專利名稱：從高細胞密度培養(yǎng)物純化腺病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒制備領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及從細胞懸液純化腺病毒顆粒的改進方法。
背景技術(shù)：
疫苗制備領(lǐng)域近來的進展產(chǎn)生了對大規(guī)模生產(chǎn)的需求。亟需穩(wěn)健和高效的方法來為全世界提供足量的(重組)疫苗以對抗傳染病。針對傳染病的疫苗可以基于重組腺病毒顆粒。為此進行了大量的努力以優(yōu)化基于細胞的腺病毒制備方法。將細胞以漸增密度培養(yǎng)，隨后感染以獲得更高的總病毒收率。 這樣的高細胞密度方法公開于例如Crucell Holland BV的WO 2010/060719和Yuk et al. 0004)。其中描述了制備高濃度重組腺病毒的方法。這種優(yōu)化方法依賴于這樣的能力， 即以高細胞密度(例如，高于切106細胞/ml)感染培養(yǎng)物并保留高的每細胞病毒產(chǎn)率。這提供一種在單生物反應(yīng)器中獲得高病毒濃度的收獲病毒溶液的方法。所述方法通常的病毒顆粒(VP)收率為約 1. 5-2. 5xl012VP/mL。以高密度培養(yǎng)細胞的方法易于積累大量的細胞碎片和宿主細胞DNA。在純化過程中必須進一步除去這些污染物，而這是繁瑣的操作。US7326555最近公開一種從收獲的細胞培養(yǎng)物除去宿主細胞DNA的方法。所述方法由選擇性地從細胞培養(yǎng)物沉淀宿主細胞DNA組成。選擇性沉淀劑可以特異性地結(jié)合宿主細胞DNA，并且不沉淀腺病毒顆粒。然而，該文獻中的方法僅對低細胞密度細胞培養(yǎng)物進行描述，其中細胞碎片和宿主細胞DNA存在的量不尚ο目前尚未知所述方法可以應(yīng)用于包含高細胞密度的培養(yǎng)物。相比之下，從現(xiàn)有技術(shù)可以推知的強烈建議是，當以高濃度使用時用于所述方法的沉淀劑不會選擇性地從培養(yǎng)物沉淀宿主細胞DNA，并且會沉淀病毒顆粒(Goerke et al. 2004)。通常將包含腺病毒的細胞培養(yǎng)收獲物進一步加工以獲得純化的腺病毒。所述純化方法中通常包括利用例如深層過濾和/或切向流過濾(TFF)的澄清步驟。TFF的使用要求相對純(clean)的收獲物，即包含有限量的細胞碎片或其他雜質(zhì)，例如宿主細胞DNA。過量的所述雜質(zhì)可能阻塞過濾器。因此，通過TFF進行的澄清通常用于進一步的純化方法，例如作為第三或第四方法步驟。收獲后利用切向流過濾直接從包含腺病毒的細胞懸液分離腺病毒此前在例如 EP1371723中有描述。然而，腺病毒生長于粘附的細胞，其在收獲后保留在生物反應(yīng)器中。因此，進一步加工的含病毒懸液包含非常低濃度的細胞碎片和宿主細胞DNA。W02006/052302 還描述了在收獲后直接使用TFF。然而，其中所用的含病毒收獲物的細胞密度大大低于切106細胞/ml。如本文所公開的，收獲后在澄清步驟中直接使用TFF對于包含高細胞密度的細胞培養(yǎng)物是不可行的。由于細胞培養(yǎng)方法是放大級別上升的，并且細胞以漸增的密度進行培養(yǎng)，所以工業(yè)中亟需允許處理高細胞密度懸液的下游方法。這特別適用于腺病毒制備領(lǐng)域。
發(fā)明_既述本發(fā)明涉及從細胞懸液中，特別是從高細胞密度懸液中純化來自細胞裂解物的腺病毒顆粒的方法。如本文所示(實施例1)，用現(xiàn)有的方法從高細胞密度懸液純化腺病毒的病毒回收率很低。收獲后獲得的高細胞密度懸液中的雜質(zhì)濃度通常過高而無法實現(xiàn)直接的腺病毒純化。利用已知方法進行高細胞密度懸液的下游加工通常要求多個步驟。第一過濾步驟由粗濾組成以除去大沉淀和細胞碎片。隨后，需要一個或多個選擇性過濾步驟以獲得足夠純化的腺病毒懸液。我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)并在本文公開了，緊隨制備包含腺病毒的細胞裂解物之后， 連續(xù)使用宿主細胞DNA破碎和/或沉淀，接著進行包括切向流過濾(TFF)的澄清步驟，得到了高度純化的腺病毒懸液。令人驚訝的是，包含腺病毒、大量細胞碎片、宿主細胞DNA和其他雜質(zhì)的細胞裂解物可以由本發(fā)明有效地加工成純化的腺病毒。因此，本發(fā)明提供一種適合于在大規(guī)模腺病毒純化過程中除去宿主細胞DNA的新方法。通過將DNA破碎或沉淀并入純化過程，使用TFF進行澄清的，單一的澄清步驟就足以從高細胞密度懸液中純化腺病毒。本發(fā)明提供一種從具有范圍為5x106-150X106細胞/ml的細胞密度的細胞懸液中純化腺病毒顆粒的方法，所述方法包括a)將所述細胞懸液中的細胞裂解；b)將所述細胞懸液中的宿主細胞DNA破碎和/或沉淀；以及c)通過切向流過濾對得自步驟b)的細胞懸液
進行澄清。在一些實施方案中，所述腺病毒純化自細胞懸液，其具有的細胞密度范圍為 5xl06-150xl06 細胞/ml，例如 5xl06_50xl06 細胞/ml 或 10xl06_30xl06 細胞/ml。在另一實施方案中，所述步驟b)中的沉淀是通過加入選擇性沉淀劑來將宿主細胞DNA從腺病毒顆粒沉淀而進行的。在優(yōu)選實施方案中，用孔徑范圍為0. 1-0. 65 μ m的膜來進行所述切向流過濾。在其他優(yōu)選實施方案中，用中空纖維進行所述切向流過濾。在優(yōu)選的實施方案中， 用ATF系統(tǒng)進行所述切向流過濾。


圖 1 低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(20xl06-30xl06vc/ml 密度細胞懸液中，針對度米芬濃度作圖的腺病毒回收率和沉淀的宿主細胞DNA。圖 2 低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(18xl06_25xl06vc/ml)密度細胞懸液中，針對度米芬濃度作圖的腺病毒回收率和沉淀的宿主細胞DNA。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于從高細胞密度懸液純化腺病毒顆粒的方法。根據(jù)本發(fā)明，所述高細胞密度懸液通過將細胞培養(yǎng)至高細胞密度而獲得。這樣的培養(yǎng)可以，例如批量、加料批量或灌注模式來進行。將細胞培養(yǎng)至高細胞密度的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。獲得高細胞密度培養(yǎng)物的具體方法公開于，例如W02004/099396、W02005/095578、W02008/006494、 W02010/060719。
