專利名稱：生物檢測方法以及組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的實施方式總體上涉及使用分子倒置探針技術(molecular inversion probe technology)與數(shù)據(jù)庫技術結合用于檢測生物材料。相關技術的描述生物檢測方法(例如，病原體檢測方法)在多種領域(例如，生物安全、微生物法醫(yī)學(microbial forensics)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)院診斷、臨床診斷、公共衛(wèi)生(例如檢測和鑒別變應原、病毒、真菌和新發(fā)疾病(emerging diseases)，以及食品安全中的菌株分型)等方面是至關重要的。現(xiàn)有生物檢測技術包括基于DNA的檢測方法(例如，實時PCR、微陣列雜交)，基于配體的方法(例如，肽、抗體、單鏈可變片段、適體以及碳水化合物)，基于光譜學的傳感器方法(例如，生物體理化性質(zhì)的振動特征標志(vibrational signature))，以及轉(zhuǎn)導方法(例如，細胞環(huán)境感測，例如嗜中性細胞中的G蛋白信號級聯(lián)以及通過視紫質(zhì)進行光子檢測)。這些現(xiàn)有技術具有多種缺點。例如，它們不能檢測以前未知的、突變工程化的或藥物耐受性的生物體，它們需要大量的樣本用來檢測，并且在菌株鑒別方面它們提供了有限的分辨率，并且它們不能在病原體和無毒的鄰近種類之間進行區(qū)別。因此，需要生物檢測的新型方法。

發(fā)明內(nèi)容
提供了用于確定樣本中生物體表型的方法。這些方法包括以下步驟得到一個樣本，使該樣本與一種分子倒置探針(MIP)接觸，其中該MIP包括與生物體中感興趣的靶核酸序列同源性的兩個區(qū)域以及兩個探針擴增區(qū)域，其中使用對于該表型具有特異性的 MIP數(shù)據(jù)庫來選擇同源性的兩個區(qū)域，使該MIP雜交到該感興趣的核酸序列上，將該感興趣的靶核酸序列轉(zhuǎn)化成環(huán)狀DNA，將該環(huán)狀DNA擴增，從該擴增的DNA中釋放出該MIP，對擴增的DNA進行測序，以及確定是否存在相應于該表型的DNA序列。在一些方面中，該生物體是以下中的一種或多種細菌(例如鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)、布魯菌屬(Brucella)、 禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Ε. coli)、喹諾酮耐藥性大腸桿菌(Quinolone resistant Ε· coli)、立克次體(Rickettsiae)、B 族鏈球菌(Group B Str 印 tococci)、鼻疽伯克菌(Burkholderia mallie)、副百日咳博德特氏菌(副百日咳博德特菌，Bordetalla parapertusis) > M ft ft J^ (drug resistant P. falciparum) > ^n tl ^v fe ff ^ (M. tuberculosis)、霍舌L 弧菌(V. cholera)、炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)、屎腸球菌 (E. faecium)、土拉熱弗朗西絲菌(F. tularensis)、百日咳博德特氏菌(B. pertussis)、以及甲氧西林耐受性金黃色葡萄球菌(methicillin resistant S. aureus)中的一種或多種)，病毒(例如，HIV-1、禽流感以及登革熱病毒中的一種或多種)，真菌以及原生動物。在一些方面中，該擴增步驟是通過滾環(huán)擴增(rolling circle amplification) (RCA)來實現(xiàn)的。在其他方面中，該測序步驟是通過多重測序來實現(xiàn)的。在另外的其他方面中，該MIP數(shù)據(jù)庫是單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫、抗生素耐受性基因數(shù)據(jù)庫、毒力基因數(shù)據(jù)庫或它們的任意組合。在別的其他方面中，該表型是抗生素耐受性和/或毒力。本發(fā)明實施方式的優(yōu)點包括經(jīng)濟效率和時間效率。本發(fā)明的實施方式進一步提供了一種優(yōu)異的基于DNA序列的生物檢測技術，提供了檢測以前未知的、突變的和/或工程化的生物體的能力，提供了在病原體與無毒的“鄰近(near neighbor) ”種類之間進行區(qū)別的能力，提供了檢測多態(tài)性出現(xiàn)的能力，以及一種非常有效的、省時的多路復用(multiplex) 方法。在下面實施方式的說明和它們的附圖中，以及從權利要求中，本發(fā)明一些實施方式的進一步特征和優(yōu)點將變得更加完全清楚。


本專利或申請文件包含至少一幅以彩色完成的附圖。當請求并且支付必要費用時，具有一幅或多幅彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的復印件可以由專利局提供。由結合附圖取得的下面的說明性實施方式的詳細說明可以更全面地理解本發(fā)明上述的和其他特征以及優(yōu)點，其中圖1示意性地說明了分子倒置探針技術(關于綜述，參見Li et al. (2009) Science 324:1210 ；Ball et al. (2009)Nat. Biotech. 27 361 ；Porreca et al. (2007)Nat. Meth. 4 931)。圖2示意性地說明了多重捕獲。在一單一反應中可以探測超過30，000個靶(目標)(Li et al.，同上)。圖3示意性地說明了可以通過本文所描述的方法檢測的重要細菌病原體。圖4A-4C示意性地說明了可以通過本文所描述的方法檢測的病毒病原體。(A)DNA 病毒。(B)反轉(zhuǎn)錄病毒。(C)其他病毒。圖5示意性地說明了可以通過本文所描述的方法檢測的真核病原體。圖6說明了針對2009中存在的藥物耐受性監(jiān)測的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶突變(以粗體形式說明了新突變)。
