生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)的前處理和檢測方法、及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物的前處理方 法、檢測方法、檢測試劑盒及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括多巴胺（DA)、去甲腎上腺素（NE)、腎上腺素（E)、 5_羥色胺（5-HT)等，是人腦內(nèi)神經(jīng)元普遍存在的、十分重要的物質(zhì)，在人體神經(jīng)、心血管、 內(nèi)分泌等組織系統(tǒng)起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，對情緒、情感、應(yīng)激行為、睡眠覺醒等生理活動有 重要影響。
[0003] 生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物的含量變化與多種疾病密切相關(guān)，是診斷嗜鉻細 胞瘤、阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據(jù)。同時，生物原胺類 神經(jīng)遞質(zhì)還可用作診療性藥物，如去甲腎上腺素和腎上腺素是心肺復(fù)蘇的主要藥物、多巴 胺是重要的抗休克和治療急慢性腎功能衰竭的藥物。因此，生物樣品中生物原胺類神經(jīng)遞 質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量的準確測定對于疾病診斷和控制、藥物開發(fā)與治療及基礎(chǔ)醫(yī)學研究具 有重要意義。尤其在神經(jīng)精神藥物研究領(lǐng)域，生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定的疾病診斷及 藥物療效評價作用更加突出。
[0004] 生物樣品中生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量很低，特別是代謝產(chǎn)物，其 含量通常僅達到pg/mL至ng/mL數(shù)量級，再加上生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定 性差，在光照和堿性條件下容易發(fā)生氧化分解，這就進一步降低了生物樣品中生物原胺類 神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量；而且，生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的熒光響應(yīng)和質(zhì) 譜響應(yīng)信號較弱；這就導(dǎo)致難以對生物樣品中生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量進 行準確檢測。
[0005] 早期采用電化學方法測定樣品中生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，但生物樣品基質(zhì)復(fù) 雜，內(nèi)源性物質(zhì)和生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間、不同種生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間的干擾較多， 導(dǎo)致采用電化學方法測定含量存在極大困難。尤其對于大鼠微滲析樣品，由于其生物原胺 類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物含量的很低，因此一直難以準確檢測。
[0006] 近來，生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量檢測取得了一些進展，包括采用 質(zhì)譜進行檢測，質(zhì)譜相比其他檢測儀器，靈敏度更高，并且能夠?qū)?nèi)源性物質(zhì)和生物原胺類 神經(jīng)遞質(zhì)之間、不同種生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間的干擾大幅降低。但生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì) 及其代謝產(chǎn)物在質(zhì)譜的反相色譜柱上保留極弱，且普遍含有的酚羥基使得離子化效率降 低，使得質(zhì)譜響應(yīng)信號減弱，制約了質(zhì)譜檢測靈敏度的發(fā)揮。對于這一問題，目前的做法是 將生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物中導(dǎo)致質(zhì)譜信號減弱或穩(wěn)定性降低的基團進行衍生 化處理，以提高檢測靈敏度。但衍生化處理的缺點是引入了高濃度的強酸或強堿鹽，這些鹽 類物質(zhì)不僅會干擾質(zhì)譜信號，而且對色譜柱乃至液質(zhì)體系的壽命都會造成影響，因此必須 盡可能在檢測前去除這些鹽類物質(zhì)。
[0007] 已有的液液萃取和離線固相萃取除鹽前處理技術(shù)，都需要在萃取后進行再濃縮， 這使得前處理變得步驟繁雜；而且，生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，濃縮等 方法會造成生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)的降解，回收率降低。
[0008] 目前尚須新的生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的前處理方法及檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明給出一種生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)和/或其代謝產(chǎn)物的前處理方法，該前處理 方法能去除衍生化產(chǎn)生的鹽類、未反應(yīng)的生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)原形雜質(zhì)，減少雜質(zhì)對檢測 造成的影響；同時能夠?qū)⒀苌a(chǎn)物快速洗脫并以適宜濃度轉(zhuǎn)移至后續(xù)檢測步驟。在此基 礎(chǔ)上，本發(fā)明還給出了生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)和/或其代謝產(chǎn)物的檢測方法，該方法能夠準 確、快速測定生物樣品中生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)和/或其代謝產(chǎn)物的含量、靈敏度高。并且， 避免了生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在測定處理過程中不穩(wěn)定的問題。在此基礎(chǔ)上， 進而給出一種生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)和/或其代謝產(chǎn)物的檢測試劑盒。
