專(zhuān)利名稱(chēng)：抗氧化功能的生物化學(xué)分析方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地涉及營(yíng)養(yǎng)和生理化學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種抗氧化功能生化分析的新方法。
相關(guān)技術(shù)描述個(gè)體的細(xì)胞經(jīng)常受到高反應(yīng)性且不穩(wěn)定分子的作用，這些分子稱(chēng)為自由基，它們會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)力(oxidative stress)。這些有害分子是生命中的正常副產(chǎn)物，它們是由氧代謝(即細(xì)胞呼吸)、免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(殺死外來(lái)物)和代謝所必需的許多酶反應(yīng)產(chǎn)生的。自由基的環(huán)境來(lái)源包括吸煙、離子輻射、空氣污染、化學(xué)物質(zhì)(致癌物、許多石油化學(xué)產(chǎn)品、殺生物劑、染料、溶劑、細(xì)胞抑制藥物等)、有毒重金屬和氧化(腐敗)的脂肪。一些最常見(jiàn)的自由基是超氧化物、羥基、單線態(tài)氧和過(guò)氧化物。某些價(jià)態(tài)的鐵和銅能夠催化自由基形成，盡管這些自由基的壽命很短，但是它們會(huì)加速自由基形成的鏈反應(yīng)，隨后會(huì)改變和損傷生物分子。
自由基對(duì)活生物有毒性，它會(huì)破壞所有生物分子的結(jié)構(gòu)。分子損傷會(huì)導(dǎo)致遺傳密碼改變、細(xì)胞膜完整性破壞、神經(jīng)學(xué)疾病、內(nèi)分泌失調(diào)、過(guò)敏反應(yīng)增加、血管內(nèi)皮破壞和關(guān)節(jié)退化及發(fā)炎。
在稱(chēng)為抗氧化劑的各類(lèi)分子中發(fā)現(xiàn)它們可防止自由基的有害作用?？寡趸瘎┛芍泻妥杂苫捌滏湻磻?yīng)的副產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)變成害處較小的產(chǎn)物?？寡趸瘎┛梢允敲?如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)、必需的營(yíng)養(yǎng)物(如β胡蘿卜素、維生素C和E、硒和半胱氨酸)或各類(lèi)內(nèi)源化合物(如谷胱甘肽)或來(lái)自飲食的化合物(如生物類(lèi)黃酮)。因此，人體有不同的自由基淬滅劑。
人體研究表明，抗氧化劑營(yíng)養(yǎng)物的攝入不足與發(fā)生癌癥、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障等較高危險(xiǎn)性相關(guān)。另外，攝入較高量的營(yíng)養(yǎng)物抗氧化劑與退行性疾病的發(fā)病率較低相關(guān)。令人鼓舞的研究表明，給予抗氧化劑營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充進(jìn)行干涉，對(duì)人體有治療效益。
由于各種原因，抗氧化劑狀況的實(shí)驗(yàn)室分析還沒(méi)有成為常規(guī)。自由基的存在非常短暫，通常不容易進(jìn)行直接測(cè)定?？蓪?duì)自由基破壞產(chǎn)生的副產(chǎn)物丙二醛(MDA)、硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)或血清或尿液中的脂質(zhì)過(guò)氧化物進(jìn)行測(cè)定。這些試驗(yàn)是氧化應(yīng)力的指標(biāo)，但是只能反映某些類(lèi)型的生物分子(大多數(shù)是多聚不飽和脂質(zhì)和核酸)的破壞情況。測(cè)定血清或細(xì)胞的抗氧化營(yíng)養(yǎng)物水平以及細(xì)胞中抗氧化酶活性，可以明確特定組分的缺乏水平，但是關(guān)于抗氧化劑相互作用和凈功能能提供的信息非常少。還有其它一些測(cè)定氧化應(yīng)力的方法是在研究環(huán)境下得到的，由于這些方法復(fù)雜而且昂貴，因此它們不適合常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室使用。
現(xiàn)有技術(shù)不足處在于缺乏簡(jiǎn)單而廉價(jià)的人體抗氧化功能的生化分析方法。本發(fā)明滿(mǎn)足了這一領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)的需求。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用于人淋巴細(xì)胞抗氧化功能生化分析的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含無(wú)血清緩沖液，該緩沖液含有下列組分一種選自葡萄糖和生物學(xué)上能在細(xì)胞中產(chǎn)生葡萄糖的化合物的糖類(lèi)，一種生物可用形式的泛酸，膽堿或可在細(xì)胞中產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)，無(wú)機(jī)離子，這些無(wú)機(jī)離子包括氯離子、磷酸根、鈣離子、鎂離子、鉀離子、鈉離子和生物學(xué)上可利用形式的鐵離子，氫過(guò)氧化枯烯、去離子水和刺激待測(cè)淋巴細(xì)胞的有效量的促細(xì)胞分裂劑；所述無(wú)血清緩沖液的pH值為6.8-7.6，所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的特征是它可有效地用來(lái)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)缺乏、不足和失調(diào)，并可用來(lái)對(duì)淋巴細(xì)胞的抗氧化功能進(jìn)行生化分析。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種對(duì)個(gè)體的細(xì)胞抗氧化功能進(jìn)行生化分析的方法，該方法包括下列步驟將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
