專利名稱：在堿預(yù)處理后改善木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)釋放單糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及由木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)制備糖的一般領(lǐng)域。具體地講，本公開提供了對(duì)生物質(zhì)的預(yù)處理后和糖化以增進(jìn)單糖釋放的方法。所制得的可發(fā)酵糖可用于制備目標(biāo)產(chǎn)物。發(fā)明背景 纖維質(zhì)和木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)以及垃圾,例如農(nóng)業(yè)殘余物、木材、林業(yè)垃圾、來自造紙業(yè)的淤渣和市政及工業(yè)固體垃圾，提供了潛力巨大的可再生原料以用于生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品例如燃料和其它化學(xué)品。纖維質(zhì)和木質(zhì)纖維質(zhì)的原料和垃圾由包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的碳水化合物聚合物(多糖)組成，并且一般通過多種化學(xué)方法、機(jī)械方法和酶法處理以釋放出己糖和戊糖單糖，所述單糖隨后可通過生物催化劑發(fā)酵而制成可用的產(chǎn)品。預(yù)處理的方法通常用于使木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)的多糖更容易地被纖維素分解酶處理。多糖纖維素分解處理的一個(gè)主要障礙是存在限制酶作用于它們的底物以及用作酶非生產(chǎn)性結(jié)合的表面的木質(zhì)素障礙物。由于糖化過程中酶的高成本，希望通過鈍化木質(zhì)素對(duì)酶的吸附或者通過萃取移除木質(zhì)素以使載酶量最小化。另一個(gè)挑戰(zhàn)是由于半纖維素和木質(zhì)素對(duì)纖維素的保護(hù)或由于纖維素的結(jié)晶度導(dǎo)致的酶水解對(duì)纖維素的難以接近性。試圖克服這些挑戰(zhàn)的預(yù)處理方法包括蒸汽爆破、熱水、稀酸、氨纖維爆破、堿解(包括氨回收滲濾)、氧化去木質(zhì)素和使用有機(jī)溶劑。氨預(yù)處理的實(shí)例包括稀釋氨水(DAA ;共同持有并且共同未決的美國專利申請(qǐng)公布 US20070031918A1)、氨回收滲濾(ARP ;Kim T. H.等人，“Bioresource Technol. ”，90 :39-47,2003 ；Kim, T.，和 Lee, Y. Y.，“Bioresource Technol. ”，96 :2007-2013,2005 ；Kim.T.H.等人，“Appl. Biochem. Biotechnol. ”,133 :41-57,2006)和在氨水中浸泡(SAA, Kim,T. H.，和 Lee, Y. Y.，“Appl. Biochem. Biotechnol. ”, 136-140 :81-92, 2007)。在預(yù)處理步驟之后，生物質(zhì)在糖化酶的存在下進(jìn)一步水解以由生物質(zhì)釋放低聚糖和/或單糖，其可用于制備目標(biāo)產(chǎn)物，例如通過發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。糖化酶和生物質(zhì)處理方法已由 Lynd, L. R.等人綜述(“Microbiol. Mol. Biol. Rev. ”，66 :506-577, 2002)。生物質(zhì)的預(yù)處理和糖化應(yīng)獲得包含高濃度可發(fā)酵糖的生物質(zhì)水解產(chǎn)物以提供用于生產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)制品的經(jīng)濟(jì)型方法的基礎(chǔ)。在準(zhǔn)備糖化時(shí)預(yù)處理木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是使碳水化合物(纖維素和半纖維素)損失最小化，同時(shí)使其酶水解可達(dá)性最大化。而且，在氨水預(yù)處理過程期間，除了半纖維素和纖維素以外，還可釋放多種其它組分，這可影響糖化酶的作用，從而降低糖化后生成的單糖的收率。因此，待解決的問題是研發(fā)處理生物質(zhì)的高性價(jià)比方法，所述方法保留碳水化合物并且減少糖化中的干擾以制備富含可發(fā)酵糖的水解產(chǎn)物，同時(shí)使糖化酶的用量最小化。發(fā)明概沭
本發(fā)明提供了處理生物質(zhì)以制備可發(fā)酵糖的方法，所述方法涉及首先用堿處理生物質(zhì)，然后是洗滌和/或干燥步驟中的一個(gè)或兩個(gè)，以及與至少一種化學(xué)添加劑存在下的酶糖化相結(jié)合。這些步驟的組合改善了得自生物質(zhì)的可發(fā)酵單糖的收率。因此，本發(fā)明提供了由預(yù)處理過的生物質(zhì)制備可發(fā)酵糖的方法，所述方法包括a)提供預(yù)處理過的生物質(zhì)，其中所述預(yù)處理過的生物質(zhì)已經(jīng)經(jīng)受堿預(yù)處理過程；b)使所述預(yù)處理過的生物質(zhì)經(jīng)受預(yù)處理后的過程，所述過程選自洗滌、干燥以及它們的組合，從而制得預(yù)處理后的生物質(zhì)；以及c)在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，使步驟(b)中的所述預(yù)處理后的生物質(zhì)接觸至少一種糖化酶以及一種或多種化學(xué)添加劑以制得可發(fā)酵糖，所述化學(xué)添加劑選自烷撐二醇、天然油和非離子表面活性劑。附圖
簡沭 圖IA和IB圖IA是示出了稀氨水預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所述玉米芯未被洗滌且未被干燥，但是在存在或不存在2%重量/重量的PEG8000的情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。圖IB是示出了稀氨水預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所述玉米芯被洗滌過但是未被干燥，并且在存在或不存在2%重量/重量的PEG8000的情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。圖2A和2B圖2A是示出了稀氨水預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所述玉米芯未被洗滌但是被干燥，然后在存在或不存在2%重量/重量的PEG8000的情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。圖2B是示出了稀氨水預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所述玉米芯被洗滌且被干燥，然后在存在或不存在2%重量/重量的PEG8000情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表
