專利名稱：細(xì)胞組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及純化的造血干細(xì)胞組合物。
背景技術(shù)：
由于細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，已揭示了不同細(xì)胞的生理性質(zhì)與功能，發(fā)展了把細(xì)胞本身用于醫(yī)療目的的方法。例如，雖然化療和放療已用于治療癌癥，但有時(shí)這種治療方法導(dǎo)致正常細(xì)胞致死性的損害，特別是對骨髓細(xì)胞。于是為了減少這種危險(xiǎn)，提出了自體骨髓移植，即在處理前從病人體內(nèi)收獲骨髓細(xì)胞，在處理后送還到該病人體中。此外，近來已發(fā)展了通過轉(zhuǎn)移所需外源基因到靶細(xì)胞中的稱為基因療法的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)移一多重抗藥性基因到骨髓細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞獲得多重抗藥性，因此使運(yùn)用藥物治療癌癥成為可能；由于這些藥物對骨髓細(xì)胞有劇烈的細(xì)胞毒性，因而到現(xiàn)在為止它們沒被用于這樣的治療。
發(fā)明目的這樣，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包含合適細(xì)胞的組合物或包含適當(dāng)修飾細(xì)胞的組合物是非常重要的。然而，在靶細(xì)胞組合物被癌細(xì)胞污染的情況下，不能得到充分的治療效果；特別是當(dāng)上述多重抗藥性基因被轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞污染的細(xì)胞組合物時(shí)，污染的癌細(xì)胞也獲得多重抗藥性，這對所需的癌癥治療產(chǎn)生不利的影響。
本發(fā)明的目的是提供一適宜于基因治療的靶細(xì)胞組合物，以及一種獲得該組合物的方法；在該組合物中癌細(xì)胞已被大致除掉了。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用特異性誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，只有造血干細(xì)胞組合物中污染的癌細(xì)胞能被特異性地消除掉；而且在用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物處理后，通過轉(zhuǎn)移一所需的外源基因到造血干細(xì)胞中去，能安全地進(jìn)行基因治療。如此，本發(fā)明就完成了。
即本發(fā)明的第一方面是細(xì)胞組合物，它包含大致無癌細(xì)胞的造血干細(xì)胞。特別是包含造血干細(xì)胞的細(xì)胞組合物，通過用對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物從其中已大致消除了癌細(xì)胞。其代表例為包含這種造血干細(xì)胞的緩沖液。
所述組合物中造血干細(xì)胞的量不特別地限制，可根據(jù)組合物的特殊用途而確定。另外，該緩沖液可以包含其它的造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等等，并且它可以包含所述造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基質(zhì)、一種造血干細(xì)胞生長因子、一種干細(xì)胞分化因子、一種造血干細(xì)胞保護(hù)劑等等。
本發(fā)明的第二方面是獲得包含大致無癌細(xì)胞的造血干細(xì)胞的細(xì)胞組合物的一種方法，特別是包括通過用對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物選擇性地消除癌細(xì)胞的步驟的方法。
本發(fā)明的第三方面是包含大致無癌細(xì)胞的、轉(zhuǎn)移了一外源基因的造血干細(xì)胞的細(xì)胞組合物，特別是包含造血干細(xì)胞的下述細(xì)胞組合物，所述細(xì)胞組合物通過用對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物已大致消除了其中的癌細(xì)胞，并于其中轉(zhuǎn)入了一外源基因。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式，它不同于壞死。從形態(tài)學(xué)的觀點(diǎn)來看，細(xì)胞凋亡通過核濃縮、細(xì)胞皺縮、空泡形成、細(xì)胞表面光滑化、細(xì)胞破碎等等而產(chǎn)生，并且是程序化細(xì)胞死亡的一種代表方式(Nikkei Biotech編輯，Nikkei Biotechnology New Terminology Dictionary，第4版，第21-22頁)。
按照本發(fā)明，通過使用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，則所需的、已轉(zhuǎn)入一外源基因的細(xì)胞可移植到宿主中，而沒有把基因轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞這樣的危險(xiǎn)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在本發(fā)明中所用的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物就它對癌細(xì)胞有特異性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性而言，不限于特定的一種；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的選擇性可通過用正常細(xì)胞和癌細(xì)胞來確定。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的實(shí)例包括硫酸化多糖和/或它們的分解產(chǎn)物的誘導(dǎo)物、包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物和/或它們的分解產(chǎn)物的誘導(dǎo)物以及包含由式(1)表示的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的誘導(dǎo)物。
按照本來已知的方法，可以將單獨(dú)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物或與一已知的藥學(xué)上可接受的載體一起配制成藥物制劑。該藥學(xué)上可接受的載體可根據(jù)制劑特定的形式而適當(dāng)?shù)剡x擇；例如，如果是固體制劑的話，可用乳糖、蔗糖、甘露(糖)醇、淀粉、羧甲基纖維素、無機(jī)鹽等等。通過將上述制劑加入細(xì)胞組合物中或?qū)⑺芙獾郊?xì)胞組合物中而進(jìn)行細(xì)胞與上述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的接觸。
用于本發(fā)明的硫酸化多糖的實(shí)例包括巖藻多糖、硫酸葡聚糖等等。
巖藻多糖是在其分子中包含硫酸巖藻糖的多糖。盡管巖藻多糖的存在不限于特定的一類，例如褐藻、海參等等包含巖藻多糖[監(jiān)督Tokuro Souda，編輯Fujio Egami,“Tatorui-Kagaku(多糖化學(xué))”1995年12月15日由Kyoritsu Shuppan K.K.出版，第319和321頁]，已知從褐藻得到的含硫酸巖藻糖的多糖通常被叫作巖藻多糖、巖藻聚糖和墨角藻多糖，并有若干分子種類。在本說明書中，它們?nèi)趲r藻多糖中；另外，在本發(fā)明中，巖藻多糖的分解產(chǎn)物也能使用。
象用于本發(fā)明的巖藻多糖一樣，從含巖藻多糖物質(zhì)得到的含巖藻多糖的提取物、或從所述提取物獲得的純化物質(zhì)也可被運(yùn)用。按照本來已知的方法可進(jìn)行含巖藻多糖提取物的制備和提取物的純化，且它們不限于特定的一種。
此外，巖藻多糖的分解產(chǎn)物是巖藻多糖經(jīng)酶化學(xué)、化學(xué)或物理分解而得到的分解產(chǎn)物，任何已知的酶化學(xué)、化學(xué)或物理方法可用于此。
作為含巖藻多糖的褐藻，有例如Yukio Yamada和Sokichi Segawa描述的那些，參見1977年由HOIKUSHA出版的《日本海藻彩色圖解》第22-52頁；例如通過用消逝墨角藻(Fucus evanescens)、厚葉日本褐藻(Kjellmaniella Crassifolia)、海帶及裙帶菜(Undaria pinnatifida)，可制備出巖藻多糖。
作為含巖藻多糖的海參，有例如JP-A4-91027描述的那些，例如，可用刺參和玉足海參通過用其中描述的方法，可制備巖藻多糖。
通過干褐藻、海參等和隨后研磨干材料，可制備含巖藻多糖的粉末。此外，通過用熱水或稀酸抽提含巖藻多糖的粉末，可制備含巖藻多糖的提取物。
作為用于增加巖藻多糖含量的提取物純化方法有用氯化鈣、醋酸鋇等對巖藻多糖進(jìn)行分級(jí)分離；用酸性多糖凝聚劑例如氯化十六烷基吡啶鎓等對巖藻多糖進(jìn)行分級(jí)分離；用酸性多糖凝聚劑在存在堿的情況下對巖藻多糖進(jìn)行分級(jí)分離；凝膠過濾；離子交換層析等等。必要時(shí)，可通過聯(lián)合使用這些純化方法進(jìn)行純化。
作為巖藻多糖的分解方法，可使用分解巖藻多糖的已知方法，例如用巖藻多糖分解酶的方法、酸分解法、超聲波法等等。通過上述方法可純化分解產(chǎn)物。
巖藻多糖分子中有硫酸基團(tuán)，并且這種基因和各種各樣的堿反應(yīng)生成鹽。鹽形式的巖藻多糖及其分解產(chǎn)物比具有游離硫酸基團(tuán)的巖藻多糖及其分解產(chǎn)物更穩(wěn)定；且它們通常以鹽的形式被分離出來，例如以鈉鹽和/或鉀鹽等等的形式。通過用例如Dowex 50等陽離子交換樹脂處理這些鹽，這些鹽可產(chǎn)生含游離硫酸基團(tuán)的巖藻多糖及其分解產(chǎn)物；此外，必要時(shí)通過已知的常規(guī)鹽的取代，可用各種各樣其它所需的鹽取代這些鹽。用藥學(xué)上可接受的鹽作為巖藻多糖及其分解產(chǎn)物的鹽，其實(shí)例包括與堿金屬的鹽，堿金屬例如鉀、鈉等；與堿土金屬的鹽，堿土金屬例如鈣、鎂、鋇等；與有機(jī)堿的鹽，有機(jī)堿例如吡啶鎓、銨鹽等等。
在巖藻多糖的分子種類中有二組，一組含巖藻糖作為主要的成分；另一組含百分之幾的糖醛酸和量相對大量的巖藻糖和甘露糖作為組成糖。在下文，把基本上無糖醛酸的巖藻多糖稱作巖藻多糖-F，并把含糖醛酸的巖藻多糖稱作巖藻多糖-U，其組合物簡單表示為巖藻多糖。
在本發(fā)明中，巖藻多糖-F和巖藻多糖-U可各自單獨(dú)使用，或可將其聯(lián)合使用。
即用于本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物可包含按照下面實(shí)施例1描述的方法制備的、例如有下列物理化學(xué)特性的巖藻多糖-U。
(1)組成糖它主要由巖藻糖、甘露糖和半乳糖組成，并包含糖醛酸。
(2)用一種巖藻多糖分解酶將它分解成低分子量產(chǎn)物，該酶由黃桿菌屬種名未定菌株SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生。
或者，用于本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物可包含按照下面實(shí)施例2描述的方法制備、例如有下列物理化學(xué)特性的巖藻多糖-F。