根據(jù)本發(fā)明，高細胞密度懸液包含約5χ106-150Χ106細胞/mL，例如約 8x106-120x106 細胞 /mL,如約 12xl06-100xl06 細胞 /mL,如約 20xl06-80xl06 細胞 /mL。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述高細胞密度懸液的細胞密度范圍為約 10x106-50X106細胞/mL，例如至少約15xl06細胞/mL，如至少約20xl06細胞/mL，如至少約 25xl06，如高達約30xl06細胞/mL，如高達約35xl06細胞/mL，如高達約40xl06細胞/mL，如高達約45x106細胞/mL。根據(jù)本發(fā)明，用腺病毒顆粒感染高細胞密度培養(yǎng)物以允許所述腺病毒在細胞懸液增殖。在本文中，在單一生物反應(yīng)器中獲得高細胞密度懸液，其包含高濃度的腺病毒。感染高細胞密度培養(yǎng)物的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。獲得高病毒濃度的高細胞密度培養(yǎng)物的具體方法在例如EP08168181. 9、Cortin et al. 2004和Yuk et al. 2004中有公開。 這些參考文獻描述了用于制備大量重組腺病毒的方法。這些方法依賴于用每細胞高腺病毒產(chǎn)率的保存物感染高細胞密度的培養(yǎng)物的能力。本文則提供了一種在單一生物反應(yīng)器中獲得高腺病毒濃度的高細胞密度懸液的方法。本發(fā)明方法的典型收率，例如對于重組腺病毒 35(rAd35)為約1. 5_2. 5xl012VP/mL。根據(jù)本發(fā)明，一旦腺病毒在細胞培養(yǎng)物中增殖并殺死大部分細胞，則從高細胞密度懸液純化腺病毒顆粒。本發(fā)明方法的第一步驟包括將高細胞密度懸液中所包含的細胞裂解。裂解用腺病毒顆粒感染的高細胞密度懸液導致大量細胞碎片和宿主細胞DNA積累在所述細胞懸液中。 這些積累使得細胞懸液隨后的下游加工冗長繁瑣。本發(fā)明提供一種適合于從高細胞密度懸液的細胞裂解物純化腺病毒顆粒的方法。 通過向細胞裂解物加入選擇性沉淀劑可以從高細胞密度懸液中的腺病毒顆粒選擇性沉淀大量宿主細胞DNA，從而從包含腺病毒顆粒的高細胞密度懸液沉淀至少約80 %的宿主細胞 DNA分子。如本文所公開的，在用TFF澄清后，沉淀步驟允許沉淀污染宿主細胞DNA，至少減少80 %的宿主細胞DNA，優(yōu)選90 %，并且如本文所示例的，甚至更優(yōu)選減少約95 %的宿主細胞 DNA。藤所述方法的第一步驟包括將細胞懸液中的細胞裂解。其中裂解細胞膜的第一步驟允許從感染的高細胞密度懸液收獲細胞相關(guān)(細胞內(nèi))和非細胞相關(guān)(細胞外)腺病毒。 裂解包含病毒的宿主細胞的優(yōu)選方法宿主細胞洗滌劑裂解可以由非機械裂解方法(如酶處理)和和/或機械剪切方法(如中空纖維超濾)代替以釋放最大量的腺病毒?？梢杂糜诩せ罴毎呀獾姆椒楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且例如討論于WO 98/22588, p. 28-35.這一方面可用的方法例如冷凍-解凍、固體剪切、高滲和/或低滲裂解、液體剪切、超聲、高壓擠出、洗滌劑裂解、上述方法的組合等。在本發(fā)明的一實施方案中，利用至少一種洗滌劑將細胞裂解。使用洗滌劑裂解的優(yōu)勢在于其是一種容易的方法，并且容易放大。可以使用的洗滌劑及其使用方法通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。例如幾種實例討論于TO 98/22588,p. 29-33.本文所用的洗滌劑可以包括但不限于陰離子、陽離子、兩性離子和非離子洗滌劑。洗滌劑的實例例如Triton和/或聚山梨酯-80。在一實施方案中，所用的洗滌劑為Triton X-IOO0此外，可以向裂解物或澄清的裂解物加入低濃度的諸如TNBP的溶劑以補充這些洗滌劑失活包裝的病毒的能力。另外，感染的宿主細胞由其中的腺病毒的自裂解可以提供細胞內(nèi)腺病毒的主要釋放，并且可以用于本發(fā)明的方法。因此，本領(lǐng)域已知的任何形式的宿主細胞裂解可以用于向宿主細胞培養(yǎng)基中釋放細胞內(nèi)病毒以用于通過本文公開的方法進行最后收獲。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解，洗滌劑的最優(yōu)濃度可以變化，例如在0. -1% (w/w)的范圍內(nèi)變化。破碎和詵擇件沉淀裂解后，可以將宿主細胞DNA破碎并從包含病毒的細胞懸液沉淀。在一優(yōu)選實施方案中，通過加入選擇性沉淀劑(SPA)溶液來沉淀宿主細胞DNA。這一步驟允許選擇性沉淀宿主細胞DNA，同時將未改性的病毒顆粒留在液相中。如本文所示例的，這一早期沉淀步驟在澄清后導致至少約90 %的宿主細胞DNA減少。可以用于實施本發(fā)明的SPA包括但不限于胺共聚物、季銨化合物及其任何各自的混合物。更具體地，許多形式的聚乙烯(PEI)非常有效地中和過量的陰離子電荷(DNA 雜質(zhì))?？梢院线m地用于本發(fā)明的一系列可能的SPA列于(12欄，56-67行和13欄，1-28 行)，其援引加入本文。適合用于本發(fā)明的SPA包括但不限于以下可商購產(chǎn)品的類型和實例單烷基三甲基銨鹽(可商購產(chǎn)品的實例包括十六烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基氯化銨，CTAB ；四癸基三甲基溴化銨或四癸基三甲基氯化銨(TTA)；烷基三甲基氯化銨； 烷基芳基三甲基氯化銨；十二烷基三甲基溴化銨或十二烷基三甲基氯化銨；十二烷基二甲基-2-苯氧基乙基溴化銨；十六烷基胺鹽酸鹽或氫溴酸鹽；十二烷基胺或鹽酸鹽；以及十六烷基二甲基乙基溴化銨或十六烷基二甲基乙基氯化銨)；單烷基二甲基芐基銨鹽(實例包括烷基二甲基芐基氯化銨和芐索氯銨，BTC) ；二烷基二甲基銨鹽(商業(yè)產(chǎn)品包括度米芬(DB) ；二癸基二甲基鹵化銨和和辛基十二烷基二甲基氯化銨或辛基十二烷基二甲基溴化銨)；雜芳香銨鹽(商業(yè)產(chǎn)品包括十六烷基鹵化吡啶鐺(CPC或氫溴酸鹽和十六烷基溴化吡啶鐺或十六烷基氯化吡啶鐺)；順式異構(gòu)體1-[3_氯烯丙基]_3，5，7-三氮雜-1-氮鐺金剛烷；烷基-溴化異喹啉鐺；以及烷基二甲基萘基-甲基氯化銨(BTC 1110)。