/Jn o圖3是示出了氨懸浮液預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所沭玉米芯被洗滌過，然后在存在或不存在2%重量/重量的PEG8000情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。圖4A和4B圖4A是示出了氨懸浮液預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所述玉米芯未被洗滌但是被干燥，然后在存在或不存在2%重量/重量的PEG8000情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。圖4B是示出了氨懸浮液預(yù)處理過的玉米芯的木糖和葡萄糖收率的圖，所述玉米芯被洗滌、干燥，然后在存在或不存在2 %重量/重量的PEG8000情況下，使用不同的糖化酶載量來糖化。收率以占原玉米芯中的葡聚糖或木聚糖的百分比表示。發(fā)明詳述申請(qǐng)人:特別地在該公開中并入了所有引用的參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容。除非另行指出，所有百分?jǐn)?shù)、份數(shù)、比率等均按重量計(jì)。商標(biāo)以大寫體標(biāo)示。此外，當(dāng)數(shù)量、濃度或其它數(shù)值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選的范圍或優(yōu)選的上限數(shù)值和優(yōu)選的下限數(shù)值的列表形式給出時(shí)，其應(yīng)被理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選的數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選的數(shù)值的任何一對(duì)所構(gòu)成的所有范圍，而不管所述范圍是否被單獨(dú)地公開。除非另行指出，凡在本文中給出某一數(shù)值范圍之處，該范圍均旨在包含其端點(diǎn)，以及位于該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。當(dāng)定義一個(gè)范圍時(shí)，不旨在將本發(fā)明的范圍限定于所列舉的具體值。
本發(fā)明方法提供了應(yīng)用于堿預(yù)處理過的木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)同時(shí)在糖化中包括化學(xué)添加劑的過程，以改善得自預(yù)處理過的生物質(zhì)的可發(fā)酵糖的收率。本發(fā)明方法還提供了低濃度的糖化酶用于由預(yù)處理后的生物質(zhì)制得高收率的易于發(fā)酵的單糖的用途。此類易發(fā)酵的糖可用于制備多種目標(biāo)化學(xué)制品或產(chǎn)品。定義本文采用下列定義“生物質(zhì)”和“木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)”互換使用，并且如本文所用，是指任何木質(zhì)纖維質(zhì)材料，包括纖維質(zhì)的和半纖維質(zhì)的材料，例如生物能作物、農(nóng)業(yè)殘余物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、庭院垃圾、木材、林業(yè)垃圾以及它們的組合,并且進(jìn)一步描述于下文中。生物質(zhì)具有包括多糖和低聚糖在內(nèi)的碳水化合物成分并且還可包含附加組分，例如蛋白質(zhì)和/或類脂。如本文所用，“堿預(yù)處理過的生物質(zhì)”是指已經(jīng)經(jīng)受堿預(yù)處理過程的任何生物質(zhì)。任何已知的堿預(yù)處理過程均是適宜的，包括在用于準(zhǔn)備酶糖化以制得可發(fā)酵單糖時(shí)，將木 質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)懸浮于堿水或堿的水溶液/溶劑溶液中以釋放纖維素材料的過程。如本文所用，“預(yù)處理過的生物質(zhì)”是指糖化之前已經(jīng)經(jīng)受處理以改善糖化效果的生物質(zhì)。預(yù)處理過的生物質(zhì)可包含碎裂的木質(zhì)素、氨水或其它預(yù)處理化學(xué)制品、附加的堿、半纖維素、纖維素、糖、蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或其它組分?！盎旧媳Ａ粝聛怼敝荚谏婕邦A(yù)處理后的加工期間沒有損失的碳水化合物的量，并且是預(yù)處理過的生物質(zhì)中碳水化合物的原有量的至少約50 %，60 %，70 %，80 %，或90 %。與用于糖化預(yù)處理后的生物質(zhì)的酶載量相關(guān)的“顯著減少”是指達(dá)到一定可發(fā)酵單糖收率所需的糖化酶聚生體的量或濃度，通常表示為每單位質(zhì)量碳水化合物的酶質(zhì)量，或每單位生物質(zhì)干質(zhì)量的酶質(zhì)量。例如，就堿預(yù)處理后經(jīng)受本發(fā)明方法的生物質(zhì)而言，與沒有經(jīng)受本文所述工序的預(yù)處理過而糖化的生物質(zhì)相比，釋放一定單糖收率所需的糖化酶聚生體載量可減少至少約 2%，4%，6%，8%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，或 60%。“預(yù)處理后的加工”是指任何初始?jí)A預(yù)處理過程后進(jìn)行的工序并且包括洗滌、干燥和/或它們的組合，從而制得預(yù)處理后的生物質(zhì)。如本文所用，“預(yù)處理后的生物質(zhì)”是指經(jīng)受上文所定義的預(yù)處理后加工的預(yù)處理過的生物質(zhì)。與糖化相關(guān)的“在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下”是指在一定的pH范圍、溫度和反應(yīng)混合物離子強(qiáng)度下使預(yù)處理后的生物質(zhì)與糖化酶接觸，以及糖化酶將至多100%的可轉(zhuǎn)化的預(yù)處理后的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖所需的時(shí)間。適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件可包括通過槽罐反應(yīng)器(如豎式槽罐反應(yīng)器)內(nèi)攪拌器系統(tǒng)(包括但不限于葉輪)的作用進(jìn)行的混合或攪拌?；旌匣驍嚢杩蔀檫B續(xù)的或不連續(xù)的，例如由加入附加組分或溫度和PH評(píng)估引起的中斷。“糖化”是指通過水解酶的作用由生物質(zhì)多糖制得可發(fā)酵糖。通過經(jīng)由纖維素酶和半纖維素酶作用的酶糖化而由預(yù)處理后的生物質(zhì)制得可發(fā)酵糖?！疤腔妇凵w”是指能夠作用于生物質(zhì)混合物以制得可發(fā)酵糖的酶的組合。通常，糖化酶聚生體可包括一種或多種糖苷酶，其選自纖維素-水解糖苷酶、半纖維素-水解糖苷酶和淀粉-水解糖苷酶。糖化酶聚生體中的其它酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶?！翱砂l(fā)酵糖”是指發(fā)酵過程中能夠被微生物用作碳源以制得目標(biāo)產(chǎn)物的糖，尤其是