具體實施例方式本領域已知的生物檢測系統(tǒng)不能檢測和鑒別新的和/或工程化的病原菌株。通過著手解決針對傳染性疾病鑒別靈敏度和寬度的重要挑戰(zhàn)和在病原體與鄰近種類之間進行區(qū)別以及鑒別出突變的或工程化的生物威脅(例如使用病原體進行生物戰(zhàn)或恐怖活動)，本文所描述的生物檢測方法部分地彌補了這些不足。本文所描述的生物檢測方法和組合物可以用于廣泛多樣的應用中，例如血制品監(jiān)測、農(nóng)業(yè)、法醫(yī)微生物學、流行病學、食品安全以及生物防御。本文所描述的生物檢測方法和組合物使用在每個末端具有識別序列的分子倒置探針，這些序列雜交到匹配的靶DNA序列上。通過聚合酶驅(qū)動的從捕獲探針的3’端延伸從而拷貝該靶標，緊接著連接到5’端上從而完成該循環(huán)來實現(xiàn)捕獲事件。對得到的環(huán)化探針進行富集(例如，通過滾環(huán)擴增)以及測序。該多重反應緊接著測序，允許在一個單一反應中檢測超過75，000個靶基因區(qū)域。在某些示例性實施方式中，用于本文所描述的生物檢測方法中的分子倒置探針 (MIP)被設計成靶核酸序列(例如，已知對于已經(jīng)顯示對病原性菌株獨特(獨特性，unique) 的一種蛋白(以其野生型亦或突變體形式)進行編碼的基因中感興趣的管家基因或區(qū)域)。 這類靶核酸序列(例如基因)可以控制毒力、藥物耐受性(耐藥性)和/或包含在有毒病原體與“鄰近”種類之間進行區(qū)別的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。在包含類似無毒菌株的混合物中可檢出這些靶核酸序列(例如管家基因)，并且對于基因轉(zhuǎn)移具有耐受性。已經(jīng)確定的是所實驗(受試，subject)病原體的任何工程化的或突變的形式可以通過對感興趣的基因進行測序來鑒別。本文所描述的方法和組合物在傳染性疾病診斷領域中是特別有用的，包括但不限于分子診斷產(chǎn)物、免疫測定、培養(yǎng)產(chǎn)物等。關于監(jiān)測和鑒別變應原、病毒、真菌、新發(fā)傳染性疾病等，目標市場包括但不限于醫(yī)院生物監(jiān)測(例如，HAI以及其他傳染性疾病)；醫(yī)院、臨床以及參考實驗室診斷；公共衛(wèi)生機構(例如，⑶C和DHS)；食品微生物學。病原性目標 (靶標)包括證實的和潛在的生物武器，證實的生物犯罪劑，全體和/或醫(yī)學相關的動物病原體，全體和/或醫(yī)學相關的植物病原體，具有生物工程化高潛力的生物體，動物傳染劑 (zoonotic agents)，毒素，食物傳播的病原體，新發(fā)傳染劑等。特異性病原性目標(靶標) 進一步包括但不限于種類A、B、C優(yōu)先病原體(變態(tài)反應和傳染病國家研究院(National institutes of Allergy and Infectious Disease))，選擇劑(衛(wèi)生與公共服務部(Health and Human Services))，高后果性的植物和動物病原體(美國農(nóng)業(yè)部(U. S. D^artment of Agriculture))，須申報的試劑(疾病控制中心(Centers for Disease Control))等，以及在本文中進一步說明的其他病原體。本文所描述的方法和組合物還廣泛地用作診斷工具用于監(jiān)測受試者(對象)體內(nèi)多種失調(diào)和/或疾病。在一非限制性實例中，可以使用包括特異性癌標志物的數(shù)據(jù)庫來設計MIP以用來診斷、預測和/或監(jiān)測樣本(例如，生物樣本)中癌的存在。本文所描述的生物檢測方法包括下面步驟收集樣本，制備文庫，MIP雜交和隨后捕獲，擴增，以及測序。可以從與本發(fā)明一起使用的廣泛多樣的來源(包括但不限于細胞培養(yǎng)物、動物或植物組織、病人活檢、環(huán)境樣本等)收集包含靶多核苷酸的樣本或樣品(例如基因組DNA和 /或基因組RNA的片段)。使用常規(guī)技術來制備樣品，這些技術典型地取決于從中取得樣本或樣品的來源。如本文使用的，術語“樣本”是指來自其中尋找靶核酸檢測或測量的生物的、環(huán)境的、醫(yī)學的、或病人來源的大量材料。另一方面它是指包括樣品或培養(yǎng)物(例如，微生物培養(yǎng)物)。另一方面，它是指包括生物樣本和環(huán)境樣本兩者。樣本可以包括合成來源的樣品。生物樣本可以是動物，包括人類，流體，固體(例如，糞便或組織)，以及液體或固體食物和飼料產(chǎn)品以及成分例如奶制品，蔬菜，肉和肉類副產(chǎn)物，以及廢物。生物樣本可以包括從病人體內(nèi)取得的材料，包括但不限于培養(yǎng)物、細胞、組織、血、唾液、腦脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰、精液、針吸物等?？梢詮乃羞@些不同科的家養(yǎng)動物以及野化的或野生的動物體內(nèi)得到生物樣本，包括但不限于這類動物，例如有蹄動物、熊、魚、嚙齒動物等。環(huán)境樣本包括環(huán)境材料例如表面物質(zhì)，土壤，水和工業(yè)樣本，以及從食品和乳制品處理儀器、器具、裝備、 器皿、一次性以及非一次性物品中得到的樣本。這些實例不應被解釋為限制可用于本發(fā)明的樣本類型。在樣本上進行反應之前，通常理想的是在該樣本上進行一個或多個樣品制備操作。典型地，這些樣本制備操作會包括這類操作如提取細胞內(nèi)材料，例如來自全細胞樣本的
核酸、病毒等?？紤]到適合從緊密相關物中差異性地鑒別出病原性菌株的遺傳標志特征，基于對藥物耐受性、抗原、毒素以及表面蛋白進行編碼的基因區(qū)域編譯了一個病原體多態(tài)性數(shù)據(jù)庫。這些感興趣的區(qū)域還顯示出對環(huán)境樣本中靶病原體具有特異性。選擇出已經(jīng)顯示對表型性狀，例如藥物耐受性(耐藥性)、毒力、毒素、表面蛋白等(它們還顯示出對于處于其野生型亦或突變型形式病原體的獨特性)進行編碼的基因中感興趣的基因或區(qū)域。下面的標準(它們提供了質(zhì)量控制)用于在添加到數(shù)據(jù)庫中之前對候選基因進行評估1)臨床和環(huán)境病原體隔離群的公開研究中的基因參照；2)感興趣的區(qū)域出現(xiàn)在已經(jīng)通過表型的藥物敏感性測試表征的隔離群中；幻可以通過說明基因核苷酸位置以及核苷酸或氨基酸改變來鑒別出感興趣的區(qū)域；以及4)進行BLAST評估用來驗證感興趣基因的獨特性。使用軟件例如MIPTAG ftx)，可以將MIP探針設計成捕獲包括感興趣區(qū)域(像例如，SNP，耐受性突變或類似物)的基因中感興趣的整個基因或區(qū)域。輸入核苷酸位置以及一組基因組。使用這些標準產(chǎn)生MIP探針。然而應當理解的是可以使用本領域熟知的方法和試劑來設計額外的數(shù)據(jù)庫用來針對多種目的(例如疾病診斷，疾病預測，疾病監(jiān)測等)適配多種已知生物標記。如本文使用的，"MIP技術”是指能夠大規(guī)模詢問(查詢，interrogating)感興趣核酸序列(例如，單堿基改變，單核苷酸多態(tài)性，藥物耐受性突變等)的一種高通量基因分型技術。在SNP的高度多重基因分型中使用分子倒置探針技術的方法是已知的。參見 Hardenbol et al. Genome Res. (2005) 15 269 以及 Hardenbol et al. (2003)Nat. Biotechnol. 21 6730在等位基因定量中分子倒置探針技術的應用也是已知的。