)建方法構(gòu)建的粘多糖貯積癥II型動物模型或者第二方面的粘多糖貯積癥II型動物模型在研究粘多糖貯積癥II型中的用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案至少具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)建立的粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型為進一步深入研究粘多糖貯積癥II型的致病機理及治療效果評價提供了極其重要的動物模型。

(2)采用本發(fā)明的方法獲得粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型的周期短，僅需2個月。

(3)采用本發(fā)明獲得的IDS基因敲除模型鼠，其基因型標(biāo)記為X^-idsX^ids，為表現(xiàn)型正常的小鼠，可在實驗室中正常培養(yǎng)，通過與野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型為X^idsY)交配，其基因可穩(wěn)定遺傳，發(fā)明人成功建立了一種基因可穩(wěn)定遺傳的IDS基因敲除模型鼠品系。其與野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型為X^idsY)交配獲得F1代小鼠，F(xiàn)1代小鼠中理論上有25％的小鼠其基因型為X^-idsY，即粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型(基因型為X^-idsY)，同時理論上有25％的小鼠的基因型為X^-idsX^ids，即IDS基因敲除模型鼠(基因型為X^-idsX^ids)。這種情況下，一旦獲得IDS基因敲除模型鼠(基因型為X^-idsX^ids)，就只需在實驗室中進行簡單的自然交配過程就會獲得粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型(基因型為X^-idsY)，而不需要再重新進行復(fù)雜的基因敲除實驗。因此，本發(fā)明的方法獲得了一種可同時生產(chǎn)IDS基因敲除模型鼠和粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型的IDS基因敲除模型鼠，這是本發(fā)明技術(shù)方案中的最巧妙之所在。

附圖說明

圖1為RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)定向基因組修飾作用機制示意圖；

圖2為CRISPR/Cas9介導(dǎo)的IDS基因修飾情況分析；

圖3為靶點處DNA序列結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4(A)和圖4(B)為粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型的基因型鑒定測序結(jié)果；

圖5為粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型組織切片阿爾新藍染色結(jié)果。

具體實施方式

為充分了解本發(fā)明之目的、特征及功效，借由下述具體的實施方式，對本發(fā)明做詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不僅僅限于此。下述具體實施方式中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述具體實施方式中所涉及的物質(zhì)均為常規(guī)市購得到。

本發(fā)明所涉及的CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)，是繼鋅指核酸酶、TALEN等技術(shù)后可用于定點構(gòu)建基因敲除鼠的最新一代方法，在定向?qū)蜻M行修飾上展現(xiàn)出巨大的潛力。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)提供一種粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型及其構(gòu)建方法，為進一步深入研究粘多糖貯積癥II型的致病機理及治療效果評價提供了極其重要的動物模型。

I.粘多糖貯積癥II型小鼠模型的構(gòu)建

1.CRISPR靶向修飾基因載體的構(gòu)建

針對IDS基因發(fā)明人設(shè)計了兩個靶點(針對Mouse BAC-146N21Chromosome X contains iduronate-2-sulfatase gene(小鼠BAC-146N21X染色體含有的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因)(Accession：AC002315)的5號外顯子(核苷酸18934-19134bp)的18963-18981bp核苷酸區(qū)域和18985-19005bp核苷酸區(qū)域，其中ms Ids E5-1-sgRNA1針對18963-18981bp核苷酸區(qū)域，ms Ids E5-2-sgRNA2針對18985-19005bp核苷酸區(qū)域)，合成兩對寡聚核苷酸鏈(ms Ids E5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；ms Ids E5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT)用于制備sgRNA(small guide RNA，小向?qū)NA)，其作用機理如圖1所示。合成的寡聚核苷酸經(jīng)退火(95℃5min后自然降至室溫)，連入經(jīng)BsaI酶切回收的pUC57-T7-sgRNA表達載體(Addgene，NO.51132)，構(gòu)建sgRNA表達載體。通過測序驗證連入片段是否正確，選擇正確的克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒用于準(zhǔn)備體外轉(zhuǎn)錄模板。

Cas9(D10A)表達質(zhì)粒(Pst1374-NLS-Cas9-ZF)，經(jīng)AgeI酶切線性化，經(jīng)酚氯仿抽提純化后，溶于無核酸酶的水中作為模板，用于體外轉(zhuǎn)錄。Cas9mRNA的合成由試劑盒T7Ultra Kit(Ambion，AM1345)在體外利用T7RNA聚合酶完成。sgRNA表達載體DraI酶切線性化后，經(jīng)酚氯仿抽提純化，溶于無核酸酶的水中作為模板，用于體外轉(zhuǎn)錄。sgRNA的體外合成由試劑盒MEGAshortscript Kit(Ambion，AM1354)在體外利用T7RNA聚合酶完成。