在本發(fā)明還有一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種測(cè)定個(gè)體所需特定營(yíng)養(yǎng)物的異常營(yíng)養(yǎng)需求量的方法，該方法包括下列步驟將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有有限濃度的待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種在對(duì)有害作用敏感的個(gè)體中，鑒定營(yíng)養(yǎng)因素或生化中間產(chǎn)物的方法，該營(yíng)養(yǎng)因素或生化中間產(chǎn)物能克服營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或其產(chǎn)物、以及包括藥物在內(nèi)的其它血液組分的有害作用，該方法包括下列步驟對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行接種，該細(xì)胞培養(yǎng)基含有至少一種營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或產(chǎn)物、或包括藥物在內(nèi)的其它血液組分，它們的濃度對(duì)細(xì)胞反應(yīng)有有害作用；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將其反應(yīng)與添加了某物質(zhì)的相同培養(yǎng)基中的反應(yīng)進(jìn)行比較，該物質(zhì)懷疑能影響待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或其產(chǎn)物、或包括藥物在內(nèi)的其他血液組分的有害作用。
本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)可以從下面公開(kāi)的本發(fā)明較佳實(shí)施例的描述中明顯看出。
附圖簡(jiǎn)述為了能獲得并詳細(xì)了解本發(fā)明上述的特征、優(yōu)點(diǎn)和目的，以及將變得清晰的其它特征，本發(fā)明簡(jiǎn)要?dú)w納如上，更具體的描述需參考一些實(shí)施例，這些實(shí)施例在附圖中有所說(shuō)明。這些附圖組成了說(shuō)明書(shū)的一部分。然而，應(yīng)當(dāng)注意，附圖只是說(shuō)明本發(fā)明的較佳實(shí)施例，因此不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明局限在它們的范圍內(nèi)。


圖1顯示在參照范圍總體內(nèi)的氫過(guò)氧化枯烯的劑量反應(yīng)曲線。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及評(píng)估細(xì)胞內(nèi)維生素缺乏和總的抗氧化功能的血液測(cè)試方法，該方法提供了一種對(duì)個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行生化分析的新方法。這種分析反映了營(yíng)養(yǎng)物和抗氧化劑系統(tǒng)在個(gè)體的周?chē)馨图?xì)胞中實(shí)際起作用的程度。以前，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)維生素狀況是不可能的，而本發(fā)明的方法可以在維生素缺乏導(dǎo)致臨床問(wèn)題前就準(zhǔn)確地檢測(cè)到維生素缺乏。
直到發(fā)展了本發(fā)明以前，維生素的測(cè)定根據(jù)的是臨床觀察和血清、尿液或頭發(fā)中的靜態(tài)水平以及某些酶或蛋白質(zhì)標(biāo)記物的測(cè)定。這些測(cè)定只表明其短期的靜態(tài)水平，不能評(píng)估這些化合物作為酶的輔因子參與的許多復(fù)雜的代謝途徑。因此，其它方法經(jīng)常報(bào)告的結(jié)果在功能上是不準(zhǔn)確的，這些方法不能用于臨床。
本發(fā)明方法分析了維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和抗氧化劑系統(tǒng)怎樣在個(gè)體白細(xì)胞中發(fā)揮實(shí)際功能，而不是測(cè)定靜態(tài)水平。與其它方法(甚至那些聲稱(chēng)是功能性的方法)不同，本發(fā)明方法采用了代謝活躍的周?chē)馨图?xì)胞，測(cè)定其DNA合成(細(xì)胞生長(zhǎng))來(lái)確定限制了細(xì)胞分裂反應(yīng)的胞內(nèi)功能性缺陷。因此，本發(fā)明方法提供的測(cè)試結(jié)果反映總代謝功能，而不是血清水平的測(cè)試結(jié)果，或采用分離的生化途徑的測(cè)試結(jié)果。
淋巴細(xì)胞提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈?1)是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的宿主，并且很容易刺激生長(zhǎng)(細(xì)胞分裂)；(2)能反映長(zhǎng)期的時(shí)間-平均營(yíng)養(yǎng)物狀況(淋巴細(xì)胞的壽命約為6個(gè)月)；(3)具有其它細(xì)胞常見(jiàn)的代謝途徑，含有能使DNA迅速合成和細(xì)胞迅速生長(zhǎng)的細(xì)胞核，并且容易用標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺法收集。
本發(fā)明方法是通過(guò)使用化學(xué)組成明確的無(wú)血清或無(wú)蛋白培養(yǎng)基，測(cè)定每位患者淋巴細(xì)胞的DNA合成(細(xì)胞生長(zhǎng))，來(lái)確定胞內(nèi)功能性缺陷的唯一血液試驗(yàn)。對(duì)照培養(yǎng)基中含有支持淋巴細(xì)胞最優(yōu)生長(zhǎng)或有絲分裂反應(yīng)所需的最小量的各種必需營(yíng)養(yǎng)物。通過(guò)控制培養(yǎng)基中使淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)所依賴(lài)的單種營(yíng)養(yǎng)物，并測(cè)定所引起的DNA合成，就可直接確定參與細(xì)胞代謝的19種不同的維生素、礦物質(zhì)和氨基酸的功能狀態(tài)。更重要的是，本發(fā)明方法提供了一種抗氧化功能的總體測(cè)試方法，該方法可評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)抗自由基和其它形式氧化應(yīng)激所致?lián)p傷的總能力。由于有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞抗氧化劑(它們有廣泛的相互作用、多余性、修補(bǔ)和負(fù)荷(recharge)能力存在)，因此測(cè)定總功能是評(píng)價(jià)抗氧化劑總體狀況的最準(zhǔn)確、臨床上最有用的方法。通過(guò)采用每位患者代謝活躍的活淋巴細(xì)胞，本發(fā)明方法比已有技術(shù)中所有實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)提供了一個(gè)更準(zhǔn)確、臨床上更有用的維生素和礦物質(zhì)狀況的分析方法。
