本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及用于篩選Nrf2激活劑的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和用途。

背景技術(shù)：

人體在受到多種環(huán)境因素如紫外照射等情況下，會(huì)產(chǎn)生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)。ROS作為第二信使，誘發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白和DNA氧化損傷，直接或間接地破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，進(jìn)而誘發(fā)包括細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷或凋亡，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤等的形成。當(dāng)暴露于ROS時(shí)，機(jī)體自身能誘導(dǎo)一系列保護(hù)性蛋白，其中核因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,簡稱Nrf2)信號通路是最為重要的抗氧化應(yīng)激通路，它可以啟動(dòng)II相酶和抗氧化酶等基因轉(zhuǎn)錄，維持體內(nèi)氧化還原平衡，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。但損害過量或由于年齡因素導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力下降，細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生量超出細(xì)胞自身清除能力，則導(dǎo)致?lián)p傷。因此，采用抗氧化劑誘導(dǎo)II相酶和抗氧化酶等基因的表達(dá)和提高細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力是探索安全有效且作用機(jī)制明確的抗氧化藥物和化妝品行業(yè)的重點(diǎn)。

如上所述，Nrf2信號通路是最重要的抗氧化應(yīng)激通路，激活后的Nrf2，由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，與Maf蛋白形成異二聚體，識別并與核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合，啟動(dòng)II相酶和抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄，維持體內(nèi)氧化還原平衡，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。

目前已有報(bào)道利用ARE順式轉(zhuǎn)錄原件(cis-regulatory element)調(diào)控報(bào)告基因來監(jiān)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活作用，這些報(bào)告基因主要包括螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein)、β-半乳糖甘酶(β-galactosidase)等。然而，這些報(bào)告系統(tǒng)還存在一系列的問題：(1)以螢火蟲熒光素酶等各種酶作為報(bào)告基因，后續(xù)檢測其活性時(shí)均需要裂解細(xì)胞后檢測，操作步驟復(fù)雜而不方便，難以實(shí)現(xiàn)長期檢測；(2)檢測靈敏度較差，還有待進(jìn)一步提高；(3)上述報(bào)告基因采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，其中最常用的HaCaT細(xì)胞其轉(zhuǎn)染效率非常低(轉(zhuǎn)染效率20％左右)，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡便、快速、高效的用于篩選Nrf2激活劑的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和用途，從而實(shí)現(xiàn)了對能否激活Nrf2通路的抗氧化劑進(jìn)行高通量的篩選和比較，以及長期效應(yīng)的檢測，而且檢測靈敏度可靠、穩(wěn)定。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

提供用于篩選Nrf2激活劑的重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含一個(gè)或兩個(gè)以上相互串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件以及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件、分泌型熒光素酶基因、分泌型堿性磷酸酶基因；所述抗氧化反應(yīng)元件為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

其中，所述基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

其中，所述分泌型熒光素酶基因是源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶基因。

其中，所述源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶基因包含其野生型序列以及SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

其中，所述分泌型堿性磷酸酶基因包含SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

其中，所述重組質(zhì)粒還包含有抗性基因。

其中，所述抗性基因選自新霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。

本發(fā)明還提供上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)在含有分泌型熒光素酶基因和含有CMV啟動(dòng)子序列的分泌型堿性磷酸酶質(zhì)粒中，將基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建到分泌型熒光素酶基因的上游；

(2)通過分子克隆技術(shù)將一個(gè)或兩個(gè)以上相互串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件構(gòu)建到步驟(1)獲得的質(zhì)粒的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件的上游，從而獲得重組質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后加入含有TBHQ或者SF培養(yǎng)基，對細(xì)胞刺激誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)2-24h后，取出培養(yǎng)基上清，然后加入熒光素酶檢測試劑，檢測熒光素酶活性，選出對TBHQ或者SF誘導(dǎo)響應(yīng)最高的質(zhì)粒即為所述用于篩選Nrf2激活劑的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供上述重組質(zhì)粒在篩選抗氧化劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供上述重組質(zhì)粒篩選抗氧化劑的方法，包括以下步驟：