參見Wang et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33^1)?？傮w上，MIP技術是針對在每個末端處與識別序列，并且可選地與一個或多個條形碼序列一起使用寡核苷酸探針。使該探針與靶(例如基因組)核酸序列雜交使得它形成環(huán)形結構，其中探針末端對接。這在感興趣的核酸序列的位置處留下一個單堿基缺口。具有缺口長度大于一個堿基的探針設計也用于其中希望捕獲較長靶DNA序列的測定中。然后在四個分開的反應(各自存在一個單一 dNTP種類)中對該缺口雙鏈體進行測試，其中成功的聚合反應和連接作用提供了等位基因差異。隨后從靶核酸序列中釋放出探針并且使用“通用”PCR引物對來擴增在適當?shù)牡任换?核苷酸反應組合中已經(jīng)共價環(huán)化的那些。選擇標簽以便具有類似Tm以及堿基組成并且在序列互補性方面最大地正交。根據(jù)本發(fā)明的多個方面，基于Hardenbol，Nature Biotech.，Vol. 21，No. 6.，6 June 1993 ；Hardenbol et al. , Genome Research,2005 ； 15 (2) :269-75 ；Fakhrai et al. (2003) Nature Biotech. 21 (6) :673 以及 Wang et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33 :el83 中所描述的方法使用分子倒置探針。該探針包括位于該探針末端或端部的與靶核酸序列 (例如，SNP、抗生素耐受性基因或類似物)具有同源性的兩個區(qū)域以及與所有探針共同的兩個PCR引物區(qū)域，以及兩個共同的切割位點?？梢匀芜x地包括通用的檢測標簽序列用于對擴增的探針進行陣列檢測。切割位點用于從靶核酸序列中釋放環(huán)化的探針并且用于擴增后加工。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了由此使用可共享探針池的多種方法。根據(jù)這個方面，以可收集和可擴增的(并且因此易于共享)方式在寡核苷酸芯片(例如，安捷倫 (Agilent))上產(chǎn)生了大量的和不同數(shù)量的MIP探針。每個MIP寡聚物在側(cè)翼上為可以去除的用于擴增的通用寡聚物。下面的方法用來分離雙鏈PCR產(chǎn)物的適當鏈以及用來去除上述的通用引物區(qū)域(1)使用該兩個引物之一上的一個或多個3’硫代磷酸化核苷酸 (3' phosphothioate nucleotide), (2)使用對3，或5，突出端(或其缺少)敏感的核酸外切酶，一個引物具有一個或多個dU并且可以通過USER(它是尿嘧啶DNA糖基化酶與DNA 糖基化酶-裂解酶內(nèi)切核酸酶VIII的混合物)去除，然后另一個引物具有rU，它可以通過堿來切割，(3)使用固相固定(例如磁珠鏈親合素)一個引物，其中使用堿或加熱解鏈(熔融，melting)該堿基對以選擇性地釋放另一條鏈，(4)使用不對稱PCR(使用過量的合乎要求的鏈的引物)以及( 通過將寡聚物工程化為具有不同長度(使用rU或dU方法亦或 2’ 0甲基基團來阻斷PCR延伸超過該2’ Ome)而通過兩條鏈的尺寸和/或電泳差異來使用分離。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，可以制造具有大于一個核苷酸的缺口并且不延伸分子倒置探針長度的分子倒置探針。根據(jù)一個方面，在連接反應過程中，該MIP的單鏈區(qū)域自由延伸遠超過常規(guī)的0.34nm/堿基并且自由地旋轉(zhuǎn)(與完美的CCC不同)?？商娲兀鶕?jù) Bates et al. (1989)EMBO J. 8 :1861中說明的方法可以制造非常小的DNA環(huán)。根據(jù)本發(fā)明， 針對較大靶標(目標)的較小MIP探針被認為在300個堿基對至900個堿基對的范圍內(nèi)更好地執(zhí)行，這對于外顯子和其他保守元件是有利的。在一些示例性實施方式中，將樣本核酸序列、多種探針以及耐熱的連接酶和聚合酶的混合物熱變性并且到達退火溫度。使靶向探針每個末端的兩個序列雜交到靶核酸序列中的互補位點上，產(chǎn)生在探針末端之間具有單核苷酸缺口的環(huán)形構象。根據(jù)一個替代實施方式，該缺口可以大于一個核苷酸。然后將基因組DNA分裂成四個分開的樣本。將未標記的dATP、dCTP、dGTP或dTTP添加到四個樣本的每一個中。在其中添加的核苷酸與單個堿基缺口互補的反應中，DNA聚合酶添加核苷酸并且DNA連接酶封閉該缺口從而形成一個共價封閉的環(huán)形分子，該分子環(huán)繞將它雜交到其上的基因組鏈。添加核酸外切酶用來消化當添加的核苷酸未與缺口互補時反應中的線性探針以及當環(huán)形分子形成時反應中過量的線性探針。然后將反應加熱用來使核酸外切酶失活。為了從樣本核酸序列中釋放出探針，添加尿嘧啶-N-糖基化酶用來使探針中的尿嘧啶殘基脫嘌呤。然后將混合物加熱用來在無堿基位點處切割分子并且從樣本核酸序列中將它釋放?？商娲?，可以通過與切割不同的方法從樣本核酸序列中去除該分子，由此以其環(huán)形形式留下該分子。然后可以進行擴增。用于擴增核酸的示例性方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)(參見例 ia, Mullis et al. (1986)Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.51 Pt 1 263 和 Cleary et al. (2004)Nature Methodsl :241 ；以及美國專利號 4，683，195 和 4，683，202)，錨式 PCR，RACE PCR，連接鏈式反應(LCR)(參見例如 Landegran et al. (1988) Science 241 :1077-1080 ；以及 Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 360-364)，自續(xù)式序列復制(自主序列復制，self sustained sequence replication) (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α. 87 :1874)，轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :1173), Q-β 復制酶(Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6 :1197)，遞歸式 PCR(Jaffe et al. (2000)，J. Biol. Chem. 275 :2619 ；以及 Williams et al. (2002)，J. Biol. Chem. 277 :7790)，美國專利號 6，391，544,6, 365，375、 6，294，323,6, 261，797,6, 124，090以及5，612，199中描述的擴增方法，等溫擴增(例如滾環(huán)擴增(RCA)，超分支滾環(huán)擴增(hyperbranched rolling circle amplification) (HRCA)， 鏈置換擴增(SDA)，螺旋酶依賴型擴增(HAD)，PWGA)或使用本領域技術人員熟知技術的任何其他核酸擴增方法，聚合酶和/或連接酶鏈式反應，熱循環(huán)(PCR)或等溫的方法(例如， RCA, hRCA, SDA, HAD, PWGA(環(huán)球網(wǎng)biohelix. com/technology, asp))。