專利名稱：Cdc45l作為腫瘤標志物和癌癥治療靶的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及肺癌，更具體地，涉及肺癌的診斷和治療。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肺癌是全世界首要的癌癥死亡原因(NPL 1)。已經(jīng)報告了肺癌發(fā)生中牽涉的許多遺傳改變，但是精確的分子機制仍然不清楚(NPL 2)。在過去幾十年里，細胞毒劑，包括帕利他賽(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、和長春瑞濱 (vinorelbine)，開始為晚期NSCLC患者提供多種治療選項，然而，與基于順鉬的療法相比， 那些方案提供有限的存活好處(NPL3)。在這些細胞毒性藥物之外，開發(fā)了數(shù)種分子靶向劑， 諸如針對VEGF(即貝伐單抗(bevacizumab)/抗VEGF)或EGFR(即西妥昔單抗(cetuximab)/ 抗EGFR)的單克隆抗體以及EGFR酪氨酸激酶的抑制劑(即吉非替尼(gefitinib)和埃羅替尼(erlotinib))，而且現(xiàn)在廣泛用于臨床實踐(NPL 4-6) 0每一種新方案能給有限比例的患者提供存活好處。因此，急切期待新治療策略，諸如開發(fā)適用于絕大多數(shù)患者且毒性較小的更有效的分子靶向劑。為了分離用于診斷、治療、和/或預防肺癌的潛在分子靶，使用由27，648種基因或表達序列標簽(EST)組成的cDNA微陣列，對通過激光顯微解剖自101例肺癌組織純化的癌細胞實施基因表達概況的基因組范圍分析(NPL7-12)。為了驗證各基因產(chǎn)物的生物學和臨床病理學意義，建立了使用臨床肺癌材料的腫瘤組織微陣列分析與RNA干擾(RNAi)技術(shù)和細胞生長/侵襲測定法的組合的篩選系統(tǒng)(NPL 13-37)。在芽殖酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中，CDC45細胞分裂周期 45-細胞(cell division cycle 45-cell，CDC45)基因是啟動DNA復制所需的一種必需基因，而且它與MCM和CDC6蛋白一起形成在真核細胞中啟動DNA復制必需的復合物(NPL 38)。酵母⑶C45基因的人同系物，稱作⑶C45L，編碼566個氨基酸的蛋白質(zhì)且與酵母⑶C45 顯示27. 6%同一性(NPL39)。CDC45L在HeLaS3細胞中與延伸DNA聚合酶δ和-ε，及與 GINS復合物的成分以及與推定的復制性DNA螺旋酶復合物的亞基MCM5和-7相互作用(NPL 40)。已經(jīng)報告了癌細胞系的正在增殖的細胞群中較高水平的⑶C45蛋白表達(NPL
41)。然而，尚未闡明CDC45L激活在癌癥發(fā)生和進展中的作用。另一方面，小整合頻率l(petite integration frequency 1，PIF1)基因最初是在釀酒酵母中鑒定的，并歸類為自酵母至人保守的SFI 5'至3' DNA螺旋酶的一個成員(NPL
42)。PIFl在酵母中的功能涉及mtDNA修復、rDNA復制和調(diào)節(jié)端粒長度(NPL42,43)。另外，認為酵母PIFl是一種區(qū)域特異性的DNA螺旋酶，因為它在體外需要一種特定DNA結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)高效DNA的解開且以5'至3'方向解開DNA(NPL 43)。雖然PIFl樣螺旋酶存在于多種生物體中，但是大多數(shù)研究是在酵母物種中進行的，而且關于PIFl在哺乳動物細胞中的功能及它在癌發(fā)生中的作用知道的很少。引用表專利文獻[PTL 1]W02007/013671[PTL 2]61/217，133非專利文獻[NPL 1]Jemal A, et al. CA Cancer J Clin. 2008 ；58 :71-96.[NPL 2]Sozzi G. European Journal of Cancer 2001 ；37Suppl 7 :S63_S73.[NPL 3]Schiller JH, et al. N Engl J Med 2002 ；346 :92-8.[NPL 4] Sandler A, et al. N Engl J Med 2006 ；355 :2542-50.[NPL 5] Shepherd FA, et al. N Engl J Med 2005 ；353 :123-32.[NPL 6]Thatcher N. Lung Cancer 2007 ；57Suppl 2 :S18_23.[NPL 7]Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53.[NPL 8]Kikuchi Τ,et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205.[NPL 9]Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003 ；1 :485-99.[NPL 10]Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004 ； 13 :3029-43.[NPL IlJKikuchi T，et al. Int J Oncol 2006 ；28 :799-805.[NPL 12]Taniwaki Μ, et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75.[NPL 13] Suzuki C, et al. Cancer Res 2003 ；63 :7038-41.[NPL 14] Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004 ； 10 :8363-70.[NPL 15]Kato Τ, et al. Cancer Res 2005 ；65 :5638-46.[NPL 16]Furukawa C, et al. Cancer Res 2005 ；65 :7102-10.[NPL 17] Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005 ；65 :9176-84.[NPL 18]Suzuki C,et al. Cancer Res 2005 ；65 :11314-25.[NPL 19] Ishikawa N, et al. Cancer Sci 2006 ；97 :737-45.[NPL 20] Takahashi K, et al. Cancer Res 2006 ；66 :9408-19.[NPL 21]Hayama S, et al. Cancer Res 2006 ；66 :10339-48.[NPL 22]Kato Τ, et al. Clin Cancer Res 2007 ； 13 :434-42.[NPL 23] Suzuki C, et al. Mol Cancer Ther 2007 ；6 :542-51.[NPL 24] Yamabuki Τ, et al. Cancer Res 2007 ；67 :2517-25.[NPL 25]Hayama S, et al. Cancer Res 2007 ；67 :4113-22.[NPL 26]Taniwaki Μ, et al. Clin Cancer Res 2007 ；13 :6624-31.[NPL 27] Ishikawa N, et al. Cancer Res 2007 ；67 :11601-11.[NPL 28]Mano Y, et al. Cancer Sci 2007 ；98 :1902-13.[NPL 29]Kato Τ, et al. Cancer Res 2007 ；67 :8544-53.[NPL 30]Kato Τ, et al. Clin Cancer Res 2008 ； 14 :2363-70.[NPL 31]Dunleavy EM, et al. Cell 2009 ；137 :485-97.[NPL 32]Hirata D，et al. Clin Cancer Res 2009，15 :256-66.[NPL 33]Takano A,et al. Cancer Res(2009in press)
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發(fā)明概述在篩選用于人癌癥診斷、治療和預防的新分子靶物的過程中，結(jié)合激光顯微解剖在含有27，648種基因的cDNA微陣列上實施了對267例肺癌的基因組范圍表達概況分析 (Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10 ；22 (14) :2192-205 ；Kikuchi T, et al. Int J Oncol. 2006Apr ；28 (4) :799-805 ；Kakiuchi S, et al. ， Mol Cancer Res. 2003May ； 1(7) 485-99 ；Kakiuchi S, et al. , Hum Mol Genet. 2004Dec 15 ；13 (24) :3029-43. Epub 2004 Oct 20 ；Taniwaki Μ, et al.，Int J Oncol. 2006Sep ；29 (3) :567-75)。結(jié)果證明了 CDC45L 基因在絕大多數(shù)原發(fā)性肺癌中頻繁過表達。還有，發(fā)現(xiàn)PIFl基因——該基因被鑒定為編碼與⑶C45L蛋白相互作用的蛋白質(zhì)——在肺癌中過表達。另外，針對這些基因的siRNA有效遏制癌細胞增殖。這些結(jié)果提示CDC45L基因和PIFl基因會變成較好的用于癌癥診斷或治療的分子靶物。因此，本發(fā)明涉及通常在腫瘤中上調(diào)的癌癥相關基因⑶C45L和PIF1，及用于為使用CDC45L和/或PIFl的癌癥治療開發(fā)分子靶向藥物的策略。在一個方面，本發(fā)明提供利用⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平作為指標來診斷癌癥，例如過表達CDC45L基因和/或PIFl基因的癌癥，例如肺癌的方法。在本發(fā)明的方法中，可借助適宜的引物或探針來檢測⑶C45L或PIFl基因的mRNA，或者可借助抗⑶C45L 或PIFl抗體來檢測⑶C45L或PIFl蛋白，以測定基因的表達水平。在一些實施方案中， ⑶C45L和/或PIFl介導或促進所述癌癥。在一些實施方案中，所述癌癥是肺癌。在一個實施方案中，所述癌癥是肺腺癌(ADC)、肺鱗狀細胞癌(SCC)、和肺大細胞癌(LCC)、或小細胞肺癌(SCLC)。本發(fā)明還提供利用CDC45L的表達水平作為指標來預測癌癥，例如肺癌受試者的進展的方法。另外，本發(fā)明提供利用⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平或⑶C45L和/或PIFl 蛋白的生物學活性作為指標來預測癌癥，例如肺癌患者的預后的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供利用對⑶C45L和/或PIFl多肽的結(jié)合、⑶C45L 和/或PIFl基因的表達水平、或CDC45L和/或PIFl多肽的生物學活性作為指標來篩選用于治療或預防癌癥，例如肺癌的候選化合物的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供利用CDC45L多肽與PIFl多肽之間的相互作用作為指標來篩選用于治療或預防癌癥，例如肺癌的候選化合物的方法。
在又一個實施方案中，本發(fā)明提供針對⑶C45L或PIFl基因，抑制該基因表達的雙鏈分子，例如siRNA，及編碼該雙鏈分子的載體。本發(fā)明的雙鏈分子可用于治療或預防癌癥， 例如⑶C45L和/或PIFl介導的、或緣于⑶C45L和/或PIFl過表達的癌癥，例如肺癌。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在受試者中治療或預防癌癥的方法，包括對所述受試者施用藥學有效量的針對CDC45L基因或PIFl基因的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體，其中該雙鏈分子在導入表達CDC45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制細胞增殖以及該基因表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療或預防癌癥的組合物，其包含針對 CDC45L或PIFl的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體，和藥學可接受載體，其中該雙鏈分子在導入表達⑶C45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制細胞增殖以及該基因表達。本領域的技術(shù)人員會理解，本發(fā)明的一個或多個方面可以滿足某些目的，而一個或多個其它方面可以滿足某些其它目的。每一個目的可能不在全部方面均同等地適用于本發(fā)明的每一個方面。因此，前述目的可以擇一地適用于本發(fā)明的任何一個方面。在聯(lián)系附圖和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應當理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細說明都僅僅提出了優(yōu)選的實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實施方案構(gòu)成限制。附圖簡述本領域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的詳細說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應用