(1)組成糖這主要由巖藻糖組成，并基本上無糖醛酸。
(2)使用黃桿菌屬種名未定菌株SA-0082(FERM BP-5402)產(chǎn)生的巖藻多糖分解酶，不引起低分子量產(chǎn)物的實(shí)際上的分解。
通過用能分解巖藻多糖的微生物，例如上述產(chǎn)生巖藻多糖分解酶的黃桿菌屬種名未定菌株SA-0082來處理巖藻多糖，可制備巖藻多糖的微生物分解產(chǎn)物。
此外，用巖藻多糖分解酶例如上述黃桿茵屬種名未定株SA-0082產(chǎn)生的巖藻多糖分解酶來處理上述巖藻多糖-U，可制備巖藻多糖-U的酶促分解產(chǎn)物。另外，按照這些分解產(chǎn)物各自的分子量，可從這些分解產(chǎn)物制備分級(jí)分離產(chǎn)物。
一般而言，巖藻依取糖易受酸和堿影響；于是，當(dāng)用酸或堿溶液時(shí)，巖藻多糖可被容易地分解成低分子量的產(chǎn)物。通過調(diào)節(jié)加熱溫度、時(shí)間、pH等等，可制備任何所期望的分解產(chǎn)物；例如，通過凝膠過濾處理、分子量分級(jí)分離膜處理等等，可調(diào)節(jié)平均分子量、分子量分布和分解產(chǎn)物的類似性質(zhì)。另外，巖藻多糖的分子量和糖組成取決于原料的收獲季節(jié)和該原料的干燥與貯存的方法以及巖藻多糖的提取條件，例如加熱條件、pH條件等等；例如用酸水解巖藻多糖。另一方面，在堿性條件下，由于糖醛酸的β-消除而形成低分子量的產(chǎn)物。因此，至于本文描述的巖藻多糖-U和巖藻多糖-F，它們的分子量和分子量分布僅僅是范例，且它們的分子量和分子量分布隨著處理巖藻多糖條件的不同而可迅速地變化。例如，當(dāng)在100℃加熱一小時(shí)且用孔徑大小為300的分子篩膜脫鹽時(shí)，可制備分子量分布約為1000至10000的巖藻多糖、巖藻多糖-U或巖藻多糖-F。根據(jù)所用條件，可制備任何分子量和分子量分布的巖藻多糖，且在本發(fā)明中，可使用包含這些巖藻多糖的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
當(dāng)以1ug/ml或更大的濃度往癌細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中加入巖藻多糖或其分解產(chǎn)物時(shí)，在加入后的一至數(shù)天內(nèi)，導(dǎo)致癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡；由此顯示出巖藻多糖或其分解產(chǎn)物的強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。另一方面，這些產(chǎn)物不誘導(dǎo)正常細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，且對正常細(xì)胞不顯示出任何毒性。特別是，得自可食用褐藻和海參的巖藻多糖及其分解產(chǎn)物是非常安全的，因?yàn)閺奶烊淮嬖诘牟牧汐@得它們，且通過口服喂食老鼠，沒觀察到毒性。
至于把巖藻多糖用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，可將巖藻多糖和/或其分解產(chǎn)物與已知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合，以獲得藥用制劑，且該藥用制劑可被允許與所需細(xì)胞進(jìn)行接觸。
硫酸葡聚糖是葡聚糖的硫酸酯；葡聚糖是D-吡喃葡萄糖通過α-1,6-(糖苷)鍵連接而成的聚合物，且由微生物產(chǎn)生，例如由腸膜明串珠菌產(chǎn)生。在本發(fā)明中，可用市售硫酸葡聚糖。
當(dāng)添加硫酸葡聚糖或其熱處理產(chǎn)物到癌細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物時(shí)，在加入后一至數(shù)天內(nèi)導(dǎo)致癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡；由此顯示出硫酸葡聚糖或其分解產(chǎn)物具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。至于把硫酸葡聚糖用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，可將它與已知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合，以獲得藥用制劑，且該藥用組合物可被允許與所需細(xì)胞進(jìn)行接觸。
另外，含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物，是從分子中含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖、寡糖及單糖中選出來的；就它們具有的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性而言，并不特定地限于特定的一種化合物。
含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖的實(shí)例包括果膠、果膠酸、藻酸、透明質(zhì)酸等等。
含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的寡糖的實(shí)例包括從上述多糖得到的寡糖，它們可以按照已知方法產(chǎn)生。此外，本發(fā)明也包括用合成方法合成的寡糖。
糖醛酸和糖醛酸衍生物的實(shí)例包括半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸它們的內(nèi)酯、它們的酯(例如甲酯)以及其酰胺，通過已知的方法可生產(chǎn)它們。
用于本發(fā)明的、含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物且具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的糖類化合物，可用含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物作為原料來生產(chǎn)。雖然原料來源和生產(chǎn)方法不限于特定的一種，但例如通過用含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物作為組成成分的多糖，例如果膠和果膠酸，可生產(chǎn)該糖類化合物。此外，在糖類化合物的生產(chǎn)中，盡管其生產(chǎn)方法不限于特定的一種，可用例如單一的化學(xué)法、酶法或物理生產(chǎn)法或者這些方法的組合，從原料生產(chǎn)出它們。
例如，作為生產(chǎn)用于本發(fā)明的糖類化合物的化學(xué)處理，將原料于室溫至200℃處理數(shù)秒至數(shù)小時(shí)，最好于50至130℃處理幾秒至60分鐘。例如，在果膠的實(shí)例中，在pH 6.8、95℃的條件下處理幾秒至幾分鐘導(dǎo)致β-消去反應(yīng)，從而得到含不飽和糖醛酸和/或不飽和糖醛酸衍生物的糖類化合物，其在235nm的光吸收增加。本發(fā)明的糖類化合物包括含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖經(jīng)β-消去反應(yīng)而形成的在其非還原末端具有不飽和糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的那些糖類化合物。
作為生產(chǎn)用于本發(fā)明的糖類化合物的酶處理，用酶水解分解含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖是眾所周知的。所述處理還包括已知用該類多糖的裂解酶類的含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物多糖的分解。例如，在果膠和果膠酸的實(shí)例中，通過分別用已知的果膠裂解酶(EC4.2.2.10)、果膠酸裂解酶(EC4.2.2.2)及聚半乳糖醛酸外切裂解酶(EC4.2.2.9)對其進(jìn)行分解，形成具有4-脫氧-L-蘇-己-4-烯吡喃糖醛酸酯(4-deoxy-L-threo-hexa-4-enopyranosyl uronate)或在其非還原末端形成甲酯的糖類化合物，從而可得到用于本發(fā)明的糖類化合物。此外，如果是透明質(zhì)酸，用透明質(zhì)酸裂解酶(EC4 2.2.1)，如果是藻朊酸，用藻朊酸裂解酶(EC4.2.2.3)。
作為生產(chǎn)用于本發(fā)明的糖類化合物的物理處理，其實(shí)例包括用近紅外線、紅外線、微波、超聲波等等處理。例如，將果膠和/或果膠酸加入中性或堿性pH溶液中，并在高于室溫的適當(dāng)溫度下和例如在存在維生素C下的合適的還原條件下，使其受聲波處理達(dá)1秒或更長的時(shí)間以產(chǎn)生振動(dòng)能，時(shí)間最好為5秒至1小時(shí)。如上所述，除超聲波之外，微波、近紅外線和紅外線輻射也有效，且可用它們聯(lián)合照射?？蛇B續(xù)或間歇地進(jìn)行照射。
通過用含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物作為原料，可生產(chǎn)含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物且具有將用于本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的糖類化合物的分解產(chǎn)物。盡管分解產(chǎn)物的生產(chǎn)方法不限于特定的一種，例如用化學(xué)法、酶法及物理生產(chǎn)法或其相結(jié)合的方法，由原料生產(chǎn)出它們。
所用的上述分解產(chǎn)物的實(shí)例包括含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物的熱處理產(chǎn)物。
作為用于上述熱處理產(chǎn)物的生產(chǎn)中的熱處理方法，例如所述糖類化合物在例如65至350℃熱處理幾秒到幾天，優(yōu)選80至150℃幾分鐘至幾天，以獲得具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的熱處理產(chǎn)物。
待用作糖類化合物的果膠不具體限制，例如為提取自柑桔果實(shí)的果皮和蘋果的果實(shí)高的分子量多糖。工業(yè)生產(chǎn)果膠的原料是果實(shí)；除了例如檸檬、酸橙等等這些柑桔屬果實(shí)榨汁后剩下的渣滓之外(主要為內(nèi)皮)，可用從蘋果獲得汁后剩余的渣滓。這些渣滓主要含原果膠，并且在制備果膠的生產(chǎn)步驟中，果膠被溶解(抽提)出來。用酸性溫水或酸性熱水抽提，可進(jìn)行增溶；且根據(jù)所用原料，通過控制提取溫度、pH和時(shí)間，可高產(chǎn)量地獲得具有穩(wěn)定分子量和酯化度的果膠。通過離心或過濾可純化提取物，并可濃縮該提取物；加乙醇到提取物中能沉淀果膠，且可回收果膠。可干燥沉淀，并研磨制成所需干果膠。
果膠的主要結(jié)構(gòu)為部分甲基化的半乳糖醛酸的聚合物，該羧基可用甲基酯化或可游離?；蛘?，該羧基可形成銨鹽、鉀鹽或鈉鹽。按照果膠用甲基酯化的程度(DM度甲氧基與全部羧基之比)，把果膠分為具有高DM度的HM果膠和具有低DM度的LM果膠(TomoshiYoshizumi等編輯，Shin-Shokuhin Kaihatuyou Sozai Binran(《食品開發(fā)的新材料手冊》)，第114-119頁，由Korin Shoten于1991年出版]。在本發(fā)明中，可用作為添加劑的市售果膠[Akio Tonoyama編輯，Tennenbutsu Binran(《天然物質(zhì)手冊》)第12版，第138頁，由Shokuhinto Kgaku Sha于1993年出版]、市售HM果膠、市售LM果膠(參見上述《食品開發(fā)的新材料手冊)》)等等。