幾種適當?shù)腞CA方法是本領域已知的。例如，線性RCA通過聚合酶延伸的互補引物來擴增環(huán)狀DNA。這個過程產(chǎn)生了環(huán)狀DNA模板的串聯(lián)拷貝從而產(chǎn)生末端至末端串聯(lián)排列的DNA序列的多拷貝。指數(shù)RCA類似于線性過程，除了它使用與該DNA環(huán)具有相同序列的第二引物之外(Lizardi et al. (1998)Nat. Genet. 19 :225)。這種雙引物系統(tǒng)實現(xiàn)了等溫的指數(shù)擴增。指數(shù)RCA已經(jīng)用于通過使用在其兩個末端上結合到靶DNA連續(xù)區(qū)域上的線性探針來擴增非環(huán)狀DNA，緊接著使用DNA連接酶進行環(huán)化(例如，鎖式RCA) (Nilsson et al. (1994) Science 265(5181) :2085)。超分支RCA使用與滾環(huán)復制(RCR)產(chǎn)物互補的第二引物。這允許通過鏈置換機理來復制RCR產(chǎn)物，該機理可以在一等溫反應中產(chǎn)生十億倍擴增(Dahl et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 101 (13) :4548)?！熬酆厦告準椒磻被颉癙CR”是指一種用于通過同時引物延伸DNA的互補鏈進行體外擴增特定DNA序列的反應。換言之，PCR是一種用于制造在側(cè)翼上為引物結合位點的靶核酸多拷貝或復制的反應，這類反應包括下面步驟的一次或多次重復(i)使靶核酸變性，(ii)使引物退火到該引物結合位點上，以及(iii)在核苷三磷酸存在下通過核酸聚合酶來延伸引物。通常地，在熱循環(huán)儀儀器中通過針對每一步優(yōu)化的不同溫度將該反應循環(huán)。具體溫度、每一步的持續(xù)時間，以及步驟之間變化的速率取決于本領域普通技術人員熟知的多種因素，例如通過參考下面各項舉例說明的=McPherson et al.，editors, PCR =A Practical Approach \)JsR PCR2 :A Practical Approach ( ^vSiJ^ IRL Press, Oxford, 1991 和1995)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常規(guī)PCR中，可以在大于90°C的溫度下使雙鏈靶核酸變性，在50-75°C范圍內(nèi)的溫度下使引物退火，并且在72-78°C范圍內(nèi)的溫度下使引物延伸。術語“PCR”包括該反應的衍生形式，包括但不限于RT-PCR，實時PCR，巢式PCR，定量PCR，多重PCR等。反應體積范圍從數(shù)百納升(例如200nL)至數(shù)百微升(例如200微升)?！澳孓D(zhuǎn)錄PCR”或“RT-PCR”是指在逆轉(zhuǎn)錄反應之前的一種PCR，它將靶RNA轉(zhuǎn)化成互補的單鏈DNA，并且然后對該單鏈DNA進行擴增，例如Tecott等人，美國專利號5，168，038。 “實時PCR”是指隨著反應進行對反應產(chǎn)物數(shù)量例如擴增子進行監(jiān)測的一種PCR。存在多種形式的實時PCR，其差異主要在于用于監(jiān)測反應產(chǎn)物的檢測化學，例如Gelfand等人，美國專利號 5，210，015(" Taqman”) ；Wittwer 等人，美國專利號 6，174，670 和 6，569，627 (嵌入染料)；Tyagi等人，美國專利號5，925，517(分子信標)。實時PCR的檢測化學在Mackay et al. ,Nucleic Acids Research. 30 :1292-1305(2002)中進行了綜述。“巢式PCR”是指一種兩階段PCR，其中一個第一 PCR的擴增子成為使用一組新引物的對于第二 PCR的樣品，它們中至少之一結合到該第一擴增子的一個內(nèi)部位置上。如本文使用的，關于巢式擴增反應， “初始引物”是指用于產(chǎn)生第一擴增子的引物，而“第二引物”是指用于產(chǎn)生第二、或巢式、 擴增子的一個或多個引物?！岸嘀豍CR”是指其中在同一個反應混合物中多個靶序列(或一個單個靶序列和一個或多個參考序列)同時進行的一種PCR，例如Bernard et al. (1999) Anal. Biochem.，273 :221-228 (雙色實時PCR)。通常地，針對有待擴增的每個序列使用不同組的引物?！岸縋CR”是指設計用來測量樣本或樣品中的一種或多種特異性靶序列豐度的一種PCR。定量PCR包括這類靶序列的絕對定量和相對定量兩者。用于定量PCR的技術是本領域普通技術人員熟知的，如在下面參考文件中舉例說明的=Freeman et al., Biotechniques,26 :112-126(1999) ；Becker-Andre et al. ,Nucleic Acids Research, 17 9437-9447(1989) ；Zimmerman et al.，Biotechniques，21 :268-279(1996) ；Diviacco et al. , Gene,122 :3013-3020(1992) ；Becker-Andre et al.，Nucleic Acids Research,17 9437-9446(1989)等。在一些實施方式中，提供了確定一種或多種核酸序列(例如靶核酸序列)中該核酸序列的方法。