本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：最新研究發(fā)現(xiàn)，股骨頭缺血性壞死(ANFH)病人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性和數(shù)量都出現(xiàn)下降，這提示該疾病的發(fā)病原因可能不是成骨細(xì)胞本身而是間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖或分化受到抑制。而干細(xì)胞移植又存在細(xì)胞表型變異失去成骨能力現(xiàn)象，股骨頭缺血性壞死(avascularnecrosisoffemoralhead，ANFH)是臨床上常見的骨科疾病，致殘率極高。目前的治療措施包針對(duì)早期病例的髓芯減壓、鉆孔植骨等,以及晚期病例的股骨頭置換術(shù)。這些方法效果都不甚滿意,且存在爭(zhēng)議。近來(lái)的研究顯示股骨頭壞死病人的骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的活性和數(shù)量都出現(xiàn)下降，這表明該疾病的發(fā)病原因可能是間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖或定向分化受到抑制。因此，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植將成為未來(lái)治療股骨頭缺血性壞死的研究熱點(diǎn)。但人們用各種方法從自體紅骨髓中提純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞很難達(dá)到臨床應(yīng)用的細(xì)胞數(shù)量，且無(wú)論是體外培養(yǎng)擴(kuò)增還是體內(nèi)移植中發(fā)現(xiàn)均存在細(xì)胞表型變異問(wèn)題，即細(xì)胞去分化成纖維細(xì)胞特征，失去成骨能力，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量受到限制，達(dá)不到組織構(gòu)建的要求。本發(fā)明在廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳計(jì)劃項(xiàng)目《TGF-β1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損》的分析中也發(fā)現(xiàn)，單純的干細(xì)胞雖然具有很強(qiáng)的組織修復(fù)潛能，但其所修復(fù)的組織在3個(gè)月左右即出現(xiàn)退變，遠(yuǎn)期治療效果不佳。選擇合適的細(xì)胞生長(zhǎng)支架是任何組織構(gòu)建過(guò)程中必須面對(duì)的難題，也是本發(fā)明著力要解決的問(wèn)題之一。廣泛使用選取人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強(qiáng)的促成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有強(qiáng)烈的成骨轉(zhuǎn)化作用。在眾多的骨生長(zhǎng)因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合過(guò)程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長(zhǎng)因子。BMP-2位于骨形成過(guò)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，調(diào)控胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨向分化，且成骨過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等又不斷合成、分泌BMP，通過(guò)正反饋機(jī)制不斷促進(jìn)成骨。本發(fā)明在桂林市科委的資助下對(duì)hBMP促進(jìn)成骨作用在骨質(zhì)疏松和椎體滑脫治療的研究中也證實(shí)了hBMP-2的良好的成骨誘導(dǎo)活性。廣泛使用的各種合成材料，即使進(jìn)行了表面改性及修飾處理，但在生物學(xué)和力學(xué)性能上總是不盡人意。這使得近年來(lái)人們又將目光投向天然人工骨材料。迄今為止，研究同行在這一命題的研究多限于基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外成骨效果，而對(duì)體內(nèi)如何控制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到體內(nèi)后的分化方向及細(xì)胞誘導(dǎo)因子的持續(xù)有效的釋放等方面的研究還很不成熟，這離完整地理解并應(yīng)用組織工程這一原理來(lái)修復(fù)病變組織相差甚遠(yuǎn)。結(jié)合國(guó)內(nèi)外同行的研究報(bào)道和本發(fā)明的研究基礎(chǔ)，不難推斷，如能將使hBMP在整個(gè)組織修復(fù)過(guò)程中持續(xù)地對(duì)細(xì)胞發(fā)生作用，使之朝我們需要的組織細(xì)胞形態(tài)分化，必將把組織工程學(xué)理論在股骨頭缺血性壞死的研究和治療向前推進(jìn)一大步。綜上所述，本發(fā)明擬在股骨頭缺血性壞死的研究中，重點(diǎn)研究腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料復(fù)合修復(fù)股骨頭壞死的作用，并對(duì)其機(jī)理做更加深入的探討，為這一理論成果最終在臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。這一模式應(yīng)用于臨床的前景十分廣闊。它將有力地促進(jìn)我國(guó)在該領(lǐng)域的研究在世界上占有一席之地。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法，旨在解決基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs增殖的影響及基因轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞對(duì)ANFH的修復(fù)治療作用和干細(xì)胞的增殖、分化及退變過(guò)程對(duì)ANFH影響，并且目前的細(xì)胞生長(zhǎng)支架在組織構(gòu)建過(guò)程中存在生物學(xué)和力學(xué)性能上缺陷的問(wèn)題。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法，該腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法包括：將hBMP-2基因以重組缺陷型腺病毒表達(dá)載體Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMSCs；根據(jù)病毒滴度以感染復(fù)數(shù)(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察，可見感染復(fù)數(shù)為100轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％以上；感染復(fù)數(shù)為50轉(zhuǎn)染的細(xì)胞狀態(tài)良好，但細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光蛋白相對(duì)比較少，轉(zhuǎn)染效率約為60％左右；當(dāng)感染倍數(shù)為200時(shí)的感染效率較感染倍數(shù)為100時(shí)的感染效率無(wú)明顯增加，熒光顯微鏡下見EGFP的表達(dá)說(shuō)明Ad-BMP-2/EGFP包裝成功。并將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與同種異體脫鈣骨DBM支架材料在體外復(fù)合；選取脫鈣骨基質(zhì)24塊，放入體積分?jǐn)?shù)為15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中浸泡12h，無(wú)菌濾紙吸干備用。選取BMP-2基因轉(zhuǎn)染48h后的BMSCs與同期對(duì)照組細(xì)胞接種，細(xì)胞懸液充分滲入后放入37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中貼附4h，再緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)48h后倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況，材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)第7天，取各組部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金后觀察。通過(guò)掃描電鏡觀察到細(xì)胞與脫鈣骨基質(zhì)材料復(fù)合體外培養(yǎng)7天后掃描電鏡觀察可見脫鈣骨表面的細(xì)胞粘連成片，細(xì)胞布滿孔隙，呈伸展?fàn)睢⒘Ⅲw狀生長(zhǎng)。植入ANFH的動(dòng)物模型并對(duì)所修復(fù)股骨頭進(jìn)行X線、透射電鏡、組織學(xué)、免疫組化分析(半定量)及力學(xué)性能的檢測(cè)。