通過(guò)測(cè)定淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)評(píng)價(jià)功能充分程度(functional adequacy)，本發(fā)明方法反映了每位患者單獨(dú)的需求(這些需求各人大不相同)。因此，可根據(jù)各人具體的生化需求，而不是按所謂標(biāo)準(zhǔn)確定的“平均”患者需求，來(lái)調(diào)整充實(shí)(repletion)。
根據(jù)已發(fā)表的研究，美國(guó)人口中有70％處于長(zhǎng)期缺乏維生素和礦物質(zhì)危險(xiǎn)中。這些缺乏給身體的有效機(jī)能及抗病能力帶來(lái)不利影響。科學(xué)證據(jù)顯示，糾正維生素缺乏會(huì)增強(qiáng)免疫能力，并有助于防止或糾正健康慢性衰退狀態(tài)。研究也表明，在已經(jīng)服用維生素的患者中，40％以上有明顯的細(xì)胞內(nèi)功能性缺陷。另外，飲食許可量推薦(Recommended Dietary Allowance,RDA)并不是評(píng)價(jià)個(gè)體對(duì)維生素和礦物質(zhì)需求的合適指南。
許多人可以受益于本發(fā)明。維生素缺乏的糾正是健康者保持健康必需的。對(duì)于這些人進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試是很重要的。越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究不斷地報(bào)道了與維生素缺乏有關(guān)的各種疾病。這些研究證明了維生素、礦物質(zhì)、氨基酸和抗氧化劑的最優(yōu)狀況有預(yù)防和治療的效果(從防止心臟病和各種形式的癌癥到刺激免疫系統(tǒng)功能，減緩生理機(jī)能隨著年齡而衰退)。另外，維生素和礦物質(zhì)的缺乏會(huì)直接或間接地影響健康狀態(tài)如酒精中毒和飲食過(guò)渡(substance abuse)、關(guān)節(jié)炎、慢性疲勞、糖尿病、HIV/AIDS和其它免疫疾病、黃斑部變性、身體不適和疲勞、多發(fā)性硬化、神經(jīng)管缺陷、肥胖病、骨質(zhì)疏松癥和懷孕，而維生素礦物質(zhì)充足則有助于防止這些慢性疾病。
盡管下面詳細(xì)地描述了本發(fā)明的較佳的實(shí)施例，但是本發(fā)明測(cè)定方法中的各種基本組分如溶液、培養(yǎng)基、鹽和其它組分在美國(guó)專(zhuān)利No.4,499,064中有所描述。
本發(fā)明涉及一種用于生化分析人淋巴細(xì)胞抗氧化功能的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含無(wú)血清的緩沖液，該緩沖液含有下列組分選自葡萄糖的和在生物學(xué)上能在細(xì)胞中產(chǎn)生葡萄糖的化合物的糖類(lèi)，生物可利用形式的泛酸，膽堿或可在細(xì)胞中生產(chǎn)膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)，無(wú)機(jī)離子，這些無(wú)機(jī)離子包含氯離子、磷酸根、鈣離子、鎂離子、鉀離子、鈉離子和生物可利用形式的鐵離子，氫過(guò)氧化枯烯、去離子水和刺激待測(cè)淋巴細(xì)胞的有效量的促細(xì)胞分裂劑；所述無(wú)血清緩沖液的pH值為6.8-7.6，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征是它可有效地用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)缺乏、不足和失調(diào)，并可用于對(duì)淋巴細(xì)胞的抗氧化功能進(jìn)行生化分析。
在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，該營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物選自生物可利用形式的氨基酸和維生素，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物中沒(méi)有或只有限定或抑制量的待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物。在本例中，維生素選自生物素、甲酰四氫葉酸或葉酸的生物可利用形式、煙酰胺或煙酸、核黃素、硫胺素、維生素B6和維生素B12，以及可在細(xì)胞中產(chǎn)生這些物質(zhì)的化合物；其中所述氨基酸或生物學(xué)上可產(chǎn)生氨基酸的化合物，包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈胺酸，氨基酸以基團(tuán)形式存在，每種的量均不超過(guò)抑制濃度。
通常，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基含有一定濃度的氫過(guò)氧化枯烯，它允許對(duì)抗氧化功能進(jìn)行準(zhǔn)確的生化分析。較佳的是細(xì)胞培養(yǎng)基中氫過(guò)氧化枯烯的濃度約為50-500μM。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一種或多種選自丙酮酸鹽、腺嘌呤、環(huán)己六醇或能在細(xì)胞中產(chǎn)生這些物質(zhì)的化合物的刺激性營(yíng)養(yǎng)物，這些刺激性營(yíng)養(yǎng)物的濃度可引起幾乎是最大的反應(yīng)。通常，氨基酸補(bǔ)充物中除待測(cè)試氨基酸外，每種氨基酸的含量為使細(xì)胞產(chǎn)生最大反應(yīng)的最低有效濃度。而且，當(dāng)培養(yǎng)基不含絲氨酸和甘氨酸或不含其中之一時(shí)，培養(yǎng)基中應(yīng)含有能引起細(xì)胞反應(yīng)的有效濃度的維生素B6和可利用形式葉酸的一種或二者。在另一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)培養(yǎng)基不含泛酸或不含膽堿時(shí)，在補(bǔ)充了限制反應(yīng)量的培養(yǎng)基中所沒(méi)有的泛酸和膽堿后，在所述培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)可有效地測(cè)定營(yíng)養(yǎng)缺乏和異常需求。