可以使用本領域已知的多種測序方法實現(xiàn)靶核酸序列的確定，包括但不限于通過雜交測序(SBH)，通過連接測序(SBL)，定量遞增的熒光核苷酸添加測序 (QIFNAS)，逐步連接和切割，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，分子信標，TaqMan報告基因探針消化，焦磷酸測序，熒光原位測序(FISSEQ)，F(xiàn)ISSEQ珠(美國專利號7，425，431)，搖擺測序 (wobble sequencing) (PCT/US05/27695)，多重測序(于2008年2月6日提交的美國系列號 12/027，039 ；Porreca et al (2007) Nat. Methods4 :931)，聚合克隆(POLONY)測序(美國專利號 6，432，360,6, 485，944 和 6，511，803，以及 PCT/US05/06425)；納米格柵滾環(huán)測序(nanogrid rolling circle sequencing) (R0L0NY)(于 2008 年 5 月 14 日提交的美國系列號12/120，Ml)，等位基因特異性寡聚物連接測定法(例如寡聚物連接測定法(OLA)、 使用連接的線性探針以及滾環(huán)擴增(RCA)讀出的單模板分子0LA、連接的鎖式探針、和/或使用連接的環(huán)形鎖式探針和滾環(huán)擴增(RCA)讀出的單模板分子0LA)等。例如使用多種平臺(例如 Roche 454，Illumina Solexa，AB-SOLiD，Helicos，Polonator 平臺等)在環(huán)形陣列測序上還可以使用高通量測序方法。高通量測序方法在于2009年3月M日提交的美國系列號61/162，913中進行了說明。多種基于光的測序技術是本領域已知的(Landegren et al. (1998)Genome Res. 8 :769-76 ；Kwok(2000)Pharmocogenomics 1:95-100;以及 Shi (2001)Clin. Chem. 47 :164-172)。在一些示例性實施方式中，提供了用于鑒別病原體是否存在的方法。如本文使用的，術語“病原體”包括但不限于病原性生物體，例如病毒、細菌、真菌、寄生蟲、傳染性蛋白寸。病毒包括但不限于DNA或RNA動物病毒。如本文使用的，RNA病毒包括但不限于多個病毒科(virus families)，例如細小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒屬(polioviruses))，呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如，輪狀病毒屬(rotaviruses))，披膜病毒科(Togaviridae)(例如，腦炎病毒(encephalitis viruses),黃熱病毒(yellow fever virus),風疫病毒(rubella virus)),正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒(influenza viruses)),副粘病毒科 (Paramyxoviridae)(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus),麻疫病毒(measles virus),腿腺炎病毒(mumps virus),苜1J 流感病毒(parainfluenza virus))，彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病毒(rabies virus))，冠狀病毒科 (Coronaviridae)，布尼亞病毒禾斗(Bunyaviridae)，黃病毒禾斗(Flaviviridae)，纖絲病毒科(Filoviridae)，砂粒病毒科(Arenaviridae)，布尼亞病毒科(Bunyaviridae)以及逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，人T細胞淋巴營養(yǎng)病毒(人T細胞親淋巴病毒，human T cell lymphotropic viruses) (HTLV),人免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency viruses) (HIV))。如本文使用的，DNA病毒包括但不限于多種病毒科例如乳頭多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)(例如乳頭瘤病毒(papilloma viruses)),腺病毒科(Adenoviridae) (例如腺病毒(adenovirus))，皰疹病毒科(Herpesviridae)(例如，單純皰疹病毒(herpes simplex viruses))，以及痘病毒禾斗(Poxviridae)(例如天花病毒(variola viruses))。細菌包括但不限于革蘭氏陽性細菌，革蘭氏陰性細菌，耐酸細菌等。如本文使用的，革蘭氏陽性細菌包括但不限于放線菌科(Actinomedurae)，衣氏方文線菌(Actinomyces israelii)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、賭樣芽孢桿菌(蠟狀芽孢桿菌，Bacillus cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)破傷風梭菌(Clostridium tetani)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、獎腸球菌(Enterococcus faecalis)、單核細胞增生李斯特菌(單核細胞增多李斯特菌，Listeria monocytogene)、 諾卡氏菌(Nocardia)、痤疫丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm)、變異鏈球菌 (Streptococcus mutans)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)等。如本文使用的，革蘭氏陰性菌包括但不限于貓阿菲波菌屬(貓阿菲彼亞桿菌， Afipia felis)、類桿菌屬(Bactericides)、桿狀巴爾通體(Bartonella bacilliformis)、 百曰咳博德特菌(Bortadella pertussis)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、 回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis)、布魯菌屬(Brucella)、肉芽腫鞘桿菌(Calymmatobacterium granulomatis)、彎曲桿菌(Campylobacter)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、土拉熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)、陰道加德納菌 (Gardnerella vaginalis)、士矣及嗜血桿菌(Haemophilius aegyptius)、杜氏嗜血桿菌(Haemophilius ducreyi)、流感嗜血桿菌(Haemophilius influenziae)、幽門螺桿菌(Heliobacter