X線檢測(cè)：術(shù)后第4、8、12周，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在全麻下拍攝雙髖關(guān)節(jié)正位片，X線片拍攝在放射科完成，拍攝條件為45kV、125mA，投照距離為100cm，曝光時(shí)間為32ms，其結(jié)果示：A組術(shù)后4w時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭鉆孔清晰可見，邊緣銳利，骨缺損區(qū)呈現(xiàn)低密度影，部分標(biāo)本出現(xiàn)了小囊性變，股骨頭輪廓欠規(guī)則，扁平塌陷，密度不均；術(shù)后8w時(shí)，低密度透光區(qū)仍然清晰可見，缺損區(qū)周圍有骨吸收現(xiàn)象，股骨頭關(guān)節(jié)面進(jìn)一步塌陷，且骨小梁結(jié)構(gòu)不清晰；12w時(shí)股缺損區(qū)仍然透亮，股骨頭外形縮小，缺損嚴(yán)重，完全塌陷，B組術(shù)后4w時(shí)，股骨頭骨密度降低，缺損區(qū)仍然存在，填充材料呈高密度影，未見明顯吸收，周圍見明顯透光區(qū)，股骨頭無(wú)塌陷；術(shù)后8w時(shí)，股骨頭形態(tài)仍正常，填充材料周圍透光區(qū)仍清晰，鉆孔區(qū)密度高而均勻，鉆孔邊緣出現(xiàn)放射狀骨小梁接合現(xiàn)象，但骨小梁結(jié)構(gòu)比較紊亂；12w股骨頭缺損區(qū)仍然存在，填充材料呈高密度影，體積較前略變小，與周圍邊界模糊，缺損區(qū)可見少許成骨反應(yīng)及松散骨小梁結(jié)構(gòu)，C組4、8、12w變化與B組大致相同，D組術(shù)后4w時(shí)，人工骨影模糊，鉆孔區(qū)有密度增高影，質(zhì)地均勻，鉆孔邊緣變得模糊；術(shù)后8w時(shí)，人工骨影縮小，邊界不清，周圍透光區(qū)影模糊；12w股骨頭內(nèi)出現(xiàn)規(guī)則連續(xù)骨小梁，鉆孔邊緣與人工骨交界區(qū)骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺損的低密度影，鉆孔區(qū)骨密度接近周圍骨質(zhì)，未出現(xiàn)股骨頭塌陷和關(guān)節(jié)間隙狹窄等骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)；Lane-SandhuX線評(píng)分整理各組動(dòng)物X線檢查結(jié)果，參照Lane-SandhuX線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組股骨頭修復(fù)情況進(jìn)行評(píng)分；HE染色和鏡檢測(cè)：取出股骨頭標(biāo)本和一塊正常股骨頭，沿轉(zhuǎn)子間連線鋸斷股骨頭，行HE染色，其步驟如下：①股骨頭標(biāo)本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸餾水將固定標(biāo)本沖洗3次，然后沿轉(zhuǎn)子間連線鋸斷，投入體積分?jǐn)?shù)10％硝酸溶液中進(jìn)行脫鈣5天。③用梯度酒精脫水：體積分?jǐn)?shù)60％酒精脫水1h，體積分?jǐn)?shù)70％酒精脫水1h，體積分?jǐn)?shù)80％酒精脫水過(guò)夜，體積分?jǐn)?shù)90％酒精脫水lh，體積分?jǐn)?shù)95％酒精脫水30min，無(wú)水乙醇脫水1h，再無(wú)水乙醇脫水1h，純氯仿中靜置48h，使組織變得透明，5.5h后更換一次純氯仿。④對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行浸蠟處理，第一蠟2h，第二蠟2h，然后用蠟塊包埋標(biāo)本，行5μm厚冠狀切片，連續(xù)5張。A、B、C、D組及正常組(健側(cè)股骨頭)標(biāo)本于倒置顯微鏡下觀察觀察骨小梁形態(tài)、成骨細(xì)胞并計(jì)算空骨陷窩率。空骨陷窩率＝空骨陷窩數(shù)/總骨陷窩數(shù)；其結(jié)果顯示：股骨頭正常結(jié)構(gòu)可見大量骨髓組織，骨小梁規(guī)則，骨細(xì)胞形態(tài)正常，A組術(shù)后4w時(shí)骨小梁疏松，部分?jǐn)嗔?，大量骨?xì)胞壞死；8w時(shí)骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、壞死，部分壞死骨小梁開始吸收，出現(xiàn)較多破骨細(xì)胞；12w時(shí)骨小梁廣泛斷裂、壞死、吸收，髓腔內(nèi)出現(xiàn)大量壞死組織，空骨陷窩被擠壓變形，B組術(shù)后4w骨小梁結(jié)構(gòu)不規(guī)則，少許斷裂，軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞壞死量較A組少；8w時(shí)可見成骨反應(yīng)，出現(xiàn)少許結(jié)構(gòu)不規(guī)則的幼稚骨小梁；12w時(shí)缺損區(qū)周邊有成骨反應(yīng)，有向中心部生長(zhǎng)的趨向，新生骨小梁較前增多，但仍為幼稚骨小梁，仍可見壞死骨組織，C組變化與B組大致相當(dāng)，D組術(shù)后4w充填區(qū)周邊出現(xiàn)反應(yīng)帶，周邊為軟骨性骨痂形成，孔隙內(nèi)見纖維肉芽組織及毛細(xì)血管長(zhǎng)入，未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)；8w周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應(yīng)向中心部推進(jìn),而中心部空腔面積明顯減小，部分充填區(qū)基本為幼稚的骨小梁所占據(jù),表面有較多的成骨細(xì)胞；12w時(shí)充填區(qū)廣布相對(duì)較成熟的骨小梁,致密飽滿，無(wú)硬化帶形成，表面骨細(xì)胞數(shù)量較多且清晰可見，B和C組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)空陷細(xì)胞率、D組和正常側(cè)組12W時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；微觀形貌觀察與能譜分析：取4、8、12周的四組標(biāo)本和一塊正常兔股骨頭標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本剖面隨機(jī)挖取3塊1mm×1mm×0.5mm的樣本，浸入雙蒸水震蕩30min，共3次；4％多聚甲醛固定15min；25％、50％、75％、95％、100％酒精各脫水15min，自然晾干；真空鍍膜儀噴金處理；置入Quanta200FEG場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡和X-射線能譜儀，電鏡觀察樣品表面微觀形貌，X線能譜分析儀(EnergyDispersiveSpectrometer，EDS)測(cè)定微區(qū)主要元素(碳、氮、氧、鈣、硫、磷元素)的重量百分比和原子百分比百分含量，重復(fù)3次，然后計(jì)算鈣磷比；其結(jié)果顯示：電鏡下正常骨組織板層結(jié)構(gòu)致密、完整、排列方向一致，鈣化良好，表面光滑，板層之間纖維成交交錯(cuò)，未見骨板斷裂、扭曲等現(xiàn)象，4周時(shí)，A組骨板裂痕仍然清晰，出現(xiàn)纖維增生；8周時(shí)見骨小梁變細(xì)，部分?jǐn)嗔眩w維增生較前增加，欠規(guī)則，未見鈣化顆粒；12周時(shí)見大量扭曲纖維增生充滿視野，表面未見鈣化物，骨小梁大部分消失，無(wú)明顯新生成骨表現(xiàn)；B、C兩組在4～8周時(shí)可見骨小梁變細(xì)，但未出現(xiàn)大量斷裂現(xiàn)象，骨小梁表面出現(xiàn)“云翳狀覆蓋物”，覆蓋物表面出現(xiàn)鈣化顆粒沉積；12周時(shí)可見纖維表面鈣化顆粒進(jìn)一步增多，部分鈣化顆粒堆積成團(tuán)塊，附著于骨小梁上，但是新生骨小梁形態(tài)欠佳，新生骨版結(jié)構(gòu)不整，仍不成熟，D組在4周時(shí)出現(xiàn)大量新生膠原纖維，形態(tài)規(guī)則，方向一致，表面可見顆粒性鈣化物，出現(xiàn)低鈣化類骨質(zhì)；8周時(shí)鈣化物電子密度進(jìn)一步增大，低密度類骨質(zhì)逐漸融合成粗大骨小梁，骨小梁表面細(xì)胞漸豐富；12周時(shí)新生骨繼續(xù)改建，新生骨板致密、規(guī)則，骨小梁結(jié)構(gòu)趨向正常，并出現(xiàn)規(guī)則的骨陷窩及骨細(xì)胞，與正常骨組織形態(tài)大致相同；正常骨組織的主要成分為鈣、磷酸鹽沉積，Ca、P含量較高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆蓋面積約為P元素峰覆蓋面積的兩倍，即Ca/P＝2.06，A組在4-12W的鈣磷含量均較低，各元素水平未見明顯變化，Ca/P為0.82，B、C兩組在4W時(shí)鈣磷含量較低；8W時(shí)Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12W時(shí)Ca、P元素含量進(jìn)一步上升，P元素增速明顯減慢，各元素含量處于比較穩(wěn)定狀態(tài)，Ca含量超過(guò)了P元素，B組Ca/P＝1.33,C組Ca/P＝1.52，D組在4W時(shí)即見到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加較快，呈雙峰；8W時(shí)Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P達(dá)到2.85；12W時(shí)Ca、P含量增速變緩，各元素含量逐漸穩(wěn)定，Ca/P＝1.99，與正常骨組織含量及鈣磷比無(wú)較大差異，所述同種異體脫鈣骨DBM支架材料為在體外構(gòu)建具有生物活性的載體-細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞復(fù)合物，該同種異體脫鈣骨DBM支架材料制備方法為：健康新西蘭大白兔處死后取其四肢骨干骺端骨及椎體松質(zhì)骨，根據(jù)Urist等方法經(jīng)-80℃低溫凍存72h，剔除骨組織以外組織，脫鈣液脫鈣72h，置乙醚、乙醇中脫脂各24h，以無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗、浸泡，直至浸泡液呈中性為止。此時(shí)松質(zhì)骨塊呈白色海綿狀，能壓縮變形并自動(dòng)恢復(fù)至原狀。去酸處理后的骨塊繼續(xù)在蒸餾水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脫鈣骨基質(zhì),環(huán)氧乙烷消毒，4℃保存?zhèn)溆谩５怪蔑@微鏡下觀察支架材料有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，取部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金后觀察。通過(guò)掃描電鏡觀察脫鈣骨基質(zhì)材料表面較平整，可見脫鈣骨基質(zhì)呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小不一，形狀不規(guī)則并相互交通。脫鈣骨基質(zhì)的孔隙直徑為215±86μm，孔隙率達(dá)76±3.51％，所述同種異體脫鈣骨DBM支架材料為具有天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)的原骨鹽支架三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明按照計(jì)劃，掌握了密度梯度離心法提取兔BMSCs的實(shí)驗(yàn)方法，并成功完成了兔BMSCs培養(yǎng)、傳代工作，之后對(duì)其表型進(jìn)行了鑒定。通過(guò)探討凍存技術(shù)對(duì)細(xì)胞的影響，本發(fā)明得出短期凍存(30天以內(nèi))對(duì)細(xì)胞生物活性的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)ALP、Ⅰ型膠原蛋白實(shí)驗(yàn)證明兔BMSCs在體外誘導(dǎo)作用下能夠像成骨細(xì)胞分化。