在本發(fā)明中，可用果膠和果膠酸的分解產(chǎn)物。作為果膠的分解方法，例如有諸如酸處理、堿處理等等的化學(xué)分解法；諸如超聲處理、熱處理、壓力處理、壓力及熱處理等等的物理分解法，或酶促分解法。
用于本發(fā)明的含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物和/或其分解產(chǎn)物包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
至于用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物及/或其分解產(chǎn)物可與已知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合，以制備藥物制劑。
當(dāng)把含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物和/或其分解產(chǎn)物力入癌細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中時(shí)，在加入后一至數(shù)天，導(dǎo)致癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡，而且，它們對正常細(xì)胞不顯示任何毒性。
含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖類化合物和/或其分解產(chǎn)物得自天然存在的材料，且經(jīng)口和非腸道將其給予小鼠時(shí)，沒觀察到毒性。
用于本發(fā)明并由式(1)表示的具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(在下文簡稱為環(huán)戊烯酮)可由化學(xué)合成而合成出來[Carbohydrate Res,247,217-222(1993)；和Helvetica Chimica Acta,55,2838-2844(1972)]，且反式和順式同分異構(gòu)體都能用于本發(fā)明。
此外，當(dāng)D-葡萄糖醛酸水溶液在121℃受到4小時(shí)熱處理時(shí)，在熱處理材料中可形成環(huán)戊烯酮。用溶劑抽提熱處理材料中的環(huán)戊烯酮，并濃縮提取物。然后，用硅膠柱層析分級(jí)分離濃縮物；將洗脫出的環(huán)戊烯酮部分濃縮，然后用氯仿從濃縮物中抽提環(huán)戊烯酮。濃縮該提取物并用正常相柱層析過柱分離，以獲得純化的環(huán)戊烯酮。
環(huán)戊烯酮的物理性質(zhì)如下在下面的性質(zhì)中，分別用DX 302質(zhì)譜儀(由Nippon Denshi制造)進(jìn)行質(zhì)量分析；用JNM-A500(由NipponDenshi制造)測定使用氘化氯仿溶劑的核磁共振譜；用DIP-370旋光計(jì)(由Nippon Bunko制造)測定比旋光度；用UV-2500分光光度計(jì)(由Shimadzu制造)測定紫外吸收光譜；并用FTIR-8000紅外分光光度計(jì)(由Shimadzu制造)測定紅外吸收光譜。
MS m/z 115[M+H]+1H-NMR(CDCl3)δ4.2(1H,d,J=2.4Hz,H-5),4.83(1H,m,H-4),6.30(1H,dd,J=1.2,6.1Hz,H-2),7.48(1H,dd,J=2.16.1Hz,H-3)，如果把CHCl3的化學(xué)位移值看作7.26ppm，則1H-NMR的化學(xué)位移值顯示如上。
比旋光度[α]20D0°(C=1.3,H2O)IR(KBr):3400,1715,1630,1115,1060,1025cm-1紫外線λ最大215nm(H2O)至于把環(huán)戊烯酮用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，可將它與已知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合，以獲得藥物制劑。
當(dāng)把環(huán)戊烯酮加入癌細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中時(shí)，在加入后的一至數(shù)天內(nèi)導(dǎo)致癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡，而且它對正常細(xì)胞不顯示出任何毒性。
用于本發(fā)明的環(huán)戊烯酮對小鼠不顯示出任何毒性。
造血干細(xì)胞是具有分化能力的細(xì)胞，能從單一的細(xì)胞分化成熟的血細(xì)胞，例如紅血球、粒細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等(多能性)，造血干細(xì)胞也具有自我復(fù)制的能力。
造血干細(xì)胞用于(1)造血干細(xì)胞缺陷型宿主造血系統(tǒng)的更新；(2)在給藥、照射等之前從患病的宿主收獲骨髓，從該骨髓制備造血干細(xì)胞；對其處理后，通過再移植于宿主而進(jìn)行治療；(3)產(chǎn)生不同的造血細(xì)胞；以及(4)尤其通過轉(zhuǎn)入基因到自體的造血干細(xì)胞中，以治療疾病。
為了獲得造血干細(xì)胞，必需從骨髓細(xì)胞群體或其它造血源中分離制備多功能的造血干細(xì)胞。首先，可從骨髓源獲得骨髓細(xì)胞；骨髓源例如髂嵴、脛骨、股骨、脊椎或其它骨腔。其它造血細(xì)胞源包括胚胎卵黃囊、胎肝、胎脾和成人脾以及血液，例如外周血及臍帶血。
作為分離造血干細(xì)胞及制備其組合物的方法，雖然現(xiàn)在可用任何已知的方法，但制備造血干細(xì)胞組合物的一種最簡單最有效的方法是JP-A7-313150公開的方法；由該方法可制備基本上均質(zhì)的人造血干細(xì)胞組合物。例如通過用包裹一種抗體的磁珠的磁分離、親和層析、使用單克隆抗體等，來獲得含所需細(xì)胞的組分，并通過熒光活化的細(xì)胞分選器將該組分進(jìn)一步分離以獲得所需細(xì)胞。將該細(xì)胞懸浮于緩沖培養(yǎng)基中。
含所分離的造血干細(xì)胞的組合物可根據(jù)特定的目的而使用。然而，如果該組合物被癌細(xì)胞污染，可能會(huì)依該組合物的用途而產(chǎn)生各種各樣的問題。
因而，通過使用對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，本發(fā)明人在僅僅消除掉存在于造血干細(xì)胞組合物中的癌細(xì)胞方面已獲成功。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物可以以足以誘導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡且僅消除癌細(xì)胞的濃度使用?？珊喴椎匕鸭?xì)胞凋亡誘導(dǎo)物加入造血干細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中；而且，在制備造血干細(xì)胞組合物期間的任何合適的步驟中，可加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。然而，在造血干細(xì)胞組合物制備后立即加細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物于其中，可獲得最有效的結(jié)果。
本發(fā)明的細(xì)胞組合物是包含如此獲得的造血干細(xì)胞的組合物，并可用本來已知的方法制備。組合物中造血干細(xì)胞的量不被特別地限制，并可根據(jù)組合物的特定用途而確定該量。另外，該組合物可包含其它造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等等，并且它還能包含一造血干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，一種造血干細(xì)胞生長因子、一種干細(xì)胞分化因子、一種造血干細(xì)胞保護(hù)劑等等。
按照本發(fā)明，甚至可從患有多發(fā)性骨髓瘤病人的外周血中制備造血干細(xì)胞組合物，在這種造血干細(xì)胞組合物中找不到癌細(xì)胞，即，癌細(xì)胞被從中大致消除了；從患多發(fā)性骨髓瘤病人獲得無癌細(xì)胞的造血干細(xì)胞組合物，在現(xiàn)在則被認(rèn)為是最困難的[Blood,86,381-389(1995)]。
用一種已知的方法，例如在前面JP-A 7-313150中描述的方法可增殖所制備的造血干細(xì)胞組合物。例如，在含一種保持因子或其同類物的培養(yǎng)基中，可通過與基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)而增殖該造血干細(xì)胞組合物。
造血干細(xì)胞可被用作基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞。雖然按照已知的方法可將基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，但作為把基因轉(zhuǎn)入例如造血干細(xì)胞之類的靶細(xì)胞的方法，最有效的方法是1995年公布的WO 95/26200中公開的方法。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的基因，即外源基因，可以是任何希望轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中的基因。例如，外源基因可以是編碼例如腺苷脫氨酶(ADA)之類與疾病相關(guān)蛋白的基因，可以是編碼反義核酸或核酶的基因，或者可以是編碼假引物(例如參見1990年11月15日公布的WO90/13641)、細(xì)胞內(nèi)抗體(例如參見1994年2月3日公布的WO94/02610)、生長因子等等的基因。
在適合于控制這些外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下，可將這些外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞；通常，該啟動(dòng)子為外源啟動(dòng)了。此外，必要時(shí)，可加入啟動(dòng)子以外的表達(dá)控制因子，例如終止子序列和增強(qiáng)子序列。
通過用例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可進(jìn)行轉(zhuǎn)移基因到造血干細(xì)胞中去。所述載體可包含諸如如抗生素抗性基因之類的標(biāo)記基因，以致于已轉(zhuǎn)入所需基因的細(xì)胞能被容易地選擇出來。用于本發(fā)明的代表性的載體的實(shí)例包括N2/Zip TKNEO(TKNEO)載體(效價(jià)1×105G418r cfu/ml，在NIH 3T3細(xì)胞上)、Zip PGK-hADA載體、ZipPGK-mADA載體等等。它們?nèi)加蒑oritz等報(bào)道過(J.Exp.Med,178,529(1993))。
