專利名稱：臭氧誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的DNA序列，產(chǎn)生含有新DNA序列的新植物的方法，所述DNA序列的編碼序列經(jīng)臭氧誘導(dǎo)后被表達(dá)。本發(fā)明還涉及所述新植物，和DNA序列在植物和植物細(xì)胞中產(chǎn)生臭氧-反應(yīng)性基因表達(dá)的用途。另外，本發(fā)明還涉及新的啟動(dòng)子，通過(guò)除去其臭氧反應(yīng)能力可增加其特異性。
在過(guò)去的一百年里，較強(qiáng)的工業(yè)活動(dòng)使得北半球陸地上方較低的對(duì)流層中臭氧的濃度持續(xù)增加(Volz和Kley(1988)，自然，332,240-242)。與此同時(shí)，歐洲和北美的臭氧值也達(dá)到100nL/L至200nL/L的周期性高峰，(Krupa等，(1995)，環(huán)境污染，87,119-126)。
空氣污染物臭氧的植物毒性已被完善地檢測(cè)和報(bào)道，例見(jiàn)Heagle(1989),Annu.Rev.Phytopathol,27,397-423；Heath(1994):Alscher,Wellburn(編)“植物對(duì)大氣環(huán)境的反應(yīng)”,p121-145,Chapman& Hall，倫敦。通常，這種臭氧影響的結(jié)果是減少凈光合作用，增加早衰，從而會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)的衰弱和收獲產(chǎn)量的降低。
盡管臭氧利用擴(kuò)散作用由開放的氣孔侵入植物細(xì)胞，但不論環(huán)境中的臭氧濃度如何，葉細(xì)胞間空間內(nèi)的臭氧濃度幾乎為零(Laisk等，(1989)，植物生理學(xué)，90,1163-1167)。通常假定臭氧與細(xì)胞壁和質(zhì)膜的成分快速反應(yīng)，并轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚匝躅?，如過(guò)氧化物-陰離子，羥基基團(tuán)和過(guò)氧化氫，通過(guò)使用電子自旋共振光譜在經(jīng)臭氧處理的植物材料中可檢測(cè)到所述的活性氧類(Mehlhorn等，(1990),Physiologia Plantarum,79,377-383)。所謂的“氧化性爆發(fā)”，即相對(duì)大量的活性氧類的快速發(fā)展因改變了植物膜的通透性，滅活了對(duì)氧化還原作用敏感的蛋白質(zhì)和增加了脂質(zhì)的過(guò)氧化而導(dǎo)致對(duì)正常細(xì)胞功能的顯著干擾。
對(duì)經(jīng)臭氧處理的植物所進(jìn)行的最新試驗(yàn)顯示出非特異性防御酶生物合成的增加，所述防御酶的功能是保護(hù)活細(xì)胞使之抵抗因氧化應(yīng)力造成的損害(Kangasjarvi等，(1994)，植物細(xì)胞和環(huán)境，17,783-794)。但迄今為止仍不了解負(fù)責(zé)臭氧-誘導(dǎo)的基因激活，并將質(zhì)外體形成的相關(guān)信息傳遞至細(xì)胞核心的信號(hào)-轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈，即活性氧類。最近討論的結(jié)果是由氧化應(yīng)力引起的多種因素可能是信號(hào)聯(lián)系，所述因素在植物的防御反應(yīng)中一般能起一定的作用，所述因素如胞質(zhì)溶膠中鈣濃度的增加(Price等，(1994)，植物細(xì)胞，6,1301-1310)，水楊酸(Klessig和Malamy(1994)，植物分子生物學(xué)，26,1439-1458)和植物激素茉莉酸(Farmer(1994)，植物分子生物學(xué)，26,1423-1437)和乙烯(Ecker(1995)，科學(xué)，268,667-674)的形成。
對(duì)通入臭氧的煙草植物的試驗(yàn)表明臭氧可導(dǎo)致多種疾病抗性基因，即一些PR-(致病-相關(guān))蛋白表達(dá)的增加(Ernst等，(1992)，植物分子生物學(xué)，20,673-682；Ernst等，(1996)，植物生理學(xué)雜志，148,215-221；Eckey-Kaltenbach等，(1994)，植物生理學(xué)，104,67-74)。這些結(jié)果表明由臭氧引起的氧化應(yīng)力可按與病原體攻擊類似的方式影響植物防御基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)。目前能利用的有關(guān)順式調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄因子的信息非常有限，作為對(duì)多種環(huán)境影響的反應(yīng)，所述調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄因子可能在控制非特異性防御基因的基因表達(dá)方面起一部分作用(Lee等，(1994)，歐洲生物化學(xué)雜志，226,109-114)。然而，根據(jù)目前的研究結(jié)果，可假定編碼PR-蛋白的基因存在分離的或至少僅部分重疊方式的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Somssich(1994):Nover(編)“植物啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子”，p163-179,Springer Publishing House，柏林；Dolferus等，(1994)，植物生理學(xué)，105,1075-1087)。
至于參與植物抗毒素合成的1,2-二苯乙烯合酶(STS)的活性，已知在成年植物中環(huán)境應(yīng)力因素可誘導(dǎo)該活性，所述因素如病原體攻擊(Langcake(1981),Physiol.Plant Pathol,18,213-226)，紫外線(Fritzemeier和Kindl(1981),Planta,151,48-52)和臭氧(Rosemann等，(1991)，植物生理學(xué)，97,1280-1286)。與之形成對(duì)照的是在胚中觀察到組成型表達(dá)模式(Sparvoli等，(1994)，植物分子生物學(xué)，24,743-755)。
1,2-二苯乙烯合酶催化由1分子p-香豆?；?CoA或肉桂酰-CoA和3單位丙二酰基-CoA合成1,2-二苯乙烯，如白藜蘆醇或赤松素。白藜蘆醇和赤松素具有植物抗毒素特性和抗真菌活性，并與其它衍生自苯基丙烷代謝的1,2-二苯乙烯聯(lián)合，作為植物抗毒素在抵抗病原體的防御中行使重要的功能(Hart(1981),Annu.Rev.Phytopathol,19,437-458)。
STS基因被發(fā)現(xiàn)于一些不相關(guān)的植物種中，如花生(Schroder等，(1988)，歐洲生物化學(xué)雜志，172,161-169)，葡萄樹(Hain等，(1993)，自然，361,153-156)和松樹(Fliegmann等，(1992)，植物分子生物學(xué)，18,489-503)，并構(gòu)建在較大的基因家族中，其含有6個(gè)或更多個(gè)基因(Lanz等，(1990),Planta,181,169-175；Wiese等，(1994)，植物分子生物學(xué)，26,667-677)。
對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明1,2-二苯乙烯合酶的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平上被調(diào)節(jié)，在多個(gè)植物種的進(jìn)化過(guò)程中，應(yīng)力-誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈被保留下來(lái)(Hain等，(1990)，植物分子生物學(xué)，15,325-335)。
已分離出花生(Arachis hypogaea)和葡萄樹(Vitis vinifera)的STS基因(Schroder等，(1988)，文獻(xiàn)同上或Hain等，(1993)，文獻(xiàn)同上)，并在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)了STS基因(Hain等，(1990)，文獻(xiàn)同上或Hain等，(1993)，文獻(xiàn)同上)。
已知編碼1,2-二苯乙烯合酶的DNA序列，例見(jiàn)歐洲專利EP0309862，德國(guó)專利申請(qǐng)DE-A-4107396，歐洲專利申請(qǐng)0464461以及美國(guó)專利5.500.367。這些文獻(xiàn)描述了1,2-二苯乙烯合酶基因的分離及其生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的用途。所得轉(zhuǎn)基因植物對(duì)多種植物害蟲如真菌，細(xì)菌，昆蟲，病毒和線蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。含有STS基因的質(zhì)粒已被保藏于德國(guó)微生物保藏中心(DSM),Mascheroder Weg 1B,D-38124,Braunschweig。還保藏了pVstⅠ質(zhì)粒中的葡萄樹VstⅠ-基因，其保藏號(hào)為DSM6002(DE-A-4107396,EP-A-0464461，美國(guó)專利5.500.367)。
同時(shí)還描述了STS編碼序列用于產(chǎn)生雄性不育的植物和花顏色有所改變的植物的用途(德國(guó)專利申請(qǐng)DE-A-4440200)，但至今仍完全未弄清STS基因表達(dá)和臭氧誘導(dǎo)之間可能存在的關(guān)系。