pylori)、嗜月市軍團菌(Legionella pneumophila)、問號鉤端螺方寵體 (Leptospira interrogans)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidia)、牙銀口卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、其Jf式普羅威登其Jf菌(Providencia sturti)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸炎沙門菌(Salmonella enteridis)、傷寒沙門菌 (Salmonella typhi)、粘質(zhì)沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)、鮑氏志賀菌(Shigella boydii)、念珠狀鏈桿菌(Streptobaci 1 Ius moniliformis)、化胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、蒼白密螺旋體(Tr印onema pallidum)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、小腸結腸炎耳口爾森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耳口爾森菌(Yersinia pestis)等。如本文使用的，耐酸細菌包括但不限于鳥分支桿菌(Myobacterium avium)、麻風分枝桿菌(Myobacterium leprae)、結核分枝桿菌(Myobacterium tuberculosis)等。如本文使用的，未落在其他三個類別中的其他細菌包括但不限于漢氏巴爾通體(Bartonella henselae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原體 (Chlamydia trachomatis)、伯氏考克斯體(Coxiella burnetii)、月市炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、小株立克次體(Rickettsia akari)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)、恙蟲熱立克次體(Rickettsia tsutsugamushi)、斑疹傷寒立克次體(Rickettsia typhi)、解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum)、月市炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)、查菲埃立克體(Ehrlichia chafensis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、腦膜炎球菌(Meningococci)等。如本文使用的，真菌包括但不限于曲霉(Aspergilli)、假絲酵母屬(Candidae)、 白色念珠菌(Candida albicans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、隱球菌屬 (Cryptococci)、以及它們的組合。如本文使用的，寄生性微生物包括但不限于結腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli)、小球隱孢子蟲(小隱孢子蟲，Cryptosporidium parvum)、卡曼環(huán)孢子球蟲 (Cyclospora cayatanensis)、腦胞內(nèi)原蟲屬(Encephalitozoa)、溶組 只內(nèi)可米巴 (Entamoeba histolytica)、比氏腸胞微抱子蟲(Enterocytozoon bieneusi)、蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、利什曼原蟲屬(Leishmaniae)、瘧原蟲(Plasmodii)、鼠弓形體 (Toxoplasma gondii)、維蟲屬(Trypanosomae)、梯形阿米巴蟲(trapezoidal amoeba)等。如本文使用的，寄生蟲包括蠕蟲類(例如蠕蟲(helminthes))，尤其是寄生性蠕蟲類包括但不限于線蟲動物門(圓蟲類，例如，鞭蟲類(whipworms)、鉤蟲類、蟯蟲類、蛔蟲類、 絲蟲類等)，多節(jié)絳蟲亞綱(例如，絳蟲類(條蟲類，tapeworms))。如本文使用的，傳染性蛋白包括朊病毒類。由朊病毒引起的失調(diào)包括但不限于人類失調(diào)，例如克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease) (CJD)(包括例如醫(yī)源性克-雅二氏病(iCJD)、變異型克-雅二氏病(vCJD)、家族性克-雅二氏病(fCJD)、以及散發(fā)性克-雅二氏病(sCJD))，杰茨曼-斯脫司勒-史茵克綜合征(Gerstmann-Strausslerlcheinker syndrome) (GSS)，家族致命性失眠癥(fFI)，散發(fā)性致命性失眠癥(sFI)，庫魯病等，以及動物體內(nèi)的失調(diào)，例如瘙癢癥(綿羊和山羊)，牛海綿狀腦病(瘋牛病)(BSE)(牛)，傳染性水貂腦病(TME)(水貂)，慢性消耗性疾病(CWD)(駝鹿，黑尾鹿(mule deer))，貓海綿狀腦病 (貓)，外來有蹄類腦病(exotic ungulate enc印halopathy) (EUE)(尼牙藪羚，長角羚，大彎角羚)，鴕鳥的海綿狀腦病等。在一些示例性實施方式中，提供了預測、診斷和/或監(jiān)測一種或多種細胞增生性失調(diào)的方法。細胞增生性失調(diào)意在包括與快速增殖相關的失調(diào)。如本文使用的，術語“細胞增殖性失調(diào)”包括多種失調(diào)，其特征為多細胞生物體內(nèi)一個或多個細胞亞群不希望的或不適當?shù)脑鲋?。術語“癌”是指各種類型的惡性瘤，它們中的大多數(shù)可以侵入外圍組織，并且可以轉(zhuǎn)移到不同部位(參見例如PDR Medical Dictionary 1 st edition(1995)，出于所有目的通過引用將其全部內(nèi)容結合在此)。術語“瘤(neoplasm)”和“腫瘤(tumor) ”是指通過比正常情況更快地細胞增殖所生長的異常組織。同前。這種異常組織顯示部分地或全部地缺少結構組織以及與正常組織的功能協(xié)調(diào)(它可以是良性的(例如良性腫瘤)或惡性的 (例如惡性腫瘤))。