多取代的季銨鹽(可商購的產(chǎn)品包括但不限于烷基二甲基芐基糖精銨和烷基二甲基乙基芐基環(huán)己基氨基磺酸銨)；雙季銨鹽(產(chǎn)品實例包括1，10-雙O-甲基-4-氨基氯化喹啉鐺)_癸烷； 1，6_雙{1-甲基-3-(2，2，6-三甲基環(huán)己基)-丙基二甲基氯化銨]己烷或曲比氯銨以及 Buckman Brochures的稱為CDQ的bis-quat)；禾口聚合季按鹽(包括polyionene，如聚[氧化乙烯(二甲基亞氨基)亞乙基(二甲基亞氨基)亞乙基二氯化物]；聚[N-3-二甲基銨基)丙基]N-[3_亞乙基氧化乙烯二甲基銨基)丙基]脲二氯化物；和α-4_[1-三O-羥基乙基)氯化銨)。本領(lǐng)域技術(shù)人員從US73^555應(yīng)當理解，其中這些化合物中的幾種據(jù)證實發(fā)揮作用，并且其中據(jù)證實本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地發(fā)現(xiàn)這些化學選擇性沉淀DNA的合適濃度，這些為SPA的實例，并且基于其公開和本發(fā)明的公開，這些化合物顯然也適合于本發(fā)明。在一優(yōu)選實施方案中，陽離子洗滌劑用于本發(fā)明。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，二烷基二甲基銨鹽如度米芬(DB)用于本發(fā)明。盡管大量潛在的SPA可以用于實施本發(fā)明，但是度米芬主要由于其作為GMP等級原料的可用性以及目前用在目的是人用途的其他產(chǎn)品而引起特別關(guān)注。更特別地，由于度米芬廣泛用作口服衛(wèi)生產(chǎn)品以及局部抗生素乳膏的活性成分，所以這種分子在cGMP條件下大量生產(chǎn)并分配。本文測定在高細胞密度懸液中用于從細胞懸液沉淀宿主細胞DNA的最優(yōu)SPA濃度。盡管基于現(xiàn)有技術(shù)預(yù)期，當腺病毒顆粒與高濃度SPA接觸時會立即沉淀，但是意料之外的是腺病毒顆粒仍保持未沉淀。確實，例如在US73^555中，據(jù)現(xiàn)有技術(shù)證實，在低細胞密度懸液(高達IxlO6細胞/ml)中，腺病毒顆粒當陽離子洗滌劑濃度增加時發(fā)生沉淀。如本文所公開的，通過裂解高細胞密度培養(yǎng)物而制備的懸液會包含大量增加量的宿主細胞DNA和其他雜質(zhì)，并因此需要增加量的陽離子洗滌劑(例如，增加2倍)。因此基于低細胞密度結(jié)果的外推，預(yù)期陽離子洗滌劑濃度的這種增加會導致懸液中存在的腺病毒顆粒的整體的沉淀。然而，令人驚訝地，在高SPA濃度下，從包含病毒顆粒的高細胞密度懸液選擇性除去污染宿主細胞DNA仍然是可以的。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，加入的SPA(優(yōu)選 DB)的濃度為1.2-5mM。在一甚至更優(yōu)選的實施方案中，加入的SPA(優(yōu)選DB)的濃度為 1. 3-2. 2mM，如1. 4_2mM，如1. 4-1. 8mM，如1. 5-1. 6mM?；诒景l(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當清楚對于給定的收獲時的細胞密度，如何確定合適的SPA濃度窗。用于處理包含腺病毒的高細胞密度懸液(包含的細胞密度為10χ106-150χ106細胞 /mL)的DB的合適濃度為約1. 2mM-5mM。用于處理包含腺病毒的高細胞密度懸液(包含的細胞密度為10χ106-50χ106細胞/mL)的DB的合適濃度為約1. 3mM_2. 2mM。用于處理包含腺病毒的高細胞密度懸液收獲物(包含的細胞密度為10χ106-30χ106細胞/mL)為約1. 3_2mM， 如約 1. 4-1. 9mM,如約 1. 4-1. 8mM,如約 1. 4-1. 7mM,如約 1. 45-1. 65mM,如約 1. 5-1. 55mM。如本文對度米芬(DB)所示例的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解如何測試本文公開的 SPA的潛在代替物以鑒定有效地從腺病毒顆粒沉淀核酸分子和其他細胞碎片的化合物。因此，本發(fā)明部分地涉及從高細胞密度懸液純化腺病毒顆粒的方法。所述方法包括通過向裂解后宿主細胞培養(yǎng)基中加入選擇性沉淀劑來選擇性地從裂解后的高細胞密度懸液沉淀宿主細胞核酸分子。盡管從細胞懸液除去宿主細胞DNA的優(yōu)選方法為選擇性沉淀，但是本發(fā)明并不局限于此。除去宿主細胞DNA的任何其他方法也包括在本發(fā)明中。因此，在一實施方案中，將宿主細胞DNA破碎，即切成碎片。根據(jù)本發(fā)明，裂解后的宿主細胞DNA破碎可以通過向細胞懸液加入核酸酶來進行。適合用于本發(fā)明的示例性核酸酶包括Benzonase 、Pulmozyme 或者本領(lǐng)域中常用的任何其他DNase和/或RNase。 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，核酸酶為Benzonase ，其通過水解特定核苷酸之間的內(nèi)部磷酸二酯鍵而水解核酸，從而降低細胞裂解物的粘性。Benzonase 可以商購獲得，例如購自 Merck KGaA (編號 W214950)。充分破碎所需的核酸酶的濃度取決于，例如宿主細胞密度、反應(yīng)的溫度和時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何確定和優(yōu)化成功地破碎宿主細胞DNA所選的核酸酶濃度。膽然后將獲得自之前步驟的SPA處理的細胞裂解物澄清以除去沉淀的宿主細胞 DNA、細胞碎片和其他雜質(zhì)。如本文所示例的(實施例1)，用一步澄清方法直接從高細胞密度懸液純化腺病毒的嘗試導致低病毒回收率。收獲后所獲得的高細胞密度懸液中的雜質(zhì)濃度通常過高而不允許直接病毒純化。通常，如本領(lǐng)域通常使用和推薦以及如本文所示例的，合適的澄清需要至少兩個連續(xù)濾器的組合。我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)并在本文公開，通過利用TFF的澄清步驟合并DNA沉淀允許以高回收率從高細胞密度懸液純化病毒。單切向流過濾步驟足以從含病毒懸液除去細胞碎片和核酸沉淀物。沉淀超過95%的宿主細胞DNA，并且病毒回收率高于80%。因此，根據(jù)本發(fā)明可以使用TFF作為單澄清步驟。