同時(shí)，有多種跡象表明為了基于轉(zhuǎn)基因植物中STS基因的表達(dá)對(duì)疾病產(chǎn)生盡可能有效的抗性，如果植物中異源STS基因的表達(dá)(或異源STS基因)首先被進(jìn)攻病原體刺激，即如果首先被植物和病原體的相互作用所刺激的話較為有利(Fischer和Hain(1994),Current Opinion in Bio-technology,5,125-130；Fischer(1994)“用于植保的1,2-二苯乙烯合酶基因之異源表達(dá)的最優(yōu)化”，Hohenheim大學(xué))。以下觀察結(jié)果特別贊同這一說(shuō)法，即病原體-誘導(dǎo)的STS基因表達(dá)局限于感染部位，并且具有瞬時(shí)特性，這意味著STS的表達(dá)相對(duì)快地達(dá)到最高值，并在48小時(shí)之內(nèi)重新降低(Hain等，(1993)，文獻(xiàn)同上)。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中STS基因在花椰菜花葉病毒的組成型35S RNA啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明真菌感染后，所述植物獲得的抗病性低于在病原體-誘導(dǎo)的同源STS啟動(dòng)子控制下表達(dá)相同基因的植物所獲得的抗性(Fischer和Hain等，(1994)，文獻(xiàn)同上；Fischer(1994)，文獻(xiàn)同上)。無(wú)論如何，需要因插入STS基因而顯示出較強(qiáng)的抗病性的轉(zhuǎn)基因栽培植物中的STS表達(dá)只被(和直至)病原體的攻擊激活和控制，而不必另外(或以前曾)被不必要的環(huán)境應(yīng)力因素如臭氧所激活和控制。
因此，植保生物技術(shù)研究的重要任務(wù)是在植物中實(shí)現(xiàn)更特殊的防御基因表達(dá)，為了以有效的和可控的方式使產(chǎn)生較強(qiáng)抗性植物的分子生物學(xué)策略具體化。重要的是除去不必要的，非特異性的環(huán)境刺激，如通過(guò)臭氧，紫外線，重金屬，極端溫度和其它非生物刺激誘導(dǎo)某些防御基因。
因此，本發(fā)明重要的目的是提供在臭氧誘導(dǎo)的抗性基因表達(dá)中直接起作用的新的DNA序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是顯示除去臭氧誘導(dǎo)的可能性，即消除臭氧對(duì)基因表達(dá)不必要的刺激。
另外，本發(fā)明的重要目的是提供DNA序列，借助于該DNA序列，僅在植物與病原體接觸之后，而不必通過(guò)臭氧刺激可在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)1,2-二苯乙烯合酶基因。
正如在本文開始時(shí)所述，可觀察到對(duì)植被也有顯著影響的臭氧影響的穩(wěn)定增加。目前，對(duì)空氣中臭氧濃度的觀察和測(cè)定已構(gòu)成化學(xué)，物理學(xué)，和生物學(xué)，環(huán)境學(xué)研究的焦點(diǎn)。用于這種研究的重要工具是所謂的生物監(jiān)測(cè)器，借助于該工具易于定性和定量地測(cè)定臭氧影響及其后果，尤其是生物毒性效果。
因此，本發(fā)明的另一目的是提供可用于產(chǎn)生定向的臭氧可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的DNA序列。借助于這種啟動(dòng)子可使生物技術(shù)研究領(lǐng)域中眾所周知的所謂的報(bào)道基因被用作生物監(jiān)測(cè)器，由簡(jiǎn)單的酶促試驗(yàn)即可證明所述報(bào)道基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種系統(tǒng)，借助于該系統(tǒng)，可使某些基因在必要時(shí)，如臭氧影響較大的情況下能被“打開”，所述基因的表達(dá)產(chǎn)物能解毒細(xì)胞中的氧類。換句話說(shuō)，通過(guò)提供負(fù)責(zé)臭氧-反應(yīng)基因之調(diào)節(jié)的DNA序列，應(yīng)該可以提供所述基因的臭氧-誘導(dǎo)的表達(dá)，所述基因如過(guò)氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因。因此，本發(fā)明的目的是提供可用于產(chǎn)生臭氧誘導(dǎo)的，細(xì)胞“臭氧保護(hù)系統(tǒng)”的DNA序列。隨著下列描述的進(jìn)行，本發(fā)明的其它目的將是顯而易見(jiàn)的。
通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題，特別是根據(jù)本發(fā)明所提供的直接參與植物中臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)的DNA序列可解決這些問(wèn)題。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)某些植物核酸序列直接參與臭氧-反應(yīng)性STS表達(dá)。而對(duì)轉(zhuǎn)基因的煙草胚和植物(在不同長(zhǎng)度的5’缺失的葡萄樹VstⅠ啟動(dòng)子的控制下表達(dá)大腸桿菌中常規(guī)的報(bào)道基因uidA，所述基因編碼β-葡糖醛酸酶)所作的實(shí)驗(yàn)表明至少一些負(fù)責(zé)真菌誘導(dǎo)的順式元件(cis-element)位于含有堿基對(duì)-140至-280(從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)處計(jì)算)的啟動(dòng)子范圍內(nèi)(Fischer(1994)，文獻(xiàn)同上)，含有堿基對(duì)-280至-430的VstⅠ序列范圍是通過(guò)臭氧強(qiáng)烈激活基因表達(dá)所必需的。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)，可以表明剩下直至并包括-280的唯一堿基對(duì)的VstⅠ啟動(dòng)子(因而缺乏位于其上游的VstⅠ-啟動(dòng)子序列)不再是臭氧可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。然而，如上所述，所述變短的啟動(dòng)子仍能表現(xiàn)出由其控制的編碼序列的病原體-誘導(dǎo)的基因表達(dá)(見(jiàn)Fischer(1994)，文獻(xiàn)同上)。
上述分析也讓我們懷疑用臭氧處理植物與植物細(xì)胞中乙烯生物合成或釋放增加之間的關(guān)系，因此，臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中乙烯反應(yīng)元件的參與不能被排除，通過(guò)考慮最近在乙烯反應(yīng)能力方面被討論的熟悉的順式元件(Sessa等，(1995)，植物分子生物學(xué)，28,145-153；Shinshi等，(1995)，植物分子，27,923-932)，在臭氧誘導(dǎo)的STS基因表達(dá)中不能排除含有堿基對(duì)-283至-273的VstⅠ啟動(dòng)子之序列范圍的參與。
因此，首次在本文中描述的臭氧反應(yīng)性DNA序列范圍含有葡萄樹VstⅠ啟動(dòng)子的堿基對(duì)-270至-430。
因此，本發(fā)明涉及權(quán)利要求1所限定的DNA序列(SEQ ID NO:1):
ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAA T，所述序列是植物中臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)所必需的。本發(fā)明優(yōu)選的DNA序列涉及得自葡萄樹的DNA序列，特別優(yōu)選得自葡萄樹1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ的DNA序列(堿基對(duì)-270至-430)。
另外，本發(fā)明涉及至少缺乏含有VstⅠ基因之堿基對(duì)-270至-430的DNA序列的VstⅠ基因啟動(dòng)子區(qū)域。優(yōu)選本發(fā)明涉及僅含有VstⅠ基因翻譯起始點(diǎn)至堿基對(duì)-270的序列范圍的VstⅠ基因啟動(dòng)子區(qū)域。特別優(yōu)選缺乏VstⅠ基因之序列范圍-270至-430的啟動(dòng)子區(qū)域能賦予植物病原體誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
本發(fā)明也涉及嵌合的核酸分子，其中插入了VstⅠ基因之堿基對(duì)-270至-430的DNA序列或至少插入此序列范圍的片段。特別優(yōu)選本發(fā)明的嵌合核酸分子因VstⅠ基因之堿基對(duì)-270至-430的DNA序列或至少其片段的存在可為含有所述核酸分子的植物提供編碼區(qū)的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
核酸分子可以是任何核酸分子，尤其是DNA或RNA分子，如cDNA，基因組DNA,mRNA等。它們可以是天然產(chǎn)生的分子或通過(guò)基因技術(shù)或化學(xué)合成方法制備的分子。
目前，通過(guò)利用本發(fā)明的DNA序列，啟動(dòng)子區(qū)域，核酸分子或載體，可以利用基因技術(shù)方法以使植物細(xì)胞顯示出臭氧誘導(dǎo)特性的方式突變所述植物細(xì)胞。另外，可以利用基因技術(shù)方法以使植物細(xì)胞顯示出一個(gè)或多個(gè)基因不再能被臭氧誘導(dǎo)，但優(yōu)選主要被病原體誘導(dǎo)之特性的方式突變所述植物細(xì)胞，所述基因因權(quán)利要求1所述DNA序列或衍生自該序列的DNA序列或與所述DNA序列同源的DNA序列而天然地可被臭氧誘導(dǎo)。
本發(fā)明特殊的優(yōu)點(diǎn)是這一事實(shí)可通過(guò)在基因中缺失權(quán)利要求1所述的DNA序列，或至少缺失其片段來(lái)消除植物和植物細(xì)胞中天然可被臭氧誘導(dǎo)的基因的臭氧誘導(dǎo)，所述基因中天然含有此DNA序列或可衍生自此DNA序列的DNA序列或與所述DNA序列同源的DNA序列。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)使用本發(fā)明的核酸序列能使植物和植物細(xì)胞中不能或基本上不能天然地被臭氧誘導(dǎo)的基因顯示出能被臭氧誘導(dǎo)的特性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，負(fù)責(zé)臭氧誘導(dǎo)之表達(dá)的核酸分子或至少其片段控制著基因表達(dá)，所述基因的基因產(chǎn)物能解毒植物細(xì)胞中由臭氧引起的除別的以外還可產(chǎn)生的活性氧類。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子控制過(guò)氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因的表達(dá)。