圖1。圖1描繪肺腫瘤組織和細胞系中的⑶C45L表達。A，B，通過半定量RT-PCR分析檢測的，1份正常肺組織和15份臨床肺癌組織樣品(5份肺ADC，5份肺SCC，和5份SCLC) (A)及正常氣道上皮衍生細胞(SAEC)和15種肺癌細胞系⑶中的⑶C45L表達。C，通過 Western印跡分析檢測的，6種肺癌細胞系和SAEC細胞中的⑶C45L蛋白表達。D，LC319細胞中內(nèi)源⑶C45L蛋白的亞細胞定位。⑶C45L在核中強染色，而在胞質(zhì)中弱染色。圖2。圖2描繪正常組織中的⑶C45L表達和NSCLC患者的⑶C45L過表達與較差預后的關聯(lián)。A，5種正常組織(心，肺，肝，腎，和睪丸)和肺癌中⑶C45L蛋白表達的免疫組織化學分析。CDC45L在睪丸和肺癌細胞中(主要在核和/或胞質(zhì)中)豐富表達，但是在剩余四種正常組織中幾乎檢測不到它的表達。B，癌癥組織中CDC45L表達的陽性和陰性染色的例子(初始放大倍數(shù)X100)。C，⑶C45L蛋白表達與較差預后的關聯(lián)。NSCLC患者存活的 Kaplan-Meier 分析(P = 0. 0045，時序檢驗)。圖3。圖3描繪針對⑶C45L的siRNA對肺癌細胞的生長遏制效應。A，通過半定量 RT-PCR分析，兩種不同的針對CDC45L的siRNA，即si_CDC45L_#l和si_CDC45L_#2及兩種對照siRNA (si-LUC和si-EGFP)對A549 (左)禾口 SBC-3 (右)細胞中CDC45L表達的基因敲低效應。B，C，經(jīng)si-CDC45L或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的A549 (左)和SBC-3 (右)細胞的集落形成(B)和MTT (C)測定法。柱，三次重復測定的相對吸光度；線，SD。D，經(jīng)si-CDC45L-#2或 si-LUC轉(zhuǎn)染的A549細胞的流式細胞術(shù)分析(轉(zhuǎn)染后48小時)。圖4。圖4描繪⑶C45L與PIFl的相互作用。A，通過半定量RT-PCR分析，1份正常肺組織和15份臨床肺癌組織樣品中⑶C45L和PIFl的表達分析。B，肺癌SBC-3細胞中內(nèi)源⑶C45L與外源PIFl的相互作用。用抗FLAG抗體對來自經(jīng)帶FLAG標簽的PIFl表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SBC-3細胞的細胞溶胞物進行免疫沉淀。使用抗CDC45L抗體對免疫沉淀物進行Wfestern印跡分析。IB，免疫印跡；IP，免疫沉淀。C，SBC-3細胞中內(nèi)源CDC45L和外源 PIFl 的免疫熒光染色。顯現(xiàn)了 CDC45L-Alexa488、PIF 1-Alexa594、或細胞核 6' -二脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽[DAPI])。觀察到⑶C45L和PIFl在核和胞質(zhì)中的共定位。圖5。圖5描繪針對PIFl的siRNA對肺癌細胞的生長遏制效應。A，通過半定量 RT-PCR 分析檢測的，兩種 si-PIFl (si-PIFl-#l 和 si_PIFl_#2)和兩種對照 siRNA (si_LUC 和si-EGFP)對A549(左)和SBC_3(右)細胞中PIFl表達的基因敲低效應。B，C，經(jīng)si-PIFl 或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的A549(左)和SBC-3 (右)細胞的集落形成⑶和MTT (C)測定法。柱， 三次重復測定的相對吸光度；線，SD。實施方案的描述盡管與本文描述相似或等價的任何方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明實施方式，在此仍描述了優(yōu)選方法、裝置、與材料。然而，在描述本發(fā)明的材料與方法之前，應理解本發(fā)明并不限于本文中的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案等，因其可根據(jù)常規(guī)實驗與優(yōu)化而有變化。亦應理解本描述所用的命名法僅以描述特定版本或?qū)嵤├秊槟康?，并非意欲限定本發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權(quán)利要求所限定。通過本文中的述及而具體收錄本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖恼麄€公開內(nèi)容。然而，本文中無一處要解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開。當存在沖突時，應以本說明書所述為準，包括定義在內(nèi)。另外，材料、方法、和實施例僅僅是例示性的，而非意圖是限制性的。^X除非另有明確說明，本文中用語“一個/種”、“該”和“所述”指的是“至少一個/ 種，，。與物質(zhì)(例如多肽、抗體、多核苷酸等)聯(lián)用時術(shù)語“分離的”和“純化的”表示該物質(zhì)基本上不含至少一種可包括于天然來源中的其他物質(zhì)。因此，分離的或純化的抗體指基本上不含細胞物質(zhì)例如碳水化合物、脂質(zhì)或其他來自該蛋白質(zhì)(抗體)來源的細胞或組織的污染性蛋白質(zhì)的抗體，或當化學合成時基本上不含化學前體或其他化學品的抗體。術(shù)語“基本上不含細胞物質(zhì)”包括其中多肽與來自其被分離或重組產(chǎn)生的細胞的細胞組分相分離的所述多肽制備物。因此，基本上不含細胞物質(zhì)的多肽包括具有少于約30^^20^^10%或5% (按干重計)的異源蛋白質(zhì)(在此也稱為“污染性蛋白質(zhì)”)的多肽制備物。當多肽系重組產(chǎn)生時，在一些實施方案中，其還基本上不含培養(yǎng)基，包括具有少于約20%、10%或5%蛋白質(zhì)制備物體積的培養(yǎng)基的多肽制備物。當多肽通過化學合成產(chǎn)生時，在一些實施方案中，其基本上不含化學前體或其他化學品，包括具有少于約30^^20^^10^5% (按干重計)的與該蛋白質(zhì)合成有關的化學前體或其他化學藥品的多肽制備物。可例如通過在蛋白質(zhì)制備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍染色等之后單一條帶的出現(xiàn)來顯示特定蛋白質(zhì)制備物含有分離的或純化的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(包括抗體)是分離的或純化的。“分離的”或“純化的”核酸分子，例如cDNA分子，當通過重組技術(shù)產(chǎn)生時可基本上不含其他細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當化學合成時可基本上不含化學前體或其他化學品。在一個實施方案中，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子是分離的或純化的。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在此可互換地用于指氨基酸殘基聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為修飾的殘基或非天然存在的殘基，例如相應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸多聚體，以及天然存在的氨基酸多聚體。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸功能類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及在細胞中翻譯后被修飾的那些(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸根和0-磷酸絲氨酸)。短語 “氨基酸類似物，，指除具有修飾的R基或修飾的骨架之外，具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)(連接氫原子、羧基、氨基和R基的α碳原子)的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)、但具有類似的功能的化學化合物。在此，氨基酸可以用它們普遍知道的、IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號表示。除非另有明確陳述，術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子” 可交換使用，并且與氨基酸類似，以普遍接受的單字母代碼來表示。類似于氨基酸，它們涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物?；?、多核苷酸、寡核苷酸、核酸、或核酸分子可包含DNA、RNA或其組合。如本文中使用的，術(shù)語“生物樣品”指整個生物體或其組織、細胞或組成部分(例如體液，包括但不僅限于血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血(amniotic cord blood)、尿液、陰道液和精液)的子集(subset)。“生物樣品”進一步指從整個生物體或其細胞、組織或組成部分的子集制備的勻漿物、裂解物、提取物、細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或其級分或部分。最后，“生物樣品”指含有細胞組分(例如蛋白質(zhì)或多核苷酸)的培養(yǎng)基，例如生物體已在其中繁殖的營養(yǎng)湯或凝膠。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達⑶C45L和/或PIFl基因的癌癥，諸如肺癌， 包括腺癌(ADC)、鱗狀細胞癌(SCC)、大細胞癌(LCC)、和小細胞肺癌(SCLC)。(1)基因和多肽人CDC45L基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO 13，而且還作為GenBank登錄號 NM_003504. 3可得。在本文中，短語“⑶C45L基因”涵蓋人⑶C45L基因以及其它動物(包括但不限于非人靈長類動物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛)的CDC45L基因，而且包括等位突變體和在其它動物中找到的對應于CDC45L基因的基因。由人CDC45L基因編碼的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO 14，而且還作為GenBank 登錄號NM_003504. 3(NP_003495. 1)可得。在本發(fā)明中，由⑶C45L基因編碼的多肽稱作 “CDC45L”，而且有時稱作“CDC45L多肽”或“CDC45L蛋白”。人PIFl基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO :15，而且還作為GenBank登錄號 NM_025049. 2可得。在本文中，短語“PIF1基因”涵蓋人PIFl基因以及其它動物(包括但不限于非人靈長類動物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛)的PIFl基因，而且包括等位突變體和在其它動物中找到的對應于PIFl基因的基因。由人PIFl基因編碼的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO 16，而且還作為GenBank登錄號NM_025049. 2 (NP_079325. 2)可得。在本發(fā)明中，由PIF 1基因編碼的多肽稱作“PIF1 ”， 而且有時稱作“PIF1多肽”或“PIF1蛋白”。依照本發(fā)明的一個方面，功能性等同物也包括在⑶C45L和PIFl中。在本文中， 蛋白質(zhì)的“功能性等同物”指具有與蛋白質(zhì)等同的生物學活性的多肽。也就是，任何保留 CDC45L或PIFl的至少一種生物學活性的多肽可用作本發(fā)明中的此類功能性等同物。例如， CDC45L的功能性等同物和PIFl的功能性等同物保留促進細胞增殖的活性。另外，CDC45L 的生物學活性含有對PIFl的結(jié)合活性。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，CDC45L的功能性等同物可含有PIFl結(jié)合區(qū)。還有，PIFl的生物學活性含有對⑶C45L的結(jié)合活性。因此， 在一個優(yōu)選的實施方案中，PIFl的功能性等同物可含有CDC45L結(jié)合區(qū)。⑶C45L的功能性等同物包括那些其中對⑶C45L蛋白的天然發(fā)生氨基酸序列替代、刪除、添加、或插入一個或多個氨基酸，例如1-5個氨基酸，例如多至5%的氨基酸者。還有，PIFl的功能性等同物包括那些其中對PIFl蛋白的天然發(fā)生氨基酸序列替代、刪除、添加、或插入一個或多個氨基酸，例如1-5個氨基酸，例如多至5%的氨基酸者。一般地，已知蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不影響蛋白質(zhì)的功能(Mark DF, et al.，Proc Natl Acad Sci USA. 1984Sep ；81(18) :5662-6 ； Zoller MJ & Smith Μ.Nucleic Acids Res. 19820ct 25 ； 10 (20) :6487-500 ；Wang A, et al. , Science. 1984 Jun 29 ；224 (4656) :1431-3 ；Dalbadie-McFarland G, et al. , Proc Natl Acad Sci U S A. 1982Nov;79(21) :6409-13)。本領域技術(shù)人員會認識到，對氨基酸序列進行改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸的個別添加、刪除、插入、或替代是“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子有疏水性氨基酸(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸)、親水性氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、 半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)、和具有下列共同官能團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸)；含有羥基基團的側(cè)鏈(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)；含有硫原子的側(cè)鏈(C，M)；含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；含有堿的側(cè)鏈(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)；和含有芳香族的側(cè)鏈(組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。另外，提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領域是公知的。例如，下列8個組各自包含彼此構(gòu)成保守性替代的氨基酸(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；(5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和(8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Thomas Ε. Creighton，Proteins, Publisher :New York :ff. H.Freeman,cl984)。此類保守性修飾多肽包括在本發(fā)明的⑶C45L或PIFl蛋白中。然而，本發(fā)明并不僅限于此，而且⑶C45L或PIFl蛋白包括非保守性修飾，只要它們保留⑶C45L或PIFl蛋白的任何一種生物學活性即可。此類經(jīng)修飾蛋白質(zhì)中要突變的氨基酸的數(shù)目一般是10個氨基酸或更少，例如6個氨基酸或更少，例如3個氨基酸或更少。通過添加一個或多個氨基酸而修飾的蛋白質(zhì)的例子有CDC45L或PIFl蛋白的融合蛋白。融合蛋白包括CDC45L或PIFl蛋白與其它肽或蛋白質(zhì)的融合物，其也可用于本發(fā)明。 融合蛋白可通過本領域技術(shù)人員公知的技術(shù)來生成，例如通過連接編碼CDC45L或PIFl基因的DNA與編碼其它肽或蛋白質(zhì)的DNA，使得框匹配，將融合DNA插入表達載體中并在宿主中表達它。對與CDC45L或PIFl蛋白融合的肽或蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得融合蛋白保留 ⑶C45L或PIFl蛋白的任何一種目標生物學活性即可?？