與本發(fā)明方法的原始裂解物(步驟a中獲得)相比， 用本發(fā)明方法獲得的澄清的含病毒懸液大量減少了宿主細胞DNA和其他雜質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，TFF設(shè)定中所用的濾器為例如來自GE Healthcare或JMs印arations 的中空纖維濾器；其他替代選擇為來自Millipore或Sartorius stedim biotech的平面篩 (flat screen)濾器。在所述TFF設(shè)定中，在滲透物中收集病毒顆粒，而細胞碎片、沉淀的宿主細胞DNA和其他雜質(zhì)則保留在滲余物中。本文中證實，中空纖維濾器非常適合于加工高細胞密度懸液。因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，用中空纖維濾器進行TFF。根據(jù)本發(fā)明，所述濾器的孔徑優(yōu)選為0. 1-1 μ m。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，孔徑為0. 2-0. 65 μ m。所述孔徑允許病毒顆粒通過膜，并使得細胞碎片、沉淀的宿主細胞DNA 和其他雜質(zhì)被濾器保留。優(yōu)選按照生產(chǎn)商的說明將濾器模塊用水預(yù)濕潤。利用管道和蠕動泵使液體通過模塊再循環(huán)。在本發(fā)明的某些實施方案中，TFF以交替切向過濾(ATF)的形式使用。ATF是切向流過濾的一種形式，并且本文發(fā)現(xiàn)利用ATF的澄清特別適合于從包含高濃度細胞碎片、宿主細胞DNA和其他雜質(zhì)的懸液回收病毒。切向流可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并例如描述于 US 6，544，424 的方法實現(xiàn)。使用 ATF 系統(tǒng)(如 ATF System, Refine Technology, Co.， East Hanover, NJ)的優(yōu)勢在于供料和滲余物流隨每次ATF泵循環(huán)(循環(huán)由加壓和排氣模式組成)而改變方向。這產(chǎn)生反相流清掃和跨過膜的連續(xù)改變的跨膜壓力(TMP)。在排氣中產(chǎn)生真空，其中一些材料從滲透物側(cè)回流至滲余物側(cè)，導致膜的清理。使用ATF會導致膜較少的污垢，從導致較高的病毒回收率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定最大收率的最優(yōu)ATF和滲透物流速。根據(jù)本發(fā)明，所述ATF系統(tǒng)中使用的濾器為例如來自GE healthcare的中空纖維
1 ' O使用ATF系統(tǒng)的另一優(yōu)勢在于用于澄清的設(shè)定可以更早地用于灌注模式培養(yǎng)細胞。連接至ATF系統(tǒng)的生物反應(yīng)器確實可以首先(in the first place)用于將細胞培養(yǎng)至高細胞密度。使用ATF灌注系統(tǒng)可以獲得超過ΙΟΟχΙΟ6活細胞/mL的極高細胞密度，例如通過使用PER. C6細胞(參見，例如Yallop et al，2005and WO 2005/095578)。一旦細胞達到高細胞密度，它們可以進行感染以獲得高度濃縮的含病毒細胞懸液。在整個過程匯中保持連接至生物反應(yīng)器的ATF系統(tǒng)隨后可以用于從所述高細胞密度懸液純化病毒。選擇性沉淀與通過TFF的澄清的組合除去至少70%、優(yōu)選至少80%并且甚至更優(yōu)選至少90%的收獲后獲得的高細胞密度裂解物中所含的宿主細胞DNA。進一步純化的方法在某些實施方案中，將收獲的病毒顆粒進一步純化。如WO 2005080556所述(其援引加入本文)，病毒的進一步純化可以在幾個步驟中進行，包括濃縮、超濾、滲濾或用色譜進行分離。也可以使用其他步驟，例如陰離子交換色譜、滅菌過濾、反相吸附、羥基磷灰石色譜。這些步驟例如公開于US73^5555，其援引加入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何發(fā)現(xiàn)每個純化步驟的最優(yōu)條件。此外，WO 98/22588描述了制備和純化病毒顆粒的方法，其援引加入本文。
在本發(fā)明的某些實施方案中，澄清的腺病毒顆粒懸液可以通過超濾進行處理。超濾用于濃縮病毒懸液。懸液可以濃縮5-20倍，并可以用核酸酶進行處理(如上文所述)。 本發(fā)明的另一方面是隨后通過滲濾引入離子交換緩沖液。利用超濾器的滲濾或緩沖液交換是一種除去和交換鹽、糖等的方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解緩沖液交換發(fā)生的條件以及何種緩沖液適合于這一步驟。所選的特定超濾膜會的大小足夠小以保留腺病毒顆粒，但是足夠大以有效地清除雜質(zhì)。取決于生產(chǎn)商和膜類型，IO-IOOOkDa的表觀分子量截止是合適的。 利用切向流模式的超濾是優(yōu)選的。在所述模式中，所述步驟可以通過設(shè)定具有或不具有滲余物返回上的背壓的固定錯流(cross-flow)、設(shè)定固定的跨膜壓力或者固定錯流和滲透物通量來控制。根據(jù)本發(fā)明，隨后步驟可以使陰離子交換色譜。在所述步驟中，腺病毒顆粒結(jié)合至帶正電荷的材料，如膜、筒或柱。隨后的洗脫允許從雜質(zhì)和剩余的宿主細胞DNA分離病毒顆粒。對于用Mustang Q膜吸附劑純化腺病毒，用于進樣和洗滌的NaCl濃度在pH 7. 5下任何時候大概可以為0. 3-0. 4M，并且在pH交替時可以變化。更優(yōu)選的NaCl濃度為0. 35M。 緩沖液的PH需要足夠高以使得腺病毒結(jié)合(大于約6. 5)。此外，緩沖體系的pH也應(yīng)當足夠低以避免病毒不穩(wěn)定?？捎玫木_最大PH取決于腺病毒特定的穩(wěn)定性譜和緩沖液組分， 并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員對于特定應(yīng)用而容易地確定。作為指導，當然并非限制，PH可以潛在地為約5-10。緩沖液中存在0. 1 % PS-80對于實現(xiàn)產(chǎn)物中的低殘留DNA水平是高度優(yōu)選的，因為這減弱腺病毒/DNA結(jié)合和腺病毒聚集。確定可以用于促進腺病毒顆粒與其他腺病毒以及各種細胞污染物解離的較高或較低洗滌劑濃度或替代性洗滌劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)實驗范圍內(nèi)。為方法的緩沖劑選擇替代性洗滌劑也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)實驗范圍內(nèi)。