在其它的實(shí)施方案中，負(fù)責(zé)臭氧誘導(dǎo)之基因表達(dá)的DNA序列控制著報(bào)道基因的表達(dá)，為了定量和/或定性地測(cè)定臭氧濃度和評(píng)價(jià)臭氧的影響可測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)。這種報(bào)道基因可以是例如植物生物技術(shù)中常規(guī)的大腸桿菌編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)的uidA基因，螢光素基因或其它基因。生物技術(shù)，生物化學(xué)或分子生物學(xué)領(lǐng)域的每一位技術(shù)人員都熟悉適當(dāng)?shù)膱?bào)道基因。
另外，本發(fā)明涉及含有上述DNA序列或其啟動(dòng)子區(qū)域或其片段的載體，因此，本發(fā)明也涉及基因技術(shù)中常見(jiàn)的含有本發(fā)明的上述核酸分子的載體，特別是質(zhì)粒，粘粒，病毒，噬菌體和其它載體，如有必要，可使用所述載體將所述核酸分子轉(zhuǎn)移到植物或植物細(xì)胞中。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明核酸分子的經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物，如細(xì)菌，病毒和真菌。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供植物和植物細(xì)胞，所述植物和植物細(xì)胞的特征在于缺乏在植物中可天然地通過(guò)臭氧誘導(dǎo)的基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
通過(guò)提供負(fù)責(zé)臭氧誘導(dǎo)的DNA序列和通過(guò)利用缺乏所述序列的啟動(dòng)子，因而可以不再為受該啟動(dòng)子控制的植物和植物細(xì)胞中的基因提供臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)解決了這一難題。
通過(guò)提供本發(fā)明的DNA序列可類似地解決為不能天然地被臭氧誘導(dǎo)的基因提供臭氧反應(yīng)性基因表達(dá)的難題，因此，利用了在臭氧存在的條件下可特異性地確定某些特性的植物和植物細(xì)胞。
優(yōu)選的實(shí)施方案涉及經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞，其中基因經(jīng)臭氧誘導(dǎo)而表達(dá)，其基因產(chǎn)物能解毒植物細(xì)胞中的活性氧類。在此方面特別優(yōu)選過(guò)氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因。或者，也可以產(chǎn)生植物和植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)，所述植物和植物細(xì)胞經(jīng)臭氧誘導(dǎo)后顯示出所謂的報(bào)道基因的特性，所述報(bào)道基因必要時(shí)可用作生物監(jiān)測(cè)器。
因此，本發(fā)明的主題是轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物含有整合至植物基因組的如上所述的重組核酸分子，這種植物在理論上可以是任何植物，優(yōu)選這種植物是單子葉或雙子葉的有用植物。單子葉植物的例子是屬于下列屬的植物燕麥，小麥，黑麥，大麥，水稻，稷，狼尾草，狗尾草，小米，玉米。有用的雙子葉植物如棉花，豆科植物，如豆，尤其是苜蓿，大豆，油菜，番茄，甜菜，馬鈴薯，觀賞植物，樹。其它有用的植物可以是產(chǎn)果植物(尤其是蘋果，梨，櫻桃，葡萄樹，柑橘，鳳梨和香蕉)，油棕櫚，茶樹和可可灌木，煙草，西沙爾麻以及藥用植物，如蘿芙木屬植物和洋地黃。特別優(yōu)選谷類植物，如小麥，黑麥，燕麥，大麥，水稻，玉米和黍，甜菜，油菜，大豆，番茄，馬鈴薯和煙草。
另外，本發(fā)明的主題是本發(fā)明植物的增殖材料，如種子，果實(shí)，插條，塊莖，根狀莖等以及這種植物的組成成分，如植物細(xì)胞，原生質(zhì)體和愈傷組織。
植物細(xì)胞包括分化的和未分化的植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)以及其中核酸分子整合至植物基因組中或以自主分子的形式存在(包括瞬時(shí)轉(zhuǎn)化)的植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及已被上述重組核酸分子或載體轉(zhuǎn)化或接種的宿主細(xì)胞，特別是原核或真核細(xì)胞，和衍生自所述宿主細(xì)胞并含有所述核酸分子或載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌或真菌細(xì)胞以及植物或動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的目的還在于描述生產(chǎn)植物和植物細(xì)胞的方法，所述植物和植物細(xì)胞的特征在于在植物和植物細(xì)胞中的其表達(dá)能天然地被臭氧刺激的基因缺乏臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
通過(guò)利用生產(chǎn)新的不具有這種天然產(chǎn)生的臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)的植物和植物細(xì)胞的方法可解決這一難題。
如上所述，本發(fā)明的另一目的是提供在臭氧刺激后表達(dá)這種基因的植物和植物細(xì)胞的生產(chǎn)方法，所述基因的表達(dá)天然地不被，或基本上不被臭氧激活。通過(guò)生產(chǎn)植物和植物細(xì)胞的方法可解決這一難題，所述植物和植物細(xì)胞在本發(fā)明的DNA序列或至少其片段插入天然不能被臭氧誘導(dǎo)的基因或僅在很低水平上被臭氧誘導(dǎo)的基因之后，經(jīng)臭氧刺激可表達(dá)這種基因。
有多種生產(chǎn)這種新植物或植物細(xì)胞的方法，首先，通過(guò)常規(guī)的基因技術(shù)轉(zhuǎn)化方法，以新的核酸分子整合至植物基因組的方式(這意味著產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體)突變植物或植物細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)包括下列步驟的方法生產(chǎn)因缺乏本發(fā)明的核酸序列或至少其片段而不再顯示出天然含有所述序列之基因的臭氧誘導(dǎo)現(xiàn)象的植物或植物細(xì)胞a)從基因中缺失如權(quán)利要求1所限定的DNA序列，或能衍生自所述序列的序列，或與所述序列同源的序列，或至少缺失這種序列的片段，所述基因缺失了本發(fā)明的DNA序列之后，包括植物細(xì)胞中可能被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)節(jié)元件，并具有至少一種編碼序列，以及可能有的用于終止轉(zhuǎn)錄和給各個(gè)轉(zhuǎn)錄物加上poly-A-尾的終止信號(hào)。
b)用步驟a)產(chǎn)生的基因或核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和c)可以再生轉(zhuǎn)基因植物和增殖植物。
可選擇的另一種方法是在步驟a)中不必缺失負(fù)責(zé)臭氧誘導(dǎo)的序列，只需通過(guò)例如誘變將所述序列或至少其片段滅活或阻斷，使其在基因中以失活的形式存在。不論以何種方式缺失臭氧反應(yīng)性基因的序列范圍，利用常規(guī)方法并借助于重組基因技術(shù)(例見(jiàn)Sambrook等，(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)可進(jìn)行所有的操作檢測(cè)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)中被轉(zhuǎn)移至植物或植物細(xì)胞的核酸分子含有允許例如編碼序列經(jīng)病原體誘導(dǎo)而進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)包括下列步驟的方法生產(chǎn)因本發(fā)明核酸序列或至少所述序列的片段存在而顯示出臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)的植物或植物細(xì)胞，所述核酸序列是含有該序列之基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)所必需的或共同負(fù)責(zé)所述表達(dá)a)在天然地不被，或基本上不被臭氧誘導(dǎo)表達(dá)的基因中插入至少一種在植物中可產(chǎn)生臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)的本發(fā)明的DNA序列，或衍生自所述序列的序列，或與所述序列同源的序列，或至少插入所述序列的片段。
b)用步驟a)產(chǎn)生的具有在植物細(xì)胞中表達(dá)所天然必需的所有元件的基因或核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和c)可以再生轉(zhuǎn)基因植物和增殖植物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及的基因是過(guò)氧化氫酶歧化酶，超氧化物歧化酶或一般的報(bào)道基因。