捎米饕c蛋白質(zhì)融合的已知肽包括例如FLAG(Hopp TP，et al. ,Biotechnology 6 :1204-10(1988))、含有六個His (組氨酸)殘基的6xHis、lOxHis、流感凝集素(HA)、人 c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7標簽、HSV標簽、E標簽、SV40T抗原片段、Ick標簽、α-微管蛋白片段、B標簽、蛋白C片段、等等?？梢耘c本發(fā)明蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)的例子包括GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、β -半乳糖苷酶、 MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)、等等。另外，經(jīng)過修飾的蛋白并不排除多態(tài)變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼者。本領域已知用于分離功能性等同物蛋白的方法包括例如雜交技術(shù)(Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd ed. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001) 0本領域技術(shù)人員能容易地分離與編碼人CDC45L蛋白的人CDC45L DNA序列 (例如SEQ ID N0 13)的整個或部分具有高同源性(即序列同一性)的DNA，并自分離的 DNA分離人CDC45L蛋白的功能性等同物蛋白。還有，本領域技術(shù)人員能容易地分離與編碼人PIFl蛋白的人PIFl DNA序列(例如SEQ ID NO 15)的整個或部分具有高同源性(即序列同一性)的DNA，并自分離的DNA分離人PIFl蛋白的功能性等同物蛋白。如此，用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括那些由在嚴格條件下與編碼人CDC45L蛋白或人PIFl蛋白的DNA序列的整個或部分雜交的DNA編碼且是人CDC45L蛋白或人PIFl蛋白功能性等同物者。這些蛋白質(zhì)包括與自人或小鼠衍生的蛋白質(zhì)對應的哺乳動物同源物(例如由猴、大鼠、家兔或牛基因編碼的蛋白質(zhì))。在分離與編碼人CDC45L基因或人PIFl基因的DNA高度同源的cDNA時， 可使用肺癌組織或細胞系或來自睪丸的組織。本領域技術(shù)人員能常規(guī)選擇用于分離編碼與人CDC45L基因或人PIFl基因功能等同的蛋白質(zhì)的DNA的雜交條件。短語“嚴格(雜交)條件”指這樣的條件，在該條件下， 核酸分子會與其靶序列雜交，通常在核酸復雜混合物中，而沒有與其它序列的可檢測的雜交。嚴格條件取決于序列，而且在不同情況下會有所不同。較長的序列在更高溫度特異性雜交。對于核酸雜交的詳盡指導可見于Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays，，(1993)。 一1 ^/eH-^t 件選擇為在限定的離子強度pH，比特定序列的熱熔點(Tm)低大約5-10°C。Tm是如下的溫度(在限定的離子強度、PH和核酸濃度下)，在該溫度下在平衡時50%的與靶互補的探針與靶序列雜交(因為靶序列過量存在，所以在Tm，在平衡時50%的探針被占據(jù))。嚴格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，例如背景雜交的10倍。例如，可用下述步驟進行預雜交在68攝氏度用“Rapid-hyb buffer” (Amersham LIFE SCIENCE)進行30分鐘或更長的預雜交，添加經(jīng)過標記的探針，并在68攝氏度溫育一小時或更長。下面的清洗步驟可在例如低嚴格度條件中進行。一種低嚴格度條件是例如 42°C、2xSSC、0. 1%SDS,例如50°C、2xSSC、0. 1% SDS0在一些實施方案中，使用高嚴格條件。 一種高嚴格條件是例如在室溫在hSSC、0. 1 % SDS中清洗3次各20分鐘，然后在lxSSC、 0. 1% SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘，并在lxSSC、0. 1% SDS中在50攝氏度清洗2 次各20分鐘。然而，數(shù)種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴格度，而且本領域技術(shù)人員可合適地選擇所述因素以達到所需的嚴格度。代替雜交，可以利用基因擴增方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)方法，使用基于編碼人CDC45L(SEQ ID NO :13或15)或PIFl (SEQ ID NO: 14或16)蛋白的DNA的序列信息合成的引物來分離編碼與人CDC45L或PIFl基因功能等同的蛋白質(zhì)的DNA，[實施例]中的半定量RT-PCR指出了引物序列的例子。由經(jīng)由上述雜交技術(shù)或基因擴增技術(shù)分離的DNA編碼的與人⑶C45L或PIFl蛋白功能等同的蛋白質(zhì)通常與人CDC或PIFl蛋白的氨基酸序列具有高同源性(也稱作序列同一性)。“高同源性”(也稱作“高序列同一性”)通常指兩種最佳比對序列(或是多肽或是多核苷酸序列)之間的同一性程度。通常，高同源性或序列同一性指40%或更高的同源性，例如60%或更高，例如80%或更高，例如85%、90%、95%、97%、98%、99%、或更高。兩種多肽或多核苷酸序列之間的同源性或同一性程度可遵循“Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci USA. 1993Feb ；80 (3) :726_30” 中的算法來確定。適合于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的別的例子是有記載的BLAST 和 BLAST 2.0 算法(Altschul SF, et al.，J Mol Biol. 19900ct 5 ；215(3) :403-10; Nucleic Acids Res. 1997Sep 1 ；25(17) :3389-402)。用于實施BLAST分析的軟件是公眾通過(美國)國家生物技術(shù)信息中心(在萬維網(wǎng)上于ncbi.nlm.nih.gov/)可得的。該算法涉及首先通過鑒定檢索序列中在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞比對時匹配或滿足一些正值閾得分T的長度W的短詞來鑒定高得分序列對(HSP)。T稱作鄰近詞得分閾(Altschul et al，supra)。這些初始鄰近命中詞充當種子啟動搜索以尋找含有它們的更長HSP。然后將命中詞沿每一條序列在兩個方向上延伸，只要累積比對得分能增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(—對配對殘基的獎分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是<0) 來計算累積得分。對于氨基酸序列，使用打分矩陣來計算累積得分。命中詞在每個方向上的延伸在下述情況下停止累積比對得分自其最大實現(xiàn)值下降數(shù)量X ；由于一個或多個打負分殘基比對的累積，累積得分達到零或以下；或到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T、和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默認使用詞長(W) 28、期望(E) 10,M = UN = _2、和雙鏈比較。對于氨基酸序列，BLASTP 程序默認使用詞長(W) 3、期望伍)10、和見05疆62打分矩陣(Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Nov 15 ；89 (22) :10915-9)?？捎糜诒景l(fā)明語境的蛋白質(zhì)可在氨基酸序列、分子量、等電點、糖鏈的有無、或形式方面有變化，這取決于用于產(chǎn)生它的細胞或宿主，或使用的純化方法。無論如何，只要它具有CDC45L蛋白(SEQ ID NO 14)或PIFl蛋白(SEQ ID NO 16)的任何一種生物學活性， 它就可用于本發(fā)明。本發(fā)明還涵蓋⑶C45L蛋白和PIFl蛋白的部分肽的使用。部分肽具有⑶C45L蛋白或PIFl蛋白特有的氨基酸序列，而且由不到約400個氨基酸，通常不到約200個，常常不到約100個氨基酸，且至少約7個氨基酸，例如約8個氨基酸或更多，例如約9個氨基酸或更多組成。用于本發(fā)明篩選的部分⑶C45L肽適當含有⑶C45L的至少一個結(jié)合域。另外，用于本發(fā)明篩選的部分CDC45L適當含有PIFl結(jié)合區(qū)。術(shù)語CDC45L蛋白的“功能性等同物” 也涵蓋此類部分肽。還有，用于本發(fā)明篩選的部分PIFl肽適當含有PIFl的至少一個結(jié)合域。另外，用于本發(fā)明篩選的部分PIFl適當含有⑶C45L結(jié)合區(qū)。術(shù)語PIFl蛋白的“功能性等同物”也涵蓋此類部分肽。用于本發(fā)明方法的多肽或片段可作為天然存在蛋白質(zhì)通過常規(guī)純化方法獲得自自然界，或基于所選擇的氨基酸序列通過化學合成獲得。例如，可用于合成的常規(guī)肽合成法包括(1)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；(2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；(3)Peptide Synthesis ( H ), Maruzen Co. , 1975 ；(4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( Hip·) ,Maruzen Co. , 1985 ；(5) Development of Pharmaceuticals (第二卷)(日語)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；(6)W099/67288 ；和(7)Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York，1980，100—118?；蛘撸刹捎糜糜诋a(chǎn)生多肽的任何已知基因工程方法來獲得該蛋白質(zhì)(例如 Morrison DA. , et al., J Bacteriol. 1977 Oct ；132(1) :349-51 ；Clark-Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymo 1. 1983 ；101 :347-62)。例如，首先制備以可表達形式(例如位于包含啟動子的調(diào)節(jié)序列的下游)包含編碼目標蛋白質(zhì)的多核苷酸的適合的載體， 然后轉(zhuǎn)化入合適的宿主細胞，接著培養(yǎng)宿主細胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。更具體的說，通過將編碼 CDC45L或PIFl的基因插入用于表達外來基因的載體例如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3. 1、 pCAGGS或ρ⑶8，在宿主(例如動物)細胞等中表達該基因。啟動子可用于表達?？墒褂萌魏纬Ｓ玫膯幼樱ɡ鏢V40早期啟動子 (Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982,83-141)、EF-α 啟動子(Kim Dff, et al. Gene. 1990 Jull6 ；91 (2) :217-23)、CAG 啟動子(Niwa H, et al.，Gene. 1991 Decl5 ；108 (2) :193-9)、RSV LTR 啟動子(Cullen BR. Methods Enzymo 1. 1987 ；152 :684-704)、SRa 啟動子(Takebe Y, et al.，Mol Cell Biol. 1988Jan ；8(1) :466-72)、CMV 立即早期啟動子(Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987May ；84(10) :3365-9)、SV40 晚期啟動子(Gheysen D & Fiers W J Mol Appl Genet. 1982 ； 1(5) :385-94)、腺病毒晚期啟動子(Kaufman RJ, et al.，Mol Cell Biol. I989Mar ；9 (3) :946-58) ,HSV TK 啟動子等。
可根據(jù)任何方法將載體導入宿主細胞以表達⑶C45L或PIFl基因，例如電穿孔法(Chu G, et al.，Necleic Acids Res. 1987Feb 11 ； 15 (3) :131116)、磷酸鈣法(Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987Aug ；7 (8) :2745-5 、DEAE 右旋糖苷法(Lopata MA, et al.，Nucleic Acids Res.1984Jul 25 ；12(14) :5707-17 ；Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug ；4(8) : 1641-3)、脂轉(zhuǎn)染法(Derijard B, et al.，Cell. 1994 Mar 25 ； 76(6) :1025-37 ；Lamb BT, et al.，Nat Genet. 1993 Sep ；5(1) :22-30 ；Rabindran SK, et al.，Science. 1993 Jan 8 ；259 (5092) :230-4)等。還可采用體外翻譯系統(tǒng)在體外產(chǎn)生蛋白。在本發(fā)明的語境中，短語“⑶C45L基因”涵蓋編碼人⑶C45L或人⑶C45L基因的任何功能性等同物的多核苷酸。還有，短語“PIF1基因”涵蓋編碼人PIFl或人PIFl基因的任何功能性等同物的多核苷酸。⑶C45L基因和PIFl基因可作為天然存在的蛋白自自然界獲得，經(jīng)常規(guī)克隆方法獲得，或經(jīng)由基于選定核苷酸序列的化學合成來獲得。使用cDNA文庫等等克隆基因的方法是本領域公知的。(2)抗體如本文中使用的，術(shù)語“抗體”意圖包括與指定蛋白質(zhì)或其肽特異性反應的免疫球蛋白及其片段?？贵w可包括人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、 與其它蛋白質(zhì)或放射性標記物融合的抗體、和抗體片段。另外，本文中的抗體以最廣義使用，而且明確涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、自至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體 (例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學活性?！翱贵w”包括所有類 (例如 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM)。本發(fā)明可使用針對⑶C45L蛋白或PIFl蛋白的抗體。這些抗體可用于診斷肺癌。 另外，本發(fā)明可使用針對CDC45L多肽或PIF多肽的部分肽的抗體。在下文所述篩選方法中，可優(yōu)選使用針對⑶C45L多肽之PIF結(jié)合區(qū)或PIFl多肽之⑶C45L結(jié)合區(qū)的抗體。這些抗體可用于抑制和/或阻斷⑶C45L多肽與PIFl多肽之間的相互作用，例如結(jié)合，而且可用于治療和/或預防(過)表達⑶C45L和/或PIFl的癌癥， 例如肺癌。這些抗體會通過已知方法來提供。對于用于生成本發(fā)明中使用的抗體的技術(shù)， 可用于常規(guī)方法。(3)雙鏈分子本文中使用的術(shù)語“雙鏈分子”指抑制靶基因表達的核酸分子，包括例如短干擾 RNA(siRNA，例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA))與短干擾DNA/RNA(siD/ R-NA,例如DNA與RNA的雙鏈嵌合體(dsD/R-NA)或DNA與RNA的小發(fā)夾嵌合體(shD/ R-NA))。本文中使用的術(shù)語“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導入細胞的標準技術(shù)，包括其中以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA的那些。所述siRNA包括與靶基因的有義核酸序列對應的核糖核苷酸(亦用“有義鏈”指代)、與靶基因的反義核酸序列對應的核糖核苷酸(亦用“反義鏈”指代)、或兩者。所述siRNA可如此構(gòu)建使得單個轉(zhuǎn)錄物具有靶基因的有義核酸序列及與其互補的反義核酸序列，例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述siRNA可為 dsRNA 或 shRNA。