單糖和二糖。如本文所用，“指定的可發(fā)酵糖收率”是指特定的目標(biāo)可發(fā)酵糖收率，例如酶糖化后獲得至少約40% (按生物質(zhì)干重計(jì))的可發(fā)酵單糖?！澳举|(zhì)纖維質(zhì)”是指包含木質(zhì)素和纖維素的組合物。木質(zhì)纖維質(zhì)的材料也可包含半纖維素。“纖維質(zhì)”是指包含纖維素的組合物。生物質(zhì)“干重”是指移除全部或基本上全部水分后的生物質(zhì)的重量。干重通常依 照美國材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)標(biāo)準(zhǔn)E1756-01 (Standard Test Method for Determinationof Total Solids in Biomass)或紙衆(zhòng)與造紙工業(yè)技術(shù)協(xié)會(huì)，Inc. (TAPPI)標(biāo)準(zhǔn)T-412om-02 (Moisture in Pulp, Paper and Paperboard)進(jìn)行測量?！澳繕?biāo)產(chǎn)物”和“目標(biāo)化學(xué)制品”互換使用，并且是指通過發(fā)酵制得的化學(xué)制品、燃料、或化學(xué)構(gòu)建單元。此外，目標(biāo)產(chǎn)物被廣義地使用并且可包括分子例如蛋白質(zhì)、肽、酶和抗體。目標(biāo)產(chǎn)物和目標(biāo)化學(xué)制品的定義中還設(shè)想的是乙醇、丁醇和其它化合物。“堿性”是指pH大于7. O?！疤烊挥汀笔侵柑烊淮嬖诘娜魏渭兊幕虿患兊挠?，例如植物油、大豆油、玉米油、或作為生物食品副產(chǎn)物或農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物而留下來的任何油。“單糖”包括具有單個(gè)戊糖或己糖單元的糖，例如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。如本文所用，“協(xié)同改善”是指當(dāng)將因素組合時(shí)獲得大于預(yù)期改善的改善度，所述預(yù)期改善是每個(gè)單獨(dú)因素的單獨(dú)改善之和。如本文所用，“發(fā)酵”是指通過選定的微生物將由預(yù)處理后的并且糖化的生物質(zhì)釋放的單糖轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化學(xué)制品。如本文所用，“洗滌”是指使用水或有機(jī)/含水混合物來洗滌預(yù)處理過的堿性生物質(zhì)。如本文所用，“干燥”是指在糖化之前，將可能已經(jīng)洗滌過的預(yù)處理過的生物質(zhì)懸浮液干燥至60-99. 9%干固體?？蓪⑸镔|(zhì)風(fēng)干，或在烘箱中采用高達(dá)110°C的溫度干燥。如本文所用，“發(fā)酵微生物”或“生物催化劑”是指適于通過糖的發(fā)酵制得期望的目標(biāo)產(chǎn)物的任何有氧或厭氧原核或真核微生物。根據(jù)本發(fā)明，適宜的微生物將糖例如木糖和/或葡萄糖直接地或間接地轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)物。微生物可自然而然地制得產(chǎn)物，或可被轉(zhuǎn)基因以制得所需的產(chǎn)物。此類微生物的實(shí)例包括但不限于真菌例如酵母和細(xì)菌。優(yōu)選的酵母包括下列菌株糖酵母屬物種，具體地講為啤酒糖酵母或葡萄汁酵母；或畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母例如樹干畢赤酵母CBS 5773 ;或假絲酵母屬，具體地講為產(chǎn)朊假絲酵母、迪丹假絲酵母、或博伊丁假絲酵母，其能夠?qū)⑵咸烟呛湍咎前l(fā)酵成乙醇。其它設(shè)想的微生物包括但不限于下列屬種的成員發(fā)酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、足球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽胞桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬和漢遜酵母屬。提供了用于預(yù)處理后加工堿性預(yù)處理過的木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)以及糖化所述生物質(zhì)的方法。本文所述方法使糖化所需的糖化酶的濃度最小化并且同時(shí)改善了所述方法的單糖收率。木質(zhì)纖維質(zhì)的牛物質(zhì)適用于本文的木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)包括但不限于生物能作物、農(nóng)業(yè)殘余物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、來自造紙業(yè)的淤渣、庭院垃圾、木材和林業(yè)垃圾。生物質(zhì)實(shí)例包括但不限于玉米芯、作物殘余例如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材料、藻類、獲取自下列研磨物的組分谷物、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及矮樹叢、蔬菜、水果、花和動(dòng)物糞肥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的生物質(zhì)包括具有相對(duì)高碳水化合物含量的生物質(zhì)，它們相對(duì)密集，和/或相對(duì)易于收集、運(yùn)輸、貯存和/或處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)包括農(nóng)業(yè)殘余物例如玉米秸桿、小麥 秸桿、大麥秸桿、燕麥秸桿、稻桿、卡諾拉秸桿和大豆秸桿，草例如柳枝稷、芒草、米草和草蘆，纖維加工殘余如玉米纖維、甜菜漿、紙漿廠殘?jiān)蛷U棄物以及蔗渣，高粱秸桿，林業(yè)垃圾例如白楊木、其它硬木、軟木和鋸屑，和消費(fèi)者用過的紙制品垃圾，以及其它作物材料或足夠豐富的木質(zhì)纖維質(zhì)材料。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可用的生物質(zhì)包括玉米芯、玉米秸桿、蔗渣和柳枝稷。木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)可來源于單一來源，或者生物質(zhì)可包括來源于一種以上來源的混合物；例如生物質(zhì)可包括玉米芯和玉米秸桿的混合物，或莖或桿和葉的混合物。當(dāng)?shù)米运鰜碓磿r(shí)，生物質(zhì)可直接使用，或者可經(jīng)過一些預(yù)加工，例如可向生物質(zhì)施能以降低尺寸、增加暴露的表面積、和/或提高生物質(zhì)中存在的木質(zhì)素和纖維素、半纖維素和/或低聚糖對(duì)堿預(yù)處理以及方法第三步中所用糖化酶的可達(dá)性?？