本發(fā)明的另一目的是顯示本發(fā)明核酸序列有利的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明包括新的DNA分子用于生產(chǎn)上述本發(fā)明植物和植物細(xì)胞的用途，所述植物和植物細(xì)胞的特征在于或者缺乏正常情況下受臭氧影響的某些表型區(qū)別性標(biāo)志，或者就是因?yàn)楸景l(fā)明DNA序列的存在，通過(guò)臭氧誘導(dǎo)的特性即可將它們自身與非轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞區(qū)分開。
另外，本發(fā)明包括本發(fā)明的核酸分子用于生產(chǎn)其特征在于病原體誘導(dǎo)的而不是臭氧誘導(dǎo)的抗病性有所增加的植物的用途。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的核酸序列或其片段用于檢測(cè)和鑒定臭氧反應(yīng)性核酸元件的用途。
技術(shù)人員通過(guò)應(yīng)用常規(guī)的分子生物學(xué)方法，如雜交實(shí)驗(yàn)或DNA蛋白質(zhì)結(jié)合研究可鑒定這種臭氧反應(yīng)性核酸元件。例如，第一步可從經(jīng)臭氧處理的組織中分離poly(A)*RNA，然后建立cDNA庫(kù)。第二步可借助于基于未經(jīng)處理之組織的poly(A)*RNA分子的cDNA克隆，利用雜交來(lái)鑒定第一個(gè)庫(kù)中的那些克隆，所述雜交中相應(yīng)的poly(A)*RNA分子在臭氧處理過(guò)程中被嚴(yán)格誘導(dǎo)。借助于以此方式鑒定的cDNA，隨后可分離具有臭氧反應(yīng)性元件的啟動(dòng)子。當(dāng)檢查和鑒定這些分離的啟動(dòng)子時(shí)，核酸序列和分子可能是有用的工具。
本發(fā)明的主題也包括與本發(fā)明的上述核酸分子之一或上述DNA序列之一雜交的核酸分子或其片段。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“雜交”指的是在常規(guī)雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行的雜交，所述條件描述于例如Sambrook等，(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約。
可從例如基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中分離與本發(fā)明的分子雜交的核酸分子。
通過(guò)使用本發(fā)明的核酸分子，或所述分子的片段或這種分子的反向互補(bǔ)物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(例見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上)雜交即可實(shí)現(xiàn)這種核酸分子的鑒定和分離。
因此，本發(fā)明也涉及本發(fā)明DNA序列或其片段用于從植物或其它生物體中鑒定和分離同源序列的用途。
例如，精確地或大體上具有本發(fā)明核苷酸序列的核酸分子或這種序列的片段可用作雜交探針。用作雜交探針的片段也可以是合成的片段，借助于常規(guī)的合成技術(shù)可產(chǎn)生這種合成片段，該片段的序列基本上相當(dāng)于本發(fā)明核酸分子的序列。一旦鑒定和分離出與本發(fā)明核酸分子雜交的基因，必需測(cè)定序列并分析其特性。為此，技術(shù)人員可使用大量分子生物學(xué)，生物化學(xué)和生物技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法。
與本發(fā)明的核酸分子雜交的分子也包括上述DNA分子的片段，衍生物和等位基因變體，所述DNA分子含有活性形式或失活形式的臭氧反應(yīng)性序列，或者其特征在于它們不再具有這種序列。本文中所用術(shù)語(yǔ)“衍生物”指的是這些分子的序列與上述核酸分子之序列僅在一個(gè)或幾個(gè)位置上有差別，在很大程度上與所述序列同源。在此方面的同源性指的是序列同一性至少為40％，特別是同一性至少為60％，優(yōu)選為80％以上，特別優(yōu)選為90％以上。缺失，添加，取代，插入或重組可導(dǎo)致得自上述核酸分子的衍生物。
至于與上述分子同源并構(gòu)成這種分子的衍生物的核酸分子，它通常包括這種分子的變體，所述變體具有修飾，但行使相同的生物學(xué)功能。這些變體可包括天然產(chǎn)生的變異，如得自其它生物體的序列，或突變，所述突變中這些修飾可天然產(chǎn)生或通過(guò)定點(diǎn)誘變導(dǎo)入。另外，變異可涉及合成產(chǎn)生的序列。至于等位基因變體，它們可以是天然產(chǎn)生的，也可以是合成產(chǎn)生的變體，或通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生的變體。
為了將外源基因插入高等植物或其細(xì)胞，可使用大量克隆載體，所述載體含有大腸桿菌復(fù)制信號(hào)和用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞的標(biāo)記基因。這種載體的例子是pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等?？稍谶m當(dāng)?shù)南拗菩郧懈钗稽c(diǎn)處將所需序列插入載體中，將所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，隨后收獲細(xì)胞并裂解之，回收質(zhì)粒。通常將限制性分析，凝膠電泳和其它生物化學(xué)，分子生物學(xué)方法用作分析方法以鑒定所得的質(zhì)粒DNA。每次操作后，裂解質(zhì)粒DNA，將所得的DNA片段與其它DNA序列連接，每個(gè)質(zhì)粒DNA序列可被克隆至相同的或其它的質(zhì)粒中。
可使用很多眾所周知的方法將DNA導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞中，技術(shù)人員可毫不困難地確定各個(gè)適當(dāng)?shù)姆椒?。這些技術(shù)包括通過(guò)使用根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，原生質(zhì)體融合，將分離的DNA直接基因轉(zhuǎn)移至原生質(zhì)體中，DNA電穿孔，利用biolistic方法導(dǎo)入DNA以及其它方法。轉(zhuǎn)化過(guò)程中可產(chǎn)生穩(wěn)定的以及瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化體。
當(dāng)將DNA注射和電穿孔至植物細(xì)胞中時(shí)，對(duì)所用的質(zhì)粒沒(méi)有特殊的需求，直接基因轉(zhuǎn)移也是如此。可使用簡(jiǎn)單的質(zhì)粒，如pUC衍生物。然而，如果需由以此方式轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生整個(gè)植株，需要選擇性標(biāo)記基因的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知通常的選擇性標(biāo)記，對(duì)于他們而言不難選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，通常使用的選擇性標(biāo)記是使經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞對(duì)殺蟲劑或抗生素具有抗性，所述殺蟲劑或抗生素如卡那霉素，G418，博來(lái)霉素，潮霉素，氨甲碟呤，glyphosate，鏈霉素，磺酰脲，慶大霉素或膦絲菌素等。
根據(jù)所選擇的將基因?qū)胫参锛?xì)胞中的方法，也需要另外的DNA序列，例如，如果使用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，至少應(yīng)將Ti或Ri質(zhì)粒中所含T-DNA的右邊界，但通常將其右和左邊界作為側(cè)翼區(qū)與被導(dǎo)入的基因連接。
如果使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，需導(dǎo)入的DNA必需被克隆至特殊的質(zhì)粒中，即或者克隆至中間質(zhì)粒中或者克隆至二元載體中。由于存在與T-DNA中的序列同源的序列，通過(guò)同源重組可將中間質(zhì)粒整合到農(nóng)桿菌的Ti或Ri質(zhì)粒中。另外，后者包括T-DNA轉(zhuǎn)移所需的vir-區(qū)域。中間載體不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制，利用輔助質(zhì)?？蓪⒅虚g質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至根瘤農(nóng)桿菌中(接合)。二元載體可在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌中復(fù)制，它們含有選擇性標(biāo)記基因和接頭或多接頭，框內(nèi)還含有T-DNA右和左邊界區(qū)域。它們可以直接被轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中(Holster等(1978)，分子和普通遺傳學(xué)，163,181-187)。用作宿主細(xì)胞的農(nóng)桿菌應(yīng)含有具有vir-區(qū)域的質(zhì)粒，vir-區(qū)域是T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞所必需的。可以存在另外的T-DNA，將按所述方式轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
已深入研究了T-DNA用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的用途，有關(guān)內(nèi)容詳細(xì)描述于EP120515；Hoekema二元植物載體系統(tǒng)，OffsetdrokkerijKanters B.V,Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，(1993),Crit.Rev.Plant.Sci,4,1-46和An等，(1985),EMBO J,4,277-287。