(1)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，然后加入待篩選的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)2-24h；

(2)取出培養(yǎng)基上清，加入熒光素酶檢測試劑反應(yīng)5～15min，然后檢測熒光素酶的相對活性，若隨待篩選的藥物濃度增加，熒光素酶的相對活性也增加，則判定該藥物具有抗氧化活性。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的重組質(zhì)粒包含一個(gè)或兩個(gè)以上相互串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件以及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件、分泌型熒光素酶基因、分泌型堿性磷酸酶基因和抗性基因；所述抗氧化反應(yīng)元件為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。該重組質(zhì)粒通過將抗氧化反應(yīng)元件中的核心保守序列(SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)置于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件的上游，并以分泌型熒光素酶基因作為報(bào)告基因和以分泌型堿性磷酸酶作為內(nèi)參基因。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)與現(xiàn)有技術(shù)采用螢火蟲熒光素酶等作為報(bào)告基因相比，本發(fā)明采用分泌型熒光素酶作為報(bào)告基因，該酶在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行高效的分泌表達(dá)，其檢測靈敏度是螢火蟲熒光素酶的1000倍以上，靈敏性好，線性范圍寬，在哺乳動(dòng)物中基本沒有內(nèi)源性活性，而且后續(xù)檢測熒光素酶基因活性時(shí)無需裂解細(xì)胞，只需要取轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清即可進(jìn)行熒光素酶基因活性檢測，可以直接在96孔板內(nèi)進(jìn)行，非常適合高通量應(yīng)用，大大簡化了操作步驟，檢測更加方便快捷，從而實(shí)現(xiàn)長期活性的監(jiān)測；

(2)本發(fā)明的重組質(zhì)粒載體包含了新霉素抗性基因，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可通過在培養(yǎng)基中加入G418抗生素進(jìn)行篩選培養(yǎng)，從而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

(3)本發(fā)明為篩選抗氧化劑或檢測抗氧化劑活性提供了一種高效、快速、簡便的方法，也為研究一些抗氧化劑機(jī)制提供了方便，可應(yīng)用于具有抗氧化作用天然藥物和人工合成的化合物的篩選，亦可用從天然藥物中篩選具有抗氧化作用的有效成分。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1的重組質(zhì)粒的圖譜結(jié)構(gòu)圖。

圖2是實(shí)施例1的1個(gè)抗氧化反應(yīng)元件的測序結(jié)果圖。

圖3是實(shí)施例1的2個(gè)串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件的測序結(jié)果圖。

圖4是實(shí)施例1的4個(gè)串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件的測序結(jié)果圖。

圖5是實(shí)施例1的8個(gè)串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件的測序結(jié)果圖。

圖6是實(shí)施例2的p1XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p2XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p4XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p8XARE-ML-Gluc-AP-Puro重組質(zhì)粒對抗氧化劑SF和tBHQ的反應(yīng)性結(jié)果圖。

圖7是實(shí)施例2的p1XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p2XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p4XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p8XARE-CV-Gluc-AP-Puro重組質(zhì)粒對抗氧化劑SF和tBHQ的反應(yīng)性結(jié)果圖。

圖8是實(shí)施例3的已知Nrf2激活劑不同作用時(shí)間的反應(yīng)活性圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法

(一)實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，分泌型熒光素酶載體，大腸桿菌質(zhì)粒(購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞研究所)。

試劑：Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit(購自Genecopoeai公司)；lipofec3000脂質(zhì)體(購自Invitrogen公司)。

設(shè)備：Infinite F200Pro多功能酶標(biāo)儀(購自TECAN公司)，UV燈管(購自Philips公司)。

(二)實(shí)驗(yàn)步驟

本實(shí)施例以源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶(Gaussia Luciferase，Gluc)為報(bào)告基因，通過篩選抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)，構(gòu)建易檢測、高靈敏和高穩(wěn)定性的Nrf2信號通路激活的報(bào)告系統(tǒng)，具體步驟如下：