TKNEO載體具有由單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子表達(dá)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。用該載體轉(zhuǎn)入了所需基因的細(xì)胞，可通過利用由標(biāo)記基因提供的新霉素抗性選擇出來。在ZipPG K-hADA載體中，由人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子表達(dá)人ADA(hADA)cDNA。該基因是該載體唯一可表達(dá)的基因，且該載體沒有任何可選擇的標(biāo)記基因。ZipPGK-mADA(PGK-mADA)載體，除了用鼠ADA(mADA)cDNA替代人ADA cDNA外，它與ZipPGK-hADA載體是一樣的。這些載體和其它病毒載體的性質(zhì)和生產(chǎn)方法是眾所周知的，給出了本文的說明書，載體的選擇和使用則完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
已轉(zhuǎn)入所需基因的造血干細(xì)胞組合物可用于遺傳疾病的治療。通過移植含有能彌補(bǔ)致病基因缺陷或異常的基因的自體或同種異體造血干細(xì)胞組合物，可治療與造血細(xì)胞相關(guān)的遺傳病。
例如，由于已鑒定出象β-地中海貧血癥(地中海貧血癥)、鐮狀細(xì)胞貧血癥、ADA缺陷、重組酶缺陷、重組酶調(diào)節(jié)基因缺陷等等這類疾病的致病基因，因而可通過同源或隨機(jī)重組，將正常的野生型基因轉(zhuǎn)入到造血干細(xì)胞的基因中，并移植所述細(xì)胞到病人體內(nèi)，以進(jìn)行治療。
此外，如果是同種異體造血干細(xì)胞，可用無異常基因的正常造血干細(xì)胞進(jìn)行治療。
基因治療的另一應(yīng)用是通過轉(zhuǎn)入抗藥性基因到正常的造血干細(xì)胞中，供給該細(xì)胞抗藥性，從而使以通常認(rèn)為是危險(xiǎn)的高濃度使用藥物成為可能。特別是，通過將一種對抗癌藥物有抗藥性的基因(例如多重抗藥性基因)轉(zhuǎn)入按照本發(fā)明得到的大致無癌細(xì)胞的造血干細(xì)胞組合物，則可能使用高濃度的該抗癌藥物進(jìn)行治療。
甚至對于造血系統(tǒng)相關(guān)疾病以外的那些疾病，在所述疾病涉及諸如激素、酶、細(xì)胞因子、生長因子等等分泌蛋白缺乏的情況下，可以用造血干細(xì)胞進(jìn)行治療。通過轉(zhuǎn)移在一合適啟動(dòng)子控制下的編碼該缺乏蛋白的基因到造血干細(xì)胞中，可誘導(dǎo)并表達(dá)所缺乏的蛋白；即使由與正常表達(dá)該蛋白的細(xì)胞類型不相同的細(xì)胞類型的細(xì)胞表達(dá)該蛋白，也能控制表達(dá)，使得所得到的活性與由其天然表達(dá)所得到的活性相同。
除了如上所述對基因的缺陷和異常彌補(bǔ)之外，可將編碼核酶、反義核酸或其同類物的基因或者另一合適的基因插入到細(xì)胞中，以控制所述細(xì)胞中特定基因產(chǎn)物的表達(dá)或抑制患病的傾向，特別是抑制患血液病的傾向。
例如，對例如HIV、HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ等等血液病原體，人們可使造血干細(xì)胞受到基因修飾，而在造血干細(xì)胞或從造血干細(xì)胞分化出的細(xì)胞中表達(dá)反義核酸或核酶，所表達(dá)的反義核酸或核酶能阻止上述病原體在造血干細(xì)胞或在從其分化出的細(xì)胞中生長。
或者，在細(xì)胞表面受體中，可從屬于T細(xì)胞的細(xì)胞消除特定的分子。即，通過運(yùn)用由同源重組而產(chǎn)生的受體基因的基因修飾，或者通過用抑制受體基因表達(dá)的反義核酸或核酶，可抑制特定受體的表達(dá)。
例如，通過常規(guī)的靜脈內(nèi)注射，可將如此得到的、已轉(zhuǎn)入一基因的造血干細(xì)胞組合物引入脊椎動(dòng)物體中，該脊椎動(dòng)物是細(xì)胞移植的受體。雖然優(yōu)選的受體是供體本身，但可進(jìn)行同種異體的移植。特別是，當(dāng)臍帶血細(xì)胞用于移植時(shí)，最好是同種異體移植。
通過使用本發(fā)明的具有癌細(xì)胞選擇性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，可選擇性地除去用于基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞組合物中的癌細(xì)胞。靶細(xì)胞不特別地限制，且其實(shí)例包括選自干細(xì)胞、造血細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、卵母細(xì)胞、卵原細(xì)胞、卵細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子、CD34+細(xì)胞、C-藥盒+細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等等的細(xì)胞。按照已知的方法可分別制備包含這些細(xì)胞的組合物。
此外，當(dāng)胚胎干細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、卵母細(xì)胞、卵原細(xì)胞、卵細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子等等用作靶細(xì)胞時(shí)，可簡單而容易地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的脊椎動(dòng)物。
下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。在下面的實(shí)施例中，所有的％都按重量表示。實(shí)施例1(1)徹底地干燥厚葉日本褐藻后，用一空的M-2粉磨機(jī)(由NaraKikai Seisakusho制造)將該海藻(2千克)磨成粉，并將該干粉懸浮于80％的乙醇(9升)中。于80℃處理該懸浮液2小時(shí)，然后通過濾紙過濾以得到濾渣；將該濾渣用同樣的乙醇洗滌及過濾步驟反復(fù)處理三次，以獲得用乙醇洗滌過的殘余物。將該殘余物懸浮于0.2M醋酸鈣溶液(36升)中，于95℃處理該懸浮液2小時(shí)并過濾。所產(chǎn)生的渣滓用0.2M醋酸鈣溶液(4升)洗滌并將此洗滌液與上述濾液合并，以得到厚葉日本褐藻的巖藻多糖提取物(36升)。
用配備了超濾膜的超濾裝置將該濾液濃縮至2升，該超濾膜的排阻分子量為10萬。以終濃度為1.5M加氯化鈉于該濃縮液中，然后加入5％的氯化十六烷基吡啶鎓，其加入量使得不再形成沉淀。通過離心除去形成的沉淀，用超濾將所產(chǎn)生的上清液濃縮到1升，并往其中加入(4升)乙醇。通過離心收集所產(chǎn)生的沉淀，加(100ml)4M氯化鈉到該沉淀中，充分?jǐn)嚢韬?，以終濃度為80％加入乙醇。攪拌該混合物并且離心，以獲得沉淀。通過同樣的懸浮于80％乙醇且離心的步驟，使所產(chǎn)生的沉淀受到反復(fù)處理，直到上清液在260nm的光吸收消失為止。將該沉淀溶解于(2升)2M氯化鈉中，并通過離心除掉不溶物。然后，往所產(chǎn)生的上清液中加DEAE-Cellulofine A-800(由Seikagaku Kogyo生產(chǎn)，50ml)，并攪拌此混合物，接著通過過濾除去添加的樹脂。把該濾液上柱，該柱為用2M氯化鈉平衡的DEAE-Cellulofine A-800柱；并用一臺(tái)超濾裝置對未吸附的組分進(jìn)行超濾，以完全除去生色物質(zhì)和氯化鈉，上述超濾裝置配備一種中空纖維，其排阻分子量為10萬或更小。然后，通過離心及過濾除去不溶物，并將濾液凍干以制備巖藻多糖-U；此干巖藻多糖-U的量為15克。
用Sephacryl S-500通過凝膠過濾測定了所產(chǎn)生的巖藻多糖-U的分子量；它顯示出具有中位值約為19萬的分子量分布。
(2)

圖1顯示在存在過量的氯化十六烷基吡啶鎓時(shí)，上述的巖藻多糖-U和在下文實(shí)施例2中制備的巖藻多糖-F在不同濃度氯化鈉下的沉淀形成特性。
在圖1中，垂直軸表示沉淀形成速率(％)，且水平軸表示氯化鈉的濃度(M)。在圖1中，實(shí)線和空心園表示在各個(gè)氯化鈉濃度下的巖藻多糖-U的沉淀速率。在圖1中，虛線和空心三角表示在不同氯化物濃度(M)下，巖藻多糖-F的沉淀形成速率。
在溶液溫度為37℃的條件下，如下測定沉淀形成速率。
巖藻多糖-U和巖藻多糖-F以2％的濃度分別溶于水和4M氯化鈉中，并以不同的比例混合所產(chǎn)生的溶液，以制備具有不同氯化鈉濃度的巖藻多糖-U的溶液同巖藻多糖-F的溶液(每份125μl)。另一方面，在水和4M氯化鈉中以2.5％的濃度分別溶解氯化十六烷基吡啶鎓，并將它們混合以便制備具有不同氯化鈉濃度的1.25％的氯化十六烷基吡啶鎓溶液。
為了用1.25％的氯化十六烷基吡啶鎓溶液把巖藻多糖-U同巖藻多糖-F從其2％的水溶液中完全沉淀出來，需要3.2倍巖藻多糖溶液體積的氯化十六烷基吡啶鎓溶液。于是，將加400μl各個(gè)氯化物濃度的氯化十六烷基吡啶鎓溶液加入125μl各個(gè)氯化物濃度的2％的巖藻多糖-U溶液和巖藻多糖-F溶液中，并充分?jǐn)嚢杷a(chǎn)生的混合物。讓所述混合物靜置30分鐘，然后離心。用苯酚-硫酸法[Analytical Chemistry,28350(1956)]測定上清液中的糖類含量，以計(jì)算在各個(gè)氯化鈉濃度下巖藻多糖的沉淀形成速率。
(3)用下面的方法分析上述巖藻多糖-U的成分。
首先，根據(jù)Journal of Biological Chemistry,175,595(1948)]的描述，測定巖藻糖的量。
以0.5％的濃度將所得到的干燥的標(biāo)準(zhǔn)巖藻多糖-U溶解于1N的鹽酸中，并通過在110℃處理2小時(shí)，將其水解成組成單糖。通過水解得到的單糖的還原端用GlycoTAGTM和GlycoTAGTM試劑盒(兩者皆由Takara Shuzo生產(chǎn))進(jìn)行吡啶基-(2)-氨基化(PA衍生物)，并經(jīng)過HPLC測定所述組成糖的比例。
其次，按照Analytical Biochemistry,4,330(1962)的描述，測定糖醛酸。
此外，按照Biochemical Joumal,84,106(1962)的描述，測定硫酸的含量。
結(jié)果，巖藻多糖-U的組成糖是巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖和糖醛酸。
不含任何其它的中性糖。主要成分的摩爾比是巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸酯基約為10∶7∶4∶5∶20。
(4)如下測定巖藻多糖-U的結(jié)構(gòu)
(4)-1將下述的內(nèi)切型巖藻多糖分解酶與純化的巖藻多糖-U反應(yīng)，并純化所產(chǎn)生的分解產(chǎn)物。
即，將1％的巖藻多糖-U溶液(16ml)、50mM磷酸緩中液(pH 8.0,12ml)、4M的氯化鈉溶液(4ml)和下述的內(nèi)切型巖藻多糖分解酶溶液(32U/ml,8ml)混合，并于25℃讓該混合物反應(yīng)48小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，辨認(rèn)出了230nm處的光吸收增加，表明該巖藻多糖-U被該酶分解了。
反應(yīng)混合物用Microancilyzer G3(由Asahi Kasei生產(chǎn))脫鹽后，把反應(yīng)混合物分成(a)、(b)和(c)三個(gè)組分，并用DEAE Sepharose FF(由Pharmacia生產(chǎn))純化。
內(nèi)切型巖藻多糖分解酶可制備如下用于生產(chǎn)內(nèi)切型巖藻多糖分解酶的微生物菌株可以是任何能夠產(chǎn)生所述內(nèi)切型巖藻多糖分解酶的菌株，其實(shí)例包括種名未定的黃桿菌屬菌株SA-0082(FERM BP-5402)。