這樣的替代性洗滌劑的實例可見US 7326555.陰離子交換膜色譜產(chǎn)物，如I^ll (如 Mustang series)和Sartorius (如Sartobind系列)生產(chǎn)的那些適合于根據(jù)本發(fā)明來純化病毒。美國專利6，485，958或WO 05/080556描述了使用陰離子交換色譜來純化重組腺病毒。病毒對膜吸附劑如Mustang Q (Pall Corporation)的結(jié)合能力非常高，在 7xl013VP/ml數(shù)量級。適合于這種方法的腺病毒純化的其他膜吸附劑包括但不限于Source 15Q 禾口 Source 30Q(GE life sciences)、Q-Sepharose XL(GE life sciences)、Fractogel TMAE (EM industries)、Sartobind Q (Sartorius)、Adsept Q (Natrix separations)、CIM QA(BIA separations) 0優(yōu)選利用包含NaCl的緩沖液來進行腺病毒洗脫。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何優(yōu)化NaCl濃度。在某些實施方案中，優(yōu)選使用至少一個陰離子交換色譜步驟。陰離子交換色譜步驟后，腺病毒可以足夠純。然而，在某些實施方案中，進一步進行尺寸排阻色譜步驟以增加方法的穩(wěn)健性。這一步驟可以在陰離子交換色譜步驟之前或之后。顯然，其他純化步驟也可以合適地與陰離子交換色譜步驟組合。使用陰離子交換色譜進行腺病毒純化已經(jīng)得到廣泛描述，因此這一方面也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。許多不同的色譜基質(zhì)可以用于純化腺病毒，并且是合適的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地發(fā)現(xiàn)純化腺病毒的最優(yōu)陰離子交換材料。
在本發(fā)明的任何具體實施方案中，可以將陰離子交換產(chǎn)品滲濾入配置緩沖液中， 并滅菌過濾。或者，可以在滲濾之前或之后加入額外的色譜步驟(如陽離子交換)以潛在地改進雜質(zhì)和/或病毒/朊病毒清除的穩(wěn)健性。在這一階段還可以進行額外的超濾步驟。切向流超濾用于除去殘留的蛋白和核酸以及將腺病毒交換入配置緩沖液。收率與改進的雜質(zhì)清除之間的折衷使得選擇 300kDa-500kDa的膜。其他膜配置(如中空纖維)是可接受的替代。所選的超濾膜的大小足夠小以保留腺病毒顆粒，但是足夠大以有效地清除雜質(zhì)。 取決于生產(chǎn)商和膜類型，IOO-IOOOkDa的表觀分子量截止可以使合適的。所述方法可以包括滅菌過濾步驟，這有助于消除生物負荷。產(chǎn)物可以通過0. 22微米的改性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(如Millipore，Millipak)進行過濾。所述方法中可以加入任選的下游加工步驟。這些步驟可以包括，例如尺寸排阻色譜步驟、反相吸附步驟和/或羥基磷灰石色譜步驟。這些步驟的每一個的更多細節(jié)可以參見，例如 US 7326555, WO 03/097797、W002/44348。國際申請WO 97/08298描述了利用某些色譜基質(zhì)純化腺病毒以防止對病毒的損傷，包括陰離子交換和大小排阻步驟。如WO 2006/108707所公開的，某些超濾方法也非常適合于純化腺病毒。這樣的步驟可以除了某些色譜純化步驟之外或者代替某些色譜純化步驟進行。細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的放大和下游加工系統(tǒng)本發(fā)明的方法可以放大。本發(fā)明所用的細胞培養(yǎng)物從小規(guī)模培養(yǎng)物(如1-10升運行)至中等規(guī)模培養(yǎng)物(如20-1000L運行)，高達大規(guī)模商業(yè)制備物，如1000-50000L生產(chǎn)運行。初始方法步驟(裂解、深層過濾和超濾)隨培養(yǎng)體積而放大，而陰離子交換色譜和后續(xù)步驟則隨腺病毒顆粒輸入而放大。因此，后期步驟的大小基于至少IxlO12腺病毒顆粒 /mL(vp/mL)的生物反應(yīng)器的產(chǎn)率估計。這些高腺病毒收率可以例如通過感染高細胞密度培養(yǎng)物而獲得(例如EP08168181.9所述)。這些含高濃度腺病毒顆粒的高密度細胞懸液的進一步純化可以利用本發(fā)明進行。加工包含大量細胞碎片和宿主細胞DNA的這些懸液的可能性允許純化每體積懸液的大量腺病毒顆粒。本發(fā)明的優(yōu)點在于提供一種加工包含高濃度腺病毒顆粒的高細胞密度細胞培養(yǎng)物批次的方法，從而允許每加工體積的非常高的病毒收率。盡管應(yīng)用于大規(guī)模細胞培養(yǎng)物的本發(fā)明方法允許較小規(guī)模培養(yǎng)細胞，但是也應(yīng)用于較高細胞密度，并達到高腺病毒收率，其可以有效地進一步加工。所述方法提供加工高度濃縮的腺病毒批次的可能性，這對整個腺病毒純化工業(yè)會產(chǎn)生極大影響。腺病毒和生產(chǎn)細胞本發(fā)明涉及腺病毒的純化。本發(fā)明的腺病毒可以使任何野生型、修飾的、突變的腺病毒和/或重組腺病毒載體。基因疫苗和/或基因治療應(yīng)用中引起特別關(guān)注的是使用第一或第二代復制缺陷型腺病毒，帶有El或其他缺失，包括“空殼(gutless)”腺病毒載體。腺病毒基因組通常與人的良性病理有關(guān)。基因組可進行操作，這取決于構(gòu)建各自載體所用的策略。復制缺陷病毒如重組腺病毒35(rAd3Q或沈(^(126)載體(如本文示例)要求彌補 (complement)所述缺失的生產(chǎn)細胞系。生產(chǎn)細胞(有時在本領(lǐng)域和本文中稱為“包裝細胞”或“補充細胞”或“宿主細胞”) 可以使任何生產(chǎn)細胞，其中可以增殖期望的腺病毒。例如，在互補腺病毒缺陷的生產(chǎn)細胞中進行重組腺病毒載體的增殖。這樣的生產(chǎn)細胞優(yōu)選在其基因組中具有至少腺病毒El序列， 由此能夠互補重組腺病毒El區(qū)中的缺失。另外，腺病毒可以在E3區(qū)中具有缺失，其對于Ad 基因組并非必需的，因此，這樣的缺失不必被互補?？