意在被本發(fā)明包括的瘤類型的實例包括但不限于與神經(jīng)組織、血液形成組織、乳 (胸部)、皮膚、骨、前列腺、卵巢、子宮、子宮頸、肝、肺、腦、喉、膽囊、胰腺、直腸、甲狀旁腺、 甲狀腺、腎上腺、免疫系統(tǒng)、頭和頸、結腸、胃、支氣管、和/或腎的癌相關的那些瘤。對于其中對全細胞、病毒或其他組織樣本進行分析的那些實施方式，典型地將有必要在繼續(xù)進行不同樣本制備操作之前，從細胞或病毒中提取核酸。因此，在樣本收集之后，可以從收集的細胞、病毒衣殼等中釋放核酸進入粗提取物中，緊接著進行額外處理來制備樣本用于隨后操作，例如污染(DNA結合)蛋白的變性、純化、過濾、脫鹽等。從樣本細胞或病毒中釋放核酸，使DNA結合蛋白的變性一般可以通過化學的、物理的、或電解的溶解方法來實現(xiàn)。例如，化學方法一般使用溶解試劑來破裂細胞并且從細胞中提取核酸，緊接著用離液鹽例如異硫氰酸胍或脲處理提取物從而使任何污染的和潛在地干擾蛋白變性?？傮w上，當使用化學提取和/或變性方法時，可以將適當?shù)脑噭┙Y合到樣品制備室、分離的可進入室中，或者可以外部引入。在提取之后，通常可以期望的是從粗提取物的其他元件中(例如變性的蛋白、細胞膜顆粒、鹽等)分離這些核酸。去除微粒物質(zhì)一般通過過濾、絮凝或類似方法來實現(xiàn)?？梢詫⒍喾N過濾器類型容易地結合到該設備中。此外，當使用化學變性方法時，可以期望的是在進行下一步之前將該樣本脫鹽。樣本脫鹽和分離核酸一般可以在單一步驟中實現(xiàn)，例如通過將核酸結合到固相上并且洗掉污染鹽類或?qū)颖具M行凝膠過濾層析，使鹽通過透析膜等。用于核酸結合的適當固體載體包括例如硅藻土、硅石(例如，玻璃棉)或類似物。適當?shù)哪z排阻介質(zhì)(也是本領域熟知的)也可以容易地結合到本發(fā)明的設備中，并且可以從例如 Pharmacia 禾口 Sigma Chemical 商購。在一些應用中(例如測量來自病人血液的稀有細胞中的靶多核苷酸)，在進行測定之前可以例如通過免疫磁分離、熒光細胞分選、或其他這類技術執(zhí)行富集步驟?？梢允褂帽绢I域已知的多種技術和材料來進行這類分離或富集，如在下面的代表性參考文獻中披露的Terstappen等人，美國專利號6，365，362 ；Terstappen等人美國專利號5，646，001 ； Rohr等人，美國專利號5，998，224 ；Kausch等人，美國專利號5，665，582 ；Kresse等人，美國專利號6，048，515 ；Kausch等人，美國專利號5，508，164 ；Miltenyi等人，美國專利號 5，691，208 ；Molday，美國專利號 4，452，773 ；Kronick，美國專利號 4，375，407 ；Radbruch 等入，Chapter 23, in Methods in Cell Biology,Vol. 42(Academic Press,New York,1994)； Uhlen 等人，Advances in Biomagnetic Separation (Eaton Publishing, Natick, 1994)； Safarik 等人，J. Chromatography B, 722 :33-53(1999) ；Miltenyi 等人，Cytometry,11 231-238(1990) ；Nakamura 等人，Biotechnol. Prog.，17 :1145-1 155(2001) ；Moreno 等人， Urology, 58 :386-392(2001) ；Racila 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. , 95 :4589-4594 (1998)； Zigeuner 等人，J. Urology, 169 :701-705 (2003) ；Ghossein 等人，Seminars in Surgical Oncology,20 :304-311(2001)。本文使用的核酸化學、生物化學、遺傳學、以及分子生物學的術語和符號遵循本領域中的標準論述和文本的那些，例如Komberg and Baker, DNA Replication,Second Edition(W. H. Freeman, New York,1992) ；Lehninger, Biochemistry, Second Edition(Worth Publishers, New York,1975) ；Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition(Wiley-Liss, New York,1999) ；Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs :A Practical Approach(Oxford University Press, New York,1991) ；Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1984)等?！盎パa”或“基本上互補”是指核苷酸或核酸之間(像例如雙鏈DNA分子的兩個鏈之間或一個寡核苷酸引物與單鏈核酸上的一個引物結合位點之間)雜交或堿基配對或形成雙鏈體?；パa的核苷酸通常是A和T(或A和U)，或C和G。當一個鏈的核苷酸(最佳地比對和比較的并且具有適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?與另一個鏈的至少約80%核苷酸配對時(通常是至少約90%至95%，并且更優(yōu)選地從約98%至100% )，兩個單鏈RNA或DNA分子被稱為是基本上互補的?？商娲?，當在選擇的雜交條件下一個RNA或DNA鏈可以雜交到其互補物上時，存在實質(zhì)的互補性。典型地，當在至少14至25個核苷酸的一段序列上存在至少約65%互補性時(優(yōu)選地至少約75%，更優(yōu)選至少約90%互補性)，可以發(fā)生選擇性雜交。參見Kanehisa(1984)Nucl. Acids Res. 12 :203。根據(jù)本發(fā)明，有用的MIP引物序列雜交到側(cè)翼為待捕獲的核苷酸堿基或堿基系列的序列上。“復合物”是指彼此直接或間接接觸的分子組裝體或聚集體。一方面，關于分子復合物或關于特異性或特異性結合，“接觸”，或更具體地，“直接接觸”是指兩個或更多分子足夠接近使得吸引性非共價相互作用例如范德華力、氫鍵、離子鍵以及疏水相互作用等主導了分子的相互作用。在這樣的方面中，分子復合物是穩(wěn)定的因為在這些測定條件下該復合物在熱力學方面比其組分分子的未聚集或未復合狀態(tài)更有利。如本文使用的，“復合體”是指多核苷酸的雙鏈體或三鏈體或兩種或更多種蛋白的穩(wěn)定聚集體。就后者而言，通過抗體特異性結合到其相應的抗原上形成一種復合物?！半p鏈體”是指全部或部分互補的至少兩個寡核苷酸和/或多核苷酸在其核苷酸全部或大多數(shù)中經(jīng)歷沃森-克里克(Watson-Crick)類型堿基配對從而形成一種穩(wěn)定的復合物。