本文中使用的術(shù)語“dsRNA”指包含相互互補的序列的兩個RNA分子的構(gòu)建體，所述兩個RNA分子通過所述互補序列退火以形成雙鏈RNA分子。在本發(fā)明中，雙鏈RNA分子也可指siRNA或小干擾RNA分子。兩條鏈的序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質(zhì)編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因的非編碼區(qū)域的核苷酸序列的 RNA分子。如本文中使用的，本文中使用的術(shù)語“shRNA”指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，所述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)包含彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)(即有義鏈和反義鏈)。兩個區(qū)的互補程度和方向足以使兩個區(qū)之間發(fā)生堿基配對，所述第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接在一起，所述環(huán)是因為環(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈(intervening single-strand) ”本文中使用的術(shù)語“siD/R-NA”指包含RNA和DNA 二者的雙鏈核酸分子，包括RNA 和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說明書中，雜合體表示這樣的分子， 其中由DNA組成的寡核苷酸和由RNA組成的寡核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導入細胞的常規(guī)技術(shù)。所述siD/R-NA包括靶基因的有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、靶基因的反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)、或兩者。siD/R-NA可以這樣構(gòu)建，使單個轉(zhuǎn)錄物同時具有來自靶基因的有義核酸序列和互補反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/R-NA可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術(shù)語“dsD/R-NA”是指這樣兩個分子的構(gòu)建體，所述兩個分子包含彼此互補的序列并且已經(jīng)藉由所述互補序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因非編碼區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA的兩個分子中的一個或兩個由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者一個分子由RNA組成而另一個由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術(shù)語“shD/R-NA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，所述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)包含彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。所述區(qū)的互補程度和方向足以使它們之間發(fā)生堿基配對，第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，所述環(huán)是因為在環(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈”。⑴靶序列如本文中使用的，術(shù)語“靶序列，，是靶基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的核苷酸序列， 其會導致靶基因的完整mRNA翻譯的遏制，如果靶向該序列的雙鏈分子被導入表達該靶基因的細胞內(nèi)的話。對于靶基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的核苷酸序列，當包含與靶序列對應的序列的雙鏈分子抑制該靶基因在表達該基因的細胞中的表達時，該核苷酸序列可確定為靶序列。遏制基因表達的雙鏈多核苷酸可以由靶序列和3'突出端(例如uu)組成。 當靶序列由cDNA序列來顯示時，使用雙鏈cDNA的有義鏈，即mRNA序列轉(zhuǎn)變成DNA 序列的序列來限定靶序列。雙鏈分子包含具有與靶序列對應的序列的有義鏈和具有靶序列的互補序列的反義鏈，而且反義鏈與有義鏈在互補序列處雜交以形成雙鏈分子。
在本文中，短語“與...對應”或“對應于”表示根據(jù)構(gòu)成雙鏈分子的有義鏈的核酸種類來變換靶序列。例如，當靶序列以DNA序列來顯示且雙鏈分子的有義鏈具有RNA區(qū)時， 該RNA區(qū)內(nèi)的堿基“t”用堿基“U”置換。另一方面，當靶序列以RNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有DNA區(qū)時，該DNA區(qū)內(nèi)的堿基“U”用“t”置換。例如，當靶序列以SEQ ID NO 9的RNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有由DNA構(gòu)成的3'側(cè)半?yún)^(qū)時，“與靶序列對應的序列”是“5' -GCAAACACCUGCTCAAGTC-3‘ ”。還有，對于雙鏈分子的反義鏈，靶序列的互補序列可依照構(gòu)成反義鏈的核酸種類來限定。例如，當靶序列以SEQ ID NO 9的RNA顯示且雙鏈分子的反義鏈具有由DNA構(gòu)成的5'側(cè)半?yún)^(qū)時，“靶序列的互補序列”是“3' -CGUUUGUGGACGAGTTCAG-5‘ ”。另一方面，當雙鏈分子由RNA構(gòu)成時，與SEQ ID NO :9的靶序列對應的序列是SEQ ID NO 9的RNA序列，而且與SEQ ID NO 9的靶序列對應的互補序列是 “3' -CGUUUGUGGACGAGUUCAG-5‘ ”的 RNA 序列。除了與靶序列對應的序列及其互補序列之外，還雙鏈分子可具有一個或兩個長度為2-5個核苷酸的3’突出端(例如im)和/或連接有義鏈和反義鏈以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)序列。針對⑶C45L基因、與⑶C45L mRNA雜交的雙鏈分子通過結(jié)合⑶C45L基因的通常呈單鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此干擾翻譯，從而抑制CDC45L蛋白表達，抑制或降低由該基因編碼的⑶C45L蛋白的生成。還有，通過結(jié)合PIFl基因通常是單鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此干擾翻譯，并如此抑制PIFl蛋白表達，針對PIFl基因的雙鏈分子(該分子與PIFl mRNA雜交) 抑制或降低由該基因編碼的PIFl蛋白的生成這兩種雙鏈分子每一種都抑制癌細胞系中⑶C45L基因和PIFl基因的表達(圖3 和圖5)。因此，本發(fā)明提供分離的雙鏈分子，其具有在導入細胞中時抑制或降低癌細胞中 ⑶C45L基因或PIFl基因表達的特性。雙鏈分子的靶序列可通過下文所述siRNA設計算法來設計。在優(yōu)選的實施方案中，⑶C45L的靶序列包括例如5，-GCAAACACCUGCUCAA⑶C-3，(SEQ ID NO 9)或5，-GGACGUGGAUGCUCU⑶⑶-3，(SEQ ID NO: 10)。還有，在優(yōu)選的實施方案中，PIFl的靶序列包括例如5，-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3，(SEQ ID NO 11)或5，-GGCAUGACCCUGGAUU⑶G-3，(SEQ ID NO: 12)。換言之，本發(fā)明還提供其靶序列包含SEQ ID NO :9，10，11或12或由其組成的雙鏈分子。具體地，本發(fā)明提供了下列雙鏈分子[1]至[18][1] 一種分離的雙鏈分子，它當被導入細胞后，抑制⑶C45L基因或PIFl基因的體內(nèi)表達和細胞增殖，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與選自下組的靶序列匹配 SEQ ID NO 9, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 12 ；[2] 一種分離的雙鏈分子，它當被導入細胞后，抑制⑶C45L基因或PIFl基因的體內(nèi)表達和細胞增殖，其中所述雙鏈分子包含有義鏈以及與之互補的反義鏈，二者彼此雜交形成雙鏈，其中所述有義鏈包含與選自下組的靶序列對應的核苷酸序列SEQ ID NO 9, SEQID NO 10, SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 12 ；[3] [1]至[2]中所述的雙鏈分子，其中所述靶序列包含來自選自SEQ ID NO 13或 15的核苷酸序列的約19個至約25個連續(xù)核苷酸；[4] [1]至[2]任一中所述的雙鏈分子，其具有少于約100個核苷酸的長度；[5] [4]中所述的雙鏈分子，其具有少于約75個核苷酸的長度；[6] [5]中所述的雙鏈分子，其具有少于約50個核苷酸的長度；[7] [6]中所述的雙鏈分子，其具有少于約25個核苷酸的長度；[8] [7]中所述的雙鏈分子，其具有約19到約25個核苷酸的長度；[9] [1]至[8]任一中所述的雙鏈分子，其由單一寡核苷酸組成，所述寡核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中，[Α]為包含與選自 SEQ ID NO 9,SEQ ID NO 10、SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO :12 的靶序列對應的核苷酸序列的有義鏈，[B]為間插單鏈，且[A']為包含與[A]中選定的靶序列之互補序列對應的核苷酸序列的反義鏈；[11] [1]至[10]任一中所述的雙鏈分子，其包含RNA。[12] [1]至[11]任一中所述的雙鏈分子，其包含DNA和RNA。[13] [12]中所述的雙鏈分子，其是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體。[14] [13]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈分別由DNA與RNA構(gòu)成。[15] [12]中所述的雙鏈分子，其為DNA與RNA的嵌合體。[16] [15]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈中靶序列的5’端區(qū)域和/或反義鏈中靶序列的互補序列的3’端區(qū)域由RNA組成。[17] [16]中所述的雙鏈分子，其中所述RNA區(qū)域由9到13個核苷酸組成；和[18] [1]至[2]任一中所述的雙鏈分子，其包含一個或兩個3’突出端。本發(fā)明所述的雙鏈分子將在下面更詳細描述。設計具有抑制細胞內(nèi)靶基因表達能力的雙鏈分子的方法是已知的(見例如，美國專利No. 6，506，559，本文通過提述并入其全部內(nèi)容)。例如，可以從Ambion網(wǎng)站(在萬維網(wǎng)上 ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)訪問用于設計 siRNA 的計算機程序。該計算機程序可以根據(jù)如下的規(guī)程選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。靶點的設計1.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描搜尋AA雙核苷酸序列。記錄每個 AA的出現(xiàn)及其3’側(cè)相鄰的19個核苷酸作為潛在siRNA靴點。Tuschl等建議避免針對5’ 和3’非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設計siRNA，因為這些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點，而UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復合物可能干擾 siRNA核酸內(nèi)切酶復合物的結(jié)合。2.將潛在靶點與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠等)進行比較，將任何與其他編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外。主要使用BLAST(Altschul SF 等，Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可見于 NCBI 服務器萬維網(wǎng)上 ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 處。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著待評估的基因的長度選擇幾個靶序列。