梢允褂萌魏蜤l互補型生產(chǎn)細胞，例如通過El永生化的人視網(wǎng)膜細胞，如911或PER. C6細胞(參見美國專利5，994，128) ；El-轉(zhuǎn)化的羊水細胞(參見歐洲專利1230354) ；El-轉(zhuǎn)化的A549細胞(參見，例如WO 98/39411、 美國專利 5，891，690) ；GH329 =HeLa (Gao et al，2000，Human Gene Therapy 11 :213-219)， 293等。在某些實施方案中，所述生產(chǎn)細胞為例如HEK293細胞、或PER. C6細胞、或911細胞、IT293SF細胞等。優(yōu)選將PER. C6細胞(ECACC，保藏號9602^40，1996年2月四日保藏于 ECACC，CAMR, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, United Kingdom ；參見美國專利 5，994，128)或由其衍生的細胞用作生產(chǎn)細胞。復制缺陷腺病毒載體可以利用作為載體DNA來源的腺病毒或嵌合腺病毒的任何物種、菌株、亞型或者物種、菌株、亞型的混合物產(chǎn)生(參見for instance WO 96/26281,WO 00/030 )，其例如可以提供能夠感染某些期望細胞類型的腺病毒載體。在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，rAd35或rAc^6用作腺病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解利用例如公開于美國專利6，492，169或W003/104467及其中的參考文獻所公開的方法來在特定宿主細胞上增殖不同血清型的腺病毒載體的可能性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，對于El-缺陷的rAd35的增殖，可以構(gòu)建表達Ad35的 Ε1Β-5^(的特定生產(chǎn)細胞，例如基于表達Ad5的ElA和ElB的現(xiàn)有生產(chǎn)細胞，例如PER. C6或 HEK293細胞(參見，例如US 6，492，169)?；蛘咔覂?yōu)選地，例如WO 03/104467充分公開的 (其援引加入本文)，通過將Ad5的E4-orf6編碼序列引入rAd35或rAc^6載體，可以使用現(xiàn)有的(Ad5_)互補細胞系(例如PER. C6或HEK293)無需細胞的修飾而用于El-缺陷的 rAd35或rAd26的增殖。因此，任何血清型的腺病毒載體的增殖可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的手段和方法在生產(chǎn)細胞上進行。腺病毒載體、其構(gòu)建方法及其增殖方法為本領(lǐng)域公知，并描述于例如 U. S. Pat. Nos. 5，559，099，5，837，511，5，846，782，5，851，806，5，994，106， 5, 994, 128,5, 965, 541,5, 981, 225,6, 040, 174,6, 020, 191,和 6,113,913 以及 Thomas Shenk, “ Adenoviridae and their Replication" , Μ. S. Horwitz, " Adenoviruses“, Chapters 67 and 68, respectively, in Virology, B. N. Fields et al. , eds. , 3d ed., Raven Press, Ltd. , New York(1996)，及其中所描述的其他參考文獻。在以下實施例中進一步解釋本發(fā)明。這些實施例并不以任何方式限制本發(fā)明而僅用于示例本發(fā)明。
實施例實施例1 直接TFF澄清對于高細胞密度收獲物不起作用使PER. C6細胞于37°C下生長于生物反應(yīng)器中，并用Ad35在無血清培養(yǎng)基中感染 3天。在20-30xl06細胞/ml的細胞密度和1_1. 5xl012VP/ml的病毒滴度時收獲細胞。病毒在加入非離子洗滌劑Triton X-100和Tween_80至終濃度各自為0. 和0.05%時從細胞釋放。裂解時間為2-Mhr。裂解后，通過切向流過濾(TFF)澄清含病毒收獲物。禾Ij用 0. 2 μ m (GE Healthcare, CFP-2-E-4MA Μ, 0.042m2)或 a 0. 65 μ m(GEHealthcare, CFP-6-D-4MA型，0. 046m2)中空纖維濾器進行澄清。將1升裂解的收獲物濃縮至少3倍。澄清后，利用3倍的滲余物體積，在放氣(bleed)和進料操作中進行沖洗。過濾實驗以15-40LMH的滲透物通量進行。在下表中測定澄清步驟的病毒回收率。表 1
實驗
#
方法參數(shù)性能參數(shù)
孔徑細胞密病毒滴度沉淀 的HC-DNA病毒回病毒回收整體病毒 (μιη)度 (xlO11 HC-DNA(%) (ng/lxlO11 收率 ppt 濾澄清(％)回收率(％) (xlO6 細 VP/ml)vp)(%)
胞/ml)
10.2 29.2 11.4 未進行未進行未進行 OO
20.65 20.1 15未進行未進行未進行 OO澄清后無病毒回收。這有些出人意料，因為EP1371723和W02006/052302描述了
將TFF成功地用于腺病毒收獲物的澄清。顯然，該方法的高細胞密度妨礙這一步驟，并使得 TFF不適合于直接澄清。實施例2 高細胞密度懸液中的選擇性宿主細胞DNA沉淀現(xiàn)有技術(shù)(Goerkeet al (2005),US7326555)證實了對于高達 IxlO6細胞/ml 的細胞密度的選擇性宿主細胞DNA沉淀。其中證實，(在低細胞密度下)，至少80%的宿主細胞 DNA從細胞懸液沉淀，并且病毒顆粒的回收率為90%。然而，目前完全不了解這樣的選擇性沉淀在高細胞密度下是否可行，因為這樣的細胞懸液會包含高得多的量的宿主細胞DNA和細胞碎片，因此預(yù)期需要高得多的量的DNA沉淀劑，而從現(xiàn)有技術(shù)外推的數(shù)據(jù)建議這樣更高濃度的DNA沉淀劑也會沉淀腺病毒。為了研究高細胞密度下DNA沉淀的可能性，在包含高達30xl06細胞/ml的細胞密度的小規(guī)模試管中測試宿主細胞DNA沉淀。小規(guī)模試管模型用作快速篩選以測試選擇性 DNA沉淀在高細胞密度下是否仍然發(fā)生。使PER. C6細胞在生物反應(yīng)器中生長，用腺病毒35 感染，并于37°C下在無血清培養(yǎng)基中生長3天。在2-30xl06細胞/ml的細胞密度和8χ101(ι-1. 5xl012VP/ml的病毒滴度時收獲細胞。