該菌株被研究過且新近從日本青森的海水中獲得，并且該菌株被表示為種名未定的黃桿菌屬菌株SA-0082；按照《布達(dá)佩斯條約》自1995年3月29日(最初保藏日)以來，該茵株以保藏號(hào)FERM BP-5402已保藏于日本工業(yè)科學(xué)與技術(shù)局的國立生命科學(xué)和人類技術(shù)研究所，它位于1-3,Higashi l chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken。
至于可被產(chǎn)內(nèi)切型巖藻多糖分解酶菌株同化的營養(yǎng)源，可以加任何營養(yǎng)源到該菌株的培養(yǎng)基中。碳源的實(shí)例包括巖藻多糖、海藻粉、藻朊酸、巖藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉等等。合適的氮源實(shí)例包括酵母膏、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米漿、肉膏、脫脂大豆、硫酸銨、氯化銨等等。另外，也可加入無機(jī)物，例如鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等等以及金屬鹽。
對于內(nèi)切型巖藻多糖分解酶產(chǎn)生茵的培養(yǎng)，雖然產(chǎn)量依培養(yǎng)條件而變化，但一般而言，培育溫度最好為15℃至30℃，培養(yǎng)基pH最好為5-9；并且通過5至72小時(shí)的通氣攪拌培養(yǎng)，內(nèi)切型巖藻多糖分解酶的產(chǎn)量達(dá)到最大值。自然，設(shè)定培養(yǎng)條件以便獲得內(nèi)切型巖藻多糖分解酶的最大產(chǎn)量。
內(nèi)切型巖藻多糖分解酶既存在于微生物細(xì)胞中，又存在于培養(yǎng)上清液中。
在一合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述名未定的黃桿菌屬茵株SA-0082，并收集其細(xì)胞，用常規(guī)的細(xì)胞破碎方法破碎其細(xì)胞。例如用超聲波處理獲得無細(xì)胞的提取物。
然后，可用常規(guī)的純化方法從該提取物獲得純化的酶標(biāo)準(zhǔn)；例如，可通過鹽析、離子交換柱層析、疏水鍵柱層析、凝膠過濾柱層析等等來進(jìn)行純化，以獲得無其它巖藻多糖分解酶的純化的內(nèi)切型巖藻多糖分解酶。
此外，由于大量的酶(胞外酶)存在于培養(yǎng)上清液中，該培養(yǎng)上清液通過從上述內(nèi)湯培養(yǎng)物除去細(xì)胞而得到，因而可用與純化胞內(nèi)酶方法相同的方法純化胞外酶。
純化內(nèi)切型巖藻多糖分解酶的實(shí)施方案如下把由含(0.25％)葡萄糖、(1.0％)蛋白胨及(0.05％)酵母膏的人造海水組成的(600ml)培養(yǎng)基(由Jamarine實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)，pH 7.5)裝入一個(gè)2升的錐瓶中，接著(在120℃)滅菌(20分鐘)。接種種名未定的黃桿菌屬菌株SA-0082(FERM BO-5402)到2升錐瓶里的(600ml)培養(yǎng)基中，并在24℃培育24小時(shí)以獲得種子肉湯培養(yǎng)物。將含(0.25％)葡萄糖、(1.0％)蛋白胨、(0.05％)酵母膏和(0.01％)消泡劑(由Shinetsu Chemical生產(chǎn))的人造海水組成的(20升)培養(yǎng)基(由Jamarine實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)，pH 7.5)置于一個(gè)30升的發(fā)酵罐中，并在120℃滅菌20分鐘。冷卻后，用上述(600ml)種子肉湯培養(yǎng)物接種，并在10升/分的通氣量和以125 r.p.m.攪拌的培養(yǎng)條件下，于24℃培育24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心肉湯培養(yǎng)物以獲得微生物細(xì)胞。
將該細(xì)胞懸浮于含200mM氯化鈉的20mM醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液中(pH 7.5)，接著經(jīng)超聲波和隨后的離心，以獲得細(xì)胞提取物。細(xì)胞提取物中的本發(fā)明內(nèi)切型巖藻多糖分解酶的活性被測定時(shí)，檢測出肉湯培養(yǎng)物的活性為5mU/ml。活性的測定將在下文說明。
以終濃度為90％飽和度往該提取物中加入硫酸銨，并攪拌該混合物以溶解硫酸銨。將該混合物離心，并將所產(chǎn)生的沉淀懸浮于與上述微生物細(xì)胞提取緩沖液同樣的緩沖液中。對含50mM氯化鈉的20mM醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)充分透析該懸液。通過離心除去產(chǎn)生于透析的沉淀，然后將該上清液過用一個(gè)含50mM氯化鈉的20mM醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)平衡的DEAE Sepharose FF柱。用同樣的緩沖液徹底洗滌該柱吸附的材料，并用50mM至600mM線性濃度梯度氯化鈉洗脫該柱，以收集活性組分。接著，以終濃度為4M往該活性組分中加入氯化鈉。將該組分過一個(gè)用含4M氯化鈉的20mM磷酸緩沖液(pH 8.0)平衡的苯基Sepharose CL-4B柱(由Pharmacia生產(chǎn))。用同樣的緩沖液徹底洗滌該吸附物，并用4M到1M線性濃度梯度的氯化鈉洗脫該吸附物以收集活性組分。然后，用超濾器濃縮該活性組分，并用Sephacryl S-300(由Pharmacia生產(chǎn))對該濃縮物進(jìn)行凝膠過濾層析，以收集活性組分，該Sephacryl S-300先用含50mM氯化鈉的10mM磷酸緩沖液平衡。當(dāng)根據(jù)在Sephacryl S-300柱上的保留時(shí)間來確定的分子量時(shí)，它約為46萬。此外，用含25mM氯化鈉的10mM磷酸緩沖液(pH 7)透析該活性組分。將該酶溶液過一個(gè)用含250mM氯化鈉的10mM磷酸緩沖液(pH 7)平衡的Mono Q HR5/5柱(由Pharmacia制造)，用同樣的緩沖液徹底洗滌該吸附劑，并用250mM至450mM線性濃度梯度的氯化鈉洗脫該柱以收集活性組分，如此，得到純化的酶。這些生產(chǎn)步驟顯示于表1中，通過測量該酶溶液在280mM的光吸收來進(jìn)行蛋白的測定，在該測定中，把1mg/ml蛋白溶液的光吸收看作1.0。
表1
該酶的活性如下測定將從厚葉日本褐藻(50μl)得到的2.5％的巖藻多糖溶液、酶溶液(10μl)及含667mM氯化鈉的83mM磷酸緩沖液(pH 7.5)(60μl)混合，并讓它們在37℃相互反應(yīng)3小時(shí)；接著，將酶反應(yīng)混合物(105μl)與水(2ml)混合，攪拌此混合物并于230nm測定其光吸收(AT)。作為對照，通過僅用用于溶解該酶的上述緩沖液代替該酶溶液在同樣的條件下進(jìn)行反應(yīng)，及通過僅用水代替巖藻多糖溶液在同樣的條件下進(jìn)行反應(yīng)；且測定該反應(yīng)混合物的光吸收(AB1和AB2)。
將每分鐘消去性地裂解1μmol甘露糖和糖醛酸之間的糖苷鍵所需要的酶量定義為1個(gè)酶單位(U)。通過把經(jīng)消去反應(yīng)形成的不飽和糖醛酸的mmol摩爾光吸收指數(shù)看作5.5，以計(jì)算鍵，來進(jìn)行被裂解鍵的測定；通過下列等式計(jì)算酶活(AT-AB1-AB2)×2.105×120/5×105×0.01×180=U/ml其中2.015是測定光吸收的樣品溶液的量(ml)；120是酶反應(yīng)混合物的量(μl)；5.5是不飽和糖醛酸在230nm的mmol摩爾光吸收系數(shù)(/mM)；105是被稀釋的反應(yīng)混合物的量(μl)；0.01是酶溶液的量(ml)；180是反應(yīng)時(shí)間(分鐘)。
從厚葉日本褐藻得到的、用作底物的巖藻多糖如下制備用一空的M-2粉磨機(jī)將干燥的厚葉日本褐藻磨成粉，接著在70℃在10倍體積85％的甲醇中處理2小時(shí)，并過濾。于70℃在10倍體積的甲醇中處理所產(chǎn)生的濾渣2小時(shí)，接著過濾。向該濾渣加入20倍體積的水，并于100℃處理該混合物3小時(shí)，過濾它以獲得提取物。把該提取物的鹽濃度調(diào)整到與400mM氯化鈉溶液的濃度同一樣的濃度，然后，向其中加入氯化十六烷基吡啶鎓直到不再形成沉淀為止，離心此混合物。用乙醇充分洗滌沉淀，并在完全除去氯化十六烷基吡啶鎓后，脫鹽；用一超濾裝置進(jìn)行低分子量物質(zhì)的去除(超濾膜的排阻分子量10萬，膜由Amicon生產(chǎn))。通過離心除去形成的沉淀，凍干該上清液以獲得純化的厚葉日本褐藻的巖藻多糖。
(4)-2上述內(nèi)切型巖藻多糖分解酶通過一消去反應(yīng)裂解存在于復(fù)合多糖中的D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸之間的α1→4鍵。當(dāng)該酶與巖藻多糖反應(yīng)時(shí)，形成具有由下面式(2)、(3)及(4)表示的結(jié)構(gòu)的寡糖。

然后，用GlycoTAG和GlycoTAG試劑盒對上述用DEAE SepharoseFF(柱)分離且純化的(a)、(b)及(c)三組分的各個(gè)部分進(jìn)行其還原末端的吡啶基-(2)-氨基化作用(PA衍生物)，以分別獲得糖類的PA衍生物(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)。用HPLC對(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)進(jìn)行分析，以檢查它們和三種寡糖PA衍生物間的差異，所述PA衍生物具有由上面(2)、(3)和(4)式表示的結(jié)構(gòu)。
HPLC條件如下(ⅰ)運(yùn)用分子量級(jí)分柱(molecular weight fraction column)的HPLC分析。
儀器L-6200 (由Hitachi Seisakusho制造)柱SHODEX SB-803(4.6×250mm)(由Showa Denko制造)洗脫溶液0.2M氯化鈉∶二甲亞砜=9∶1檢測用激發(fā)波長為320nm的熒光檢測器F-1150(由HitachiSeisakusho制造)，在400nm的熒光波長下進(jìn)行檢測。
流速1ml/分鐘。
柱溫50℃。
(ⅱ)運(yùn)用反相柱的HPLC分析儀器L-6200(由Hitachi Seisakusho制造)柱L-柱(4.6×250mm)(由Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai制造)洗脫溶液50mM乙酸-三乙胺(pH 5.5)。
檢測用激發(fā)波長為320nm的熒光檢測器F-1150(由HitachiSeisakusho制造)，在400nm的熒光波長下進(jìn)行檢測。
流速1ml/分鐘。
柱溫40℃。
作為上面二項(xiàng)HPLC分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過用上述內(nèi)切型巖藻多糖分解酶分解巖藻多糖-U而得到的三種寡糖與具有由上述(2)、(3)及(4)式表示的結(jié)構(gòu)的三種寡糖是相同的。