“實施例”中為⑶C45L基因設計的優(yōu)選靶序列包括5，-GCAAACACCUGCUCAA⑶C-3，(SEQ ID NO 9)或5，-GGACGUGGAUGCUCU⑶⑶-3，(SEQ ID NO: 10)。還有，“實施例”中為PIFl基因設計的優(yōu)選靶序列包括5，-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3，(SEQ ID NO 11)或5，-GGCAUGACCCUGGAUU⑶G-3，(SEQ ID NO: 12)。具體地，本發(fā)明提供靶向任一上述靶序列的雙鏈分子，分別檢查了它們抑制和降低表達靶基因的癌細胞生長的能力。表達⑶C45L基因或PIFl基因的癌細胞的生長受到本發(fā)明雙鏈分子抑制和降低(圖3和圖5)。因此，本發(fā)明提供靶向選自下組的⑶C45L基因靶序列的雙鏈分子5，-GCAAACACCUGCUCAA⑶C-3，(SEQ ID NO 9)禾口5，-GGACGUGGAUGCUCU⑶⑶-3，(SEQ ID NO: 10)。還有，本發(fā)明提供靶向選自下組的PIFl基因靶序列的雙鏈分子5，-GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3，(SEQ ID NO :11)禾口5，-GGCAUGACCCUGGAUU⑶G-3，(SEQ ID NO :12)。本發(fā)明靶向上述⑶C45L或PIFl基因靶序列的雙鏈分子包括分離的多核苷酸，其包含靶序列和/或靶序列互補序列的任一核酸序列。靶向CDC45L或PIFl基因的雙鏈分子的例子包括寡核苷酸，其包含與SEQ ID NO :9，10，11或12及其互補序列對應的序列。然而，本發(fā)明不限于這些例子，而且上述核酸序列中的次要修飾是可接受的，只要經(jīng)過修飾的分子保留遏制⑶C45L或PIFl基因表達的能力。在本文中，核酸序列中的“次要修飾”指一處、兩處或幾處對序列的核酸替代、刪除、添加或插入。在一個實施方案中，雙鏈分子由兩條多核苷酸構(gòu)成，一條多核苷酸具有與靶序列對應的序列，即有義鏈，而另一條多肽具有與靶序列互補的序列，即反義鏈。有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。此類雙鏈分子的例子包括dsRNA和dsD/ R-NA。在另一個實施方案中，雙鏈分子由一條多核苷酸構(gòu)成，其具有與靶序列對應的序列(即有義鏈)和與靶序列互補的序列(即反義鏈)二者。一般地，有義鏈和反義鏈通過間插鏈連接，并彼此雜交以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。此類雙鏈分子的例子包括shRNA和shD/R-NA。換言之，本發(fā)明的雙鏈分子包含具有靶序列之核苷酸序列的有義鏈多核苷酸和具有靶序列之互補核苷酸序列的反義鏈多核苷酸，而且兩多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。在包含該等多核苷酸的雙鏈分子中，兩條鏈任一或二者的多核苷酸的一部分可以是 RNA,而且當靶序列以DNA序列來限定時，靶序列及其互補序列內(nèi)的核苷酸“t”用“U”替換。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的此類雙鏈分子包含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，由有義鏈和反義鏈構(gòu)成。有義鏈和反義鏈可以通過環(huán)連接。因而，本發(fā)明還提供包含單一多核苷酸的雙鏈分子，單一多核苷酸含有有義鏈和反義鏈二者，它們通過間插單鏈連接或側(cè)翼有間插單鏈。在本發(fā)明中，靶向⑶C45L基因或PIFl基因的雙鏈分子可具有選自SEQ ID NO :9， 10，11和12的序列作為靶序列。因而，本發(fā)明雙鏈分子的優(yōu)選例包括在與SEQ ID NO :9，10， 11或12及其互補序列對應的序列處彼此雜交的的多核苷酸，和具有與SEQ ID NO 9,10,11或12及其互補序列對應的序列的多核苷酸。依照本發(fā)明，本發(fā)明的雙鏈分子可使用實施例中采用的方法測試其能力(見“實施例”中的RNA干擾測定法)。在實施例中，對于包含CDC45L或PIFl基因mRNA的不同部分的有義鏈及其互補反義鏈的雙鏈分子依照標準方法在體外測試其降低癌細胞系(例如使用SBC-3和A549)中⑶C45L或PIFl基因產(chǎn)物生成的能力。另外，例如，與候選雙鏈分子接觸的細胞中CDC45L或PIFl基因產(chǎn)物與在候選分子不存在時培養(yǎng)的細胞相比的降低可通過例如使用所述CDC45L或PIFl基因mRNA的引物進行的RT-PCR來檢測(見“實施例”中(b) 半定量RT-PCR)。然后在體外基于細胞的測定法中降低CDC45L或PIFl基因產(chǎn)物生成的序列可測試其對細胞生長的抑制效應。然后對于在體外基于細胞的測定法中抑制細胞生長的序列，可使用具有癌癥的動物，例如裸鼠異種移植物模型測試其體內(nèi)能力以確認CDC45L或 PIFl基因產(chǎn)物生成的降低和癌細胞生長的降低。當分離的多核苷酸是RNA或其衍生物時，核苷酸序列中的堿基“t”應替換為“U”。 本文中使用的術(shù)語“互補”指多核苷酸中核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen 堿基配對，且術(shù)語“結(jié)合”意指兩個多核苷酸間物理的或化學的相互作用。當所述多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯酶聯(lián)接時，這些多核苷酸亦可以同樣地發(fā)生相互結(jié)合。一般而言，互補多核苷酸序列在合適條件下雜交以形成包含很少或沒有錯配的穩(wěn)定雙鏈體。進一步，本發(fā)明的分離多核苷酸的有義鏈和反義鏈可通過雜交形成雙鏈分子或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，上述雙鏈體在每10個匹配中包含不超過一個錯配。在一些實施方案中，雙鏈體的鏈完全互補，這樣的雙鏈體不包含錯配。本發(fā)明的多核苷酸的長度通常少于500，200，100，75，50，或25個核苷酸。本發(fā)明的分離多核苷酸可用于形成針對CDC45L或PIFl基因的雙鏈分子或制備編碼雙鏈分子的模板DNA。當所述多核苷酸用于形成雙鏈分子時，多核苷酸的有義鏈可長于19個核苷酸，例如長于21個核苷酸，例如介于約19和25個核苷酸之間。因而，本發(fā)明提供了包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈包括與靶序列對應的核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為 19至25個核苷酸對的雙鏈分子。當將雙鏈分子導入細胞中時，雙鏈分子充當RISC復合物中識別mRNA的同源序列的向?qū)?。被識別的靶RNA受到Dicer核酸酶活性的切割和降解，由此雙鏈分子最終降低或抑制由該RNA編碼的多肽生成(表達)。如此，本發(fā)明的雙鏈分子可通過其生成在嚴格條件下與CDC45L或PIFl基因的mRNA特異性雜交的單鏈的能力來定義。在本文中，mRNA中與自雙鏈分子生成的單鏈雜交的部分稱作“靶序列，，或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本發(fā)明中， “靶序列”的核苷酸序列不僅可使用mRNA的RNA序列來顯示，而且也可以以自mRNA合成的 cDNA的DNA序列來顯示。本發(fā)明中所述雙鏈分子可包含一個或更多修飾核苷酸和/或非磷酸二酯連接。本領域眾所周知的化學修飾具有增加所述雙鏈分子的穩(wěn)定性、可用性和/或細胞攝入的能力。一般技術(shù)人員明白本發(fā)明分子可包含的其它類型的化學修飾(W003/070744 ； W02005/045037)。在一個實施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。上述修飾的例子包括硫代磷酸酯聯(lián)接、2’ -0-甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉(zhuǎn)脫氧脫堿基殘基的摻入(美國專利申請No. 20060122137)。另一個實施方案中，可以使用修飾來增強雙鏈分子的穩(wěn)定性或增加尋靶效率。修飾包括但不限于雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學交聯(lián)、雙鏈分子一條鏈的3’或5’末端的化學修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸(W02004/(^9212)。在另一個實施方案中，修飾可以用于增加或減少針對靶mRNA中和/或互補雙鏈分子鏈中互補核苷酸的親和力(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸可以用2-硫、 5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一個實施方案中，當雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時，可以把3’ -末端核苷酸突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸 (Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15,15(2) :188-200) 關于進一步的細節(jié)，可以利用公開文獻如美國專利申請No. 20060234970。本發(fā)明不限于這些實例，可以將任何已知化學修飾應用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得分子保留抑制靶基因表達的能力。此外，本發(fā)明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性?？梢孕纬蒁NA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸) 制成的雜合型雙鏈分子、或在任一單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，諸如此類，來增強所述雙鏈分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA連的雜合體可以是這樣的雜合體，其中有義鏈是DNA而反義鏈是RNA，或者相反，只要它在導入表達靶基因的細胞中后具有抑制該基因表達的活性。在一些實施方案中，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可以具有如下的結(jié)構(gòu)，其中有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要在導入表達靶基因的細胞中時，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩(wěn)定性，在一些實施方案中，分子中包含盡可能多的DNA;而為了誘導靶基因的表達抑制，要求分子在一定范圍內(nèi)是RNA，以充分地誘導表達抑制。在嵌合型雙鏈分子的一個實例中，雙鏈分子的上游部分區(qū)域(即位于有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補序列之側(cè)翼的區(qū)域)為RNA。所述上游部分區(qū)表示有義鏈的5’側(cè)(5’端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)。就是說， 在一些實施方案中，反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA組成。例如，本發(fā)明的嵌合型或雜合型雙鏈分子包含以下組合。有義鏈5，-[DNA]-3，3，- (RNA) - [DNA] _5，反義鏈，有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，和有義鏈5，-(RNA)-[DNA]-3，
3’ -(RNA)-5’ 反義鏈。上游部分區(qū)可以是由約9-13個核苷酸構(gòu)成的域，從雙鏈分子的有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的實例包括這樣的實例 鏈長為19-21個核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半?yún)^(qū)(對于有義鏈為5’側(cè)區(qū)域而對于反義鏈為3’側(cè)區(qū)域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達的效果比反義鏈整體為RNA時高得多(美國專利申請No. 20050004064)。在本發(fā)明中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如短發(fā)夾RNA(shRNA)以及由DNA與 RNA組成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列， 其形成緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)彎，可以用來通過RNA干擾來沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA在單一鏈上包含有義靶序列和反義靶序列，其中所述序列被環(huán)序列隔開。通常，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細胞機制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進一步與RNA誘導的沉默復合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合。這種復合物結(jié)合并切割與所述dsRNA或 dsD/R-NA的靶標序列匹配的mRNA。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可以在有義序列與反義序列之間設置由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列。因此，本發(fā)明還提供具有通式5’ -[A]-[B]-[A’ ]-3’的雙鏈分子。式中，[A] 為有義鏈，包含與靶序列對應的序列；[B]為間插單鏈；[A']為反義鏈，包含與[A]互補的序列。靶序列可以選自下組例如SEQ ID NO 9, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11禾口 SEQ ID NO :12ο本發(fā)明不限于這些實例，在雙鏈分子保持抑制被靶定的⑶C45L或PIFl基因的表達及導致表達這些基因的細胞受到抑制或減少的能力的前提下，[Α]中的靶序列可以是在這些實例的基礎上修飾而得到的序列。區(qū)域[Α]與[A']雜交而形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。間插單鏈部分[B]、即環(huán)序列，長度可以為3 23個核苷酸。例如，環(huán)序列可以選自由以下的序列組成的組(在萬維網(wǎng)上www. ambion. com/techlib/tb/tb_506. html處)。此外， 由23個核苷酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al. ,Nature 2002 Jul 25， 418(6896) :435-8,Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896)435-8，Epub 2002Jun 26 ；UUCG :Lee NS et al. ,Nat Biotechnol 2002May,20(5) :500-5 ；Fruscoloni P et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) 1639-44，Epub 2003 Feb 10;UUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat ReV Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6) 457-67。具有本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈分子實例如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 組成的組；但本發(fā)明不限于此GCAAACACCUGCUCAA⑶C-[B]-GACUUGAGCAGGUGUUUGC(對于 SEQ ID NO 9 的靴序列)；GGACGUGGAUGCUCU ⑶⑶ _[B]_ACACAGAGCAUCCACGUCC(對于 SEQ ID NO: 10 的靶序列)；
GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-[B]-GAAGAUGCUCUGGCCUUUC (對于 SEQ ID NO: 11 的靶序列)；和GGCAUGACCCUGGAUU ⑶ G-[B]-CACAAUCCAGG ⑶ CAUGCC(對于 SEQ ID NO: 12 的靶序列)。此外，為了增強雙鏈分子的抑制活性，可以將幾個核苷酸添加到有義鏈和/或反義鏈的3’末端，作為3’突出端。添加的核苷酸的數(shù)目為至少2個，通常為2-10個，例如為 2-5個。添加的核苷酸在雙鏈分子的有義鏈和/或反義鏈的3’末端形成單鏈。3’突出端的核苷酸優(yōu)選但不限于“U”或“t”。當雙鏈分子具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)時，反義鏈的3'末端添加有3'突出端。對于雙鏈分子的制備方法可采用本技術(shù)領域公知的任何化學合成方法。根據(jù)化學合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當?shù)姆椒ㄊ顾鼈兺嘶鸬揭黄穑瑏慝@得雙鏈分子。或者，本發(fā)明的雙鏈分子或SiRNA分子也可用體外翻譯來合成。在此實施方案中，編碼包含靶序列及其反義的核苷酸序列的DNA在體外轉(zhuǎn)錄成雙鏈分子。在退火的一個實施方案中，將合成的單鏈多核苷酸以至少約3 7、例如約4 6、例如基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈分子解離的溫度，再逐漸冷卻。經(jīng)退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術(shù)領域公知的常用方法來純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剩余的單鏈多核苷酸(例如利用適當?shù)拿高M行降解)的方法。所述位于靶序列側(cè)翼的調(diào)控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達能夠獨立地，或者以時間性或空間性方式被調(diào)控。所述雙鏈分子可通過將CDC45L或PIFl基因模板克隆入載體(例如含有來自小核RNA(snRNA)TO的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或人類HlRNA 啟動子的載體)以在胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄?；蛘?，雙鏈分子可胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄方式是將其編碼序列克隆入在該編碼序列附近含有在適當細胞中指導雙鏈分子表達的調(diào)控序列(例如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA poly III轉(zhuǎn)錄單元或人Hl RNA啟動子)的載體。雙鏈分子的編碼序列側(cè)翼的調(diào)控序列可以相同或不同，使得它們的表達可獨立地或以空間或時間方式調(diào)控。下文會描述能夠生成雙鏈分子的載體的詳情。(ii)載體本發(fā)明還包括包含一種或多種本文所述的雙鏈分子的載體、以及包含該載體的細胞。本發(fā)明的載體編碼處于可表達形式的本發(fā)明雙鏈分子。在本說明書中，術(shù)語“處于可表達的形式”，是指該載體當被導入細胞中時，將表達該分子。在一個實施方案中，載體包含雙鏈分子表達所必需的調(diào)節(jié)元件。因而，在一個實施方案中，表達載體編碼本發(fā)明的雙鏈分子且適合表達雙鏈分子。本發(fā)明的這種載體可以用于產(chǎn)生雙鏈分子，也可以直接用作癌癥治療的活性成分?；蛘?，本發(fā)明提供了如下的載體，其包括包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中的任一個，其中所述有義鏈核酸包含與SEQ ID NO :9，10，11或12對應的核苷酸序列，而所述反義鏈核酸由與有義鏈互補的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導入表達⑶C45L基因或PIFl的細胞中時抑制所述基因的表達。優(yōu)選地，多核苷酸是長度為約19個至25個核苷酸的寡核苷酸(例如來自SEQ ID NO 13或15核苷酸序列的連續(xù)核苷酸)。更優(yōu)選地，多核苷酸組合包括單一核苷酸轉(zhuǎn)錄物，其包含經(jīng)單鏈核苷酸序列相連接的有義鏈和反義鏈。更優(yōu)選地，多核苷酸組合具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是包括SEQ ID NO :9，10，11或12的核苷酸序列；[B]是由約3個至約23個核苷酸組成的核苷酸序列；而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。本發(fā)明的載體可通過下述方法生成例如，將包含靶序列的序列克隆入表達載體中，使調(diào)控序列可操作性地連接于該序列，以允許兩條鏈的表達(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄) (Lee NS et al. ,Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，作為 mRNA之反義的 RNA 分子由第一啟動子(例如位于克隆DNA的3’末端側(cè)翼的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，對mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動子(例如位于克隆DNA的5’末端側(cè)翼的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄。 有義和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默該基因的雙鏈分子構(gòu)建體?；蛘?，使用分別編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個載體構(gòu)建體來分別表達有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構(gòu)建體。而且，克隆的序列可編碼具有二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體，即，載體的單一轉(zhuǎn)錄物同時包含靶基因的有義序列和互補的反義序列二者。也可以配置本發(fā)明的載體使得其實現(xiàn)在靶細胞的基因組中的穩(wěn)定插入(關于同源重組盒載體的說明，參見Thomas KR & Capecchi MR5Cell 1987,51 :503-12)。可以參考例如Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ；美國專利第 5，580，859 號、第 5，589，466 號、 第 5，804，566 號、第 5，739，118 號、第 5，736，524 號、第 5，679，647 號和 WO 98/04720?；贒NA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導型)輸送、陽離子脂質(zhì)復合體、和粒子介導型投遞(“基因槍”)或壓力介導型輸送(例如參照美國專利第5，922，687號)。本發(fā)明的載體可以是，例如，病毒載體或細菌載體。表達載體的例子包括減毒病毒宿主，例如牛痘或雞痘(參照美國專利第4，722，848號)。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來表達編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導入表達靶基因的細胞時即表達該分子并由此抑制細胞的增殖?？墒褂玫妮d體的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG 載體在Mover等，Nature 1991,351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈分子的治療性施用與生產(chǎn)，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等?？梢詤⒄绽鏢iata等，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000,68 :793-806 ；以及 Hipp 等， In Vivo 2000，14 :571_85。(iii)使用雙鏈分子抑制或降低癌細胞生長和治療或預防癌癥的方法在本發(fā)明中，分別檢查了針對上文所述靶序列的雙鏈分子抑制或降低(過)表達靶基因的細胞生長的能力。本發(fā)明的雙鏈分子抑制或降低了(過)表達CDC45L和/或PIFl 基因的癌細胞生長(圖3和圖5)。因而，本發(fā)明提供了抑制來自⑶C45L和/或PIFl基因過表達所致的，或由⑶C45L 和/或PIFl基因介導的癌癥的細胞之細胞生長，即癌性細胞生長的方法，所述方法通過抑制⑶C45L和/或PIFl基因的表達來實施。⑶C45L或PIFl基因表達可通過任何特異性地靶定CDC45L或PIFl基因表達的前述本發(fā)明雙鏈分子或可表達任何本發(fā)明雙鏈分子的本發(fā)明載體來抑制。
上述本發(fā)明雙鏈分子及載體抑制癌性細胞細胞生長的能力提示其可用于治療癌癥，⑶C45L和/或PIFl基因過表達所致的或由⑶C45L和/或PIFl基因介導的癌癥的方法。因此，本發(fā)明提供通過施用針對⑶C45L或PIFl基因的雙鏈分子即抑制性核酸或表達所述分子的載體治療⑶C45L和/或PIFl基因過表達所致或由⑶C45L和/或PIFl基因介導的癌癥患者的方法，所述方法無不良作用，因為所述基因在正常器官中幾乎檢測不到。具體地，本發(fā)明提供下列[1]至[23]的方法[1] 一種用于抑制或降低(過)表達⑶C45L和/或PIFl基因的細胞生長的方法或治療或預防(過)表達CDC45L和/或PIFl基因的癌癥的方法，其中該方法包括對受試者施用至少一種雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體的步驟，其中所述雙鏈分子在導入細胞中時抑制或降低所述CDC45L或PIFl基因的體內(nèi)表達；[2] [1]的方法，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與選自下組的靶序列享有序列同一性或互補:SEQ ID NO 9,10，11和12 ；[3] [1]的方法，其中所述雙鏈分子包含有義鏈和與其互補的反義鏈，它們彼此雜交以形成雙鏈，其中所述有義鏈包含與選自SEQ ID N0:9、10、ll和12的靶序列對應的核苷酸序列；[4] [1]至[3]任一的方法，其中施用多種雙鏈分子；[5] [4]的方法，其中所述多種雙鏈分子靶向相同基因；[6] [1]至[5]任一的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸；[7] [6]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[8] [7]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[9] [8]的方法，其中所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[10] [1]至[9]任一的方法，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度在 19個與25個核苷酸對之間的雙鏈分子；[11] [1]至[10]任一的方法，其中所述雙鏈分子由單一寡核苷酸組成，所述寡核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈二者。[12] [11]的方法，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID N0:9、10、ll和12中的靶序列對應的核苷酸序列的有義鏈，[B] 為間插單鏈，且[A']為包含與[A]中選擇的靶序列的互補序列對應的寡核苷酸的反義鏈。[13] [1]至[12]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含RNA。[14] [1]至[12]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA 二者。[15] [14]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體。[16] [15]的方法，其中所述有義與反義鏈多核苷酸分別由DNA與RNA構(gòu)成。[17] [14]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體。[18] [17]的方法，其中有義鏈和反義鏈多核苷酸之一或二者的5’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA構(gòu)成。[19] [18]的方法，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成。[20] [1]至[19]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含一個或兩個3’突出端。[21] [1]至[20]任一的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼。[22] [21]的方法，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中，[A]為包含與選自SEQ ID NO :9、10、11和12中的靶序列對應的核苷酸序列的有義鏈，[B] 為間插單鏈，且[A']為包含與[A]中選擇的靶序列的互補序列對應的寡核苷酸的反義鏈。 和[23] [1]至[22]任一的方法，其中所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強劑和/或細胞滲透劑。本發(fā)明方法將在下面更加詳細的加以描述。通過將細胞與針對⑶C45L或PIFl基因的雙鏈分子、表達該分子的載體或包含同樣分子的組合物接觸來抑制(過)表達⑶C45L和/或PIFl基因的細胞的生長?？蛇M一步將所述細胞與轉(zhuǎn)染劑接觸。合適的轉(zhuǎn)染劑在本領域是已知的。