本發(fā)明還涉及一種確定個(gè)體特別需要營(yíng)養(yǎng)物的異常營(yíng)養(yǎng)需求量的方法，該方法包括下列步驟將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中有濃度限制的待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體的淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
本發(fā)明還涉及一種在對(duì)有害作用敏感的個(gè)體中鑒定營(yíng)養(yǎng)因素或生化中間產(chǎn)物的方法，該營(yíng)養(yǎng)因素或生化中間產(chǎn)物能克服營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或其產(chǎn)物、以及包括藥物在內(nèi)的其它血液組分的有害作用，該方法包括下列步驟對(duì)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行接種，該細(xì)胞培養(yǎng)基含有至少一種營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或產(chǎn)物、或包括藥物在內(nèi)的其它血液組分，它們的濃度對(duì)細(xì)胞反應(yīng)有有害作用；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將其反應(yīng)與添加了某物質(zhì)的相同培養(yǎng)基中的反應(yīng)進(jìn)行比較，該物質(zhì)懷疑能影響待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或其產(chǎn)物、或包括藥物在內(nèi)的其他血液組分的有害作用。
本發(fā)明還提供一種對(duì)個(gè)體細(xì)胞抗氧化功能的生化分析方法，該方法包括下列步驟將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體的淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。下面將詳細(xì)描述該實(shí)例的各個(gè)方面。
給予下列例子描述本發(fā)明的不同實(shí)施例，并不意味著本發(fā)明在任何方式上局限于下列例子。
實(shí)驗(yàn)1抽取患者血液本發(fā)明方法需要兩份用酸-枸櫞酸鹽-葡萄糖保藏的10ml全血樣品。無(wú)需禁食。需要的就是取血。即可進(jìn)行本發(fā)明測(cè)定?；蛘?，患者的血液應(yīng)當(dāng)在室溫下送到合適的實(shí)驗(yàn)室。不要對(duì)血液進(jìn)行離心。全面測(cè)試結(jié)果提供了對(duì)患者(營(yíng)養(yǎng))缺乏情況的合理而有科學(xué)依據(jù)的分析。
實(shí)驗(yàn)2樣品的加工細(xì)胞分離所有的步驟在層流超凈臺(tái)上采用無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行，以確保樣品無(wú)菌。實(shí)驗(yàn)室收到每位患者的血樣時(shí)給予登錄號(hào)。該登錄號(hào)用作樣品號(hào)，以便在整個(gè)操作、數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析步驟中進(jìn)行跟蹤。用該樣品號(hào)(登錄號(hào))對(duì)操作患者樣品時(shí)的每個(gè)試管、離心管、微量滴定板和打印出的數(shù)據(jù)作標(biāo)記。
每份患者樣品包括2個(gè)酸-枸櫞酸鹽-葡萄糖(黃色頂部)真空(Vaccutainer)試管，每個(gè)試管中含有8毫升全血。在編好了登錄號(hào)(樣品號(hào))后，顛倒6次使全血混合。將兩試管的全血合并到一個(gè)50毫升一次性離心試管中。
從每份樣品中無(wú)菌取出500μl等份，放在12×17mm試管中。用該等份試樣在Coulter T450型細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)。Coulter打印出的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果標(biāo)記上登錄號(hào)上，并附在那位患者的工作記錄表上。
將5.0ml Histopaque 1077(Ficoll/3,5-雙[乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯甲酸鈉，Sigma,St.Louis,Missouri)加入到15ml圓錐形離心試管中，準(zhǔn)備2個(gè)這樣的Ficoll梯度試管。用10ml移液管和電子移液器將8ml全血緩緩地鋪在各個(gè)Ficoll梯度試管上。給Ficoll梯度試管加蓋，并在2160RPM(轉(zhuǎn)/分)下離心20分鐘。
在離心結(jié)束后，小心地將梯度試管從離心機(jī)中取出避免破壞梯度。用5ml移液管將Ficoll中間層界面處的白細(xì)胞層(含有淋巴細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到15ml一次性圓錐形離心試管中。將白細(xì)胞層與磷酸鹽緩沖鹽-0.72％葡萄糖溶液(PBS-G)合并至最終體積為12ml。試管加蓋并顛倒6次，使白細(xì)胞層和PBS-G混合。
離心含有白細(xì)胞層和PBS-G的試管，2160RPM 5分鐘。離心后，吸棄上清液留下細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸于12ml PBS-G中，顛倒6次以確保細(xì)胞沉淀充分分散。然后如上所述再次離心樣品。
第二次離心后，吸棄上清液。細(xì)胞沉淀重懸于6.0ml PBS-G中。用聯(lián)接電子移液器的5ml移液管使細(xì)胞沉淀分散并與PBS-G混合。獲得均質(zhì)細(xì)胞懸液后，將200μl懸液等份轉(zhuǎn)移到12×75mm試管中。用Coulter T450型細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)該等份進(jìn)行初始細(xì)胞懸液(ICS)計(jì)數(shù)。
該等份計(jì)數(shù)的打印結(jié)果標(biāo)上樣品號(hào)并附在工作記錄表中。如果淋巴細(xì)胞數(shù)目在3.9-1.2×103細(xì)胞/立方厘米(THSD/mm3)之間，則該樣品可作微量滴定板接種。需加入的細(xì)胞懸液體積列在表Ⅲ中。如果淋巴細(xì)胞數(shù)目大于3.9THSD/mm3，則該樣品必需再次稀釋。然而，如果淋巴細(xì)胞數(shù)目少于1.2THSD/mm3，則此樣品拒絕測(cè)試。