捎糜诮档统叽?、增加暴露的表面積、和/或提高生物質(zhì)中存在的木質(zhì)素和纖維素、半纖維素、和/或低聚糖對(duì)預(yù)處理方法以及糖化酶的可達(dá)性的方法包括但不限于粉碎、壓碎、碾磨、撕碎、切剁、盤磨、超聲和微波。這些方法的施用可發(fā)生于預(yù)處理之前或期間，預(yù)處理后加工和糖化之前或期間，或它們的任何組合。就本發(fā)明目的而言，除了如上所述的降低尺寸以外，在預(yù)處理之前，可通過常規(guī)方法來干燥生物質(zhì)，例如在環(huán)境溫度下暴露于真空，或在大氣壓下接觸流動(dòng)的空氣，和/或在烘箱或真空爐中加熱。作為另外一種選擇，預(yù)加工過的生物質(zhì)可無需干燥而用于預(yù)處理。堿預(yù)處理在生物質(zhì)中，晶狀纖維素原纖埋于半纖維素基質(zhì)中，所述半纖維素基質(zhì)繼而被木質(zhì)素外層包圍。通常需要生物質(zhì)預(yù)處理來移除木質(zhì)素障礙物以用于隨后更有效的酶糖化過程。一種生物質(zhì)預(yù)處理方法是堿預(yù)處理。堿性是指大于7. 0的pH。多種類型的化合物可用于生物質(zhì)的堿預(yù)處理，例如使用氫氧化銨(氨水)、碳酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣和氫氧化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿預(yù)處理是指在含水介質(zhì)中使用氨氣(NH3)、包含銨離子(NH4+)的化合物如氫氧化銨或硫酸銨、當(dāng)降解時(shí)釋放氨的化合物例如尿素、以及它們的組合。在本發(fā)明方法中，含氨的水溶液還任選包含至少一種附加的堿，例如氫氧化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、氫氧化鈣和碳酸鈣。氨預(yù)處理生物質(zhì)的方法公開于共同持有、共同未決的美國專利申請(qǐng)公布US20070031918A1、US20070031919A1 ;和US20070031953A1中，將所述文獻(xiàn)以引用方式并入本文。
在本發(fā)明方法中，可使用任何堿預(yù)處理方法來制備預(yù)處理過的生物質(zhì)。例如，本文使用的制備預(yù)處理過的生物質(zhì)的氨水預(yù)處理方法包含12-20%干固體重量/重量(wt/wt)總預(yù)處理懸浮液和15-80%氨重量/重量生物質(zhì)干固體，其中反應(yīng)溫度在20-200°C的范圍內(nèi)并且反應(yīng)時(shí)間在0. 5-96小時(shí)內(nèi)變化。當(dāng)使用玉米作為木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)時(shí),典型條件為約15%干固體重量/重量的總預(yù)處理懸浮液，30%氨重量/重量的生物質(zhì)干固體、23°C和96小時(shí)。當(dāng)使用柳枝稷或蔗渣作為木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)時(shí)，典型條件為約12%干固體重量/重量的總預(yù)處理懸浮液，60%氨重量/重量的生物質(zhì)干固體、以及140°C和I小時(shí)。注意到，該段中所述的條件用于含水漿液的氨預(yù)處理，對(duì)于高固體的氨預(yù)處理過程而言是不必要的，用于該處理過程的條件更典型地為約50%干固體重量/重量的總預(yù)處理懸浮液和4-10%氨重量/重量的生物質(zhì)干固體，其中反應(yīng)溫度在20-200°C的范圍內(nèi)，并且反應(yīng)時(shí)間在5-120分鐘內(nèi)變化。預(yù)處理后的加工如上所述形成的預(yù)處理過的生物質(zhì)包含多種物質(zhì)，例如堿以及可用作酶糖化和/或發(fā)酵抑制劑進(jìn)而阻礙由生物質(zhì)水解產(chǎn)物高性價(jià)比制備目標(biāo)化學(xué)制品的許多可溶性和不 溶性化合物。在本發(fā)明方法中，提供了其它步驟即預(yù)處理后的加工來制備預(yù)處理過的生物質(zhì)以使得如下所述的酶糖化后的可發(fā)酵糖的收率最大化。本發(fā)明方法中的預(yù)處理后的加工包括洗滌或干燥，或洗滌和干燥。用溶液洗滌預(yù)處理過的生物質(zhì)，所述溶液包括例如水溶液或水與有機(jī)溶劑比率不同的有機(jī)/含水混合物。典型的洗滌溶液包括水、水和乙醇混合物、以及水和異丙醇混合物。洗滌可在室溫下，或在高溫下例如在83°C下進(jìn)行?？墒褂孟嗤虿煌娜芤褐貜?fù)洗滌若干次。洗滌條件可取決于向其實(shí)施預(yù)處理后洗滌的預(yù)處理過的生物質(zhì)類型。例如，玉米生物質(zhì)的典型洗滌條件為3X3體積的23°C的水。柳枝稷或蔗渣生物質(zhì)的典型洗滌條件為2 X 3體積的95 % EtOH, 2 X 3體積的50 % EtOH,以及2X3體積的水?？扇绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣進(jìn)行洗滌。例如,加入洗滌溶液并且將所述溶液與預(yù)處理過的生物質(zhì)漿液混合?？稍诶邕^濾、離心或沉淀后，通過重力流、傾倒或抽吸來移除洗滌溶液。洗滌可包括置換或稀釋洗滌過程，其可用于替代上述那些，或與前述預(yù)處理后的加工組合?？墒褂每缮藤彨@得的過濾器和離心機(jī)實(shí)施置換過程。這些過程與洗滌和脫水組合于一個(gè)單元操作中。在過濾情況下，置換洗滌可用如下設(shè)備例如帶式過濾器、鼓式過濾器、盤式過濾器、壓濾器、或大規(guī)模濾過器(Pfaudler Reactor System,Rochester,NY)來實(shí)施?？墒褂玫碾x心機(jī)包括臥式和立式滾筒離心機(jī)。在洗滌液體消耗方面，置換洗滌過程是高效的。稀釋洗滌通過將固體重新懸浮于洗滌液體中而最有效地移除最后痕量的雜質(zhì)。這可在簡單的槽罐中或在將過濾和再懸浮組合于一個(gè)單元操作中的濾過器中完成。洗滌操作可包括置換洗滌過程和稀釋洗滌過程以充分利用二者的有益效果。在本發(fā)明方法中，可使預(yù)處理過的生物質(zhì)干燥。干燥可通過常規(guī)方法進(jìn)行，如在環(huán)境溫度(19-25°C )下，接觸真空或在大氣壓下接觸流動(dòng)空氣，和/或在烘箱或真空爐中加熱。干燥可單獨(dú)進(jìn)行，或與洗滌組合，或在洗滌一次或多次后進(jìn)行。干燥所用溫度可為20-110°C，優(yōu)選35-75°C，并且更優(yōu)選40-65°C。預(yù)處理過的生物質(zhì)可干燥至50% -99%固體。所述生物質(zhì)可優(yōu)選干燥至>80%固體。