(1)將編碼分泌型堿性磷酸酶(如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列)的cDNA用PCR擴(kuò)增，在5'末端帶上CMV啟動(dòng)子序列，在其3'末端帶上polyA序列，然后插入經(jīng)過AgeI-PmeI限制性內(nèi)切酶消化的帶有Puromcin抗性基因的pPuro質(zhì)粒中，獲得pAP-Puro質(zhì)粒；

(2)將編碼Gaussia princeps的分泌型熒光素酶(如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列)的cDNA用PCR擴(kuò)增，在其3'末端帶上SV40polyA序列，然后插入經(jīng)過HindIII-AgeI限制性內(nèi)切酶消化的pAP-Puro質(zhì)粒，獲得pGluc-AP-Puro質(zhì)粒；

(3)人工合成基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件mini-ML(如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列)和mini-CV(如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列)，并在其5′端和3′端分別帶有XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)，隨后插入到經(jīng)過XhoI-HindIII限制性內(nèi)切酶消化的pGluc-AP-Puro質(zhì)粒中，獲得pML-Gluc-AP-Puro質(zhì)粒和pCV-Gluc-AP-Puro質(zhì)粒；

(4)人工合成單鏈DNA片段：

分別構(gòu)建串聯(lián)1個(gè)、2個(gè)、4個(gè)和8個(gè)抗氧化反應(yīng)元件的分泌型熒光素酶的ARE/Gluc克隆，同時(shí)以SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)作為內(nèi)參報(bào)告基因。在EcoRI片段和XhoI片段之間分別串聯(lián)了1個(gè)、2個(gè)、4個(gè)、8個(gè)抗氧化反應(yīng)元件。每個(gè)抗氧化反應(yīng)元件的3’端引物序列如表1所示。

表1.抗氧化反應(yīng)元件的3’端引物序列

(5)將1ARE PF+1ARE PR；2ARE PF+2ARE PR；4ARE PF+4ARE PR；8ARE PF1+8ARE PF2+8ARE PR1+8ARE PR2分別進(jìn)行褪火，獲得不同數(shù)目(1,2,4,8個(gè))的抗氧化反應(yīng)元件串聯(lián)序列；

(6)將不同數(shù)目(1,2,4,8個(gè))的抗氧化反應(yīng)元件串聯(lián)序列插入到經(jīng)EcoRI-XhoI消化pML-Gluc-AP-Puro質(zhì)粒和pCV-Gluc-AP-Puro質(zhì)粒中，獲得p1XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p2XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p4XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p8XARE-ML-Gluc-AP-Puro；p1XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p2XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p4XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p8XARE-CV-Gluc-AP-Puro，圖譜結(jié)構(gòu)如圖1所示；

(7)提取質(zhì)粒DNA后進(jìn)行測序，1，2，4，8個(gè)抗氧化反應(yīng)元件串聯(lián)序列測序結(jié)果分別如圖2至圖5所示，其中：

1個(gè)抗氧化反應(yīng)元件為SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列(見圖2)；

2個(gè)串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件為SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列(見圖3)；

4個(gè)串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件為SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列(見圖4)；

8個(gè)串聯(lián)的抗氧化反應(yīng)元件為SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列(見圖5)；

實(shí)施例2：用已知的Nrf2激活劑鑒定實(shí)施例1的重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)性

(1)HaCaT細(xì)胞在補(bǔ)充了100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中、在含5％CO2的氣氛下、在37℃下培養(yǎng)，用Life Technologies公司(Carlsbad,CA,USA)購買的Lipofectamine 2000試劑按推薦流程用于實(shí)施例1制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

(2)轉(zhuǎn)染24h后，更換含有SF(10uM)和tBHQ(20uM)的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h；