通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，本課題組采用腺病毒MOI為50、100、200三種實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MOI50轉(zhuǎn)染率豬油60％，MOI100時(shí)轉(zhuǎn)染率為96％，且細(xì)胞形狀未見明顯改變，當(dāng)MOI200時(shí)，轉(zhuǎn)染率也為96％，但是此時(shí)細(xì)胞形狀發(fā)生明顯改變，病毒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。因此認(rèn)為腺病毒的最佳MOI為100。轉(zhuǎn)染后運(yùn)用PCR、Weston-blot。免疫組化方法檢測(cè)BMP-2基因在BMSCs內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá)。本課題組根據(jù)Urist法成功構(gòu)建DBM，并運(yùn)用SEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其孔隙率接近正常骨組織，最為支架材料其性能明顯優(yōu)于其他支架材料。BMSCs復(fù)合DBM后，運(yùn)用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和SEM檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BMSCs與DBM復(fù)合情況良好，且復(fù)合BMSCs能在DBM表面生存，并產(chǎn)生細(xì)胞分泌物,證明很課題組成功構(gòu)建組織工程骨。將組織工程骨進(jìn)行體成骨誘導(dǎo)，通過(guò)茜素紅染色、SEM、EDS方法檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)、表面微觀形貌、能譜分等指標(biāo)，證明體外組織工程骨具有良好的成骨效應(yīng)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，本課題組成功掌握兔缺血性股骨頭壞死模型的制作方法，并成功制造合格的股骨頭壞死模型。將組織工程骨植入兔股骨頭壞死模型后，通過(guò)PCR、TRFQ-PCR和Wseton-blot方法檢測(cè)hBMP-2表達(dá)情況，證明hBMP-2基因能夠在異種體內(nèi)表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。組織工程骨植入動(dòng)物模型后，同意標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，盡量排出外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，運(yùn)用X線、解剖學(xué)觀察、HE染色、SEM、EDS方法檢測(cè)股骨頭壞死修復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)植入組織工程骨的實(shí)驗(yàn)組比未植入組織工程的對(duì)照組有明顯的修復(fù)效果。證明本發(fā)明的Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對(duì)缺血性股骨頭壞死有明顯的修復(fù)效果。本發(fā)明用腺病毒介導(dǎo)的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein-2gene,Ad-hBMP-2)轉(zhuǎn)染MSCs并與同種異體脫鈣骨(demineralizedbonematrix，DBM)支架材料在體外復(fù)合，植入股骨頭缺血性壞死(ANFH)的動(dòng)物模型，期望成功修復(fù)缺血壞死的股骨頭，并使其具備正常關(guān)節(jié)所需的生物學(xué)及力學(xué)特性。基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后合成的蛋白經(jīng)過(guò)自身細(xì)胞翻譯后修飾，能更有效地同細(xì)胞表面受體結(jié)合，調(diào)控靶細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。腺病毒表達(dá)載體因具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因高水平表達(dá)、免疫排斥反應(yīng)低、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，亦成為臨床基因治療的主要載體。因?yàn)楣切迯?fù)是一個(gè)階段性過(guò)程，不需要轉(zhuǎn)染的目的基因長(zhǎng)久表達(dá)，因此利用其將目的基因?qū)敫杉?xì)胞促進(jìn)骨再生比較理想。選取人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強(qiáng)的促成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有強(qiáng)烈的成骨轉(zhuǎn)化作用。在眾多的骨生長(zhǎng)因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合過(guò)程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長(zhǎng)因子。BMP-2位于骨形成過(guò)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，調(diào)控胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨向分化，且成骨過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等又不斷合成、分泌BMP，通過(guò)正反饋機(jī)制不斷促進(jìn)成骨。選擇合適的細(xì)胞生長(zhǎng)支架是任何組織構(gòu)建過(guò)程中必須面對(duì)的難題，也是本發(fā)明著力要解決的問(wèn)題之一。廣泛使用選取人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強(qiáng)的促成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有強(qiáng)烈的成骨轉(zhuǎn)化作用。在眾多的骨生長(zhǎng)因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合過(guò)程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長(zhǎng)因子。BMP-2位于骨形成過(guò)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，調(diào)控胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨向分化，且成骨過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等又不斷合成、分泌BMP，通過(guò)正反饋機(jī)制不斷促進(jìn)成骨。本發(fā)明在桂林市科委的資助下對(duì)hBMP促進(jìn)成骨作用在骨質(zhì)疏松和椎體滑脫治療的研究中也證實(shí)了hBMP-2的良好的成骨誘導(dǎo)活性。廣泛使用的各種合成材料，即使進(jìn)行了表面改性及修飾處理，但在生物學(xué)和力學(xué)性能上總是不盡人意。這使得近年來(lái)人們又將目光投向天然人工骨材料。因此，本發(fā)明選擇同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料在體外構(gòu)建具有生物活性的載體-細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞復(fù)合物將有助于解決細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子持續(xù)發(fā)揮作用這一難題。通過(guò)體內(nèi)植入法證實(shí)同種異體脫鈣骨基質(zhì)(demineralizedbonematrix,DBM)與MSCs具有良好的生物相容性，且具有體內(nèi)成骨及成軟骨能力。用同種異體或異種骨制備的生物衍生骨支架材料具有天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，原骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)，其組成及結(jié)構(gòu)符合生理要求，具有良好的組織相容性，有利于細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)與分化。天然骨從形態(tài)學(xué)和力學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，都具有合成材料無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。脫鈣松質(zhì)骨的吸收與新骨的形成基本同步,既為新骨生成提供支架,又不影響新骨的塑形，具有較好的細(xì)胞界面，利于細(xì)胞貼附、遷移與增殖。本發(fā)明也對(duì)脫鈣骨材料的生物學(xué)特征以及與干細(xì)胞的生物相容性方面進(jìn)行了比較系統(tǒng)的分析，已證實(shí)它是一種比較理想的生物支架材料。在細(xì)胞增殖的整個(gè)周期，其降解速度與細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的速度相吻合，其降解率及生物黏附性能均能滿足骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖需要。迄今為止，研究同行在這一命題的研究多限于基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外成骨效果，而對(duì)體內(nèi)如何控制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到體內(nèi)后的分化方向及細(xì)胞誘導(dǎo)因子的持續(xù)有效的釋放等方面的研究還很不成熟，這離完整地理解并應(yīng)用組織工程這一原理來(lái)修復(fù)病變組織相差甚遠(yuǎn)。