預(yù)處理后洗滌和/或干燥步驟可重復(fù)一次或多次以獲得更高的糖收率。用于糖化的預(yù)處理后的生物質(zhì)調(diào)節(jié)預(yù)處理后的生物質(zhì)的pH應(yīng)適于糖化酶的最佳表現(xiàn)。堿預(yù)處理后，預(yù)處理過的生物質(zhì)懸浮液的PH高于pH 7.0。如果預(yù)處理后的產(chǎn)物的PH超過使糖化酶活化的pH，則可使用酸來降低pH?？赏ㄟ^加入固體或液體形式的酸來改變pH。作為另外一種選擇，可使用可從發(fā)酵中回收的二氧化碳(CO2)來降低pH。例如，如果存在足夠液體，可從發(fā)酵罐中收集CO2并且將其通入閃蒸槽內(nèi)的預(yù)處理后的產(chǎn)物頂部空間中，或起泡通過預(yù)處理后的生物質(zhì)，同時(shí)監(jiān)控pH直至達(dá)到所需的pH。加入用于達(dá)到所需pH的酸可生成鹽，在一定濃度下，所述鹽在單糖發(fā)酵成目標(biāo)產(chǎn)物期間抑制糖化酶或微生物生長。為了降低達(dá)到期望PH所需要的酸的量并且降低預(yù)處理后加工前的預(yù)處理期間所用氨的原材料成本，可從預(yù)處理反應(yīng)器中排出氨氣并且回收。預(yù)處理后的生物質(zhì)可用于糖化中，或用于同時(shí)發(fā)生的糖化和發(fā)酵(SSF)中，其中pH已經(jīng)如上所述調(diào)節(jié)至適于最佳糖化酶的期望的范圍內(nèi)?？筛淖儨囟纫耘c糖化酶活性所需 溫度相協(xié)調(diào)?？杉尤胩腔^程中使用的酶活性所需的任何輔因子?；瘜W(xué)添加劑根據(jù)本發(fā)明方法，可在預(yù)處理后的加工之后的糖化期間加入一種或多種化學(xué)添加齊U，例如烷撐二醇、天然油、或非離子表面活性劑。在預(yù)處理后的加工之后的糖化期間，可加入化學(xué)添加劑，例如增塑劑、軟化劑、或它們的組合，例如多元醇(例如甘油、乙二醇)、多元醇的酯(例如單乙酸甘油酯)、二醇醚(例如二甘醇)、乙酰胺、乙醇、膽胺、聚氧乙烯(例如PEG 400、1000、2000、3000、4000或8000)和/或天然存在的油，例如植物油、大豆油、玉米油)或作為生物食品副產(chǎn)物或農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物而留下來的任何油(參見例如美國專利7，354，743，將所述文獻(xiàn)以引用方式并入本文)?？捎糜诒景l(fā)明的其它化學(xué)添加劑包括但不限于非離子表面活性劑例如胺乙氧基化物、葡糖苷、葡糖酰胺、聚乙二醇、蘆布若爾、全氟烷基聚烷氧基化酰胺、N，N-雙[3D-葡糖酰氨基丙基]膽酰胺、癸酰基-N-甲基-葡糖酰胺、n-癸基P -D-吡喃葡萄糖苷、n-癸基@ -D-吡喃葡萄糖苷、n-癸基P -D-吡喃麥芽糖苷、n-十二烷基P -D-吡喃葡萄糖苷、n- i^一烷基P -D-吡喃葡萄糖苷、n-庚基P -D-吡喃葡萄糖苷、n_庚基P -D-硫代吡喃葡萄糖苷、n-己基P -D-吡喃葡萄糖苷、n-壬酰基P -吡喃葡萄糖苷、I-單油酸-rac-甘油酯、壬?；?N-甲基葡糖酰胺、十二烷基P-D-麥芽糖苷、N，N-雙[3-葡糖酰氨基丙基]脫氧膽酰胺、二甘醇單戊醚、洋地黃皂苷、庚?；?N-甲基葡糖酰胺、辛?；?N-甲基葡糖酰胺、n-辛基P -D-吡喃葡萄糖苷、n-辛基P -D-吡喃葡萄糖苷，n_辛基P -D-硫代吡喃半乳糖苷、n-辛基P-D-硫代吡喃葡萄糖苷；三油酸脫水山梨糖醇酯、單油酸脫水山梨糖醇酯、一月桂酸脫水山梨糖醇酯、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯、天然卵磷脂、合成卵磷脂、二油酸二甘醇酯、油酸四氫糠酯、油酸乙酯、肉豆蘧酸異丙酯、單油酸甘油酯、一硬脂酸甘油、一蓖麻油酸甘油酯、鯨蠟醇、硬脂醇、或一月桂酸甘油酯。表面活性劑的其它實(shí)例包括合成磷脂，例如二硬脂?；字Ｄ憠A或文獻(xiàn)中提供的其它表面活性劑[McCutcheon的 “Emulsifiers and Detergents，，北美版，2000 年由 Manufacturers ConfectionersPublishing Co. (Glen Rock, N. J)公布]。可在糖化前將一種或多種化學(xué)添加劑加入到預(yù)處理后的生物質(zhì)中，總化學(xué)添加劑的量相對(duì)于生物質(zhì)干重小于約20重量％?？偦瘜W(xué)添加劑的量相對(duì)于生物質(zhì)干重優(yōu)選小于約 16 重量％，并且可為約 0. 05%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%或 16%?？砂l(fā)酵糖生產(chǎn)改進(jìn)在由木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)生產(chǎn)可發(fā)酵糖的本發(fā)明方法中，將堿預(yù)處理過的生物質(zhì)如上所述進(jìn)行預(yù)處理后加工，并且在糖化(糖化描述于下文中)期間加入如上所述的化學(xué)添加劑。這些步驟中的每一個(gè)獨(dú)立改善了糖的生產(chǎn)。當(dāng)組合時(shí)，這些步驟共同提供協(xié)同的改善效應(yīng)當(dāng)在方法中將所述步驟組合時(shí)，獲得的改善大于基于單獨(dú)效應(yīng)加和的預(yù)期效果。例如，本文實(shí)施例6中示出，洗滌在木糖產(chǎn)量方面單獨(dú)提供110%的改善度，并且加入PEG8000，在木糖產(chǎn)量方面提供5%的改善度。就洗滌和加入PEG而言，這兩個(gè)改善度之和為115%的木糖收率改善度。然而，包括洗滌和加入PEG的方法在實(shí)驗(yàn)獲得的木糖產(chǎn)量方面的改善度為250%，為協(xié)同增高的改善度。 糖化
用于生物質(zhì)處理的糖化酶和酶組以及方法綜述于Lynd，L.R.等人文章中(“Microbiol. Mol. Biol. Rev. ”，66 :506-577,2002)。糖化酶和酶組可包含一種或多種糖苷酶，所述糖苷酶由纖維素-水解糖苷酶、半纖維素-水解糖苷酶和淀粉-水解糖苷酶組成。糖化酶聚生體中的其它酶可包括肽酶、脂肪酶、木素酶和酯酶。糖苷酶類別主要選自但不限于水解二糖、低聚糖和多糖的醚鍵的酶，并且其存在于廣義“水解酶”(EC 3.)的酶分類 EC 3. 2. I. X 中(“Enzyme Nomenclature”，1992,Academic Press, San Diego, CA,以及增補(bǔ) 1，1993 ;增補(bǔ) 2,1994 ;增補(bǔ) 3,1995 ;增補(bǔ) 4，1997 ;和增補(bǔ) 5[分別在“Eur. J. Biochem. ”,223 :1_5，1994 ;“Eur. J. Biochem. ”,232 :1_6，1995 ;“Eur. J. Biochem. ”，237 1-5,1996 ;“Eur. J. Biochem. ”，250 :1_6，1997 ；和 “Eur.J. Biochem. ", 264 =610-650,1999中])。本發(fā)明的方法中可用的糖苷酶能夠根據(jù)它們水解的生物質(zhì)組分進(jìn)行分類。可用于本發(fā)明方法中的糖苷酶包括纖維素水解糖苷酶(例如，纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、3 -葡萄糖苷酶)、半纖維素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、內(nèi)木聚糖酶、外木聚糖酶、3 -木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、a-淀粉酶、P -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、a -葡萄糖苷酶、異淀粉酶)。此外，它可用于將其它活性加入糖化酶聚生體中，例如肽酶(EC3. 4. X. y)、脂肪酶(EC 3. I. I. x和3. I. 4. x)、木素酶(ECI. 11. I. x)和阿魏酸酯酶(EC 3. I. I. 73)，以有助于從生物質(zhì)的其它組分中釋放多糖。本領(lǐng)域熟知生產(chǎn)多糖水解酶的微生物常常表現(xiàn)出某種活性，例如纖維素降解，該活性由若干種酶或一組具有不同底物特異性的酶催化。因此，來自微生物的“纖維素酶”可包括一組酶，所有酶可有助于纖維素降解活性。取決于獲取酶時(shí)利用的純化方案，商業(yè)或非商業(yè)酶制劑，例如纖維素酶，可包括多種酶。因此，本發(fā)明方法的糖化酶聚生體可包括酶活性，例如“纖維素酶”，然而人們認(rèn)識(shí)到該活性可被一種以上的酶催化。