通過加入非離子洗滌劑Triton X-100和Tween-80至終濃度各自為0. 1% 和0. 05%，細胞裂解進行2- 小時(hr)。向3. 5ml裂解的收獲物中加入40mM NaCl中的漸增濃度的度米芬(DB)，然后立即渦旋1分鐘。用0. 45μπι聚偏二氟乙烯(PVDF)注射器濾器除去沉淀的材料。分別利用HPLC-AEX和Q-PCR分析濾液的Ad35和宿主細胞DNA濃度。圖1示出對度米芬濃度作圖的病毒回收率和沉淀的宿主細胞DNA。三角形標示的曲線獲得自細胞密度為2.5x106-3.5xl06細胞/ml的細胞培養(yǎng)收獲物。圓形標示的曲線獲得自細胞密度為20xl06-30xl06細胞/ml的細胞培養(yǎng)收獲物。在圖中高亮低和高細胞密度以及相關(guān)百分比的沉淀的宿主細胞DNA的Cf (表現(xiàn)出90%病毒回收率的度米芬濃度)。在20χ106-30χ106細胞/ml的細胞密度下，沉淀超過90 %的宿主細胞DNA所需的 DB濃度與低10倍的細胞密度所需的DB濃度相比增加至少2. 5倍。令人驚訝地，如在較低細胞密度獲得的曲線外推所預(yù)期的，增加的DB濃度不沉淀病毒顆粒。用細胞密度為18x106-25X106細胞/ml的細胞培養(yǎng)收獲物重復實驗。圖2示出對度米芬濃度作圖的病毒回收率和沉淀的宿主細胞DNA。三角形標示的曲線獲得自細胞密度為2. 5x106-3. 5X106細胞/ml的細胞培養(yǎng)收獲物。圓形標示的曲線獲得自細胞密度為18Χ106-2&106細胞/ml的細胞培養(yǎng)收獲物。在圖中高亮低和高細胞密度以及相關(guān)百分比的沉淀的宿主細胞DNA的Cf (表現(xiàn)出90%病毒回收率的度米芬濃度)。如圖1和2中的圖可知，對于高細胞密度懸液表現(xiàn)出90%病毒回收率的DB濃度 (C*)在各個實驗中略有不同，這是正常偏差的一部分。然而，圖一致地證實，在高細胞密度下DNA的選擇性沉淀也是可以的，并且SPA (在本文中為DB)的合適濃度明顯高于低細胞密度培養(yǎng)物，但是遠低于基于外推所預(yù)期的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，對于選擇性沉淀劑的合適濃度，存在范圍而不是固定的點，并且基于本文的公開可以發(fā)現(xiàn)合適的范圍。例如，對于處理包含約10χ106-30Χ106細胞/mL的細胞密度的含腺病毒高細胞密度懸液收獲物，合適的DB濃度為約1. 3-2mM?；谶@些結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在了解，DNA沉淀可以外推至含腺病毒懸液，其包含甚至更高的細胞密度，如約40xl06細胞/mL，如約50xl06細胞/mL，如高達約IOOxIO6細胞/mL，如高達約150xl06細胞/mL;并且來自這樣的高細胞密度懸液的腺病毒可以用本發(fā)明的方法進行純化。因此，根據(jù)本發(fā)明，在從高細胞密度懸液純化腺病毒顆粒中可以使用選擇性DNA 沉淀。實施例3 較大規(guī)模的高細胞密度懸液中的選擇性宿主細胞DNA沉淀以0. 5L-20L的規(guī)模測試DNA沉淀。DNA沉淀所用的DB濃度基于之前的實驗結(jié)果 (圖2)。使用約80%的在小規(guī)模試管模型中所測定的Cf濃度。在灌注模式中，用ATF系統(tǒng)進行的灌注在約2. 5xl06總細胞/mL的細胞密度接種后4天開始。灌注14天后，將細胞懸液用新鮮的無血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中稀釋至細胞密度為約13xl06細胞/mL。隨后，將生物反應(yīng)器用Ad35病毒感染。ATF系統(tǒng)在感染后5小時開始，培養(yǎng)基更新率為每天2容器體積。3天(感染后)后收獲細胞。收獲時的細胞密度 (CDAH)示于表2。收獲之后，通過加入非離子洗滌劑Triton X-100和Tween-80至終濃度各自為 0. 和0. 05%將細胞裂解2-M小時。向裂解的收獲物加入度米芬至終濃度為40mM NaCl 中的0. 72mM和1.52mM。將沉淀的裂解物利用不同孔徑的兩個連續(xù)的載樣的(charged)深層過濾器澄清。兩個濾器估計的孔徑分別為 10- 5 ym(Millistak+CE20)and 1- 0.2ym(Cuno Zeta plus 50CP)。第一濾器用于除去大細胞碎片和雜質(zhì)。所述預(yù)過濾后，第二濾器用于除去剩余的雜質(zhì)和從含病毒懸液沉淀的DNA。以100 LMH(升/平方米/小時) 的恒定通量進行澄清，直至壓力達到5psi。表2示出方法參數(shù)和純化方法的結(jié)果。利用8種不同的收獲物進行裂解、DNA沉淀(DNA ptt)和澄清，這些收獲物在體積、收獲時的細胞密度和病毒滴度上不同。收獲物取自2L或IOL生物反應(yīng)器。測定了沉淀步驟的沉淀的宿主細胞DNA(HC-DNA)和病毒回收率。表 2實驗方法參數(shù)結(jié)果
DNAppt澄清
# CDAH病毒滴度DB 步驟回收率(％)步驟回收率(％) HC-DNA
(xlO6 細胞/ml) (xlO11 VP/ml) (mM)減少(％)
11.362.13928699.6
22.472.240.72 918699.9
32.371.85909099.2
49.16.7699799.9
518.68.9889899.8
620.1151.52 908298.3
716.711997199.9
825.815.91049299.8結(jié)論是高細胞密度時的選擇性宿主細胞DNA沉淀是可以的。確實，盡管增加DB濃度0倍)，但是病毒顆粒仍保持未沉淀(參見，回收率高于70%)，并且HC-DNA減少高于 98%。這個過程提供一種從高細胞密度培養(yǎng)物棄去宿主細胞DNA而不損害病毒回收率的方法。在本文中，其允許加工大體積的高細胞密度懸液，這是工業(yè)方法所亟需的。應(yīng)當注意，由于實際原因，在實驗4-8中將單DB濃度(1. 52mM)用于選擇性DNA沉淀。所述實驗表明，具有寬范圍(9. 1x106-25. 8xl06vc/ml)細胞密度的含腺病毒懸液可以用 1.52mM的DB進行處理。這與上文的觀點是一致的，即選擇性沉淀劑的合適濃度與細胞密度之間的關(guān)系并非非常固定，而是提供變體從而一系列的沉淀劑濃度對于給定的細胞密度是合適的。用于處理包含10χ106-50Χ106細胞/mL的細胞密度的含腺病毒高細胞密度懸液的 DB的合適濃度為約1. 3mM-2. 2mM。用于處理包含10xl06_30xl06細胞/mL的細胞密度的含腺病毒高細胞密度懸液收獲物的DB的合適濃度為約1. 3-2mM。應(yīng)當注意，對于一些高細胞密度(實驗#6和7)實驗，觀察到與低細胞密度收獲物相比，在第二濾器觀察到降低的病毒回收率和濾器能力。此外，使用兩個連續(xù)的不同濾器使得方法需密集勞力且昂貴。實施例4 通過選擇性宿主細胞DNA沉淀然后TFF的高細胞密度腺病毒制備物的