術語“退火”和“雜交”可互換地使用，用來指形成一種穩(wěn)定的雙鏈體。一方面，穩(wěn)定的雙鏈體是指通過嚴格(例如包括下面各項的條件溫度為小于該雙鏈體的鏈的Td々5°C，以及低單價鹽濃度，例如小于0. 2M，或小于0. 1M)洗滌而未破壞的一種雙鏈體結構。關于雙鏈體，“完美匹配”是指組成雙鏈體的多核苷酸或寡核苷酸鏈彼此形成一種雙鏈結構使得每個鏈中每個核苷酸與另一個鏈中的一個核苷酸經(jīng)歷沃森-克里克堿基配對。術語“雙鏈體” 包括可以使用的核苷類似物的配對，例如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤堿基的核苷、PNA等。 雙鏈體中兩個寡核苷酸或多核苷酸之間的“錯配”是指該雙鏈體中的一對核苷酸未能經(jīng)歷沃森-克里克結合。關于基因組或靶多核苷酸，“基因位點”或“基因座”是指該基因組或靶多核苷酸的一個連續(xù)亞區(qū)或區(qū)段。如本文使用的，基因位點或基因座可以指核苷酸、基因、或基因的一部分在基因組(包括線粒體DNA)中的位置，或它可以指基因組序列任何連續(xù)部分無論它是否在基因內(nèi)或與基因相關聯(lián)。一方面，基因位點是指基因組序列(包括線粒體DNA)長度從一個單核苷酸至數(shù)百個(例如100-300)核苷酸的一個區(qū)段的任何部分。通常地，可以通過其核苷酸序列或鄰近或側(cè)翼區(qū)之一或兩者的一個或多個核苷酸序列鑒別出特定基因位點。另一方面，基因位點是指基因的表達的核酸產(chǎn)物，例如其RNA分子或cDNA拷貝?！半s交”是指其中兩個單鏈多核苷酸非共價地結合從而形成一個穩(wěn)定的雙鏈多核苷酸的過程。術語“雜交”還可以指三鏈雜交。得到的(通常地)雙鏈多核苷酸是“雜交體” 或“雙鏈體”。“雜交條件”典型地可以包括鹽濃度小于約1M，更通常地小于約500mM，并且甚至更通常地小于約200mM。雜交溫度可以低至5°C，但是典型地高于22°C，更典型地高于約30°C并且通常超過約37°C。通常在嚴格條件下進行雜交，即在其中探針可以雜交到其靶子序列的條件下。嚴格條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中是不同的。較長的片段可能需要較高的雜交溫度進行特異性雜交。因為其他因素可以影響雜交的嚴格性(包括堿基組成以及互補鏈的長度，有機溶劑的存在以及堿基錯配的程度)，參數(shù)的組合比單獨任何一項的絕對測量值更重要?？傮w上，選擇嚴格條件是在定義的離子強度和PH下比特定序列的Tm 低約5°C。示例性的嚴格條件包括在pH 7. 0至8. 3并且溫度為至少25°C下鹽濃度為至少 0. OlM至不大于IM Na離子濃度(或其他鹽類)。例如，5XSSPE (750mM NaCl、50mM磷酸鈉、 5mM EDTA，pH 7.4)和25_30°C溫度的條件適合于等位基因特異性探針雜交。關于嚴格條件參見例如 Sambrook,Fritsche and Maniatis,Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)以及Anderson Nucleic Acid Hybridization, 1st Ed. ,BIOS Scientific Publishers Limited(1999)。“特異性雜交到...上”或“特異性地雜交到...上”或類似表達是指當該序列存在于復合體混合物(例如全細胞)DNA或RNA 中時，在嚴格條件下使一個分子實質(zhì)性地結合、形成雙鏈、或雜交到或僅結合、形成雙鏈、或雜交到一個或多個特定核苷酸序列上?！盎陔s交的測定”是指依賴于由于特異性結合事件形成穩(wěn)定復合體的任何測定。 一方面，基于雜交的測定是指依賴于在探針和靶核苷酸序列之間形成穩(wěn)定雙鏈體或三鏈體用于檢測或測量這樣序列的任何測定。一方面，這類測定的探針在從8至100個核苷酸的范圍內(nèi)退火到靶序列的區(qū)域上(或與其形成雙鏈體)；或在其他方面中，它們在從8至40個核苷酸的范圍內(nèi)，或更通常地在從8至20個核苷酸的范圍內(nèi)退火到靶序列上。關于基于雜交的測定，“探針”是指具有一種序列的多核苷酸，該序列能夠與靶核酸中的其互補物形成穩(wěn)定的雜交體(或三鏈體)并且能夠被直接地亦或間接地檢測出來?；陔s交的測定包括但不限于使用一個或多個寡核苷酸特異性堿基配對作為靶識別組分的測定，例如聚合酶鏈式反應，NASBA反應，寡核苷酸連接反應，單堿基延伸反應，可環(huán)化探針反應，等位基因特異性寡核苷酸雜交(處于溶液相中亦或結合到固相載體上，例如微陣列或微珠粒等)。基于雜交測定的一種重要亞類包括這類測定它們具有雜交步驟之后至少一個酶處理步驟。這個亞類的基于雜交的測定包括但不限于聚合酶鏈式反應，NASBA反應，寡核苷酸連接反應，切割酶反應(例如在INVADER 測定中)，單堿基延伸反應，探針環(huán)化反應等。在文獻中在基于雜交測定方面存在廣泛的指導，例如 Hames et al. ， editors, Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach(IRL Press,Oxford,1985) ；Tijssen,Hybridization with Nucleic Acid Probes,Parts I & II (Elsevier Publishing Company,1993) ；Hardiman,Microarray Methods and Applications (DNA Press,2003) ；Schena, editor, DNA Microarrays a Practical Approach (IRL Press, Oxford，1999)等。一方面，基于雜交的測定是溶液相測定；即在對反應速率基本上沒有表面效應或影響的條件下探針和靶序列兩者雜交。溶液相測定包括下面的情況，其中探針亦或靶序列附連到微珠粒上從而使得附連的序列具有基本上與自由序列相同的環(huán)境(例如允許試劑接入等)。另一方面，基于雜交的測定包括其中抗體使用基于擴增的核酸報告基因的免疫測定。在這類測定中，在分開的反應中抗體探針特異性地結合到靶分子(例如蛋白)上，此后這些反應的產(chǎn)物(即抗體-蛋白復合物)相結合并且對核酸報告基因進行擴增。優(yōu)選地，這類核酸報告基因包括通過酶促的方式轉(zhuǎn)化成標記的寡核苷酸標簽用于在微陣列上進行分析的寡核苷酸標簽(如下所描述)。下面示例性參考文獻披露了用于免疫測定的抗體-核酸結合物=Baez等人，美國專利號6，511，809 ； Sano等人，美國專利號5，665，539 ；Eberwine等人，美國專利號5，922，553 ；Landegren等人，美國專利號6，558，928 ；Landegren等人，美國專利
發(fā)明者喬治·M·丘奇, 阿德耶米·阿德索卡恩 申請人:哈佛大學校長及研究員協(xié)會