通過(guò)本發(fā)明使hBMP在整個(gè)組織修復(fù)過(guò)程中持續(xù)地對(duì)細(xì)胞發(fā)生作用，使之朝需要的組織細(xì)胞形態(tài)分化，必將把組織工程學(xué)理論在股骨頭缺血性壞死的研究和治療向前推進(jìn)一大步。綜上所述，本發(fā)明擬在股骨頭缺血性壞死的研究中，重點(diǎn)研究腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料復(fù)合修復(fù)股骨頭壞死的作用，并對(duì)其機(jī)理做更加深入的探討，為這一理論成果最終在臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。這一模式應(yīng)用于臨床的前景十分廣闊。它將有力地促進(jìn)我國(guó)在該領(lǐng)域的研究在世界上占有一席之地。通過(guò)本發(fā)明，闡明干細(xì)胞的增殖、定向分化及退變的條件及影響因素；通過(guò)體外測(cè)試，選擇最適合的細(xì)胞移植濃度并制定相應(yīng)參數(shù)，為干細(xì)胞治療ANFH提供細(xì)胞學(xué)理論支持。通過(guò)本發(fā)明，證實(shí)干細(xì)胞的基因修飾對(duì)維持其細(xì)胞表型、控制其定向分化的重要性。通過(guò)對(duì)Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染MSCs復(fù)合DBM體內(nèi)植入后所修復(fù)壞死股骨頭的數(shù)據(jù)分析，成功論證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、分化及退變等與股骨頭缺血性壞死的關(guān)系，闡明這一模式治療ANFH的機(jī)理，為干細(xì)胞治療股骨頭缺血性壞死這一理論成果最終向臨床過(guò)渡提供依據(jù)與支持。通過(guò)本發(fā)明，培養(yǎng)研究生掌握組織工程學(xué)理論的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為他們以后的研究奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法流程圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。1.自體MSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、細(xì)胞表型的鑒定及體外定向誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。1.1骨髓液提取：0.7％無(wú)巴比妥1ml/Kg耳緣靜脈注射，待兔子麻醉后剔除剔除股骨粗隆周圍毛發(fā)，用碘伏消毒，用12號(hào)骨穿針外接10ml注射器，注射器內(nèi)含稀釋的肝素103U/L0.2ml，從股骨大轉(zhuǎn)子處穿刺抽取骨髓7ml，加入含有5mlDMEM培養(yǎng)基的離心管中充分混勻，在轉(zhuǎn)速為1500rap/min離心5min。棄上清，加入3mlDMEM培養(yǎng)基重懸浮。1.2原代細(xì)胞培養(yǎng)：將重懸浮的骨髓液用吸管緩慢注入預(yù)置有等體積70％的percoll分離液，在轉(zhuǎn)速2500r/min離心20min。提取中間絮狀層，加入DMEM培養(yǎng)基至5ml，在轉(zhuǎn)速為1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上層清液加入含有15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基7ml重懸浮接種于60mm培養(yǎng)皿中。放入CO2濃度為5％，溫度為37℃的恒溫箱中培養(yǎng)。接種24小時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，見呈圓形的單核細(xì)胞，未見貼壁細(xì)胞。接種72小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察見好量細(xì)胞貼壁，成短梭性。在接種后的第5天棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。加入含15％FBS的DMEM5ml，以后每周換液兩次。在接種后的第10天，在顯微鏡下觀察見細(xì)胞的大部分貼壁，并且呈旋渦狀，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1.3傳代細(xì)胞培養(yǎng)：接種后7天，將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，在倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞生長(zhǎng)良好，并且呈現(xiàn)長(zhǎng)梭狀，融合率達(dá)80％。將原培養(yǎng)基棄除，用PBS洗滌3次。加入0.25％含有EDTA的胰蛋白酶0.5ml，放置于溫室孵育箱3～5min后，在倒置顯微鏡下觀察見大部分細(xì)胞呈圓形脫落，隨液體流動(dòng)。加入5mlDMEM終止消化，用吸管反復(fù)吹打，使貼壁細(xì)胞盡可能的完全脫落下來(lái)，移入離心管中，1500rap/min，離心5min后，棄上層清液，加入5ml含有15％FBS的DMEM反復(fù)吹打，使細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞液按1:2接種于新的60mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。記為P1放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。以后的傳代細(xì)胞記為P2，P3…代細(xì)胞。第20代BMSCs1.4MTT檢測(cè)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好地P2，P4代細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，加入0.25％含有EDTA的胰蛋白酶0.5ml，放置于溫室孵育箱1～2min后，在倒置顯微鏡下觀察見大部分細(xì)胞呈圓形脫落，隨液體流動(dòng)。加入4mlDMEM終止消化，用吸管反復(fù)吹打，使貼壁細(xì)胞盡可能的完全脫落下來(lái)，移入離心管，1500rap/min，離心5min后，棄上層清液，加入4mlDMEM,用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液，滴加10ul在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度＝(A1+A2+A3+A4)÷4×10000.所需細(xì)胞懸液體積＝細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞濃度。以2.5×103個(gè)細(xì)胞/孔移入7個(gè)96孔板(一天用一塊96孔板防止污染)，每孔100μl，每組設(shè)5孔，再在每孔加入含5％FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別于接種后1、2、3、4、5、6、7天加MTT液(MTT用PBS溶解濃度為5mg/ml，過(guò)濾滅菌，4℃避光保存)10μl，37℃孵育4小時(shí)，小心棄除培養(yǎng)液，加入DMSO150μl，振蕩待甲臜產(chǎn)物充分溶解，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(波長(zhǎng)490nm)，計(jì)算每組5個(gè)孔OD的平均值，以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制細(xì)胞增殖。1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P1,P4代細(xì)胞，加入0.25％的胰蛋白酶(含有EDTA)0.5ml，放置在溫室孵育箱孵育3～5分鐘。在倒置顯微鏡下觀察，見大部分細(xì)胞脫落，呈圓形并隨液體流動(dòng)，加入5mlDMEM培養(yǎng)基終止消化，1500rap/min，離心5min，棄上層清液。加入3mlPBS洗滌3遍，1500rap/min，離心5min。離心后棄上層清液，加入1mlPBS重懸浮，震蕩加入9ml70％冰乙醇。放置于4℃冰箱固定30min。1500rap/min，離心5min，離心后去上層清液，加入冷PBS洗滌1次，加入400ulPI染液，室溫避光放置15min。1.6BMSCs表型檢測(cè)：取第10代兔BMSCs約1.5×106個(gè)，胰酶消化，1500轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌2次，加入100ul的PBS重懸細(xì)胞；分別加一抗鼠抗兔CD44、CD45，室溫放置30min；用PBS洗滌2次，100ulPBS重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)二抗山羊抗小鼠PerCP標(biāo)記單克隆抗體，室溫避光放置30min；加PBS洗滌3次，以300ulPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)。1.7探究?jī)龃婕夹g(shù)對(duì)BMSCs的影響以及體外定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)：1.7.1凍存與復(fù)蘇：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第5代兔BMSCs消化、離心，加入凍存保護(hù)液，程序降溫過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮中30d復(fù)蘇，凍存后細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞可貼壁，但不貼壁細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組增加，細(xì)胞梭形，較瘦長(zhǎng)，部分細(xì)胞出現(xiàn)老化，傳代時(shí)間延長(zhǎng)，多次傳代后細(xì)胞可逐漸恢復(fù)凍存前狀態(tài)，1.7.2.BMSCs復(fù)蘇后計(jì)算細(xì)胞存活率、MTT吸光度發(fā)現(xiàn)：短期凍存后BMSCs的存活率為(84.38士3.78)％，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期延長(zhǎng)，MTT吸光值從第3天開始增加(即細(xì)胞增殖速度)，第4天后增殖速度能夠與對(duì)照組持平(P>0.05，n＝8)，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。