短語“抑制細胞生長”表示所述細胞較之未暴露于所述分子的細胞，以較低速率增殖或具有降低的存活率。細胞生長可通過本領域已知技術(shù)測定，例如使用MTT細胞增殖測定法。任何種類的細胞的生長均可根據(jù)本方法進行遏制，只要所述細胞表達或過表達本發(fā)明所述雙鏈分子的靶基因?？勺鳛槔拥募毎ò┘毎Ｒ虼?，對于正罹患或有危險罹患涉及⑶C45L和/或PIFl基因的疾病的患者，可通過施用至少一種本發(fā)明雙鏈分子、表達至少一種所述分子的至少一種載體或包含至少一種所述分子的至少一種組合物進行治療。舉例而言，癌癥患者可根據(jù)這些方法進行治療。癌癥類型可通過根據(jù)所診斷的特定類型腫瘤的標準方法進行鑒定。在一些實施方案中，用本發(fā)明所述方法治療的患者是用這樣的方法選出的在來自患者的活檢物中通過RT-PCR、雜交或免疫測定法檢測CDC45L和/或PIFl基因的(過)表達。在一些實施方案中，在本發(fā)明的治療之前，對于來自受試者的所述活檢樣通過本領域所知的方法，例如，免疫組織化學分析、雜交或RT-PCR，證實CDC45L和/或PIFl基因過表達(見“實施例”中半定量RT-PCR、 Western印跡或免疫組織化學)。根據(jù)本發(fā)明的方法，為抑制或降低細胞生長及由此治療癌癥，在施用多種所述雙鏈分子(或表達同樣分子的載體或含有同樣分子的組合物)時，每個所述分子可針對相同基因的不同靶序列或不同基因的不同靶序列。例如，所述方法可利用針對CDC45L或PIFl 基因轉(zhuǎn)錄物的不同雙鏈分子?；蛘撸?，所述方法可利用針對自相同基因選擇的一種、兩種或更多種靶序列的雙鏈分子。為抑制細胞生長，本發(fā)明的雙鏈分子可直接以可實現(xiàn)該分子與對應mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式導入細胞。另外，如上所述，編碼雙鏈分子的DNA可作為載體導入細胞。為將雙鏈分子和載體導入細胞，可使用轉(zhuǎn)染增強劑，例如FuGENE(Roche diagnostics)、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)與 Nucleofector (Wako pure Chemical)。當治療導致臨床效益，例如受試者中⑶C45L或PIFl基因表達的減少、癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、轉(zhuǎn)移潛力的降低等，可以判定該治療是“有效”的。當預防性地適用治療時，“有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性可以結(jié)合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來加以確定。就本發(fā)明的方法和組合物用于“預防”和“防范”的語境而言，此類術(shù)語在本文中可互換使用，指降低源自疾病的死亡率或發(fā)病率負擔的任何活動。預防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病的進展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復功能和減輕疾病相關并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負面影響的活動?；蛘撸A防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的廣泛的預防性療法。治療和/或預防癌癥和/或預防其手術(shù)后復發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預防可降低患癌個體死亡率及改善其預后，降低其血液中腫瘤標志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。應理解，本發(fā)明的所述雙鏈分子是亞化學計量地降解靶mRNA(基因轉(zhuǎn)錄物)的。雖不愿拘于任何理論，認為本發(fā)明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規(guī)的癌癥療法相比，為實施治療效應而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領域技術(shù)人員在考慮了受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎上，能夠容易地確定本發(fā)明的雙鏈分子的有效量。一般而言，本發(fā)明雙鏈分子的有效量包含在癌癥部位或其附近胞內(nèi)濃度為大約1納摩爾(nM)到約ΙΟΟηΜ，例如大約2nM到大約50nM，例如大約2. 5nM到大約IOnM0 考慮可使用更多或更少量的雙鏈分子。本發(fā)明的方法可用于抑制癌癥，例如緣于⑶C45L和/或PIFl基因過表達或由 CDC45L和/或PIFl基因介導的癌癥，例如肺癌的生長或轉(zhuǎn)移。具體而言，針對選自SEQ ID NO :9 禾口 SEQE ID NO :10 (用于 CDC45L)和 SEQ ID NO: 11 禾口 SEQ ID NO 12 (用于 PIF1)的靶序列的雙鏈分子可用來治療癌癥。為了治療癌癥，例如CDC45L和/或PIFl基因促進的癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈分子與不同于所述雙鏈分子的藥劑組合來施用于受試者?；蛘撸景l(fā)明的雙鏈分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來施用于受試者。舉例而言，本發(fā)明所述雙鏈分子可與現(xiàn)在用于治療癌癥或預防癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法(例如，放射療法，外科手術(shù)，以及使用化療劑例如順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺，5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔紅霉素或他莫昔芬的治療)組合施用。在本發(fā)明的方法中，雙鏈分子可以裸雙鏈分子的形式、以與投遞試劑相組合的形式，或者以表達雙鏈分子的重組質(zhì)?；蛘卟《据d體的形式施用于受試者。用于與本發(fā)明的雙鏈分子組合施用的合適的投遞試劑包括Mirus Transit TKO脂溶性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚陽離子(例如聚賴氨酸)、或脂質(zhì)體。在一個實施方案中，投遞試劑是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體能夠幫助將雙鏈分子投遞至特定的組織如視網(wǎng)膜或腫瘤組織中，還能夠增加雙鏈分子的血中半衰期。適合在本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體是由常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì) (vesile-forming lipids)形成的，囊泡形成性脂質(zhì)通常包括中性或帶負電荷的磷脂，以及甾醇，例如膽固醇。對一些因素的考慮通常可以為脂質(zhì)的選擇提供指導，如期望的脂質(zhì)體大小以及在血流中的脂質(zhì)體的半衰期等。有多種制備脂質(zhì)體的方法是公知的，例如Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ；美國專利第 4，235，871 號；第 4，501，7 號；第 4，837，028號；第5，019，369號；將上述文獻的全部內(nèi)容援引并入本說明書。
在一些實施方案中，包被本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體包含能夠?qū)⒅|(zhì)體輸送至癌癥部位的配體分子。可使用與腫瘤或血管內(nèi)皮細胞中普遍的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原或內(nèi)皮細胞表面抗原結(jié)合的單克隆抗體。在一些實施方案中，包被本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體經(jīng)過修飾以免被單核巨噬細胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，例如，通過使其結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合有調(diào)理作用抑制部分 (opsonization inhibition moities)。在一個實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時包括調(diào)理作用抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當調(diào)理作用抑制部分化學地或物理地搭接在脂質(zhì)體膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質(zhì)的活性基團直接結(jié)合，則調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護性表層，該表層顯著地減少巨噬-單核細胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(”RES”) 對脂質(zhì)體的攝入；在例如美國專利第4，920，016號中對此有記載，后者的全部公開內(nèi)容援引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制部分修飾過的脂質(zhì)體能夠保留在血液循環(huán)中的時間顯著更長。出于以上理由，這樣的脂質(zhì)體有時也被稱為“隱形，，(stealth)脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質(zhì)體會高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的攝入的減少阻止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈分子輸送至腫瘤細胞。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分可以為分子量約500 約40，000道爾頓、 例如約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺(polyamidoamine)； 聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，諸如化學結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、 海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應而生成了羧基結(jié)合的羧基化多糖類或寡糖。在一些實施方案中，調(diào)理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時稱為“PEG化脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制部分可以通過許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結(jié)合，然后再結(jié)合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。
上文討論了表達本發(fā)明的雙鏈分子的載體。這樣的表達至少一種本發(fā)明的雙鏈分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質(zhì)體。將表達本發(fā)明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術(shù)領域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的雙鏈分子可以通過適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內(nèi)施用途徑來施用。合適的腸內(nèi)施用途徑包括口腔、直腸、或鼻內(nèi)遞送。合適的非消化道施用途徑包括血管內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動脈內(nèi)推注、動脈內(nèi)輸注和針對血管網(wǎng)絡的導管滴注)，組織周圍和組織內(nèi)注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或其附近的區(qū)域，例如借助導管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。在一些實施方案中，通過注射或輸注可將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發(fā)明的雙鏈分子可以以單一劑量或分多個劑量來施用。當本發(fā)明的雙鏈分子的施用為輸注方式時，輸注可以是單個持續(xù)劑量，或者通過多次輸注來施用?？蓪⑺巹┲苯幼⑸涞浇M織或癌癥部位附近?？梢允┬袑⑺巹┒啻巫⑸涞桨┌Y部位或其附近的組織中。本領域技術(shù)人員可以容易地確定用于對給定受試者施用本發(fā)明雙鏈分子的合適劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近?；蛘?，雙鏈分子可以在約3 約28日、例如約7 約10日的期間內(nèi)每日一次或二次地施用給受試者。在一個例示性劑量方案中，雙鏈分子在7日期間內(nèi)一日一次地注射到癌癥部位或其附近。當劑量方案包括多次施用時，應該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量可以包含在整個劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。在本發(fā)明中，可以用至少一種選自下組的活性成分來治療過表達⑶C45L和/或 PIFl的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。所述癌癥包括但不限于肺癌。因而，在施用作為活性成分的本發(fā)明雙鏈分子之前， 優(yōu)選確認要治療的癌細胞或組織中CDC45L和/或PIFl的表達水平是否與相同器官的正常細胞相比升高。如此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療(過)表達⑶C45L和/ 或PIFl的癌癥的方法，該方法可包括下列步驟i)檢測自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中CDC45L和/或PIFl 的表達水平；ii)將所述⑶C45L和/或PIFl表達水平與正常對照比較；并iii)對具有與正常對照相比過表達⑶C45L和/或PIFl的癌癥的受試者施用至少一種選自下組的成分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，