2.胚胎供體小鼠超排卵

PMSG(血清促性腺激素)處理供體雌性小鼠，46小時后注射hCG(人絨毛膜促性腺激素)，與雄性小鼠合籠交配，次日取受精卵進行顯微注射。

3.顯微注射及胚胎移植

轉(zhuǎn)錄好的Cas9mRNA和sgRNA混合并調(diào)整濃度至20ng/μl和12.5ng/μl每種sgRNA，顯微注射法將RNA混合物注射到小鼠受精卵的細(xì)胞質(zhì)，將存活的143枚受精卵移植至5只假孕C57BL/6雌性小鼠，每個假孕雌性小鼠體內(nèi)移植28枚受精卵。約3周后小鼠出生，共獲得19只F0小鼠，存活17只。

4.Founder小鼠鑒定

胚胎移植的小鼠將在手術(shù)后19天左右出生，待小鼠出生20天后剪尾提取DNA并進行PCR鑒定。設(shè)計一對引物包含sgRNA作用靶點(ms Ids E5C9For：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT和ms Ids E5C9Rev：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50μL(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自天根生化科技(北京)有限公司)。反應(yīng)條件：95℃5min；(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，30個循環(huán)；72℃10min；保存4℃。擴增片段大小466bp。用PCR純化試劑盒(北京天根)純化PCR產(chǎn)物。取100ng純化后的PCR產(chǎn)物在NEB Buffer 2中變性、復(fù)性后，用T7核酸內(nèi)切酶(NEB，M0302L)37℃孵育40min，然后用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離。T7核酸內(nèi)切酶能夠識別不完全配對的雙鏈DNA，并進行切割，如果CRISPR/Cas9對靶點造成了突變，將能夠被該酶識別，并造成雙鏈DNA斷裂。因此，在瓊脂糖凝膠電泳中存在除PCR產(chǎn)物帶之外的條帶，說明退火產(chǎn)物能夠被T7核酸內(nèi)切酶識別并切割，表明靶點DNA序列可能存在突變(圖2)。為進一步驗證突變存在，以及突變的具體情況，通過TA克隆、測序進一步檢測確定突變(圖3)。

5.Founder小鼠與野生型小鼠交配得到F1

待雌性Founder小鼠到4周齡，可與野生型雄性小鼠交配，小鼠出生20天后PCR鑒定。若有陽性小鼠出生，則表示轉(zhuǎn)基因已經(jīng)整合到生殖細(xì)胞，標(biāo)志品系建立成功。獲得IDS基因敲除模型鼠，其基因型標(biāo)記為X^-idsX^ids。選用F0代23-1號雌性小鼠(基因型為X^-idsX^ids)與野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型為X^idsY)交配獲得F1代小鼠。

II.粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型的基因型鑒定

待F1代小鼠出生20天后，剪取F1代雄性小鼠和野生型C57BL/6雄性小鼠尾尖，提取小鼠基因組DNA，擴增目的基因。設(shè)計一對引物包含sgRNA作用靶點(ms Ids E5C9For：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT和ms Ids E5C9Rev：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50μL(PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自天根生化科技(北京)有限公司)。反應(yīng)條件：95℃5min；(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，30個循環(huán)；72℃10min；保存4℃。擴增片段大小466bp。用PCR純化試劑盒(北京天根)純化PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物直接送測序，測序結(jié)果如圖4(A)和圖4(B)所示，獲得了粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型，其基因型為X^-idsY，測序結(jié)果顯示其缺失Mouse BAC-146N21Chromosome X contains iduronate-2-sulfatase gene(Accession：AC002315)核苷酸18956-18975bp的20個堿基，序列為AACTCCACGCCAATCTGCTT，此結(jié)果與設(shè)計一致，即獲得基因型鑒定正確的粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型(基因型為X^-idsY)。

III.粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型的表型分析

頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型(基因型為X^-idsY)和雄性野生小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟四種組織，并制作以上四種組織的石蠟組織切片，切片制作好后，可對切片進行阿爾新藍染色。阿爾新藍屬于陽離子染料，是顯示酸性黏液物質(zhì)最特異的染料。通過與野生型鼠組織切片的阿爾新藍染色比對(圖5)可發(fā)現(xiàn)，粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型(基因型為X^-idsY)的心臟、肝臟、脾臟、腎臟組織中有明顯的粘多糖聚集現(xiàn)象，由此證明，粘多糖貯積癥II型小鼠動物模型構(gòu)建成功。

最后，需要注意的是：以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子，當(dāng)然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行改動和變型，倘若這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。