為了將DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，可將植物外植體與根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌一起適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)。在含有抗生素或殺蟲劑以選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基中，由被感染的植物材料(葉片，莖節(jié)，根，也有原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞)可再生出整個(gè)植株。根據(jù)常規(guī)的再生方法，使用眾所周知的培養(yǎng)基可進(jìn)行植物的再生。然后檢查按上述方式得到的植物或植物細(xì)胞中被導(dǎo)入的DNA的存在。通過(guò)應(yīng)用biolistic法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源DNA的其它方法是已知的(例見(jiàn)Willmitzer L,(1993)，轉(zhuǎn)基因植物Biotechnology,A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J.Rehm.G.Reed,A.Puhler,P.Stadler編)，vol.2,627-659,V.C.H.Weinheim-紐約-Basel-Cambridge)。
盡管通過(guò)Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)并借助于根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物或其細(xì)胞的方法已被完善地建立，但新的研究表明單子葉植物或其細(xì)胞也很能接受用基于農(nóng)桿菌的載體轉(zhuǎn)化(Chan等，(1993)，植物分子生物學(xué)，22,491-506；Hiei等，(1994)，植物學(xué)雜志，6,271-282；Deng等，(1990)，中國(guó)科學(xué)，33,28-34；Wilmink等，(1992)，植物細(xì)胞報(bào)道，11,76-80；May等，(1995),Bio/Technology,13,486-492；Conner和Domiss,(1992)，國(guó)際植物科學(xué)雜志，153,550-555；Ritchie等，(1993)，轉(zhuǎn)基因研究，2,252-265)。
轉(zhuǎn)化單子葉植物或其細(xì)胞的另外的系統(tǒng)是利用biolistic setup轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux,(1994)，植物生理學(xué)，104,37-48；Vasil等，(1993),Bio/Technology,11,1553-1558；Ritala等，(1994)，植物分子生物學(xué)，24,317-325；Spencer等，(1990),Theor.Appl.Genet,79,625-631)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，部分透化之細(xì)胞的電穿孔和利用玻璃纖維導(dǎo)入DNA。
以一般的方法在植物內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(見(jiàn)McCormick等，(1986)，植物細(xì)胞報(bào)道，5,81-84)。正常地培養(yǎng)所得植物，并用具有相同的，經(jīng)轉(zhuǎn)化的遺傳性狀或其它遺傳性狀的植物嫁接。所得的各個(gè)雜交植物具有各自的表型特性。
應(yīng)培養(yǎng)兩代或更多代以確保表型特性能穩(wěn)固地維持和增殖。也應(yīng)收獲種子以確保各個(gè)表型或其它特性能得以維持。
通過(guò)利用一般的方法可確定其中新的核酸分子為純合的轉(zhuǎn)基因品系，另外，可檢查表型行為中存在的或不存在的臭氧反應(yīng)能力并與半雜合品系的相比較。
一般也可將含有本發(fā)明核酸分子的植物細(xì)胞作為植物細(xì)胞(包括原生質(zhì)體，愈傷組織，懸浮培養(yǎng)物等)進(jìn)一步培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明的核酸分子，或這種分子的片段，或這種分子的反向互補(bǔ)物用于從植物或其它生物體中鑒定和分離包括臭氧反應(yīng)元件的同源分子的用途。至于術(shù)語(yǔ)“同源性”的定義可參見(jiàn)上文給出的定義。
為了解釋本發(fā)明給出了下列實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1在二元載體pPCV002中將VstⅠ啟動(dòng)子的5’-缺失構(gòu)建為GUS融合結(jié)構(gòu)葡萄樹VstⅠ基因的5’非編碼序列范圍(下文稱之為啟動(dòng)子)由1570個(gè)堿基對(duì)組成。此啟動(dòng)子的序列公開于德國(guó)專利申請(qǐng)DE4107396和Fischer(1994)，文獻(xiàn)同上中，借助于使用下列寡核苷酸作為引物的通常的聚合酶鏈反應(yīng)和含有整個(gè)VstⅠ基因(DE-A-4107396；Fischer(1994)，文獻(xiàn)同上)的質(zhì)粒pVstⅠ，擴(kuò)增所述啟動(dòng)子的序列以作為模板5’-CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT-3’(引物1,SEQ ID NO:2)5’-CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT-3’(引物2,SEQ ID NO:3)。
根據(jù)Perking Elmer(Norwalk,USA)的方法，使用由Perkin Elmer提供的天然Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR，隨后用限制性酶HindⅢ(此限制性位點(diǎn)位于引物1的5’端)和BamHⅠ(此限制性位點(diǎn)位于引物2的5’端)重新切割在一般的PCR條件下擴(kuò)增的DNA片段，并通過(guò)pUC18-多接頭的HindⅢ和EcoRⅠ限制性切割將所得片段與得自載體pBI101.2(Jefferson(1987),Plant Mol.Biol.Reporter,5,387-405)且含有大腸桿菌β-葡糖醛酸酶報(bào)道基因(GUS,uidA)以及根瘤農(nóng)桿菌nos基因終止信號(hào)的BamHⅠ/EcoRⅠ片段一起亞克隆至pUC18-質(zhì)粒中。使用常規(guī)的分子生物學(xué)方法和輔助物(例如Sambrook等，(1989)，文獻(xiàn)同上)進(jìn)行所有的克隆步驟；用于克隆的限制性酶和其它酶得自Boehringer Mannheim。因此，所得克隆(pUC-VstⅠ/GUS)含有VstⅠ啟動(dòng)子與GUS基因的翻譯融合，其中閱讀框中的前5個(gè)STS密碼子通過(guò)BamHⅠ切割與GUS基因連接。利用酶促鏈終止法(Sanger等，(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467)，通過(guò)使用Pharmacia(Freiburg)之T7測(cè)序試劑盒檢查融合轉(zhuǎn)換之序列范圍以及VstⅠ啟動(dòng)子序列的正確性。
下文將解釋5’缺失突變體在二元載體pPCV002(Koncz和Schell,(1986),Mol.Gen.Genet,204,383-396)中的克隆。在大多數(shù)情況下可使用pUC18亞克隆作為中間載體，因?yàn)榕c相對(duì)較大的二元載體相比，較小的pUC質(zhì)粒易于操縱。
質(zhì)粒的命名源于從位于距起始密碼子73個(gè)堿基對(duì)的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始計(jì)算的各個(gè)啟動(dòng)子片段的大致長(zhǎng)度(Hain等，(1993)，文獻(xiàn)同上；Fischer(1994)，文獻(xiàn)同上)。用于逐漸縮短VstⅠ啟動(dòng)子的限制性位點(diǎn)示于

圖1。
-p1500GUS含有完整的STS啟動(dòng)子以及GUS基因的HindⅢ/EcoRⅠ片段分離自上述質(zhì)粒pUC-VstⅠ/GUS，此片段被插入pPCV002多接頭中的限制性位點(diǎn)HindⅢ和EcoRⅠ之間。
-p1060GUS通過(guò)限制性切割BamHⅠ和SspⅠ從pUC-VstⅠ/GUS中分離1130bp的啟動(dòng)子片段并將此片段克隆至經(jīng)BamHⅠ/HincⅡ線性化的pUC18中(得到pUC1130)，隨后從pUC-VstⅠ/GUS中分離出BamHⅠ/EcoRⅠ形式的GUS基因，并將GUS基因克隆至pUC1130的BamHⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ位點(diǎn)之間。最后，通過(guò)HindⅢ/EcoRⅠ雙消化分離融合物并經(jīng)由相同的位點(diǎn)插入pPCV002的多接頭中。
-p930GUS通過(guò)限制性酶BamHⅠ和HincⅡ從pUC-VstⅠ/GUS中分離出1.0kb的啟動(dòng)子片段并經(jīng)由相同的位點(diǎn)插入pUC18的多接頭中(得到pUC1000)，接下來(lái)的操作與p1060GUS中的類似。
-p740GUS從質(zhì)粒pUC-VstⅠ/GUS中分離出大致1.6-kb-長(zhǎng)的HindⅢ/BamHⅠ啟動(dòng)子片段并用限制性酶DraⅠ消化。隨后，經(jīng)由限制性位點(diǎn)BamHⅠ和HincⅡ?qū)⑺玫?10-bp-長(zhǎng)的BamHT/DraⅠ片段克隆至pUC18中(得到pUC810)，隨后從pUC-VstⅠ/GUS中分離出BamHⅠ/EcoRⅠ片段形式的GUS基因，并將GUS基因克隆至pUC810的BamHⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ位點(diǎn)之間，最后，通過(guò)HindⅢ/EcoRⅠ雙消化分離融合物并經(jīng)由相同的位點(diǎn)插入pPCV002的多接頭中。