因此，(a)具有這樣的結(jié)構(gòu)不飽和D-葡萄糖醛酸和連接了一個(gè)硫酸酯基的L-巖藻糖均連接到還原末端殘基D-甘露糖上；(b)具有這樣的結(jié)構(gòu)不飽和D-葡萄糖醛酸和連接了二個(gè)硫酸酯基的L-巖藻糖均連接到還原末端殘基D-甘露糖上；且(c)具有這樣的結(jié)構(gòu)D-葡萄糖醛酸和連接硫酸酯基的L-巖藻糖均連接到還原末端殘基D-甘露糖上，另外，另一個(gè)D-甘露糖連接到所述的D-葡萄糖醛酸上，且不飽和的D-葡萄糖醛酸和連接硫酸酯基的L-巖藻糖皆被進(jìn)一步地連接到后一D-甘露糖上。
根據(jù)上面所述，所產(chǎn)生的巖藻多糖-U具有這樣的結(jié)構(gòu)D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖相互交替地連接，并且L-巖藻糖被連接到至少一個(gè)D-甘露糖上。
而且，巖藻多糖-U具有由下式表示的部分結(jié)構(gòu)。
其中至少一個(gè)醇式羥基(alcoholic hydroxide group)被硫酸酯化，而n是1或更大的整數(shù)。
如上文所描述，當(dāng)巖藻多糖-U和上述的內(nèi)切型巖藻多糖分解酶反應(yīng)時(shí)，形成由上面(2)、(3)及(4)結(jié)構(gòu)式所表示的寡糖。
用高速、高靈敏旋光儀SEPA-300(由Horiba Seisakusho制造)測定巖藻多糖-U的凍干產(chǎn)物的比旋光度，它為-53.6°。
實(shí)施例2(1)將厚葉日本褐藻徹底干燥并用一臺(tái)空的M-2粉磨機(jī)將其一部分(2kg)磨成粉。把所產(chǎn)生的干粉懸浮于80％的乙醇(9升)中并于80℃處理2小時(shí)，接著用濾紙過濾以得到濾渣。用同樣的乙醇洗滌及過濾步驟反復(fù)處理該濾渣三次，以獲得乙醇洗滌過的濾渣。將該濾渣懸浮于0.2M醋酸鈣(36升)中，并于95℃處理2小時(shí)，接著過濾。此濾渣用0.2M醋酸鈣(4升)洗滌，并將此洗出液和上述濾液合并，以獲得厚葉日本褐藻的巖藻多糖提取物(36升)。
將5％的氯化十六烷基吡啶鎓加到所產(chǎn)生的提取物中直到不再形成沉淀為止，并通過離心收集沉淀。將該沉淀懸浮于0.4M氯化鈉中，離心并洗滌，重復(fù)洗滌步驟三次并往沉淀中加4M氯化鈉(1升)。攪拌此混合物并以80％的終濃度加入乙醇。攪拌所產(chǎn)生的混合物，并離心以獲得沉淀。將沉淀懸浮于80％的乙醇中并離心，重復(fù)此步驟直到在260nm的光吸收消失為止。將沉淀溶解于2M氯化鈉(3升)中并通過離心除去不溶物。然后加DEAE-Cellulofine A-800(100ml)到其中并攪拌此混合物，接著過濾以除去加入的樹脂。將濾液過一個(gè)用2M氯化鈉平衡的DEAE-Cellulofine A-800柱，并通過用一臺(tái)配備了中空纖維的超濾裝置對未被吸附的部分進(jìn)行超濾，該中空纖維的排阻分子量10萬或更小，從而完全除去生色物質(zhì)和氯化鈉；接著離心并過濾，以除去不溶物；并凍干，以獲得巖藻多糖。
凍干的巖藻多糖的量為90克。
稱凍干的巖藻多糖(7克)并將其溶解于0.2M氯化鈣中。然后，用0.2M氯化鈣平衡DEAE Sepharose FF柱。將溶于0.2M氯化鈣中含硫酸巖藻糖的多糖混合物上該DEAE Sepharose FF柱，并用0.2M氯化鈣充分洗滌，接著用0至4M線性濃度梯度的氯化鈉洗脫。在被洗脫出的組分中，收集用0.05至0.8M濃度范圍的氯化鈉洗脫出的組分，并通過透析脫鹽，接著凍干以得到基本上無巖藻多糖-F的巖藻多糖-U(2.1克)。
此外，在上述組分中，收集用0.9至1.5M濃度范圍的氯化鈉洗脫出的組分，并通過透析脫鹽，接著凍干以獲得基本上無巖藻多糖-U的巖藻多糖-F(4.7克)。
當(dāng)通過用Sephacryl S-500的凝膠過濾柱層析測定上述巖藻多糖-F的分子量時(shí)，結(jié)果顯示中位值約為19萬的分子量分布。
(2)按照實(shí)施例1中描述的方法分析巖藻多糖-F的成分。
該巖藻多糖-F的組成糖是巖藻糖和半乳糖，且其摩爾比約為10∶1。不含大量的糖醛酸和其它中性糖類。另外，巖藻糖和硫酸酯基的摩爾比約為1∶2。
將1％的巖藻多糖-F溶液(16ml)和50mM磷酸緩沖液(pH 8.0,12ml)、4M氯化鈉(4ml)及實(shí)施例1-3中描述的內(nèi)切型巖藻多糖分解酶溶液(32mU/ml,8ml)混合，并于25℃使該混合物反應(yīng)48小時(shí)。沒觀察到由于反應(yīng)而產(chǎn)生的分解產(chǎn)物的形成。
然后用高速、高靈敏旋光儀SEPA-300(由Horiba Seisakusho制造)測定該巖藻多糖-F凍干產(chǎn)物的比旋光度，它為-135°。
實(shí)施例3用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(由Gibco生產(chǎn))于37℃培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞(P3×63Ag8,ATCC TIB-9)，所述胎牛血清(由JRHBioscience生產(chǎn))先在56℃處理30分鐘。將所述細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/1.8ml的濃度懸浮于含10％胎牛血清的RPMl1640培養(yǎng)基中。另一方面，將實(shí)施例1中所述的巖藻多糖-U和實(shí)施例2所述的巖藻多糖-F分別溶解于含100mM氯化鈉的50mM HEPES緩沖液中(pH 7.2)，并于120℃加熱處理20分鐘。將巖藻多糖濃度為5、10或20mg/ml的巖藻多糖-U溶液和巖藻多糖-F溶液各自(0.2ml)加入上述細(xì)胞懸浮液(1.8ml)中，并在存在5％CO2的條件下，于37℃培養(yǎng)這些混合物92小時(shí)。
在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，以檢查細(xì)胞生長的程度及細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果是添加了巖藻多糖-U或巖藻多糖-F的骨髓瘤細(xì)胞顯示出例如細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核破碎等等細(xì)胞細(xì)胞凋亡特征。沒加樣品的對照組的骨髓瘤細(xì)胞數(shù)增加多至約70倍；而加了巖藻多糖-U或巖藻多糖-F的骨髓瘤細(xì)胞則被殺傷；表明這兩種巖藻多糖顯示出強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。按照Sosiki Baiyou no Gizyutsu(Technique for Tissue Culture)，第2卷，The Society ofJapan Tissue Culture編輯，Asakura Shoten出版，第26-28頁，1990所描述的方法，在培養(yǎng)開始后隨著時(shí)間進(jìn)行活細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)；即，在血球計(jì)數(shù)器上數(shù)被錐蟲藍(lán)染色的細(xì)胞數(shù)，以得到活細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果示于圖2和圖3，圖2和圖3是闡明培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)之間關(guān)系的圖解。該水平軸表示培養(yǎng)時(shí)間，垂直軸表示肉湯培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)。圖3是圖2的擴(kuò)大圖，其中在垂直軸上的標(biāo)度被擴(kuò)大了。在圖2和圖3中，×代表沒加任何樣品的對照(C)，空心圓代表以濃度0.5mg/ml加入巖藻多糖-U，空心三角代表以濃度1mg/ml加入巖藻多糖-U，空心方格代表以濃度2mg/ml加入巖藻多糖-U，實(shí)心圓代表以濃度0.5mg/ml加入巖藻多糖-F，實(shí)心三角代表以濃度1mg/ml加入巖藻多糖-F，且實(shí)心方格代表以濃度2mg/ml加入巖藻多糖-F。
(2)在含10％于56℃處理30分鐘的胎牛血清(由JRH Bioscience生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(由Gibco生產(chǎn))中培養(yǎng)人急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞HL-60(ATCC CCL-240)。以5×104個(gè)細(xì)胞/900μl的濃度將該細(xì)胞懸浮于ASF104培養(yǎng)基(由Ajinomoto生產(chǎn))中。在由FALCON生產(chǎn)6孔板的每個(gè)孔中，各加入4.5ml等份的這種懸浮液。另一方面，以10mg/ml的濃度將實(shí)施例1中描述的巖藻多糖-U和實(shí)施例2中描述的巖藻多糖-F分別溶解于含120mM氯化鈉的30mM HEPES緩沖液(pH 7)中，并通過一濾紙進(jìn)行過濾。將這些濾液每種(0.5ml)加入上面的懸浮液中，并于37℃在存在5％CO2的條件下培養(yǎng)。作為對照，加入等量的上述緩沖液并按照同樣的方法培養(yǎng)該混合物。按照上面描述的同樣方法，在培養(yǎng)開始后16小時(shí)及40小時(shí)，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果顯示于圖4。即，圖4是一圖解，它說明了以1mg/ml的濃度往HL-60細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中加入巖藻多糖-U或巖藻多糖-F而得到的培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系。該水平軸代表培養(yǎng)時(shí)間，且垂直軸代表肉湯培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)。在圖4中，空心圓代表巖藻多糖-U而實(shí)心圓代表巖藻多糖-F；對照(沒加樣品)的活細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)開始后16小時(shí)為7×104個(gè)細(xì)胞/ml，且在培養(yǎng)開始后40小時(shí)為1.4×105個(gè)細(xì)胞/ml。
結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)抑制HL-60細(xì)胞生長速率的巖藻多糖-U和巖藻多糖-F導(dǎo)致HL-60細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
另外，以10mg/ml的濃度將巖藻多糖-U和巖藻多糖-F分別溶解于120mM氯化鈉的30mM HEPES緩沖液中(pH7)，并于121℃高壓滅菌20分鐘。按照上面描述的同樣方法測定這些溶液的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，并且得到同樣的結(jié)果。