用下列計(jì)算式確定適當(dāng)?shù)卦傧♂屗璧腜BS-G加入量C1V1=C2V2C=淋巴細(xì)胞濃度(THSD/mm3)V=體積數(shù)其中C2=3.0THSD/mm3，這是最終細(xì)胞懸浮液所需的淋巴細(xì)胞濃度。例如，當(dāng)6.0ml初始細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)為L(zhǎng)Y#5.6THSD/mm3時(shí)，C1V1=C2V2(5.6)(6.0m1)=(3.0)(X)X=11.2ml(最終體積)在重懸細(xì)胞中加入合適體積的PBS-G使最終體積為11.2ml。在本例中，初始的6.0ml中應(yīng)加入5.2ml使最終體積為11.2ml。將所需體積的PBS-G加入初始細(xì)胞懸浮液(ICS)中形成最終細(xì)胞懸液(FCS)。將LY#計(jì)數(shù)值和PBS-G體積數(shù)記錄在Spectrox試驗(yàn)工作記錄表中。
再稀釋后，將200μl等份再稀釋細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的12×75mm試管中，并如上所述進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將再稀釋細(xì)胞懸液的打印數(shù)據(jù)(最終細(xì)胞懸液LY#)附在工作記錄表中，并記錄接種體積。
實(shí)驗(yàn)3微量滴定板接種最終細(xì)胞懸液置入無(wú)菌水槽中。將含有培養(yǎng)基的微量滴定板放在層流超凈臺(tái)內(nèi)。用裝有0-50μl無(wú)菌阻欄吸頭(barrier tip)的12-通道手動(dòng)微量移液器，將指定量(根據(jù)表Ⅰ)的最終細(xì)胞懸液分種到板上“H”排的每個(gè)孔中。
表Ⅰ下列體積根據(jù)所示的最終細(xì)胞懸液淋巴細(xì)胞數(shù)(LY#)用于微滴板接種。
最終細(xì)胞懸浮液LY#為接種而調(diào)整后的體積3.9-3.7 8.0μl3.6 8.5μl2.5-3.5 10.0μl2.4 12.5μl2.3 13.0μl2.2 14.0μl2.1 14.5μl2.0 15.0μl1.9 16.0μl1.8 17.0μl1.7 18.0μl1.6 19.0μl1.5 20.0μl1.4 21.5μl1.3 23.0μl小于等于1.2 25.0μl
將細(xì)胞加入培養(yǎng)孔后，以下列方式將氫過(guò)氧化枯烯(CuOOH)溶液加入“H”排中(1)1、2、3行中加入10μl 100μM CuOOH；(2)4、5、6行中加入10μl 200μM CuOOH；(3)7、8、9行中加入10μl 300μM CuOOH；(4)10、11、12行中加入10μl 400μM CuOOH。
將CuOOH加入微量滴定板后，給板加蓋，將板放入CO2培養(yǎng)箱，37℃保溫96小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)4標(biāo)記所有的標(biāo)記步驟在放射性同位素室中進(jìn)行。從冰箱中取出含氘胸苷(H3-TdR)工作溶液，并在水浴中溫?zé)嶂?7℃。96小時(shí)后，從培養(yǎng)箱中取出微量滴定板。將H3-TdR工作溶液放在無(wú)菌水槽中，用裝有0-50μl無(wú)菌阻欄吸嘴的12-通道手動(dòng)微量移液器將10μl H3-TdR工作溶液分別加入微量滴定板中“H”形排列的每個(gè)孔中，板再放回37℃培養(yǎng)箱中保溫24小時(shí)。將日期和作標(biāo)記的技術(shù)人員姓名首字母記錄在樣品記錄表中。
實(shí)驗(yàn)5收獲所有收獲步驟在放射性同位素室中進(jìn)行。用2號(hào)筆將樣品號(hào)標(biāo)記在單個(gè)玻璃纖維濾板(Pachard Part No.6005416)上。打開(kāi)真空泵，將干燥箱設(shè)定在100℃。注滿(mǎn)與收集儀相連的蒸餾水瓶。在微量滴定板加H3-TdR24小時(shí)后，將其從培養(yǎng)箱中取出。將日期和進(jìn)行收獲的技術(shù)人員的姓名首字母記錄在樣品記錄表中。
使細(xì)胞收集儀(Packard Model No.C9619)處于打開(kāi)位置，O環(huán)暴露，將玻璃纖維濾板放在收集儀上，粗面與O環(huán)接觸。關(guān)閉細(xì)胞收集儀，用來(lái)自淋洗盤(pán)(tray)的蒸餾水潤(rùn)濕濾板。置收集儀于抽真空循環(huán)(VAC)。取去微量滴定板蓋，將板放在收集儀探頭吸嘴下。將板緩緩抬高至收集儀探頭，直至探頭吸嘴觸及板底。吸出培養(yǎng)基，以圓周運(yùn)動(dòng)方式緩緩移動(dòng)微量滴定板，用探頭吸嘴擦吸孔底部。擦吸維持10秒鐘。在微量滴定板與收集儀探頭吸嘴接觸時(shí)，繼續(xù)擦吸，壓住“清洗”按鈕10秒種。將液體從孔中吸出，并重復(fù)上述步驟。移開(kāi)此板。將淋洗盤(pán)裝滿(mǎn)甲醇，抬高淋洗盤(pán)，吸出甲醇，然后降低淋洗盤(pán)。
打開(kāi)收集儀，濾板粘在收集儀上面部分，繼續(xù)抽真空操作5秒鐘。5秒后，關(guān)閉抽真空并同時(shí)將濾板從收集儀表面上取下。濾板粗面朝上放在干燥箱中10分鐘。從干燥箱中取出濾板并冷卻至室溫。
實(shí)驗(yàn)6放射活性計(jì)數(shù)所有的計(jì)數(shù)步驟在放射性同位素室中進(jìn)行。將濾板粗面朝上放在計(jì)數(shù)裝置中。在濾板上放置準(zhǔn)直儀(固定濾板的不銹鋼薄板)。將該裝置裝在Packard Matrix9600β粒子放射活性計(jì)數(shù)器上。Q-氣體(1.3％正丁烷，在氦氣中)開(kāi)始流入Mtris9600。按下“開(kāi)始”按鈕，開(kāi)始計(jì)數(shù)程序，對(duì)每個(gè)孔的總放射活性計(jì)數(shù)3分鐘。每個(gè)樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果儲(chǔ)存在Matrix 9600的硬盤(pán)中。另外將初始放射活性計(jì)數(shù)結(jié)果打印出來(lái)。
實(shí)驗(yàn)7數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換將Matrix 9600硬盤(pán)上的數(shù)據(jù)下載到3.5英寸軟盤(pán)中。用Microsoft Excel的宏程序用原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成可報(bào)告格式。該宏程序減去每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的板本底值，產(chǎn)生三孔一組的平均值，并將該平均值用微滴板對(duì)照值(設(shè)定為100％)的百分?jǐn)?shù)表示。