1.7.3細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組各選1皿細(xì)胞消化、離心、洗滌，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組G1、S、G2/M期的細(xì)胞比例及增殖指數(shù)(PI)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，n＝9)。1.7.4BMSCs表面標(biāo)志實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組表面抗原陽(yáng)性率(％)分別為CD44：93.62±1.05、93.95±0.71；CD45：0.24±0.11、0.29±0.10，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，n＝3)，凍存復(fù)蘇對(duì)BMSCs表面抗原無(wú)明顯影響，細(xì)胞并未因凍存而發(fā)生變異。1.7.5.ALP表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組經(jīng)成骨誘導(dǎo)后7d、14d后ALP含量，隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，ALP含量呈遞增趨勢(shì)，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ALP含量變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，n＝9)。1.7.6Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色成骨誘導(dǎo)14d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Ⅰ型膠原染色均呈陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，大小形態(tài)均一，經(jīng)凍存后BMSCsⅠ型膠原蛋白表達(dá)量(平均光密度分析)變化與未凍存組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，n＝9)。1.7.7鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)到約10d左右細(xì)胞呈梭形表面粗糙，細(xì)胞間隙緊密，細(xì)碎顆粒、扁平樣改變，14d左右漩渦中心形成細(xì)胞團(tuán)，21d形成鈣化結(jié)節(jié)，肉眼可見培養(yǎng)皿底散在白色狀物，染色后均為紅色，兩組鈣結(jié)節(jié)面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，n＝9)。2.Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染MSCs的試驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)目的基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)。2.1Ad-BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs根據(jù)病毒滴度以感染復(fù)數(shù)(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察，可見感染復(fù)數(shù)為100轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％以上，感染復(fù)數(shù)為50轉(zhuǎn)染的細(xì)胞狀態(tài)良好，但細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光蛋白相對(duì)比較少，轉(zhuǎn)染效率約為60％左右，當(dāng)感染倍數(shù)為200時(shí)的感染效率較感染倍數(shù)為100時(shí)的感染效率無(wú)明顯增加，熒光顯微鏡下見EGFP的表達(dá)說(shuō)Ad-BMP-2/EGFP包裝成功。Ad-BMP-2/GFP染兔BMSCsa:MOI:50,b:MOI:100,c:MOI:200。2.2免疫組化取Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞消化后爬片，按S-P免疫組化試劑盒進(jìn)行操作，DAB顯色，封片，倒置顯微鏡觀察，未轉(zhuǎn)染組當(dāng)對(duì)照。轉(zhuǎn)染后BMP-2、免疫組化檢測(cè)結(jié)果示兔BMSCs細(xì)胞胞漿呈陽(yáng)性表達(dá)，可見棕黃色染色，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈陰性，可能由于細(xì)胞內(nèi)分泌的BMP-2蛋白量較少，抗原抗體結(jié)合量不足，估胞漿無(wú)染色，2.3Westen-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞BMP-2的表達(dá)轉(zhuǎn)染后48h，分別提取轉(zhuǎn)染48h后及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白，Western-blot檢測(cè)到約Mr30000大小的陽(yáng)性條帶，而Ad-EGFP組及未轉(zhuǎn)染組的條帶較弱，說(shuō)明Ad-BMP-2/EGFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs后BMP2目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)有高表達(dá)。3.同種異體DBM材料的制備、生物相容性檢測(cè)及力學(xué)性能分析。健康新西蘭大白兔處死后取其四肢骨干骺端骨及椎體松質(zhì)骨，根據(jù)Urist等方法經(jīng)-80℃低溫凍存72h，剔除骨組織以外組織，脫鈣液(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供)脫鈣72h，置乙醚、乙醇中脫脂各24h，以無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗、浸泡，直至浸泡液呈中性為止。此時(shí)松質(zhì)骨塊呈白色海綿狀，能壓縮變形并自動(dòng)恢復(fù)至原狀。去酸處理后的骨塊繼續(xù)在蒸餾水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脫鈣骨基質(zhì),環(huán)氧乙烷消毒，4℃保存?zhèn)溆?。倒置顯微鏡下觀察支架材料有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，取部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金后觀察。通過(guò)掃描電鏡觀察脫鈣骨基質(zhì)材料表面較平整，可見脫鈣骨基質(zhì)呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小不一，形狀不規(guī)則并相互交通。脫鈣骨基質(zhì)的孔隙直徑為215±86μm，孔隙率達(dá)76±3.51％，4.Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染MSCs與DBM的體外復(fù)合試驗(yàn)，掌握兩者之間最佳復(fù)合條件。選取脫鈣骨基質(zhì)24塊，放入體積分?jǐn)?shù)為15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中浸泡12h，無(wú)菌濾紙吸干備用。選取BMP-2基因轉(zhuǎn)染48h后的BMSCs與同期對(duì)照組細(xì)胞接種，細(xì)胞懸液充分滲入后放入37℃、5％CO2、飽和濕度孵箱中貼附4h，再緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜置培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)48h后倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況，所示。材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)第7天，取各組部分樣品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金后觀察。通過(guò)掃描電鏡觀察到細(xì)胞與脫鈣骨基質(zhì)材料復(fù)合體外培養(yǎng)7天后掃描電鏡觀察可見脫鈣骨表面的細(xì)胞粘連成片，細(xì)胞布滿孔隙，呈伸展?fàn)?、立體狀生長(zhǎng)，5.DBM/Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染MSCs的體內(nèi)植入試驗(yàn)，并對(duì)所修復(fù)股骨頭進(jìn)行放射學(xué)(X線及MRI)、解剖學(xué)、組織學(xué)、電鏡掃描、能譜分析檢測(cè)，評(píng)估其對(duì)股骨頭壞死的修復(fù)效果。5.1制造兔股骨頭壞死模型：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均右側(cè)參與實(shí)驗(yàn)，參照髓芯減壓術(shù)聯(lián)合液氮冰凍的操作步驟，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取俯臥位，10％水合氯醛水溶液耳緣靜脈注射(3ml/kg)麻醉。找到股骨頭體表投影位置，橫線為脊柱位置，“●”為股骨大轉(zhuǎn)子，“+”為股骨頭體表投影。