(3)將5-氟尿嘧啶(5-FU，由Amresco生產(chǎn)，150mg/kg)經(jīng)腹膜內(nèi)給藥于6至8周齡的小鼠(C3H/HeJ)。2天后，在股骨和脛骨上切切口以收集骨髓；將所收集的骨髓用Ficoll Hypaque(密度為1.0875g/ml、由Pharmacia生產(chǎn))進(jìn)行密度梯度離心，以制備低密度單核細(xì)胞組分；該組分用作小鼠骨髓細(xì)胞。在存在或不存在實(shí)施例中描述的巖藻多糖-U或?qū)嵤├?中描述的巖藻多糖-F的條件下將小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行液體培養(yǎng)，即，將上述小鼠骨髓細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度加入α-MEM(由Gibco生產(chǎn))中，所述α-MEM含20％的胎牛血清、重組的人白細(xì)胞介素-6(rhIL-6,100U/ml，由Amgen生產(chǎn))、重組小鼠干細(xì)胞因子(rmSCF,100ng/ml，由Amgen生產(chǎn))、青霉素(50U/ml)和鏈霉素(50μg/ml)，且進(jìn)一步加巖藻多糖-U或巖藻多糖-F(1mg/ml)于其中。然后，在5％CO2中于37℃培養(yǎng)該混合物48小時(shí)。
在培養(yǎng)結(jié)束后，通過傾析以收集未附著的細(xì)胞，并通過用一種細(xì)胞解離液(CDB，無任何酶，由Gibco生產(chǎn))，收集附著于用于培養(yǎng)的板上的細(xì)胞。將所述細(xì)胞合并，并數(shù)細(xì)胞數(shù)。對收集的細(xì)胞進(jìn)行HPP-CFC(高增殖潛力-集落形成細(xì)胞)分析。
按照Bradley等[Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci,44,287-293(1966)]描述的方法進(jìn)行HPP-CFC分析。將1％/0.66％上層軟瓊脂培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基，并以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度加入感染的細(xì)胞；在10％CO2中于37℃培養(yǎng)所述細(xì)胞13天。培養(yǎng)結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)的集落，并計(jì)數(shù)得自HPP-CFC的高密度集落，(其直徑0.5毫米或更大)。
結(jié)果示于圖5，即，圖5為闡明巖藻多糖和高密度集落數(shù)之間關(guān)系的圖形。該水平軸代表所用的巖藻多糖和沒加任何巖藻多糖的對照，垂直軸代表高密度集落數(shù)。如同從圖5所見，關(guān)于高密度集落數(shù)，在加了巖藻多糖-U或巖藻多糖-F的培養(yǎng)基和對照之間，沒識(shí)別出明顯的差異。
實(shí)施例4在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(由Gibco生產(chǎn))中于37℃培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞(P3×63Ag8U.l,ATCC CRL-1597)，該胎牛血清(由JRHBioscience生產(chǎn))已在56℃處理30分鐘；并以2.5×105個(gè)細(xì)胞/4.5ml的濃度將骨髓瘤細(xì)胞懸浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。另一方面，以10mg/ml的濃度將硫酸葡聚糖(分子量為50萬、由Oncor生產(chǎn))溶解于含120mM氯化鈉的50mM HEPES緩沖液(pH 7.0)中，并通過過濾除茵。將該溶液(0.5ml)加入上述懸浮液(4.5ml)中，并在存在5％CO2的條件下于37℃培養(yǎng)60小時(shí)。
在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞以檢查生長的程度和細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果是添加了硫酸葡聚糖的骨髓瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞凋亡的特征，例如細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核破碎等等。沒加任何樣品的對照骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)增加多至約20倍；而加了硫酸葡聚糖的骨髓瘤細(xì)胞被殺傷。因而，硫酸葡聚糖呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。在培養(yǎng)開始后，隨著時(shí)間的延續(xù)，通過錐蟲藍(lán)染色而計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)目。
結(jié)果示于圖6。圖6是一闡明培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)間關(guān)系的圖解，該水平軸代表培養(yǎng)時(shí)間，垂直軸代表肉湯培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)。在圖6中，空心方格代表沒加任何樣品的對照，而空心圓代表加了硫酸葡聚糖(1mg/ml)。
其次，以10mg/ml的濃度將硫酸葡聚糖(分子量為50萬、由Oncor生產(chǎn))溶解于含120mM氯化鈉的50mM HEPES緩沖液(pH 7.0)中，并于120℃熱處理20分鐘。按照與上面描述方法相同的方法，使用硫酸葡聚糖測定細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
結(jié)果示于圖7。圖7說明了培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系，該水平軸代表培養(yǎng)時(shí)間，垂直軸代表肉湯培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)。在圖7中，空方格代表沒加任何樣品的對照，而實(shí)心圓代表添加了熱處理的硫酸葡聚糖(1mg/ml)。該熱處理的硫酸葡聚糖也具有強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。實(shí)施例5以10mg/ml的濃度將市售檸檬果膠溶解于含120mM氯化鈉的50mM HEPES緩沖液(pH 7.0)中，該溶液的pH為5.0。將其于121℃加熱處理30分鐘，測紫外吸收光譜時(shí)，該熱處理過的材料在約235nm的光吸收增加。
用1N氫氧化鈉將這些樣品調(diào)至pH 7.0，并按照象實(shí)施例3-(2)中描述的同樣方法，測定細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
結(jié)果示于圖8。熱處理過的果膠呈現(xiàn)出顯著的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。即，圖8是一說明圖，它闡明了當(dāng)向HL-60細(xì)胞肉湯培養(yǎng)物中加入熱處理過的果膠溶液(1mg/ml)時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間和肉湯培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)。該水平軸代表培養(yǎng)時(shí)間，垂直軸代表肉湯培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)。在圖8中，空心方塊代表沒加任何樣品的對照，而空心菱形代表添加了熱處理過的果膠。實(shí)施例6(1)將D-葡萄糖醛酸(10g,Sigma生產(chǎn)，G 5269)溶解于水(1升)中，于121℃加熱4小時(shí)，并在減壓條件下濃縮至約10ml。將醋酸丁酯-醋酸-水(3∶2∶2)的混合物的上層液(40ml)加到該濃縮液中，并攪拌該混合物且離心，在減壓條件下將上清液濃縮至約10ml。
用硅膠BW-300SP柱(2×28cm，由Fuji Silicia Chemical制造)對上述提取物進(jìn)行柱層析，并在用壓縮機(jī)形成的0.2kg/cm2的壓力下，以5ml/分的流速，用醋酸丁酯-醋酸-水(3∶2∶2)的上層液作為洗脫液進(jìn)行分級(jí)分離。收集各個(gè)10ml的級(jí)分并通過TLC對其一部分進(jìn)行分析。作為結(jié)果，第61-80號(hào)的級(jí)分包含高純度的環(huán)戊烯酮。合并這些級(jí)分并在減壓條件下濃縮，然后用氯仿(約40ml)提?。辉跍p壓條件下濃縮提取物以獲得環(huán)戊烯酮(約100mg)。
用PALPAK型S柱(由Takara Shuzo制造)對該級(jí)分進(jìn)行了正相HpLC，并測定了其在215nm的紫外吸收。結(jié)果是純度為98％。
(2)將臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞(原代培養(yǎng)物，由Clonetics生產(chǎn)，CC-2517)傳代一次，并按照常規(guī)方法冰凍保藏。將細(xì)胞解凍，并在用磷酸緩沖鹽溶液(由Takara Shuzo生產(chǎn))洗滌二次后，以l×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將其懸浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。往96孔微量滴定板的每個(gè)孔中各加入90μl等份的該細(xì)胞懸浮液，并向各孔中分別加入10μl等份的10、20、50、100、200、500或1000μM的環(huán)戊烯酮水溶液或水(對照)。在存在5％CO2的條件下于37℃培養(yǎng)該板上的細(xì)胞48小時(shí)，然后，向其中加入含溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT、由Sigma生產(chǎn))的磷酸緩沖鹽水(5mg/ml)溶液(10μl)，再繼續(xù)培養(yǎng)4小進(jìn)。接著，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長。此外，加入含0.04N HCl的2-丙醇(100μl)，充分?jǐn)嚢柙摶旌衔锊y量其在590nm的光吸收。計(jì)算加入了環(huán)戊烯酮的組在590nm的光吸收與由僅加水進(jìn)行培養(yǎng)的對照組在590nm的光吸收的比率，以根據(jù)對細(xì)胞生長的抑制活性來確定細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
除了在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代外，對HL-60細(xì)胞進(jìn)行同樣的步驟。結(jié)果是與環(huán)戊烯酮對正常細(xì)胞HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞生長抑制活性相比，環(huán)戊烯酮對癌細(xì)胞HL-60細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞生長抑制活性。
結(jié)果示于圖9。圖9是說明環(huán)戊烯酮的加入量(終濃度)與細(xì)胞生長程度之間關(guān)系的圖解，在圖9中，水平軸代表環(huán)戊烯酮的濃度(終濃度μM)，且垂直軸代表加入環(huán)戊烯酮組在590nm的光吸收與加水組在590nm的光吸收之比(％)。在圖9中，空心圓代表用HUVEC而得到的結(jié)果，而實(shí)心圓代表用HL-60而得到的結(jié)果。此外，在顯微鏡下觀察到的細(xì)胞生長和在590nm的光吸收是對應(yīng)的。