單步驟澄清使PER. C6細胞生長于灌注生物反應(yīng)器中，用Ad35感染，并于36°C下在無血清培養(yǎng)基中生長3天。在20-30xl06細胞/ml的細胞密度和1_1. 5xl012 VP/ml的病毒滴度時收獲細胞。加入非離子洗滌劑Triton X-100和Tween_80至終濃度各自為0. 1和0. 05%時病毒從高細胞釋放。裂解時間為2-24小時。細胞裂解后，進行DNA沉淀步驟，然后進行澄清。利用40mM NaCl中的0. 063 % -0. 077 %的度米芬(DB)進行DNA沉淀。以 0. 17-1. 52m/s-1的攪拌速度進行DNA沉淀!3hr，并且DB的加入時間為池。澄清利用切向流過濾，通過0. 65 μ m(GE Healthcare, CFP-6-D-4MA型，0. 046m2)中空纖維濾器進行。將1升裂解和DNA沉淀的收獲物濃縮至少3倍。澄清后，利用3倍的滲余物體積，在放氣和進料操作中進行沖洗。過濾實驗以15-40LMH的滲透物通量進行。裂解及隨后的DNA沉淀和澄清利用3種不同的收獲物進行。表3中測定選擇性沉淀和澄清后的沉淀的宿主細胞DNA百分比、每IxlO11病毒顆粒的宿主細胞DNA濃度和病毒回收率。
表3
實驗方法參數(shù)方法參數(shù)
# 細胞密病毒滴度沉淀的 HC-DNA 病毒回收病毒回收率整體病毒回度 (XlOllVPZml)HC-DNA (ng/lxlO11 率 ppt(%)澄清(％) 收率(％) (xlO6(%)vp)
細胞 /ml)
120.114.11008.6889987217.917.499.96.91107481.4323.515.399.923.810081.281.2與之前的實施例類似，本文出人意料地表明高細胞密度時的選擇性DNA沉淀是可以的。確實，盡管增加DB濃度，但是病毒顆粒仍保持未沉淀(參見，回收率高于80%)，并且HC-DNA減少高于99 %。盡管在實施例1中未能成功，但是在此實施例中證實，當與選擇性HC-DNA沉淀組合時，切向流過濾允許澄清高細胞密度懸液。使用切向流過濾代替一組兩個不同深層過濾器(如之前所示例)提供在單過濾步驟中將高細胞密度懸液加工為澄清的腺病毒懸液的可能性。選擇性HC-DNA沉淀與使用切向流過濾的組合允許從高細胞密度懸液收獲物除去宿主細胞DNA，并且出人意料地并不損害腺病毒回收率。實際上，利用所述方法的整體腺病毒回收率甚至可以高于利用深層過濾器的經(jīng)典兩步澄清過濾方法。另外，與使用深層過濾器的方法相比，所述方法使得純化過程勞動強度較低并且經(jīng)濟。在本文中，所述方法允許加工大體積的高細胞密度懸液，這也是工業(yè)方法所亟需的。參考文獻Cortin V, Thibault J, Jacob D, Gamier A. High-Titer Adenovirus Vector Production in 293S Cell Perfusion Culture. Biotechnol. Prog. 2004.Goerke A, To B, Lee A, Sagar S, Konz K. Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA. Biotechnology and bioengineering, Vol. 91, No. 1, July 5,2005.Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusion Cultures of Human Tumor Cells :A Scalable Production Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors. Biotechnol. Bioengin. 86 :637-641(2004).
權(quán)利要求
1.一種從細胞懸液純化腺病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟a)將所述細胞懸液中的細胞裂解；b)將所述細胞懸液中的宿主細胞DNA破碎和/或沉淀；c)通過切向流過濾對得自步驟b)的細胞懸液進行澄清，以獲得純化的腺病毒懸液， 所述方法的特征在于所述細胞懸液的細胞密度范圍為5x106-150xl06細胞/ml。
2.如權(quán)利要求1所述的純化腺病毒顆粒的方法，其中步驟b)中的所述沉淀是通過加入選擇性沉淀劑來從所述病毒顆粒選擇性地沉淀宿主細胞DNA而進行的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選擇性沉淀劑為度米芬(DB)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中度米芬(DB)的濃度范圍為1.2-5mM。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細胞密度范圍為約10xl06-30xl06細胞/ml，并且度米芬(DB)的濃度范圍為1. 3-2mM。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中用孔徑范圍為0.1-0. 65 μ m的膜來進行所述切向流過濾。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中用中空纖維進行所述切向流過濾。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中用ATF系統(tǒng)進行所述切向流過濾。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中在所述純化的腺病毒懸液中至少已除去 80%的宿主細胞DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供利用宿主細胞DNA破碎和/或沉淀，然后進行使用切向流過濾的澄清步驟從高細胞密度懸液大規(guī)模純化腺病毒的方法。
文檔編號C12N7/02GK102575233SQ201080046353
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者M·L·德沃克特, M·維斯特拉 申請人:克魯塞爾荷蘭公司