(3)取100ul培養(yǎng)基上清，用于熒光素酶活性檢測。各報(bào)告物活性的測定使用Genecopoeai公司的Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit和采用TECAN公司Infinite F200Pro多功能酶標(biāo)儀，按照其化學(xué)發(fā)光測量辦法，測定熒光素酶(Gluc)和堿性磷酸酶(AP)的活性；

(4)以AP作為內(nèi)部對照，先以實(shí)施例1的各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清的Gluc活性讀數(shù)除以AP活性讀數(shù)，計(jì)算出比值。當(dāng)以ML序列作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列時(shí)，以沒有插入ARE元件的ML空載體(ML-Vehicle)的比值設(shè)為1，然后計(jì)算出在其前分別插入1，2，4和8個(gè)ARE元件的誘導(dǎo)倍數(shù)，其結(jié)果是以3次實(shí)驗(yàn)的平均±SD表示，結(jié)果見圖6；當(dāng)以CV序列作為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列時(shí)，以沒有插入ARE元件的CV空載體(ML-Vehicle)的比值設(shè)為1，然后計(jì)算出在其前分別插入1，2，4和8個(gè)ARE元件的誘導(dǎo)倍數(shù)，其結(jié)果是以3次實(shí)驗(yàn)的平均±SD表示，結(jié)果見圖7。從圖6和圖7的結(jié)果可以看出，隨著多個(gè)串聯(lián)ARE元件的插入，在Nrf2激活劑誘導(dǎo)下，Gluc相對活性也隨之增加，8個(gè)串聯(lián)ARE元件的Gluc相對活性最大。

實(shí)施例3：用實(shí)施例1的重組質(zhì)粒檢測已知的Nrf2激活劑不同作用時(shí)間的反應(yīng)活性以及篩選抗氧化劑的應(yīng)用

1.重組質(zhì)粒用于檢測已知的Nrf2激活劑不同作用時(shí)間的反應(yīng)活性

(1)HaCaT細(xì)胞細(xì)胞在補(bǔ)充了100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中、在含5％CO2的氣氛下、在37℃下培養(yǎng)，用Life Technologies公司(Carlsbad,CA,USA)購買的Lipofectamine 2000試劑按推薦流程用于實(shí)施例1的p8XARE-ML-Gluc-AP-Puro質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

(2)轉(zhuǎn)染24h后，更換含有SF(10uM)和tBHQ(20uM)的新鮮培養(yǎng)基，然后于0、6、24h取100ul培養(yǎng)基上清，用于熒光素酶(Gluc)的活性檢測。

(3)已知Nrf2激活劑不同作用時(shí)間的反應(yīng)活性的測定，使用Genecopoeai公司的Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit和采用TECAN公司Infinite F200Pro多功能酶標(biāo)儀，按照其化學(xué)發(fā)光測量辦法，測定Gluc和AP活性；以AP作為內(nèi)部對照，以實(shí)施例1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清的Gluc活性讀數(shù)除以AP活性讀數(shù)，計(jì)算出比值，結(jié)果見圖8。從圖8的結(jié)果可以看出，SF(10uM)和tBHQ在處理6h是作用最強(qiáng)。

2.重組質(zhì)粒用于篩選抗氧化劑的方法

將實(shí)施例1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，加入待篩選的藥物，5％CO2，37℃培養(yǎng)24h后，取細(xì)胞上清，然后并加入熒光素酶檢測試劑，檢測熒光素酶的相對活性，若隨待篩選的藥物濃度增加，熒光素酶的相對活性也增加，則說明該藥物為抗氧化劑。

本發(fā)明為篩選抗氧化劑或檢測抗氧化劑活性提供了一種高效、快速、簡便的方法，也為研究一些抗氧化劑機(jī)制提供了方便，可應(yīng)用于具有抗氧化作用天然藥物和人工合成的化合物的篩選，亦可用從天然藥物中篩選具有抗氧化作用的有效成分。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。