由臀大肌與闊筋膜張肌的間隙進(jìn)入，暴露臀小肌及髓關(guān)節(jié)外旋肌群，并貼骨面將其切斷，暴露關(guān)節(jié)囊以后小十字口切開，外旋股骨頭，使股骨頭暴露而不使其脫位，在骨與軟骨的交界處用直徑為3.5mm的無(wú)菌鉆頭，向股骨頭方向打孔，深度為4mm，用小刮匙刮除股骨頭內(nèi)骨質(zhì)，造成約50％的缺損，然后用液氮持續(xù)冷凍股骨頭，約5min，手術(shù)后飼養(yǎng)四周，X線確認(rèn)造模是否成功，5.2將組織工程骨植入動(dòng)物模型體內(nèi)，用RT-PCR、RTFQ-PCR和Westen-blot檢測(cè)hBMP-2在動(dòng)物體內(nèi)的活性：5.2.1選取36只造模成功實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為A、B、C三組，分別向股骨頭壞死部位填塞DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，然后用醫(yī)用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關(guān)閉切口；術(shù)后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臀大肌處注射青霉素鈉注射液預(yù)防感染(40萬(wàn)單位/只·天，連續(xù)3天)。5.2.2PCR檢測(cè)hBMP-2基因的表達(dá):術(shù)后1、2、3周各組分別處死4只兔子，取部分股骨頭樣品放入研缽，加入液氮，研磨成粉末后加入1.5mlEP管，然后按照總RNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟操作，并通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，使用分光光度計(jì)進(jìn)行純度濃度測(cè)定，計(jì)算出RT-PCR反應(yīng)體系(20μl體系)中所需1μgRNA所需的體積量。使用PCR儀與M-MLVFirstStrandKit試劑盒合成cDNA。根據(jù)hBMP-2的基因序列利用primer5.0合成引物，使用PCR儀與2×TaqPCRMasterMix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用培清JS-780全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照、分析。結(jié)果顯示：凝膠成像分析系統(tǒng)顯示:DNAMarker大小為100-600bp，GAFDH大小為221bp，目的條帶(hBMP-2)大小為180bp。術(shù)后1、2、3周，A組和B組hBMP-2目的基因均為陰性表達(dá)，C組在植入后第1、2、3W后hBMP-2目的基因均為陽(yáng)性表達(dá)，5.2.3RTFQ-PCR技術(shù)檢測(cè)hBMP-2基因的表達(dá):取1.2.3中C組1、2、3WRNA1μg，逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)分析。結(jié)果顯示：RTFQ-PCR:C組兔子植入hBMP-2/BMSCs/DBM后，第1、2、3周時(shí)hBMP-2基因均有表達(dá)。設(shè)C組術(shù)后1周時(shí)hBMP-2基因的相對(duì)表達(dá)量為(RQ)＝1，2、3WRQ值分別為0.947±0.025、0.895±0.059。1周與2周比較P＝0.072＞0.05，2周與3周比較P＝0.081＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.2.4WesternBlot檢測(cè)hBMP-2蛋白的表達(dá):術(shù)后1、2、3周各組分別處死4只兔子，取部分股骨頭樣品放入研缽，加入液氮，研磨成粉末后按照總蛋白提取盒步驟提取總蛋白。提取物用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，轉(zhuǎn)膜，一抗，二抗，顯影，Bio-RadChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，以內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出每組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。其結(jié)果顯示：術(shù)后1、2、3周A組和B組hBMP-2蛋白均為陰性表達(dá)，C組hBMP-2蛋白均為陽(yáng)性表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)灰度分析顯示:C組術(shù)后1、2、3周hBMP-2蛋白目的/內(nèi)參表達(dá)量的值分別為0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086，且1周與2周、1周與3周、2周與3周兩兩比較的P值分別為:0.702、0.382、0.607，均大于0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5.3將組織工程骨植入動(dòng)物模型，評(píng)估其對(duì)股骨頭壞死的修復(fù)效果。5.3.1選取48只動(dòng)物模型，隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組12只。A組為造模組，不做處理，復(fù)溫后立即逐層關(guān)閉切口；B、C、D各組動(dòng)物在造模復(fù)溫后沿向鉆孔內(nèi)分別填塞體積為3mm×3mm×3mm大小的DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，醫(yī)用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關(guān)閉切口；術(shù)后各組動(dòng)物臀大肌注射青霉素鈉預(yù)防感染(40萬(wàn)U/只/d，連續(xù)3d)。5.3.2X線檢查：術(shù)后第4、8、12周，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在全麻下拍攝雙髖關(guān)節(jié)正位片，X線片拍攝在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)院放射科完成，拍攝條件為45kV、125mA，投照距離為100cm，曝光時(shí)間為32ms。其結(jié)果示：A組術(shù)后4w時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭鉆孔清晰可見，邊緣銳利，骨缺損區(qū)呈現(xiàn)低密度影，部分標(biāo)本出現(xiàn)了小囊性變，股骨頭輪廓欠規(guī)則，扁平塌陷，密度不均；術(shù)后8w時(shí)，低密度透光區(qū)仍然清晰可見，缺損區(qū)周圍有骨吸收現(xiàn)象，股骨頭關(guān)節(jié)面進(jìn)一步塌陷，且骨小梁結(jié)構(gòu)不清晰；12w時(shí)股缺損區(qū)仍然透亮，股骨頭外形縮小，缺損嚴(yán)重，完全塌陷，B組術(shù)后4w時(shí)，股骨頭骨密度降低，缺損區(qū)仍然存在，填充材料呈高密度影，未見明顯吸收，周圍見明顯透光區(qū)，股骨頭無(wú)塌陷；術(shù)后8w時(shí)，股骨頭形態(tài)仍正常，填充材料周圍透光區(qū)仍清晰，鉆孔區(qū)密度高而均勻，鉆孔邊緣出現(xiàn)放射狀骨小梁接合現(xiàn)象，但骨小梁結(jié)構(gòu)比較紊亂；12w股骨頭缺損區(qū)仍然存在，填充材料呈高密度影，體積較前略變小，與周圍邊界模糊，缺損區(qū)可見少許成骨反應(yīng)及松散骨小梁結(jié)構(gòu)，C組4、8、12w變化與B組大致相同，D組術(shù)后4w時(shí)，人工骨影模糊，鉆孔區(qū)有密度增高影，質(zhì)地均勻，鉆孔邊緣變得模糊；術(shù)后8w時(shí)，人工骨影縮小，邊界不清，周圍透光區(qū)影模糊；12w股骨頭內(nèi)出現(xiàn)規(guī)則連續(xù)骨小梁，鉆孔邊緣與人工骨交界區(qū)骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺損的低密度影，鉆孔區(qū)骨密度接近周圍骨質(zhì)，未出現(xiàn)股骨頭塌陷和關(guān)節(jié)間隙狹窄等骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，5.3.3Lane-SandhuX線評(píng)分整理各組動(dòng)物X線檢查結(jié)果，參照Lane-SandhuX線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組股骨頭修復(fù)情況進(jìn)行評(píng)分，其標(biāo)準(zhǔn)見表1：表1.Lane-SandhuX線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)含義分值骨形成無(wú)骨形成0骨形成占缺損25％1骨形成占缺損50％2骨形成占缺損75％3骨形成充滿缺損4骨連接骨折線清楚0骨折線消失2骨折線部分存在4骨塑形未見骨塑形0骨髓腔形成2皮質(zhì)骨塑形45.3.4股骨頭大體觀察術(shù)后4周、8周、12周行X線檢查后，每組隨機(jī)選取4只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以空氣栓塞法處死，取出雙側(cè)股骨，清除表面組織，觀察股骨頭形態(tài)，測(cè)量鉆孔孔徑，測(cè)量完畢后置入-80℃超低溫冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。其結(jié)果顯示：A組術(shù)后4w鉆孔存在，孔徑(3.200±0.163)mm，鉆孔周圍可見少許纖維組織，股骨頭部分塌陷；8w孔徑(3.225±0.150)mm，纖維組織繼續(xù)增生；12w鉆孔依然存在，孔徑(3.275±0.096)mm，股骨頸縮短，周圍可見大量鮮紅色纖維組織覆蓋，股骨頭完全塌陷，B組術(shù)后4w鉆孔清晰可見，孔徑(3.000±0.141)mm，股骨頭未見塌陷；8w時(shí)孔徑呈橢圓形，周圍可見少許成骨，股骨頭無(wú)塌陷；12w時(shí)鉆孔呈不規(guī)則形，長(zhǎng)徑(2.500±0.141)mm，股骨頭無(wú)塌陷，C組術(shù)后4w仍可見鉆孔，孔徑(3.200±0.163)mm，股骨頭無(wú)塌陷；8w時(shí)孔徑(2.825±0.126)mm，鉆孔周圍有少許成骨，股骨頭未見塌陷；12w時(shí)鉆孔徑(2.475±0.170)mm，可見成骨反應(yīng)，股骨頭無(wú)塌陷，D組術(shù)后4w可見鉆孔不規(guī)則改變，孔徑(2.475±0.170)mm，周圍可見少許成骨反應(yīng)，股骨頭未見塌陷；8w時(shí)孔徑(1.500±0.216)mm，周邊可見明顯成骨反應(yīng)，開始有新生骨長(zhǎng)入缺損區(qū)，色澤近似周圍組織；12w鉆孔已經(jīng)完全消失，完全被新生骨替代，鉆孔區(qū)僅殘留少許結(jié)節(jié)樣修復(fù)痕跡，新生骨色澤與正常組織無(wú)明顯差異，股骨頭完好，5.3.5HE染色和鏡檢：取出1.2.6中股骨頭標(biāo)本和一塊正常股骨頭，沿轉(zhuǎn)子間連線鋸斷股骨頭，行HE染色，其步驟如下：①股骨頭標(biāo)本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸餾水將固定標(biāo)本沖洗3次，然后沿轉(zhuǎn)子間連線鋸斷，投入體積分?jǐn)?shù)10％硝酸溶液中進(jìn)行脫鈣5天。