-p550GUS用限制性酶AF1Ⅱ消化pUC-VstⅠ/GUS，根據(jù)廠商說(shuō)明用Klenow酶(Boehringer Mannheim；dNTP，也得自BoehringerMannheim)補(bǔ)平突出的5’端，隨后用限制性酶BamHⅠ重新切割，將所得的620bp-啟動(dòng)子片段連接至用BamHⅠ/HincⅡ線性化的pUC18中(得到pUC620)，接下來(lái)的操作與p1060GUS中的類似。
-p500GUS通過(guò)BamHⅠ/HaeⅢ雙消化從pUC-VstⅠ/GUS中分離出570bp-長(zhǎng)的啟動(dòng)子片段并連接至用BamHⅠ/HincⅡ線性化的pUC19載體中(得到pUC570)，接下來(lái)的操作與p1060GUS中的類似。
-p430GUS使用限制性酶SnaBⅠ使上述質(zhì)粒pUC1000線性化，然后用HincⅡ消化，再重新連接線性化的載體，從而缺失了-930至-430之間500個(gè)堿基對(duì)的啟動(dòng)子(-＞pUC500)，接下來(lái)的克隆與pUC1060GUS中的類似。
-p280GUS用限制性酶BanⅡ消化pUC-VstⅠ/GUS，用K1enow酶補(bǔ)平突出的5’端，隨后用限制性酶BamHⅠ消化線性化的載體，分離出350-bp-長(zhǎng)的平端/BamHⅠ-啟動(dòng)子片段之后，接下來(lái)的克隆與p1060GUS中的類似。
-p140GUS用限制性酶NsiⅠ和PstⅠ消化上述pUC亞克隆pUC620，隨后純化線性化的載體并重新連接，這可導(dǎo)致啟動(dòng)子序列-550至-140的缺失(得到pUC210)，隨后從pUC-VstⅠ/GUS中分離出BamHⅠ/EcoRⅠ片段形式的GUS基因，并將GUS基因克隆至pUC1130的BamHⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ位點(diǎn)之間，最后，通過(guò)HindⅢ/EcoRⅠ雙消化分離融合物并經(jīng)由相同的位點(diǎn)插入pPCV002的多接頭中。
-p40GUS通過(guò)NheⅠ/EcoRⅠ雙消化從pUC-VstⅠ/GUS中分離出110bp的啟動(dòng)子片段以及GUS基因，隨后將此片段克隆至經(jīng)XbaⅠ/EcoRⅠ線性化的pPCV002中。
-pΔGUS用限制性酶BamHⅠ消化結(jié)構(gòu)p1500GUS，隨后重新連接純化的載體(cleaned vector)，因此，通過(guò)載體pPCV002多克隆位點(diǎn)中天然含有的除HindⅢ位點(diǎn)以外的BamHⅠ位點(diǎn)(Koncz和Schell(1986)，文獻(xiàn)同上)可消除整個(gè)啟動(dòng)子片段。
-p35SGUS從表達(dá)載體pRT99GUS(Topfer等，(1988)，核酸研究，16,8725)中以HindⅢ片段的形式分離出用作陽(yáng)性對(duì)照的花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子與GUS基因的融合物，并插入pPCV002的多克隆位點(diǎn)。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因植物的植物材料，植物轉(zhuǎn)化和再生在26℃,3000勒和16小時(shí)光周期的條件下，在含有1％蔗糖的無(wú)激素1/2 LS-培養(yǎng)基(Linsmaier和Skoog(1965)，植物生理學(xué)，18,100-127)中將煙草品種Petit Havana SR1(Maliga等(1973),Nature NewBiol,224,29-30)培養(yǎng)成無(wú)菌幼芽培養(yǎng)物。6-8周的間隔之后，將芽節(jié)斷轉(zhuǎn)移至新鮮的LS培養(yǎng)基中。為了用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化葉切片(Horsch等，(1985)，科學(xué)，227,1229-1231)，將無(wú)菌幼芽培養(yǎng)物2-3cm長(zhǎng)的葉壓成直徑為1cm的切片，并與含有上述質(zhì)粒結(jié)構(gòu)之一的農(nóng)桿菌懸浮液(約109個(gè)細(xì)胞/ml YEB培養(yǎng)基)一起保溫5分鐘，于26℃，將經(jīng)保溫的葉節(jié)斷置于無(wú)激素的LS培養(yǎng)基上放2至3天，其時(shí)，細(xì)菌長(zhǎng)滿葉節(jié)斷，隨后用不含激素的液體LS培養(yǎng)基洗滌葉節(jié)斷，并將該葉節(jié)斷置于含卡那霉素(75μg/ml；Sigma,Munich)，頭孢噻肟(500μg/ml；Hoechst,Frankfurt)和芐氨基嘌呤(BAP,0.5mg/l；Duchef,Haarlem,TheNetherlands)的LS培養(yǎng)基上。2至3周后，可以看見(jiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)化的芽，該芽生根于含75μg/ml卡那霉素和100μg/ml頭孢噻肟的無(wú)激素LS培養(yǎng)基上。
按下述方法產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化煙草葉節(jié)斷的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物首先將上述pPCV002衍生物插入大腸桿菌轉(zhuǎn)移菌株S17-l(Simon等(1983),Bio/Technology,1,784-790)中。這可產(chǎn)生感受態(tài)的S17-1大腸桿菌細(xì)胞，根據(jù)Taketo(1988),Biochem.Biophys.Acta,949,318-324或Hanahan(1983)，分子生物學(xué)雜志，166,557-580所述方法用各個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，隨后，在相關(guān)的培養(yǎng)基中將含有各個(gè)二元載體的大腸桿菌菌株和根瘤農(nóng)桿菌菌株GV3101 C58C1 Rifr pMP90RK(Koncz和Schell(1986)，文獻(xiàn)同上)培養(yǎng)至OD580=1.0。使用下列條件培養(yǎng)大腸桿菌37℃，常規(guī)的YT培養(yǎng)基(Miller(1972)，分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)細(xì)菌用胰蛋白胨0.8％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v),NaCl0.5％(w/v,pH7.0)。為了培養(yǎng)根瘤農(nóng)桿菌，于28℃使用YEB培養(yǎng)基(牛肉膏0.5％(w/v)，酵母提取物0.1％(w/v)，細(xì)菌用胰蛋白胨0.5％(w/v)，蔗糖0.5％(w/v),MgSO42mM,pH7.2)。為了進(jìn)行接合，通過(guò)于1500×g離心5分鐘分離細(xì)菌，并用新鮮制備的10mM MgSO4溶液將細(xì)菌洗滌兩次，然后以1∶1的比率混合供體(大腸桿菌)和受體(根瘤農(nóng)桿菌)并滴在YEB瓊脂平板上。28℃保溫16小時(shí)后，用10mM MgSO4溶液沖洗細(xì)菌菌落，將10-2,10-3和10-4的稀釋液平鋪在YEB選擇平板上。于28℃，由單個(gè)培養(yǎng)物培養(yǎng)用于轉(zhuǎn)化煙草的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物。
通過(guò)芽培養(yǎng)增殖各含有上述VstⅠ啟動(dòng)子/GUS融合物之一的轉(zhuǎn)基因煙草芽，并將所述煙草芽部分轉(zhuǎn)移至土壤中，在正常條件下(22℃,60％相對(duì)大氣濕度，約15,000勒)于溫室中培養(yǎng)至開花。利用羊皮紙袋保護(hù)花免受外源傳粉，4至6周后收獲成熟的含F(xiàn)1-代種子的種子莢。為了在溫室中進(jìn)行生物學(xué)試驗(yàn)，將F1-代的種子平鋪在含75μg/ml卡那霉素的LS培養(yǎng)基上，在無(wú)菌條件下，直接在莢外進(jìn)行這些操作，或消毒表面后(1．用無(wú)菌水粗略地洗滌；2．在70％乙醇中保溫2分鐘；3．在3％的NaOCl(13％的活性氯)中保溫10分鐘；4．用水洗滌3次；5．在安全工作區(qū)的分層空氣流中干燥)進(jìn)行這些操作。于25-26℃,2000-3000勒和60％大氣濕度下，在含75μg/ml卡那霉素的LS培養(yǎng)基上培養(yǎng)約2周后，可以明顯地區(qū)分卡那霉素抗性煙草胚和卡那霉素敏感的煙草胚。與敏感的胚相比，抗性胚顯示出明顯的初生根生長(zhǎng)。除了子葉以外，2周后在抗性胚中還可辨認(rèn)出初生的葉，在這種“四葉階段”，將抗性F1-胚轉(zhuǎn)移至土壤中，使之變得結(jié)實(shí)后，再在適當(dāng)條件下進(jìn)一步培養(yǎng)。
實(shí)施例3
植物培養(yǎng)，臭氧處理和葉的收獲為了進(jìn)行臭氧處理，首先將轉(zhuǎn)基因的卡那霉素抗性的煙草胚從瓊脂平板上轉(zhuǎn)移至花盆中，所述花盆中含有標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)(T型/Fruhstofer/Lauterbach)和Pearlit的2∶1混合物，在氣候室中，以12小時(shí)-晝/夜周期，15,000勒，白晝溫度為25℃，夜晚溫度為20℃，大氣濕度為65-70％和過(guò)濾空氣的條件將所述煙草胚培養(yǎng)3周。