(3)按照常規(guī)方法用胰蛋白酶分散成纖維細(xì)胞NTH/3T3細(xì)胞(ATCC CRL-1658)，并以5×104個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于含10％胎牛血清的Dulbecco修改的Eagle氏培養(yǎng)基中。接著，在一塊96孔微量滴定板的各個(gè)孔內(nèi)各加入90μl等份的上述懸浮液。向各孔中分別加入15.6、31.3、62.5、125、250、500或1000μM的環(huán)戊烯酮水溶液(10μl)，或加入水(10μl)作為對照；并在存在5％CO2的情況下于37℃培養(yǎng)該板上的細(xì)胞48小時(shí)。再加入5mg/ml MTT的磷酸緩沖鹽溶液(10μl)，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長并按照細(xì)胞生長抑制活性估計(jì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
除了在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞外，對HL-60細(xì)胞重復(fù)同樣的步驟。
作為結(jié)果，對NIH/3T3細(xì)胞而言，在以終濃度25μM加入了環(huán)戊烯酮的組中，沒觀察到細(xì)胞的生長；而在以終濃度12.5μM加入了環(huán)戊烯酮的組中，觀察到與加水的對照組細(xì)胞生長相同的細(xì)胞生長，相反地，對HL-60細(xì)胞，在以終度6.25μM加入了環(huán)戊烯酮的組中，沒觀察到細(xì)胞的生長，并且?guī)缀跛屑?xì)胞都被殺死。因而已經(jīng)闡明，與非腫瘤細(xì)胞系NIH/3T3相比，環(huán)戊烯酮顯示出對腫瘤細(xì)胞系HL-60選擇性的細(xì)胞生長抑制活性和選擇性的殺細(xì)胞活性。實(shí)施例7巖藻多糖-U對HUVEC和HL-60的活性將HUVEC細(xì)胞傳代1次，并按照常規(guī)方法冰凍保藏。解凍細(xì)胞，并在用磷酸緩沖鹽溶液洗二次后，將其以1×105個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于含10％胎牛血清和0.1％牛腦提取物的EBM培養(yǎng)基中(由SankoPure Chemical生產(chǎn))。往一塊12孔微量滴定板的每個(gè)孔中各加入900μl等份的該細(xì)胞懸浮液，并向其中加入100μl的巖藻多糖-U水溶液(10mg/ml)或生理鹽水(對照)。在存在5％CO2的條件下將該板上的細(xì)胞于37℃培養(yǎng)24或48小時(shí)；用胰蛋白酶處理后，收集所述細(xì)胞。用錐蟲藍(lán)將所述細(xì)胞染色，并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，以計(jì)算活細(xì)胞的比率，從而確定細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性。
除了在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代所述細(xì)胞及不用胰蛋白酶進(jìn)行處理外，對HL-60細(xì)胞進(jìn)行同樣的步驟。
結(jié)果是以1mg/ml的終濃度往HUVEC細(xì)胞中加入了巖藻多糖-U的組，顯示出的活細(xì)胞比率與加了生理鹽水的對照組的活細(xì)胞比率相同；而以1mg/ml的終濃度往HL-60細(xì)胞中加入了巖藻多糖-U的組，與加了生理鹽水的對照組相比，顯示出活細(xì)胞比率明顯下降。因此已經(jīng)闡明，巖藻多糖-U誘導(dǎo)對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡，降低其活細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果示于圖10和圖11。圖10是說明HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞比率間關(guān)系的圖解，其中水平軸代表培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，且垂直軸代表活細(xì)胞比率(％)；在圖10中，實(shí)心圓代表用巖藻多糖-U而得到的結(jié)果，而空心圓代表通過使用加了生理鹽水的對照而得到的結(jié)果。在圖10中，在加入巖藻多糖-U的開始階段，活細(xì)胞比率與加入了生理鹽水的活細(xì)胞比率幾乎相同，因此該實(shí)心圓重疊到空心圓上。此外，圖11是說明H L-60細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞比率間關(guān)系的圖解，其中水平軸代表培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，而垂直軸代表活細(xì)胞比率(％)。在圖11中，實(shí)心圓代表用巖藻多糖-U而得到的結(jié)果，而空心圓代表用加了生理鹽水的對照而得到的結(jié)果。
如同在上文所描述的，按照本發(fā)明，提供大致無癌細(xì)胞的造血干細(xì)胞組合物。當(dāng)將一外源基因轉(zhuǎn)入到該組合物中并移植到宿主體內(nèi)時(shí)，可安全地進(jìn)行造血干細(xì)胞的移植而沒有將該基因轉(zhuǎn)入到癌細(xì)胞中這樣的風(fēng)險(xiǎn)。按照本發(fā)明，能除掉用于基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞組合物中的癌細(xì)胞，以確立基因轉(zhuǎn)移的安全。
附圖簡述圖1是說明巖藻多糖-U和巖藻多糖-F形成沉淀的圖解。
圖2為一圖解，它闡明了在存在巖藻多糖-U和巖藻多糖-F條件下，培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。
圖3是圖2的一幅擴(kuò)大圖，其中在垂直軸上的標(biāo)度被擴(kuò)大了。
圖4是說明HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)之間關(guān)系的圖解。
圖5是說明巖藻多糖和高密度集落數(shù)之間關(guān)系的圖解。
圖6是一圖解，它闡明了在存在硫酸葡聚糖的條件下，培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。
圖7是一圖解，它說明了在存在加熱的硫酸葡聚糖時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。
圖8是一圖解，它說明了在存在熱處理過的果膠時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間和活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。
圖9是一圖解，它闡明了添加的環(huán)戊烯酮的濃度和細(xì)胞生長之間的關(guān)系。
圖10是說明HUVEC細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和其活細(xì)胞比率之間關(guān)系的圖解。
圖11是說明HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和其活細(xì)胞比率之間關(guān)系的圖解。
權(quán)利要求
1．包含造血干細(xì)胞的已大致除掉了癌細(xì)胞的細(xì)胞組合物。
2．按照權(quán)利要求1的細(xì)胞組合物，其中通過用一種對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物已選擇性地除掉了癌細(xì)胞。
3．按照權(quán)利要求2的細(xì)胞組合物，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物是包含硫酸化多糖和/或其分解產(chǎn)物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
4．按照權(quán)利要求3的細(xì)胞組合物，其中所述硫酸化多糖是一種巖藻多糖或是一種硫酸葡聚糖。
5．按照權(quán)利要求2的細(xì)胞組合物，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物為含糖類化合物和/或其分解產(chǎn)物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，且所述糖類化合物包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物。
6．按照權(quán)利要求2的細(xì)胞組合物，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物是包含由式(1)表示的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
7．獲得包含造血干細(xì)胞的已大致除掉了癌細(xì)胞的細(xì)胞組合物的方法；所述方法包含的步驟是，通過用一種對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，選擇性地除掉所述細(xì)胞組合物中的癌細(xì)胞。
8．按照權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物是包含硫酸化多糖及/或其分解產(chǎn)物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所述硫酸化多糖為巖藻多糖或硫酸葡聚糖。
10．按照權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物為包含糖類化合物和/或其分解產(chǎn)物的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物，且所述糖類化合物包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物。
11．按照權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物為包含由式(1)表示的4,5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物。
12．細(xì)胞組合物，它包含造血干細(xì)胞和轉(zhuǎn)移入所述造血干細(xì)胞中的外源基因，并且已從中大致除掉了癌細(xì)胞。
13．按照權(quán)利要求12的細(xì)胞組合物，其中通過用一種對癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物已選擇性地除掉了癌細(xì)胞。
全文摘要
細(xì)胞組合物,其中通過用對癌細(xì)胞特異的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物,已選擇性地除去了其中的癌細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1224460SQ97196137
公開日1999年7月28日 申請日期1997年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月30日
發(fā)明者淺田起代蔵, 小西治子, 小山信人, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶酒造株式會(huì)社