實(shí)驗(yàn)8數(shù)據(jù)分析(標(biāo)準(zhǔn)化)本發(fā)明方法測(cè)定了總的抗氧化功能。采用促細(xì)胞分裂劑刺激生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞，以在有和沒(méi)有幾種劑量的CuOOH時(shí)，所測(cè)量的淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)反應(yīng)表示抗氧化功能。CuOOH是用于測(cè)定各個(gè)體淋巴細(xì)胞的抗氧化功能的氧化應(yīng)力。已建立了初步參照范圍。然而，由于CuOOH本身性質(zhì)不穩(wěn)定，它的保藏期相對(duì)短暫，而且活性隨時(shí)間而衰退，因此，在第一次生產(chǎn)后必須定期采用不同效力(的CuOOH)。在其保藏期內(nèi)不同時(shí)間獲得的每批料，要求每次實(shí)驗(yàn)當(dāng)天與原參照范圍數(shù)值相符。CuOOH的用量(100μM、200μM、300μM、400μM)根據(jù)1993/1994的CuOOH原份額數(shù)值建立。
對(duì)每天的樣品批須進(jìn)行這種數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。每次測(cè)試需制作CuOOH的四個(gè)點(diǎn)劑量反應(yīng)曲線，因此，可以使每天批料的數(shù)據(jù)與原參照范圍相符，并用新的數(shù)值來(lái)報(bào)告測(cè)試結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)化是通過(guò)尋找每天各CuOOH劑量的平均值、中值、范圍和方差來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將與原參照范圍(處于50％對(duì)照生長(zhǎng))最接近的數(shù)值用t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。然后將最接近匹配參照范圍的CuOOH劑量作為該檢驗(yàn)結(jié)果。同樣，可采用CuOOH劑量的中間值(如200+300/2)。標(biāo)準(zhǔn)化可用Microsoft Excel的Spreadsheet程序來(lái)完成。
實(shí)驗(yàn)9綜述對(duì)患者樣品的每天批號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用Execl中的描述統(tǒng)計(jì)(DescriptiveStatistics)功能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。確定每個(gè)CuOOH劑量的平均值、中值、范圍和方差，選擇與參照范圍最接近的劑量，用Execl進(jìn)行t-檢驗(yàn)，以確定CuOOH劑量與參照范圍相同或不同。用最接近1.0(并大于0.05)的兩尾P值(two-tailed P value)劑量來(lái)報(bào)告該數(shù)值。打印出結(jié)果，并放在該批文件夾中。
實(shí)驗(yàn)10裝置、試劑和溶液在本發(fā)明的試驗(yàn)中采用下列裝置層流超凈臺(tái)、離心機(jī)(Beckman GS-6)、細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Counter Model T540)、12通道移液器(5-500μl)、電子移液泵(Drummond)、滅菌50ml帶蓋圓錐形塑料管、12×75mm聚丙烯試管、滅菌的15ml帶蓋圓錐形離心管、移液器(范圍為0-20、0-200、0-100μl)、滅菌的一次性玻璃移液管(5.0ml、10.0ml)、試管架和氣溶膠阻欄式移液吸嘴(Aerosol Barrier PipetTip)(0-50μl)。表Ⅱ顯示了本發(fā)明方法中采用的各種試劑及其來(lái)源。
表Ⅱ試劑腺嘌呤鹽酸鹽 SigmaA 8751抗生素溶液(PSF) GIBCO15245-012精氨酸鹽酸鹽 SigmaA 5131d-生物素 SigmaB 4501無(wú)水氯化鈣 SigmaC 4901氯化膽堿 SigmaC 1879氫過(guò)氧化枯烯 SigmaC 0524氰鈷胺素(維生素B12) SigmaV 2876半胱氨酸鹽酸鹽，無(wú)水SigmaC 1276EDTA納 SigmaE 4884硫酸亞鐵七水合物SigmaF 8633葉酸，鈣鹽 SigmaF 7878葡萄糖 SigmaG 5767葡萄糖溶液(10％)SigmaG 3126L-谷氨酰胺 SigmaG 3126甘氨酸 SigmaG 7126HEPES，無(wú)酸 SigmaH 3375L-組氨酸(HCl-水合物)SigmaH 8125Histopaque(Ficoll/3,5-雙[乙酰氨基]-2,4,6-三 Sigma1077-1碘苯甲酸鈉)羥鈷胺素(HCI B12) SigmaH 7126肌醇SigmaI 5125L-異亮氨酸 SigmaI 2752L-亮氨酸SigmaL 8000L-賴(lài)氨酸SigmaL 5626無(wú)水硫酸鎂 SigmaM 7506無(wú)水甲醇VWR VWR4300-7L-甲硫氨酸 SigmaM 9625煙酰胺(維生素B3) SigmaN 3376D-泛酸鈣SigmaP 0290酚紅溶液，0.5％PBS SigmaP 0290L-苯丙氨酸 SigmaP 2126磷酸鹽緩沖液，pH 7.4SigmaP 3813植物凝集素PHA-P SigmaL 8754磷酸鉀，二取代 SigmaP 3786吡哆醇HCI(維生素B6)SigmaP 9755核黃素(維生素B2) SigmaR 4500L-絲氨酸SigmaS 4500氯化鈉 SigmaS 9625氫氧化鈉，5.0N溶液 VWR RS 4151丙酮酸鈉 SigmaP 2256丙酮酸鈉溶液(100mM)SigmaS 8636硫胺素(維生素B1) SigmaT 4625L-蘇氨酸 SigmaT 8625胸苷 SigmaT 9250[3H]-胸苷 ICN 24066L-色氨酸 SigmaT 0254L-酪氨酸 SigmaT 3754L-纈胺酸 SigmaV 0500實(shí)驗(yàn)11溶液所有溶液均用組織培育級(jí)去離子水(tcd H2O)制備。
在制備磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.72％葡萄糖(PBS-G)溶液時(shí)，用tcd H2O根據(jù)試劑包裝說(shuō)明制備PBS。加入足量的10％葡萄糖溶液，使最終葡萄糖濃度為0.72％。將溶液過(guò)濾除菌并儲(chǔ)藏在2-8℃冰箱中。