糖化酶可按分離形式商購獲得，例如SPEZYME CP纖維素酶(GenencorInternational, Rochester,NY)和 MULTIFECT 木聚糖酶(Genencor)。此外，糖化酶可按宿主微生物表達(dá),包括重組體微生物本領(lǐng)域的技術(shù)人員將懂得如何測定在糖化酶聚生體中使用的酶的有效量，以及如何調(diào)節(jié)條件以獲得最佳酶活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將懂得如何優(yōu)化在復(fù)合酶中的此類酶的所需活性以在選擇條件下獲得給定預(yù)處理后的產(chǎn)物的最佳糖化效果。例如參見美國專利 NO :7354743 ;美國專利公布 2009/0004692 以及 Zhang 等人(“Biotech Advances”，24 452-481,2006)。適宜的反應(yīng)條件包括下列條件，如對(duì)糖化酶活性有效的pH、溫度和時(shí)間。優(yōu)選地，糖化反應(yīng)在糖化酶的最佳溫度和PH下或接近此最佳pH和溫度的條件下進(jìn)行。本發(fā)明方法中與糖化酶聚生體一起使用的最佳溫度在約15°C至約100°C的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，最佳溫度在約20°C至約80°C的范圍內(nèi)，并且最典型為45-50°C。最佳pH可在約2至約11的范圍內(nèi)。另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中糖化酶聚生體使用的最佳pH在約4至約5. 5的范圍內(nèi)。糖化可進(jìn)行約若干分鐘至約120h，優(yōu)選約若干分鐘至約48h。反應(yīng)時(shí)間將取決于酶濃度和比活性，以及使用的底物、其濃度(即固體載量)和環(huán)境條件例如溫度和pH。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地決定特定底物和糖化酶聚生體使用的溫度、PH和時(shí)間的最佳條件。糖化可按間歇式或連續(xù)的方法進(jìn)行，并且也可在一個(gè)步驟或在多個(gè)步驟中進(jìn)行。例如，糖化所需的不同酶可表現(xiàn)出不同的最佳PH或溫度。可用酶在某個(gè)溫度和pH下進(jìn)行首次處理，隨后使用不同酶在不同溫度和/或PH下進(jìn)行第二次或第三次(或更多次)處理。此外，用不同酶在連續(xù)步驟中進(jìn)行的處理可以在相同PH和/或溫度下進(jìn)行，或在不同pH和溫度下進(jìn)行，例如使用在更高PH和溫度下穩(wěn)定的和活性更高的半纖維素酶處理，隨后用在更低PH和溫度下用活性的纖維素酶處理。糖化后得自預(yù)處理后的生物質(zhì)的糖的溶解度可通過測定單糖和低聚糖的釋放進(jìn)行監(jiān)控。測量單糖和低聚糖的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，還原糖的濃度可使用1，3_ 二硝基水楊酸(DNS)檢測分析法(Miller, G. L.，Anal. Chem. ,31 =426-428,1959)測定。作為另外一種選擇，可使用適當(dāng)?shù)闹?，通過HPLC測定糖，如下文所述。為了評(píng)定本發(fā)明方法的性能，可計(jì)算出得自起始生物質(zhì)的糖的理論收率并且與所測收率比較。發(fā)酵生成目標(biāo)產(chǎn)物如本文所述制得的預(yù)處理后的且糖化的生物質(zhì)可接觸一種或多種能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵微生物。此類發(fā)酵微生物包括但不限于如上所述的糖酵母屬、畢赤酵母屬、發(fā)酵單胞菌屬和大腸桿菌屬。目標(biāo)產(chǎn)物包括但不限于醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如乙酸、乙酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5- 二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木質(zhì)酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如甲烷、氫(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。參見例如美國專利申請(qǐng)序列號(hào)12/410501和美國專利公布NO.US20080187973A1，將兩篇文獻(xiàn)以引用方式并入本文中。發(fā)酵方法還包括在酒精消費(fèi)品工業(yè)(例如，啤酒和酒)、乳品工業(yè)(例如，發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中所使用的方法。本領(lǐng)域已知的可用的糖化和發(fā)酵方法包括但不限于分步水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合水解和發(fā)酵(HHF)、以及直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。 SHF采用分別的工序來首先將纖維素酶解為糖例如葡萄糖和木糖，然后將所述糖發(fā)酵為乙醇。在SSF中，將纖維素的酶水解和將葡萄糖發(fā)酵成乙醇被合并為一個(gè)步驟(Philippidis,G. P. , in Handbook on Bioethanol Production and Utilization,Wyman,C. E.，ed.，Taylor&Francis, Washington, D. C.，179-212，1996)。SSCF 包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan, J.，和 Himmel，M.，“Biotechnol. Prog. ”，15 :817-827,1999)。HHF 包括在同一反應(yīng)器但在不同溫度進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立的步驟，即在高溫下進(jìn)行酶解糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度下進(jìn)行SSF。