隨后，使煙草植株經(jīng)受單次臭氧脈沖10小時(shí)，然后在無(wú)污染的，經(jīng)過(guò)濾空氣中保溫2-14個(gè)小時(shí)。在特定的氣候條件下，于置于氣候室中的密閉的有機(jī)玻璃盒中進(jìn)行所有的通氣實(shí)驗(yàn)。臭氧處理總在早上9點(diǎn)鐘開始，并延續(xù)完一天的周期。通過(guò)在干燥的氧氣中放電可產(chǎn)生臭氧，在計(jì)算機(jī)的控制下進(jìn)行劑量安排和分析(Langebartels等，(1991)，植物生理學(xué)，95,882-889)。從植株的頂端至底部計(jì)數(shù)煙草植株的葉，然后按葉數(shù)目1-10分類，其中第一片葉至少為8cm長(zhǎng)。在臭氧處理開始后的不同的時(shí)間點(diǎn)將煙草葉(從1-10分類)各冷凍于液氮中，并儲(chǔ)存于-80℃中。
實(shí)施例4β-葡糖醛酸酶活性試驗(yàn)嚴(yán)格按照J(rèn)efferson(1987)，文獻(xiàn)同上或Jefferson等(1987),EMBOJ,6,3901-3907所述，使用4-甲基-umbelliferyl-葡糖苷酸(MUG,Sigma,Munich)進(jìn)行GUS酶活性的熒光計(jì)分析。用熒光光度計(jì)(PerkinElmer LS-2B濾片熒光計(jì))在石英流式池中測(cè)定產(chǎn)物4-甲基傘形酮(MU)的濃度。植物提取物中的GUS活性被計(jì)算為pmol MU×mg-1×min-1。根據(jù)Bradford(1976),Analyt.Biochem,72,248-254所述測(cè)定煙草葉提取物中的蛋白質(zhì)濃度。
用經(jīng)臭氧處理的葡萄樹植株進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，隨后進(jìn)行Northern印跡分析，結(jié)果表明用0.2μl/l和0.4μl/l臭氧通氣導(dǎo)致在mRNA水平上大量誘導(dǎo)STS基因的表達(dá)。為此，葡萄樹的STS基因應(yīng)特別適于鑒定臭氧反應(yīng)性DNA元件。在這一點(diǎn)上應(yīng)說(shuō)明的是與未經(jīng)處理的植株相比，經(jīng)臭氧處理的植株中至今已顯示出顯著的，能可靠測(cè)定的臭氧誘導(dǎo)的基因是沒(méi)有的。
為了能分析臭氧對(duì)啟動(dòng)子水平的影響，在臭氧通氣實(shí)驗(yàn)中使用了確實(shí)被轉(zhuǎn)化的煙草品系的F1-煙草植株(11周齡)，該植株中含有具完整啟動(dòng)子區(qū)的VstⅠ啟動(dòng)子/GUS融合結(jié)構(gòu)(p1500GUS)。用熒光計(jì)測(cè)定葉粗提取物中的GUS-酶活性，所述葉收獲于通入不同濃度的臭氧(0.1μl/l臭氧，0.2μl/l臭氧或0.4μl/l臭氧)10小時(shí)和在未經(jīng)污染的空氣中保溫14小時(shí)后的不同時(shí)間點(diǎn)。圖2所示結(jié)果表明與僅置于無(wú)污染空氣中的對(duì)照植物的相比，GUS活性呈快速的臭氧誘導(dǎo)的增加。因此，開始用臭氧處理12小時(shí)之后，用0.1μl/l臭氧處理導(dǎo)致11倍的由STS啟動(dòng)子控制的GUS基因表達(dá)誘導(dǎo)，用0.2或0.4μl/l臭氧處理甚至可導(dǎo)致高達(dá)25倍的誘導(dǎo)。
為了鑒定負(fù)責(zé)已觀察到的STS啟動(dòng)子之強(qiáng)臭氧誘導(dǎo)的順式調(diào)節(jié)序列，在臭氧通氣實(shí)驗(yàn)中將含有與細(xì)菌GUS報(bào)道基因融合的上述VstⅠ啟動(dòng)子5’缺失的轉(zhuǎn)基因煙草品系作為獨(dú)立的FO-植物來(lái)分析。將初次再生的植株無(wú)菌培養(yǎng)幾個(gè)月，并通過(guò)芽培養(yǎng)增殖，還需檢查這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的F1煙草植株(11周齡)的臭氧誘導(dǎo)的GUS表達(dá)。
用0.1μl/l臭氧處理轉(zhuǎn)基因的煙草植株10小時(shí)，然后在未污染的空氣中保溫2小時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)基-老葉粗提取物中的GUS活性并與未經(jīng)處理的對(duì)照植株中的酶活性相比。GUS酶活性的熒光計(jì)分析結(jié)果示于表1。盡管GUS活性導(dǎo)致臭氧誘導(dǎo)略為降低(在經(jīng)臭氧誘導(dǎo)的受試植株以及未經(jīng)處理的對(duì)照植株中，隨著啟動(dòng)子范圍逐漸由-1500縮短為-430，誘導(dǎo)系數(shù)也由約12(-1500)降至約10(-430))，但啟動(dòng)子范圍-430和-280之間的另外的缺失使經(jīng)臭氧處理的受試植株中GUS表達(dá)大幅度的降低。而其中GUS基因受-430-5’缺失啟動(dòng)子控制的植株與對(duì)照植株相比顯示出10倍的臭氧誘導(dǎo)，其中GUS基因受較短的-280-5’缺失啟動(dòng)子控制的植株僅顯示出最大為2倍的GUS表達(dá)臭氧誘導(dǎo)。因此，含有堿基對(duì)-430至-280的葡萄樹VstⅠ基因之啟動(dòng)子范圍中含有顯著臭氧誘導(dǎo)的STS基因表達(dá)所必需的順式活性元件。
通過(guò)含有上述結(jié)構(gòu)并在植物細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的植物細(xì)胞可證實(shí)這些結(jié)果。
圖和表圖1質(zhì)粒pUC-VstⅠ/GUS中VstⅠ啟動(dòng)子/GUS翻譯融合物的限制性圖譜。所述質(zhì)粒含有葡萄樹VstⅠ啟動(dòng)子與大腸桿菌GUS基因的翻譯融合物。已標(biāo)出用于克隆5’缺失突變體的限制性位點(diǎn)。nos ter=根瘤農(nóng)桿菌胭脂氨酸合酶基因的終止信號(hào)。
圖2通過(guò)多種濃度的臭氧在轉(zhuǎn)基因F1煙草植株中由VstⅠ啟動(dòng)子控制的GUS表達(dá)的誘導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)，所述植株含有GUS基因與葡萄樹完整的VstⅠ啟動(dòng)子的翻譯融合物(p1500GUS)。
根據(jù)Jefferson(1987)，文獻(xiàn)同上所述，用熒光計(jì)測(cè)定煙草葉(4號(hào)葉)粗提取物中的GUS活性，從圖中可確定多種收獲時(shí)間。10小時(shí)臭氧處理后，將煙草植株在未污染的空氣中保溫14小時(shí)。對(duì)照植株僅置于未污染的空氣中(沒(méi)有通入臭氧)，n=3或4；平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；所有試驗(yàn)都進(jìn)行雙份。
表1用熒光計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基-經(jīng)臭氧處理(+)和未經(jīng)處理的(-)，獨(dú)立的煙草轉(zhuǎn)化體之老葉的蛋白質(zhì)提取物中的GUS酶活性。轉(zhuǎn)基因的煙草品系含有與細(xì)菌GUS報(bào)道基因融合的VstⅠ啟動(dòng)子的多種5’缺失。在FO-轉(zhuǎn)化體和F1植株(11周齡)中通入100nl/l臭氧達(dá)10小時(shí)，隨后在未污染的空氣中保溫2小時(shí)。平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；所有試驗(yàn)都進(jìn)行雙份。表1
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表1用熒光計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基-經(jīng)臭氧處理(+)和未經(jīng)處理的(-)，獨(dú)立的煙草轉(zhuǎn)化體之老葉的蛋白質(zhì)提取物中的GUS酶活性。
轉(zhuǎn)基因的煙草品系含有與細(xì)菌GUS報(bào)道基因融合的VstⅠ啟動(dòng)子的多種5’缺失。在FO-轉(zhuǎn)化體和F1植株(11周齡)中通入100nl/l臭氧達(dá)10小時(shí)，隨后在未污染的空氣中保溫2小時(shí)。平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；所有試驗(yàn)都進(jìn)行雙份。
表1
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und GesundheitGmbH[Research Center for Environment and Health Inc.](B)街道Ingolstaedter Landstr.l(C)城市Oberschleissheim(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼85764(A)姓名BAYER AG(B)街道BAYERWERK(C)城市Leverkusen(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼51368(ⅱ)發(fā)明題目臭氧誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)(ⅲ)序列數(shù)3(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度161個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組-DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:1:ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCC ACTTGACTTTTGAAAAGGAG 60GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAA CCTTCGTAAT GTTAATGAAATCAAAGTCAC 120TCAATGTCCG AATTTCAAAC CTCANCAACC CAATAGCCAAT161(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CCCCAAGCTT CCCCGGATCA CATTTCTATG AGT33(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ IN NO:3CGCGGATCCT CAATTGAAGC CATTGATCCT AGCT3權(quán)利要求