在制備濃縮(2X)貯備培養(yǎng)基時(shí)，1升2X貯備培養(yǎng)基含有(1)23.80gHEPES；(2)14.02g氯化鈉；(3)1.05g磷酸氫二鉀；(4)0.241g硫酸鎂；(5)1.0ml(10μM)腺嘌呤鹽酸鹽；(6)30.0ml(100mM)丙酮酸鈉；(7)0.5ml 0.5％酚紅溶液；(8)5.0ml抗生素混合物；(9)8.0ml 5N氫氧化鈉；(10)20.0ml Fe/EDTA(1.0 mM FeSO4/0.4 mMNa2EDTA)。所有材料充分混合后，用5N氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至7.60。加入tcd H2O使最終體積為1.0升。使溶液通過(guò)0.2μ濾器過(guò)濾除菌，儲(chǔ)藏在4℃冰箱內(nèi)。在這些條件下，溶液穩(wěn)定性約為4周。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于100％微量滴定板對(duì)照，本發(fā)明新方法如下。過(guò)濾后應(yīng)無(wú)菌操作?；A(chǔ)培養(yǎng)基在層流超凈臺(tái)中制備?；旌纤薪M分，并用tcd H2O加到所需最終體積。將溶液真空過(guò)濾到無(wú)菌瓶中進(jìn)行滅菌。加入合適體積的PHA貯備液。
表Ⅲ<
實(shí)驗(yàn)12氫過(guò)氧化枯烯(CuOOH)貯備溶液氫過(guò)氧化枯烯(Sigma C 0524)的保藏期有限。該材料的有效期為從Sigma收到起3個(gè)月。當(dāng)從瓶中吸取CuOOH時(shí)，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到CuOOH的粘度增加。因此必須確保液體完全被吸入移液器吸嘴中。這需要足夠的時(shí)間和注意保證充分充滿(mǎn)移液器吸嘴。也必須擦干吸嘴以除去吸嘴外壁上多余的CuOOH。同樣，必須使CuOOH完全分散。在這一步驟后，將該溶液儲(chǔ)藏在2-8℃的冷藏條件下，并有所需的3個(gè)月穩(wěn)定性。
為制備第一CuOOH貯備液(1.0M CuOOH，在PBS-G中)，使9.5μl氫過(guò)氧化枯烯(CuOOH)與990.5μl PBS-G混合。在這一步后，將該溶液儲(chǔ)藏在2-8℃的冷藏條件下，并有所需的3個(gè)月穩(wěn)定性。
第二CuOOH貯備液(100mM，在PBS-G中)必須在細(xì)胞分離前當(dāng)天制備。它不應(yīng)儲(chǔ)藏過(guò)夜。將200μl第一貯備溶液與1800μl PBS-G混合，以制得第二CuOOH貯備液。
對(duì)于氫過(guò)氧化枯烯工作溶液，須在細(xì)胞分離前當(dāng)天制備4種工作溶液。將溶液加入用來(lái)裝載患者(細(xì)胞)板的CuOOH轉(zhuǎn)移板(分開(kāi)的二個(gè)微量滴定板)中。工作液不應(yīng)儲(chǔ)藏過(guò)夜。4種工作液是(1)100μM CuOOH使110μl第二CuOOH貯備液與4890μl PBS-G混合；(2)200μM CuOOH使220μl第二CuOOH貯備液與4780μl PBS-G混合；(3)300μM CuOOH使330μl第二CuOOH貯備液與4670μl PBS-G混合；(4)400μM CuOOH使440μl第二CuOOH貯備液與4560μl PBS-G混合；實(shí)驗(yàn)13胸苷(ThY)貯備液胸苷(ThY)貯備液(冷)(1.33mM ThY，0.322g/L)的制備如下稱(chēng)取0.16lgThY(Sigma T 9250)，溶于tcd H2O中至最終體積為500ml。無(wú)菌操作將該溶液真空過(guò)濾入無(wú)菌瓶中進(jìn)行除菌，溶液等份分入50ml離心管中。為短期保藏，該溶液可4℃冷藏，穩(wěn)定期1個(gè)月。為長(zhǎng)期保藏，該溶液應(yīng)-70℃冷凍，穩(wěn)定期6個(gè)月。標(biāo)記細(xì)胞用的放射性胸苷(H3TdR)應(yīng)當(dāng)用胸苷工作溶液來(lái)稀釋。
為了制備胸苷工作溶液(ThY+3H-TdR)，在300ml無(wú)菌除氣tcd H2O中加入下列物質(zhì)1.33mM冷的ThY1.15ml、1.70ml3H-TdR(ICN Part No.24066)，和300μCi/mmol比活。在該步驟后，溶液就可在冷藏條件下(4℃)穩(wěn)定保藏1周。
本說(shuō)明書(shū)提及的任何專(zhuān)利或出版物表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。這些專(zhuān)利和出版物以同樣的程度納入本文作參考，正如將每個(gè)單獨(dú)的出版物具體而單獨(dú)引為參考那樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易理解，本發(fā)明很適于實(shí)現(xiàn)所述的目的，并獲得所述結(jié)果和利益，以及其本來(lái)具有的那些收益。本文描述的實(shí)驗(yàn)以及方法、步驟、處理過(guò)程、分子和具體化合物是目前較佳實(shí)施例的典型代表是范例，不能視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)其所作的變化或其它應(yīng)用，均包括在權(quán)利要求范圍確定的本發(fā)明的精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種用于人淋巴細(xì)胞抗氧化功能生化分析的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含，無(wú)血清的緩沖溶液，該緩沖液含有下列組分選自葡萄糖和生物學(xué)上能在細(xì)胞中產(chǎn)生葡萄糖的化合物的糖類(lèi)，生物可利用形式的泛酸，膽堿，或可在細(xì)胞中產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)，無(wú)機(jī)離子，這些無(wú)機(jī)離子包括氯離子、磷酸根、鈣離子、鎂離子、鉀離子、鈉離子和生物學(xué)上可利用形式的鐵離子，氫過(guò)氧化枯烯，去離子水和刺激待測(cè)淋巴細(xì)胞的有效量的促細(xì)胞分裂劑；所述無(wú)血清緩沖液的pH值為6.8-7.6，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征是它可有效地用來(lái)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)缺乏、不足和失調(diào)，并可用來(lái)對(duì)淋巴細(xì)胞的抗氧化功能進(jìn)行生化分析。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基中添加有選自氨基酸和維生素的生物可利用形式的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，該營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物中沒(méi)有或只有限定量或抑制量的待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述維生素選自生物素、甲酰四氫葉酸或葉酸的生物可利用形式、煙酰胺或煙酸、核黃素、硫胺素、維生素B6和維生素B12，以及可在細(xì)胞中產(chǎn)生這些物質(zhì)的化合物；其中所述的氨基酸或在生物學(xué)上可產(chǎn)生氨基酸的化合物包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈胺酸，氨基酸以基團(tuán)形式存在，每種的量均不超過(guò)抑制濃度。