DMC將全部三個(gè)過程(纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和發(fā)酵)合并為一個(gè)步驟(Lynd, L. R.，ffeimer, P. J.，van Zyl, ff. H.,和 Pretorius, I. S.，“Microbiol. Mol. Biol. Rev. ”，66 :506_577，2002)。上述方法可用于由可發(fā)酵糖生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，所述可發(fā)酵糖由本文所述方法制得。 本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)使用了多種木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)的氨預(yù)處理方法例如DAA、ARP和SAA (Kim等人，同上)。然而，這些方法具有某些缺點(diǎn)，其致使糖化后可發(fā)酵糖例如單糖的收率差。例如，DAA技術(shù)不包括預(yù)處理后進(jìn)行干燥以移除可能存在于預(yù)處理后混合物中的酶糖化或發(fā)酵的抑制劑。在ARP和SAA方法中，采用極高含量的氨水來預(yù)處理生物質(zhì)，所述生物質(zhì)在酶糖化之前將進(jìn)一步被洗滌。然而，任一種處理后，沒有公開量化的單糖收率。 如上所述，預(yù)處理過的生物質(zhì)在糖化酶的存在下進(jìn)一步水解以釋放水解產(chǎn)物中的低聚糖和/或單糖(Lynd, L. R.等人，同上)。若干報(bào)導(dǎo)(Alkasrawi, M.等人,“EnzymeMicrobial Technol.，，，33 :71-78, 2003 ;“Borjesson. J. ” 等人，“Enzyme MicrobialTechnol. ”，40 :754-762, 2007 ；Zheng, Y.等人，“Appl. Biochem. Biotechnol. ”，146 231-248,2008)已經(jīng)指出，將增塑劑或烷撐二醇例如聚乙二醇(PEG)加入到脫木素的生物質(zhì)中，對(duì)于提高糖化期間的糖收率是無效的。此外，Jeoh等人(“Biotechnol. Bioeng. ”,98 112-122,2007)指出，向預(yù)處理過的生物質(zhì)施加干燥過程降低了隨后糖化以將木質(zhì)纖維質(zhì)材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的功效。最后，Zhang, Y.-H. P.和 Lynd,L.R. (“Biotechnol. Bioeng. ”，88 =797-824,2004)得出結(jié)論，基底干燥對(duì)于纖維質(zhì)基底的分解是不利的。如共同持有的、懸而未決的專利申請(qǐng)W02006/110900(A2) (US20070031953A1)中所述的那樣，當(dāng)使用15mg/g糖化酶固體時(shí)，就葡萄糖和木糖而言，得自氨預(yù)處理過的玉米芯的葡萄糖和木糖收率分別為47. 78%和30. 63%，所述文獻(xiàn)不包括在糖化前干燥生物質(zhì)，將所述文獻(xiàn)以引用方式并入本文。令人驚奇的是，申請(qǐng)人已示出預(yù)處理后用水或有機(jī)/水溶劑洗滌預(yù)處理過的生物質(zhì)，和/或干燥預(yù)處理過的生物質(zhì)，與隨后糖化中加入至少一種選自烷撐二醇、天然油和非離子表面活性劑的化學(xué)添加劑相組合使得酶糖化后單糖的釋放高度地改善。這些步驟對(duì)糖收率具有協(xié)同效應(yīng)并且降低糖化酶載量，同時(shí)提供高收率的可發(fā)酵糖。一般方法分析方法采用本領(lǐng)域熟知的方法來測定每種起始生物質(zhì)樣品中葡萄糖和木糖的量。將糖化反應(yīng)樣品離心后獲得的澄清的上清液過濾并且在蒸餾水中稀釋13. 3倍。由具有適當(dāng)保護(hù)柱的 HPLC(Waters Millenium 2795 系統(tǒng)，Grace-Davison Prevail 糖分析柱,4. 6X250mm,0. 5iim，流動(dòng)相75%乙腈的水溶液，Waters 2420折射率檢測器)，測定糖化液中的可溶性糖(葡萄糖、纖維二糖、木糖)。使用Grace-Davison Prevail糖分析柱和10 ii L注射體積，實(shí)施HPLC分析。流動(dòng)相為75% HPLC級(jí)乙腈的HPLC級(jí)水溶液，0. 2 u m過濾并且脫氣，流量為I. OmL/min,柱溫為35°C，并且保護(hù)柱溫度為35°C。檢測器為Waters 2420折射率檢測器，運(yùn)行時(shí)間為12分鐘，注射體積為IOii L稀釋樣品，并且流動(dòng)相為0. OlN硫酸，0. 2iim過濾并且脫氣。作為另外一種選擇，使用Sluiter,A.等人的方法(“Determination of sugars,byproducts and degradation products in liquid fraction process samples，，，National Renewable Energy Laboratory Analytical Procedure, 2006)。在該方法中，柱子為Biorad Aminex HPX-87H，檢測器為Waters2410折射率檢測器，分析時(shí)間為20分鐘，注射體積為10 U I稀釋樣品，流動(dòng)相為0. OlN硫酸，0. 2um過濾并且脫氣，流量為0. 6mL/mim并且柱溫為60°C。分析后，采用外標(biāo)曲線測定樣品中期望的化合物的濃度。材料除非另外指明，化合物均得自Sigma Aldrich ;SPEZYME CP 和 MULTIFECT_ CX12L 得自 Genencor (Genencor International, Palo Alto, CA)并且 Novozyme 188 得自 Accellerase 1000纖維素酶得自Genencor International,]!-辛基批喃葡萄糖苷和n_辛基-0-0-硫糖苷得自A. G. Scientific chemicals (San Diego, CA);壬?；谆咸酋０返米?Lab Express International Inc (Fairfield, NJ);三甲基嫁臘基溴化銨得自 USBCo (Cleveland, 0H)。下列縮寫用于下列實(shí)施例中“HPLC”為高效液相色譜；“°C”為攝氏度或攝氏；“kPa”為千帕；“m”為米；“mm”為毫米；“ U m”為微米；“ u I”為微升；“mL”為毫升；“L”為升；“min”為分鐘；“mM”為毫摩爾每升，“cm”為厘米；“g”為克；“kg”為千克，“wt”為重量，“h”為小時(shí)；“PEG”為聚乙二醇；“mg”為毫克；“mg/mL”為毫克每毫升；“rpm”為轉(zhuǎn)每分鐘；“《/ ”為重量/重量為毫米汞柱；“DWB”為生物質(zhì)干重；“ASME”為美國機(jī)械工程師協(xié)會(huì)；“wt%”為重量百分比；“ % ”為百分比；“psig”是指磅每平方英寸(壓力計(jì))。