[0010] 本發(fā)明一方面提供了一種生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)和/或其代謝產(chǎn)物的前處理方法， 包括將含有生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)和/或其代謝產(chǎn)物的樣品衍生化，以及將衍生化產(chǎn)物進行 在線固相萃取的步驟。
[0011] 本發(fā)明任一項實施方式中，所述前處理方法包含如下（1)-(9)的任意一項或者多 項：
[0012] (1)在線固相萃取的流動相為水和乙腈；
[0013] (2)在線固相萃取的富集階段，乙腈和水的體積比為（5-15) :(85-95)或（5-20): (80-95);具體為 5 :95、10 :90、15 :85 或 20 :80 ;
[0014] (3)在線固相萃取的轉(zhuǎn)移階段，乙腈和水的體積比為（85-100) :(0-15);具體為 85:15、90:10、95 :5 或 100:0 ;
[0015] (4)在線固相萃取的轉(zhuǎn)移階段，流動相的流速為0. 2-1. OmL/min ;
[0016] (5)在線固相萃取的柱活化階段，乙腈和水的體積比為（5-15) :(85-95)或 (5-20) : (80-95);具體為 5 :95、10:90、15 :85 或 20 :80 ;
[0017] (6)在線固相萃取流動相的洗脫程序為：乙腈5-15v/v% (0min，0. 2-lmL/min)- 乙臆 5_15v/v % (2-5min，0.2-1.0mL/min)-乙臆 85-lOOv/v % (5-8min，0.2-1.0mL/ min)-乙臆 85-lOOv/v% (8_12min，0.2-1. OmL/min)-乙臆 85-lOOv/v% (8. 5-12. 5min， 0· 2-1. OmL/min)-乙臆 85-100v/v % (9_13min，0· 2-1. OmL/min)-乙臆 5_15v/v % (9. 5-13. 5min, 0. 2-1. OmL/min)-乙臆 5-15v/v% (10. 5-14. 5min，0· 2-1. OmL/min)-乙臆 5-15v/v% (12. 5-16. 5min,0. 2-1. OmL/min)；
[0018] (7)在線固相萃取柱為SPE柱、預(yù)柱或色譜柱；
[0019] (8)在線固相萃取柱的填料為以硅膠和/或其修飾物為基質(zhì)的封端或未封端的反 相碳十八、以硅膠和/或其修飾物為基質(zhì)的封端或未封端的反相碳八、弱陽離子交換萃取 柱、強陽離子交換萃取柱、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱、氧化鋁萃取柱和HILIC萃取 柱中的一種或多種；
[0020] (9)在線固相萃取柱為美國 Thermo 公司的 Retain PEP Javelin, IOmmX 2. 1mm，或 者 HYPERSIL ODS 預(yù)柱，20 X 4mm，5 μ m。
[0021] 本發(fā)明任一項實施方式中，所述前處理方法包含如下（1)-(13)的任意一項或者 多項：
[0022] (1)衍生化是樣品與衍生化試劑反應(yīng)；
[0023] (2)衍生化試劑的結(jié)構(gòu)含有與芳環(huán)連接的磺酰氯基或酰氯基；具體地，還含與芳 環(huán)連接的胺基；更具體地，含對位或間位胺基；進一步具體地，胺基為伯胺、仲胺或者叔胺；
[0024] (3)衍生化試劑為2-氯苯磺酰氯、3-氯苯磺酰氯、4_(氯磺酰）異氰酸苯酯、 4-氯苯磺酰氯、苯磺酰氯、2, 3, 4-三氟苯磺酰氯、2, 3-二氯苯磺酰氯、2, 4, 5-三氯苯磺酰 氯、2, 4, 6-三氯苯磺酰氯、2, 4-二氟苯磺酰氯、2, 4-二溴苯磺酰氯、2, 4-二硝基苯磺酰氯、 2, 5-二氟苯磺酰氯、2, 5-二氯苯磺酰氯、2, 5-二溴苯磺酰氯、2, 6-二氟苯磺酰氯、2-(三 氟甲基）苯磺酰氯、2-氟苯磺酰氯、2-氯-4-(三氟甲基）苯磺酰氯、2-氯-4-氟苯磺酰 氯、2-氯-4-氰基苯磺酰氯、2-氰基苯磺酰氯、2-溴-4, 6-二氟苯磺酰氯、2-溴苯磺酰氯、 2_溴-4-氟苯磺酰氯、2-甲基-5-硝基苯磺酰氯、2-硝基苯磺酰氯、3, 4, 5-三氟苯磺酰氯、 3, 4-二氟苯磺酰氯、3, 4-二氯苯磺酰氯、3, 5-二氟苯磺酰氯、3, 5-二氯-2-羥基苯磺酰 氯、3, 5-二氯苯磺酰氯、3, 5-二甲基苯磺酰氯、3-(三氟甲基）苯磺酰氯、3-氟-4-甲基苯 磺酰氯、3_氟苯磺酰氯、3-氯-2-氟苯磺酰氯、3-氯-4-甲基苯磺酰氯、3-氰基-4-氟苯 磺酰氯、3-氰基苯磺酰氯、3-溴苯磺酰氯、3-甲氧基苯磺酰氯、3-硝基苯磺酰氯、4, 4' -亞 甲基雙（苯磺酰氯）、4-(三氟甲基）苯磺酰氯、4-(溴甲基）苯磺酰氯、4-(甲磺酰）苯磺 酰氯、4-乙酰基苯磺酰氯、4-叔丁基苯磺酰氯、4-異丙基苯磺酰氯、4-氟-2-甲基苯磺酰 氯、4_氟苯磺酰氯、4-氯-2-硝基苯磺酰氯、4-氯-3-硝基苯磺酰氯、4-氰基苯磺酰氯、 4-溴-2, 5-二氟苯磺酰氯、4-溴-2, 6-二氯苯磺酰氯、4-溴-2-氟苯磺酰氯、4-溴-2-氯 苯磺酰氯、4-溴-3-氟苯磺酰氯、4-溴-3-甲基苯磺酰氯、4-溴苯磺酰氯、4-甲基-3-硝 基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-甲氧基苯磺酰氯、4-硝基苯磺酰氯、4-碘苯磺酰氯、 4- 苯氧基苯磺酰氯、5-氟-2-甲基苯磺酰氯、5-氯-2-氟苯磺酰氯、五氟苯磺酰氯、五甲基 苯磺酰氯、2, 4, 6-三異丙基苯磺酰氯、2, 4-二甲氧基苯磺酰氯、2, 5-二甲氧基苯磺酰氯、 2, 5-雙（三氟甲基）苯磺酰氯、2-(三氟甲氧基）苯磺酰氯、2-溴-4-(三氟甲基）苯磺酰 氯、2-溴_5_(二氟甲基）苯磺酰氯、2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯、2-硝基_4_(二氟甲基） 苯