③用梯度酒精脫水：體積分?jǐn)?shù)60％酒精脫水1h，體積分?jǐn)?shù)70％酒精脫水1h，體積分?jǐn)?shù)80％酒精脫水過(guò)夜，體積分?jǐn)?shù)90％酒精脫水lh，體積分?jǐn)?shù)95％酒精脫水30min，無(wú)水乙醇脫水1h，再無(wú)水乙醇脫水1h，純氯仿中靜置48h，使組織變得透明，5.5h后更換一次純氯仿。④對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行浸蠟處理，第一蠟2h，第二蠟2h，然后用蠟塊包埋標(biāo)本，行5μm厚冠狀切片，連續(xù)5張。A、B、C、D組及正常組(健側(cè)股骨頭)標(biāo)本于倒置顯微鏡下觀察觀察骨小梁形態(tài)、成骨細(xì)胞并計(jì)算空骨陷窩率?？展窍莞C率＝空骨陷窩數(shù)/總骨陷窩數(shù)。其結(jié)果顯示：股骨頭正常結(jié)構(gòu)可見大量骨髓組織，骨小梁規(guī)則，骨細(xì)胞形態(tài)正常，A組術(shù)后4w時(shí)骨小梁疏松，部分?jǐn)嗔眩罅抗羌?xì)胞壞死；8w時(shí)骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、壞死，部分壞死骨小梁開始吸收，出現(xiàn)較多破骨細(xì)胞；12w時(shí)骨小梁廣泛斷裂、壞死、吸收，髓腔內(nèi)出現(xiàn)大量壞死組織，空骨陷窩被擠壓變形，B組術(shù)后4w骨小梁結(jié)構(gòu)不規(guī)則，少許斷裂，軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞壞死量較A組少；8w時(shí)可見成骨反應(yīng)，出現(xiàn)少許結(jié)構(gòu)不規(guī)則的幼稚骨小梁；12w時(shí)缺損區(qū)周邊有成骨反應(yīng)，有向中心部生長(zhǎng)的趨向，新生骨小梁較前增多，但仍為幼稚骨小梁，仍可見壞死骨組織，C組變化與B組大致相當(dāng)，D組術(shù)后4w充填區(qū)周邊出現(xiàn)反應(yīng)帶，周邊為軟骨性骨痂形成，孔隙內(nèi)見纖維肉芽組織及毛細(xì)血管長(zhǎng)入，未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)；8w周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應(yīng)向中心部推進(jìn),而中心部空腔面積明顯減小，部分充填區(qū)基本為幼稚的骨小梁所占據(jù),表面有較多的成骨細(xì)胞；12w時(shí)充填區(qū)廣布相對(duì)較成熟的骨小梁,致密飽滿，無(wú)硬化帶形成，表面骨細(xì)胞數(shù)量較多且清晰可見，B和C組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)空陷細(xì)胞率、D組和正常側(cè)組12W時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。術(shù)后12w骨小梁觀察(HE，×100)a～e分別為正常組織、A、B、C及D組；箭頭示骨小梁；表42空骨陷窩率(n＝12,x±s)；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組，P＜0.055.3.6微觀形貌觀察與能譜分析：取4、8、12周的四組標(biāo)本和一塊正常兔股骨頭標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本剖面隨機(jī)挖取3塊1mm×1mm×0.5mm的樣本，浸入雙蒸水震蕩30min，共3次；4％多聚甲醛固定15min；25％、50％、75％、95％、100％酒精各脫水15min，自然晾干；真空鍍膜儀噴金處理；置入Quanta200FEG場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡和X-射線能譜儀，電鏡觀察樣品表面微觀形貌，X線能譜分析儀(EnergyDispersiveSpectrometer，EDS)測(cè)定微區(qū)主要元素(碳、氮、氧、鈣、硫、磷元素)的重量百分比和原子百分比百分含量，重復(fù)3次，然后計(jì)算鈣磷比。其結(jié)果顯示：電鏡下正常骨組織板層結(jié)構(gòu)致密、完整、排列方向一致，鈣化良好，表面光滑，板層之間纖維成交交錯(cuò)，未見骨板斷裂、扭曲等現(xiàn)象，4周時(shí)，A組骨板裂痕仍然清晰，出現(xiàn)纖維增生；8周時(shí)見骨小梁變細(xì)，部分?jǐn)嗔?，纖維增生較前增加，欠規(guī)則，未見鈣化顆粒；12周時(shí)見大量扭曲纖維增生充滿視野，表面未見鈣化物，骨小梁大部分消失，無(wú)明顯新生成骨表現(xiàn)。B、C兩組在4～8周時(shí)可見骨小梁變細(xì)，但未出現(xiàn)大量斷裂現(xiàn)象，骨小梁表面出現(xiàn)“云翳狀覆蓋物”，覆蓋物表面出現(xiàn)鈣化顆粒沉積；12周時(shí)可見纖維表面鈣化顆粒進(jìn)一步增多，部分鈣化顆粒堆積成團(tuán)塊，附著于骨小梁上，但是新生骨小梁形態(tài)欠佳，新生骨版結(jié)構(gòu)不整，仍不成熟，D組在4周時(shí)出現(xiàn)大量新生膠原纖維，形態(tài)規(guī)則，方向一致，表面可見顆粒性鈣化物，出現(xiàn)低鈣化類骨質(zhì)；8周時(shí)鈣化物電子密度進(jìn)一步增大，低密度類骨質(zhì)逐漸融合成粗大骨小梁，骨小梁表面細(xì)胞漸豐富；12周時(shí)新生骨繼續(xù)改建，新生骨板致密、規(guī)則，骨小梁結(jié)構(gòu)趨向正常，并出現(xiàn)規(guī)則的骨陷窩及骨細(xì)胞，與正常骨組織形態(tài)大致相同，正常骨組織的主要成分為鈣、磷酸鹽沉積，Ca、P含量較高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆蓋面積約為P元素峰覆蓋面積的兩倍，即Ca/P＝2.06，A組在4-12W的鈣磷含量均較低，各元素水平未見明顯變化，Ca/P為0.82，B、C兩組在4W時(shí)鈣磷含量較低；8W時(shí)Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12W時(shí)Ca、P元素含量進(jìn)一步上升，P元素增速明顯減慢，各元素含量處于比較穩(wěn)定狀態(tài)，Ca含量超過(guò)了P元素，B組Ca/P＝1.33,C組Ca/P＝1.52，D組在4W時(shí)即見到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加較快，呈雙峰；8W時(shí)Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P達(dá)到2.85；12W時(shí)Ca、P含量增速變緩，各元素含量逐漸穩(wěn)定，Ca/P＝1.99，與正常骨組織含量及鈣磷比無(wú)較大差異；本發(fā)明描述了密度梯度離心法提取兔BMSCs的實(shí)驗(yàn)方法，并成功完成了兔BMSCs培養(yǎng)、傳代工作，之后對(duì)其表型進(jìn)行了鑒定。通過(guò)探討凍存技術(shù)對(duì)細(xì)胞的影響，我課題組得出短期凍存(30天以內(nèi))對(duì)細(xì)胞生物活性的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)ALP、Ⅰ型膠原蛋白實(shí)驗(yàn)證明兔BMSCs在體外誘導(dǎo)作用下能夠像成骨細(xì)胞分化。通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，本課題組采用腺病毒MOI為50、100、200三種實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MOI50轉(zhuǎn)染率豬油60％，MOI100時(shí)轉(zhuǎn)染率為96％，且細(xì)胞形狀未見明顯改變，當(dāng)MOI200時(shí)，轉(zhuǎn)染率也為96％，但是此時(shí)細(xì)胞形狀發(fā)生明顯改變，病毒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。因此認(rèn)為腺病毒的最佳MOI為100。轉(zhuǎn)染后運(yùn)用PCR、Weston-blot。免疫組化方法檢測(cè)BMP-2基因在BMSCs內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明根據(jù)Urist法成功構(gòu)建DBM，并運(yùn)用SEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其孔隙率接近正常骨組織，最為支架材料其性能明顯優(yōu)于其他支架材料。BMSCs復(fù)合DBM后，運(yùn)用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡和SEM檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BMSCs與DBM復(fù)合情況良好，且復(fù)合BMSCs能在DBM表面生存，并產(chǎn)生細(xì)胞分泌物,證明很課題組成功構(gòu)建組織工程骨。將組織工程骨進(jìn)行體成骨誘導(dǎo)，通過(guò)茜素紅染色、SEM、EDS方法檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)、表面微觀形貌、能譜分等指標(biāo)，證明體外組織工程骨具有良好的成骨效應(yīng)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，本課題組成功掌握兔缺血性股骨頭壞死模型的制作方法，并成功制造合格的股骨頭壞死模型。將組織工程骨植入兔股骨頭壞死模型后，通過(guò)PCR、TRFQ-PCR和Wseton-blot方法檢測(cè)hBMP-2表達(dá)情況，證明hBMP-2基因能夠在異種體內(nèi)表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。組織工程骨植入動(dòng)物模型后，同意標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，盡量排出外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，運(yùn)用X線、解剖學(xué)觀察、HE染色、SEM、EDS方法檢測(cè)股骨頭壞死修復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)植入組織工程骨的實(shí)驗(yàn)組比未植入組織工程的對(duì)照組有明顯的修復(fù)效果。