實(shí)施例預(yù)處理后加工生物質(zhì)以移除抑制劑并且改善糖化后的單糖收率下述實(shí)驗(yàn)工作的目的是開發(fā)經(jīng)濟(jì)型預(yù)處理后的加工，所述加工移除木質(zhì)纖維質(zhì)的生物質(zhì)氨水預(yù)處理期間形成的抑制劑以使單糖產(chǎn)量最大化并且使此類糖的損失最小化，以用于發(fā)酵成期望的一種或多種目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中得到進(jìn)一步闡述。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實(shí)施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明做出多種改變和修改以使其適用于多種用法和條件。實(shí)施例I洗滌氨水預(yù)處理過的兩種粒度的生物質(zhì)并且加入PEG，增加酶糖化后單糖的釋放該實(shí)驗(yàn)的目的是研究洗滌預(yù)處理過的生物質(zhì)并且加入PEG以及多種玉米芯生物質(zhì)粒度對(duì)糖化后單糖的釋放的影響。將錘磨過的玉米芯生物質(zhì)(通過I. 9mm篩網(wǎng))加入到5L水平犁式攪拌機(jī)(Littleford Day，M-5型)壓力容器中壓至50%的初始填充體積。然后使用真空泵將容器抽空至約75mmHg壓力。然后將氨水溶液加入到所述容器中以便使初始固體濃度為約50%重量/重量，并且氨濃度為6%重量/重量干燥生物質(zhì)。然后采用間接加熱將容器內(nèi)容物預(yù)熱至100°C溫度，接著將過熱蒸汽直接加入到所述容器中以使溫度升至140°C。然后將反應(yīng)器在140°C下保持20分鐘，然后通過打開排氣管線上的閥門，使壓力降至大氣壓。在反應(yīng)器溫度達(dá)到100°C時(shí)，使用真空泵使壓力進(jìn)一步降至約lOOmmHg。當(dāng)反應(yīng)器溫度達(dá)到約60°C時(shí)，從反應(yīng)器中取出預(yù)處理過的生物質(zhì)。生物質(zhì)的最終固體濃度為約58%。然后將預(yù)處理過的材料按原樣使用，或用蒸餾水、50%乙醇的水溶液或95%乙醇的水溶液進(jìn)一步洗滌。通過真空過濾,從殘余固體中移除每一種洗滌液體。然后將預(yù)處理過的洗滌過的固體在90°C烘箱中干燥，之后備用于酶糖化。將每種預(yù)處理過的材料批料的一半進(jìn)一步錘磨至通過I. Imm篩網(wǎng)的更小尺寸以測定粒度對(duì)糖化的影響。然后將所有預(yù)處理過的材料再次懸浮于蒸餾水中至18. 6%固體。用硫酸水溶液將所有預(yù)處理過的生物質(zhì)的PH調(diào)節(jié)至5. O。將每種懸浮液(3g)加入到20mL 玻璃閃爍小瓶中。然后所選小瓶加入按干固體計(jì)2.68%的PEG8000。向每種生物質(zhì)懸浮液中加入SPEZYME CP纖維素酶與MULTIFECT CX12L半纖維素酶的混合物(每種蛋白質(zhì)的比率為I : I)，使得酶總載量為3. 7mg酶蛋白質(zhì)/g干固體。使酶糖化反應(yīng)在55°C下進(jìn)行至多96h，以237rpm速率旋搖。96h時(shí)，取出150 y L等分試樣并且在微量離心管中以14，OOOrpm速率離心。如上所述，由HLPC測定葡萄糖和木糖單糖的濃度。數(shù)據(jù)(表I)示出，洗滌氨預(yù)處理過的生物質(zhì)，增加了隨后糖化中木糖和葡萄糖的釋放，所述釋放在PEG8000的存在下通過糖化進(jìn)一步提高。I. 9和I. Imm粒度的預(yù)處理過的生物質(zhì)均發(fā)生所述提高。激I采用不同的洗滌方案、PEG和預(yù)處理過的牛物質(zhì)粒度，由6%氨水預(yù)處理過的玉米
芯生物質(zhì)釋放的木糖和葡萄糖
權(quán)利要求
1.用于由預(yù)處理過的生物質(zhì)制得可發(fā)酵糖的方法，包括 a)提供預(yù)處理過的生物質(zhì)，其中所述預(yù)處理過的生物質(zhì)已經(jīng)經(jīng)受堿預(yù)處理過程； b)使所述預(yù)處理過的生物質(zhì)經(jīng)受預(yù)處理后的過程，所述過程選自洗滌、干燥以及它們的組合，從而制得預(yù)處理后的生物質(zhì)；以及 c)在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，使步驟(b)中的預(yù)處理后的生物質(zhì)接觸至少一種糖化酶以及至少一種化學(xué)添加劑以制得可發(fā)酵糖，所述化學(xué)添加劑選自烷撐二醇、天然油和非離子表面活性劑。
2.權(quán)利要求I的方法，其中在步驟(c)之前，將步驟(b)重復(fù)至少一次或多次。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述預(yù)處理后的過程包括洗滌，然后進(jìn)行干燥。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述干燥通過風(fēng)干或通過真空爐干燥來進(jìn)行。
5.權(quán)利要求3的方法，其中重復(fù)所述洗滌然后進(jìn)行干燥的過程。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述糖化酶是酶聚生體的一部分。
7.權(quán)利要求I的方法，其中與沒有步驟(b)的預(yù)處理后的過程以及步驟(c)中的與所述一種或多種化學(xué)添加劑的接觸而達(dá)到指定可發(fā)酵糖收率所需的糖化酶的量相比，達(dá)到相同可發(fā)酵糖收率所需的所述至少一種糖化酶的量顯著降低。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述步驟(b)與(C)的組合在可發(fā)酵糖的生產(chǎn)中提供協(xié)同效應(yīng)。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述烷撐二醇是具有約1000至約8000平均分子量的聚乙二醇。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述天然油是大豆油。
11.權(quán)利要求I或3的方法，還包括使步驟(C)中的可發(fā)酵糖與發(fā)酵性微生物接觸，從而所述微生物將所述糖轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于改善堿預(yù)處理過的生物質(zhì)釋放單糖的方法。所述方法包括進(jìn)一步加工預(yù)處理過的生物質(zhì)并且將化學(xué)制品加入到糖化反應(yīng)中，它們共同提供意料不到的高含量單糖釋放，所述單糖可發(fā)酵成目標(biāo)產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12P7/00GK102712937SQ201080046215
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日
發(fā)明者K·D·溫, R·S·希菲諾 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司