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述氫過(guò)氧化枯烯的濃度為50-500μM。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中細(xì)胞培養(yǎng)基添加有一種或多種選自丙酮酸鹽、腺嘌呤、環(huán)己六醇或能在細(xì)胞中產(chǎn)生這些物質(zhì)的化合物的刺激性營(yíng)養(yǎng)物，刺激性營(yíng)養(yǎng)物的濃度可引起幾乎是最大的反應(yīng)。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中氨基酸補(bǔ)充物中除待測(cè)氨基酸外每種氨基酸的含量是使細(xì)胞產(chǎn)生最大反應(yīng)的最低有效濃度。
7．根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基不含絲氨酸和甘氨酸或不含其中之一，而且培養(yǎng)基中含有細(xì)胞反應(yīng)所需有效濃度的維生素B6和葉酸的可利用形式，或含有其中之一。
8．根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基不含泛酸或不含膽堿，當(dāng)補(bǔ)充了限制反應(yīng)量的培養(yǎng)基中所沒(méi)有的泛酸和膽堿后，在所述培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)可有效地確定營(yíng)養(yǎng)缺乏和異常需求。
9．一種確定個(gè)體特別需要營(yíng)養(yǎng)物的異常營(yíng)養(yǎng)需求量的方法，該方法包括下列步驟將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有有限濃度的待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)物；和將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體的淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
10．一種在對(duì)有害作用敏感的個(gè)體中，鑒定營(yíng)養(yǎng)因素或生化中間產(chǎn)物的方法，其中該營(yíng)養(yǎng)因素或生化中間產(chǎn)物能克服營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或其產(chǎn)物、以及包括藥物在內(nèi)的其它血液組分的有害作用，該方法包括下列步驟對(duì)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行接種，該細(xì)胞培養(yǎng)基含有至少一種營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或產(chǎn)物、或包括藥物在內(nèi)的其它血液組分，它們的濃度對(duì)細(xì)胞反應(yīng)有有害作用；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；將其反應(yīng)與添加了某物質(zhì)的相同培養(yǎng)基中的反應(yīng)進(jìn)行比較，該物質(zhì)懷疑能影響待測(cè)營(yíng)養(yǎng)物、生化中間產(chǎn)物或其產(chǎn)物、或包括藥物在內(nèi)的其他血液組分的有害作用。
11．一種生化分析個(gè)體的細(xì)胞抗氧化功能的方法，該方法包括下列步驟將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中；培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基；和將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體的淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于人淋巴細(xì)胞抗氧化功能生化分析的細(xì)胞培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包含無(wú)血清緩沖液,該緩沖液含有下列組分:選自葡萄糖和生物學(xué)上能在細(xì)胞中產(chǎn)生葡萄糖的化合物的糖類(lèi);生物可利用形式的泛酸,膽堿,或可在細(xì)胞中產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì);無(wú)機(jī)離子,這些無(wú)機(jī)離子包括氯離子、磷酸根、鈣離子、鎂離子、鉀離子、鈉離子和生物學(xué)上可利用形式的鐵離子;氫過(guò)氧化枯烯、去離子水和刺激待測(cè)淋巴細(xì)胞的有效量的促細(xì)胞分裂劑;所述無(wú)血清緩沖液的pH值為6.8—7.6,所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征是它可有效地用來(lái)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)缺乏、不足和失調(diào),并可用來(lái)對(duì)淋巴細(xì)胞的抗氧化功能進(jìn)行生化分析。另外還提供對(duì)個(gè)體的細(xì)胞抗氧化功能進(jìn)行生化分析的方法,該方法包括下列步驟:將所述個(gè)體的淋巴細(xì)胞接種入本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中;培育接種了細(xì)胞的培養(yǎng)基;將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與對(duì)照組個(gè)體淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1222940SQ97195713
公開(kāi)日1999年7月14日 申請(qǐng)日期1997年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月19日
發(fā)明者J·F·克勞福德, L·布奇 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)