1．植物DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAAT。
2．權(quán)利要求1所述的DNA序列，其來(lái)源于葡萄樹(Vitis vinifera)。
3．權(quán)利要求1或2所述的DNA序列，該序列天然包含在1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ中，并對(duì)應(yīng)于堿基對(duì)-270至-430。
4．葡萄樹1,2-二苯乙烯合酶基因VstⅠ的啟動(dòng)子區(qū)域，所述區(qū)域至少缺乏權(quán)利要求1所述的DNA序列。
5．權(quán)利要求4所述的啟動(dòng)子區(qū)域，所述區(qū)域僅含有翻譯起始點(diǎn)至堿基對(duì)-270的序列范圍。
6．權(quán)利要求4或5所述的啟動(dòng)子區(qū)域，所述區(qū)域還能賦予植物細(xì)胞病原體誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
7．嵌合的核酸分子，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求1所述的DNA序列或至少其片段。
8．權(quán)利要求7所述的嵌合核酸分子，所述核酸分子可為植物提供所述分子中所含編碼區(qū)的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
9．含有上述權(quán)利要求之一所述的DNA序列，啟動(dòng)子區(qū)域或嵌合核酸分子，或其片段的載體。
10．含有上述權(quán)利要求之一所述的DNA序列，啟動(dòng)子區(qū)域或嵌合核酸分子，或衍生自所述DNA序列的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植物，以及這種植物的組分及其增殖材料，如原生質(zhì)體，植物細(xì)胞，愈傷組織，種子，塊莖或插條等，以及這種植物的后代。
11．轉(zhuǎn)基因植物，所述植物因缺乏(天然狀態(tài)下存在)DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAA T或至少缺乏其一個(gè)片段而不再顯示出天然可被臭氧誘導(dǎo)之基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
12．權(quán)利要求11所述的植物，其中抗病基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)被大大降低。
13．權(quán)利要求11或12所述的植物，其中1,2-二苯乙烯合酶基因，尤其是葡萄樹VstⅠ基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)被大大降低。
14．權(quán)利要求10所述的植物，其中因?qū)肓藱?quán)利要求1所述的DNA序列，或至少其片段，在不會(huì)天然出現(xiàn)所述DNA序列的基因中可發(fā)生臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
15．權(quán)利要求14所述的植物，其中可發(fā)生那些其在植物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物能解毒活性氧類的基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
16．權(quán)利要求14或15所述的植物，其中可發(fā)生過(guò)氧化氫酶或超氧化物歧化酶基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
17．權(quán)利要求14所述的植物，其中可發(fā)生報(bào)道基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
18．權(quán)利要求10至17中任一個(gè)所述的雙子葉植物，尤其是有用的植物，如大豆，油菜，番茄，甜菜，馬鈴薯，棉花，煙草以及觀賞植物或樹。
19．權(quán)利要求10至17中任一個(gè)所述的單子葉植物，尤其是如燕麥，小麥，黑麥，大麥，水稻，小米或玉米的谷類作物。
20．包括原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，含有權(quán)利要求1至9中任一個(gè)所述的DNA序列，啟動(dòng)子區(qū)域或嵌合的核酸分子，或衍生自它們的DNA序列。
21．包括原生質(zhì)體的植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞因缺乏(在天然狀態(tài)下存在)DNA序列ACTTTTCGAG CCCCTTGAAC TGGAAATTAA TACATTTTCCACTTGACTTTTGAAAAGGAG GCAATCCCAC GGGAGGGAAG CTGCTACCAACCTTCGTAATGTTAATGAAA TCAAAGTCAC TCAATGTCCG AATTTCAAACCTCANCAACCCAATAGCCAAT或至少缺乏所述DNA序列的一個(gè)片段而不再顯示出天然可被臭氧誘導(dǎo)之基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
22．權(quán)利要求20所述的植物細(xì)胞，其中因?qū)肓藱?quán)利要求1所述的DNA序列，或至少其片段，在不會(huì)天然出現(xiàn)所述DNA序列的基因中可發(fā)生臭氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
23．產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的方法，其中通過(guò)從天然含有權(quán)利要求1所述DNA序列或衍生自所述DNA序列的DNA序列的防御基因中缺失所述DNA序列或至少其片段可大大降低或消除天然可被臭氧誘導(dǎo)的防御基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)。
24．權(quán)利要求23所述的方法，其中1,2-二苯乙烯合酶基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)可被大大降低或消除。
25．權(quán)利要求23或24所述的方法，其中葡萄樹VstⅠ基因的臭氧誘導(dǎo)的表達(dá)可被大大降低或消除。
26．產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的方法，其中因?qū)肓藱?quán)利要求1所述的DNA序列或至少其片段而使一個(gè)或幾個(gè)基因可被臭氧誘導(dǎo)，所述基因的表達(dá)天然不被或基本上不被臭氧誘導(dǎo)。
27．權(quán)利要求26所述的方法，其中通過(guò)臭氧可誘導(dǎo)一個(gè)或幾個(gè)過(guò)氧化氫酶和/或超氧化物歧化酶基因。
28．權(quán)利要求26所述的方法，其中通過(guò)臭氧可誘導(dǎo)一個(gè)或幾個(gè)報(bào)道基因。
29．通過(guò)缺失或滅活權(quán)利要求1所述的DNA序列或至少其片段以除去天然含有權(quán)利要求1所述DNA序列或衍生自所述DNA序列的DNA序列的天然可被臭氧誘導(dǎo)的防御基因的臭氧誘導(dǎo)能力的方法。
30．權(quán)利要求29的方法，其中基因是1,2-二苯乙烯合酶基因。
31．權(quán)利要求29或30所述的方法，其中基因是葡萄樹的VstⅠ基因。
32．通過(guò)將權(quán)利要求1所述的DNA序列或至少其片段插入天然不被或基本上不被臭氧誘導(dǎo)的那些基因中而在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中產(chǎn)生臭氧誘導(dǎo)之特性的方法。
33．權(quán)利要求1所述DNA序列或其片段用于檢測(cè)植物基因中臭氧反應(yīng)性序列范圍的用途。
34．權(quán)利要求1所述DNA序列或其片段用于在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中產(chǎn)生臭氧誘導(dǎo)之特性的用途。
35．權(quán)利要求1所述DNA序列或其片段用于產(chǎn)生權(quán)利要求17所述的植物的用途，所述植物可用作生物監(jiān)測(cè)器以定量和/或定性地檢測(cè)臭氧濃度。
36．權(quán)利要求4至6中任一個(gè)所述的啟動(dòng)子區(qū)域用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生可被病原體更強(qiáng)誘導(dǎo)但不能被臭氧誘導(dǎo)的抗病性的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的DNA序列,產(chǎn)生含有新DNA序列新植物的方法,該DNA序列的編碼序列經(jīng)臭氧誘導(dǎo)之后被表達(dá)。本發(fā)明也涉及所述的新植物和DNA序列用于在植物和植物細(xì)胞中產(chǎn)生臭氧反應(yīng)性基因表達(dá)的用途。另外,本發(fā)明還涉及新的啟動(dòng)子,通過(guò)除去其臭氧反應(yīng)性能力可增強(qiáng)其特異性。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1235640SQ97195837
公開日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1997年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月25日
發(fā)明者羅蘭·舒伯特, 海因里?！ど５侣? 迪特里希·厄恩斯特, 魯?shù)细瘛ず６? 里賈納·費(fèi)希爾 申請(qǐng)人:Gsf環(huán)境與健康研究中心有限公司, 拜爾公開股份有限公司