證明本發(fā)明設(shè)計(jì)的Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對(duì)缺血性股骨頭壞死有明顯的修復(fù)效果。下面結(jié)合附圖1對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。一種腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法，該腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)方法包括：S101：將hBMP-2基因以重組缺陷型腺病毒表達(dá)載體Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMSCs；S102：并將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與同種異體脫鈣骨DBM支架材料在體外復(fù)合；S103：植入ANFH的動(dòng)物模型并對(duì)所修復(fù)股骨頭進(jìn)行X線、透射電鏡、組織學(xué)、免疫組化分析(半定量)及力學(xué)性能的檢測(cè)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明提供的旨在探討基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs增殖的影響及基因轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞對(duì)ANFH的修復(fù)治療作用，闡明干細(xì)胞的增殖、分化及退變過(guò)程與ANFH的關(guān)系及其影響因素，為基因組織工程治療ANFH提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該課題是在總結(jié)國(guó)內(nèi)外體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的一個(gè)大膽嘗試和創(chuàng)新。本發(fā)明在廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳計(jì)劃項(xiàng)目《TGF-β1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損》的分析中也發(fā)現(xiàn)，單純的干細(xì)胞雖然具有很強(qiáng)的組織修復(fù)潛能，但其所修復(fù)的組織在3個(gè)月左右即出現(xiàn)退變，遠(yuǎn)期治療效果不佳。本發(fā)明針對(duì)這一問(wèn)題，用腺病毒介導(dǎo)的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein-2gene,Ad-hBMP-2)轉(zhuǎn)染MSCs并與同種異體脫鈣骨(demineralizedbonematrix，DBM)支架材料在體外復(fù)合，植入股骨頭缺血性壞死(ANFH)的動(dòng)物模型，期望成功修復(fù)缺血壞死的股骨頭，并使其具備正常關(guān)節(jié)所需的生物學(xué)及力學(xué)特性?；蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞后合成的蛋白經(jīng)過(guò)自身細(xì)胞翻譯后修飾，能更有效地同細(xì)胞表面受體結(jié)合，調(diào)控靶細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。腺病毒表達(dá)載體因具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因高水平表達(dá)、免疫排斥反應(yīng)低、安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，亦成為臨床基因治療的主要載體。因?yàn)楣切迯?fù)是一個(gè)階段性過(guò)程，不需要轉(zhuǎn)染的目的基因長(zhǎng)久表達(dá)，因此利用其將目的基因?qū)敫杉?xì)胞促進(jìn)骨再生比較理想。選取人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強(qiáng)的促成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有強(qiáng)烈的成骨轉(zhuǎn)化作用。在眾多的骨生長(zhǎng)因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合過(guò)程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長(zhǎng)因子。BMP-2位于骨形成過(guò)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，調(diào)控胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨向分化，且成骨過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等又不斷合成、分泌BMP，通過(guò)正反饋機(jī)制不斷促進(jìn)成骨。選擇合適的細(xì)胞生長(zhǎng)支架是任何組織構(gòu)建過(guò)程中必須面對(duì)的難題，也是本發(fā)明著力要解決的問(wèn)題之一。廣泛使用選取人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2作為目的基因，是考慮其具有很強(qiáng)的促成骨細(xì)胞增殖、分化的作用。在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有強(qiáng)烈的成骨轉(zhuǎn)化作用。在眾多的骨生長(zhǎng)因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合過(guò)程中效果顯著，已成為骨組織工程常用的生長(zhǎng)因子。BMP-2位于骨形成過(guò)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，調(diào)控胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨向分化，且成骨過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等又不斷合成、分泌BMP，通過(guò)正反饋機(jī)制不斷促進(jìn)成骨。本發(fā)明在桂林市科委的資助下對(duì)hBMP促進(jìn)成骨作用在骨質(zhì)疏松和椎體滑脫治療的研究中也證實(shí)了hBMP-2的良好的成骨誘導(dǎo)活性。廣泛使用的各種合成材料，即使進(jìn)行了表面改性及修飾處理，但在生物學(xué)和力學(xué)性能上總是不盡人意。這使得近年來(lái)人們又將目光投向天然人工骨材料。因此，本發(fā)明選擇同種異體脫鈣骨基質(zhì)材料在體外構(gòu)建具有生物活性的載體-細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞復(fù)合物將有助于解決細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子持續(xù)發(fā)揮作用這一難題。ZhengD等通過(guò)體內(nèi)植入法證實(shí)同種異體脫鈣骨基質(zhì)(demineralizedbonematrix,DBM)與MSCs具有良好的生物相容性，且具有體內(nèi)成骨及成軟骨能力。用同種異體或異種骨制備的生物衍生骨支架材料具有天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，原骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)，其組成及結(jié)構(gòu)符合生理要求，具有良好的組織相容性，有利于細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)與分化。天然骨從形態(tài)學(xué)和力學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，都具有合成材料無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。脫鈣松質(zhì)骨的吸收與新骨的形成基本同步,既為新骨生成提供支架,又不影響新骨的塑形，具有較好的細(xì)胞界面，利于細(xì)胞貼附、遷移與增殖。本發(fā)明在過(guò)去的幾年中，在廣西衛(wèi)生廳計(jì)劃《TGF-β1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損》的研究中，也對(duì)脫鈣骨材料的生物學(xué)特征以及與干細(xì)胞的生物相容性方面進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，已證實(shí)它是一種比較理想的生物支架材料。在細(xì)胞增殖的整個(gè)周期，其降解速度與細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的速度相吻合，其降解率及生物黏附性能均能滿足骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖需要。迄今為止，研究同行在這一命題的研究多限于基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外成骨效果，而對(duì)體內(nèi)如何控制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到體內(nèi)后的分化方向及細(xì)胞誘導(dǎo)因子的持續(xù)有效的釋放等方面的研究還很不成熟，這離完整地理解并應(yīng)用組織工程這一原理來(lái)修復(fù)病變組織相差甚遠(yuǎn)。結(jié)合國(guó)內(nèi)外同行的研究報(bào)道和本發(fā)明的研究基礎(chǔ)，不難推斷，如能將使hBMP在整個(gè)組織修復(fù)過(guò)程中持續(xù)地對(duì)細(xì)胞發(fā)生作用，使之朝我們需要的組織細(xì)胞形態(tài)分化，必將把組織工程學(xué)理論在股骨頭缺血性壞死的研究和治療向前推進(jìn)一大步。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3