(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體?；蛘?，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含至少一種選自下組的成分，用于施用于具有過表達⑶C45L和/或PIFl的癌癥的受試者(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。換言之，本發(fā)明進一步提供了一種用于鑒定要用下述各項治療的受試者的方法(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(c)編碼它們的載體，該方法可包括測定源自受試者的癌細胞或組織中CDC45L和/或PIFl的表達水平的步驟，其中所述水平與該基因正常對照相比的升高指示該受試者具有可用下述各項治療的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(c)編碼它們的載體。下面會更加詳細地描述本發(fā)明治療癌癥的方法。用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不僅限于，例如， 人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。根據(jù)本發(fā)明，測定自受試者獲得的癌細胞或組織中⑶C45L和/或PIFl的表達水平。表達水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(核酸)水平確定，使用本領域熟知的方法。舉例而言，CDC45L 或PIFl的mRNA可使用探針通過雜交方法(例如，Northern雜交)定量。可在芯片或陣列上實施所述檢測。對檢測CDC45L和/或PIFl的表達水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領域技術(shù)人員可利用⑶C45L或PIFl的序列信息制備此類探針。舉例而言，⑶C45L或PIFl的cDNA 可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物諸如染料、熒光物質(zhì)或同位素來標記，且所述基因的表達水平可以作為發(fā)生雜交的標記物的強度來加以檢測。進一步，⑶C45L或PIFl的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO 13或15)可使用引物通過基于擴增的檢測技術(shù)(例如，RT-PCR)定量。上述引物可基于所述基因已知的序列信息制備。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件或低嚴格條件下與CDC45L或PIFl的mRNA雜交。本文所用的短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件， 在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。 一般地，嚴格條件的溫度選擇為比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約 0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)。或者，本發(fā)明的診斷可以通過檢測翻譯產(chǎn)物來進行。例如，可以確定⑶C45L或 PIFl蛋白(SEQ ID N0:14或16)的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對CDC45L或PIFl蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于CDC45L和/或PIFl的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的方法，可利用針對 CDC45L或PIFl蛋白的抗體通過免疫組織化學分析測量其染色的強度。即，在此測量中，強染色表明所述蛋白質(zhì)的水平/存在增加，且同時表明CDC45L或PIFl基因的高表達水平。對于癌細胞中靶基因(即⑶C45L或PIFl基因)的表達水平而言，如果測定出其較之靶基因的對照水平(例如正常細胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可認為其在癌細胞中的表達水平是增加的。對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細胞可用作正常對照?；蛘?，對照水平可以借助統(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的CDC45L和/或PIFl基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對照水平可以是源自先前測試過的細胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中CDC45L和/或PIFl基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中CDC45L和/或 PIFl基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值 +/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范圍可以用作標準值。在本發(fā)明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌性對照水平”。當⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平與正常對照水平相比升高或者與癌性對照水平相似/等同時，該受試者可診斷為具有要治療的癌癥。(iv)組合物另外，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子或編碼該分子之載體的藥物組合物。具體地，本發(fā)明提供下述[1]至[24]的組合物[1] 一種用于抑制或降低表達⑶C45L和/或PIFl基因的細胞生長或治療或預防表達⑶C45L和/或PIFl基因的癌癥的組合物，其包括至少一種在導入細胞中時抑制或降低所述基因體內(nèi)表達的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體。[2][1]的組合物，其中所述雙鏈分子作用于mRNA，所述mRNA與選自下組的靶序列匹配對于 CDC45L 基因，SEQ ID NO :9 禾口 10，及對于 PIFl，SEQ ID NO: 11 禾口 12[3][1]的組合物，其中所述雙鏈分子包含有義鏈和與其互補的反義鏈，它們彼此雜交以形成雙鏈，其中所述有義鏈包含與選自下組的靶序列對應的核苷酸序列SEQ ID NO :9,10,11和 12 ；[4] [1]至[3]任一的組合物，其中需治療的癌癥是肺癌；[5] [4]的組合物，其中所述肺癌是小細胞肺癌或非小細胞肺癌；[6] [1]至[5]任一的組合物，其中所述組合物包含多種所述雙鏈分子；[7] [6]的組合物，其中所述多種雙鏈分子靶向相同基因；[8] [1]至[7]任一的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸；[9] [8]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[10] [9]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[11] [10]的組合物，其中所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[12] [1]至[11]任一的組合物，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度在19個與25個核苷酸對之間的雙鏈分子；[13] [1]至[12]任一的組合物，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸組成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈二者；[14] [13]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與選自SEQ ID NO :9、10、11和12中的靶序列對應的核苷酸序列的有義鏈，[B]為間插單鏈，且[A']為包含與[A]中選擇的靶序列的互補序列對應的寡核苷酸的反義鏈；[15] [1]至[14]任一的組合物，其中所述雙鏈分子包含RNA ；[16] [1]至[14]任一的組合物，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[17] [16]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[18] [17]的組合物，其中所述有義與反義鏈多核苷酸分別由DNA與RNA構(gòu)成；[19] [18]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[20] [19]的組合物，其中有義鏈和反義鏈多核苷酸之一或二者的5’端側(cè)翼的至少一個區(qū)域由RNA構(gòu)成；[21] [20]的組合物，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；[22] [1]至[21]任一的組合物，其中所述雙鏈分子包含一個或兩個3’突出端；[23] [1]至[22]任一的組合物，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[24] [1]至[23]任一的組合物，其還包括轉(zhuǎn)染增強劑、細胞滲透劑或藥學可接受載體。本發(fā)明的方法將在下面更加詳述地加以描述。本發(fā)明的所述雙鏈分子可以在施用于患者之前根據(jù)本領域眾所周知的技術(shù)配制為藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物特征為至少是無菌且不含熱原的。本文中所使用的“藥物配制劑”包括適用于人類與獸醫(yī)的配制劑。制備本發(fā)明藥物配制劑的方法屬于本領域一般技術(shù)，例如，描述于 Remington' s Pharmaceutical Science, 17th ed. ，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公開內(nèi)容通過引用包含于本文中。本發(fā)明的藥物配制劑包含至少一種本發(fā)明的雙鏈分子及其編碼載體(例如，重量為0. 到90% )，或所述分子的生理學上可接受的鹽，與生理上可接受的載體介質(zhì)混合。 例示性的生理學上可接受的載體介質(zhì)包括例如水、緩沖水、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質(zhì)酸或類似物。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物可包含多種雙鏈分子，其中每一個均可針對⑶C45L或 PIFl基因的相同或不同的靶序列。舉例而言，所述組合物可包含針對⑶C45L或PIFl基因的雙鏈分子。另外，例如，所述組合物可包含針對選自CDC45L和PIFl基因的靶序列的雙鏈分子。而且，本組合物可以包含編碼1個或多個雙鏈核酸分子的載體。例如，所述載體可以編碼1種、2種或數(shù)種本雙鏈核酸分子?；蛘?，本組合物可以包含多種載體，而各載體編碼不同的雙鏈核酸分子。而且，本雙鏈核酸分子可以作為脂質(zhì)體的形式包含在本組合物中。脂質(zhì)體的具體情況可以參照“(iii)使用雙鏈分子抑制或降低癌細胞生長和治療或預防癌癥的方法”項。此外，本發(fā)明的藥物組合物中還可以包含傳統(tǒng)的藥用賦形劑和/或添加劑。合適的藥用賦形劑包括穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括生理學生物相容性的緩沖液(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補加螯合劑(例如DTPA或 DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選的， 補加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可以進行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。對于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒固態(tài)載體。例如，藥物級的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物中可以包含上述列舉的任意載體和賦形劑，以及10-95%，例如25-75%的本發(fā)明的一種或多種雙鏈分子。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可以包含0. 01-20重量％、例如1-10重量％的包被于上述脂質(zhì)體中的一種或多種本發(fā)明的雙鏈分子，以及推進劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如用于鼻內(nèi)投遞的卵
磷脂等。除上述之外，本組合物中還可以包含其它藥學活性成分，只要它們不抑制本發(fā)明雙鏈分子的體內(nèi)功能。例如，上述組合物中可以包含常規(guī)用于癌癥治療的化療藥物。本發(fā)明還提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子在制備用于治療(過)表達⑶C45L和/或 PIFl基因的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及下述雙鏈核酸分子在制備用于治療(過)表達⑶C45L和/或PIFl基因的癌癥的藥物組合物中的用途該分子在過表達 CDC45L或PIFl基因的細胞內(nèi)抑制所述基因的(過)表達，且該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以SEQ ID N0:9、10、ll或12的序列為靶標?；蛘?，本發(fā)明進一步提供用于治療表達⑶C45L和/或PIFl基因的癌癥的本發(fā)明雙鏈核酸分子。本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療(過)表達⑶C45L和/或PIFl基因的癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將藥學或者生理學可接受的載體與作為活性成分的下述雙鏈核酸分子一起制劑化的步驟，其中所述雙鏈核酸分子抑制過表達CDC45L或 PIFl基因的細胞內(nèi)所述基因的表達，且該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以SEQ ID NO :9、10、11或12的序列為靶標。本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療(過)表達⑶C45L和/或PIFl基因的癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法或工藝包括將活性成分與藥學上或生理學上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是這樣的雙鏈核酸分子，其在過表達CDC45L或PIFl基因的細胞中抑制所述基因的表達，該分子包含有義鏈與與其互補的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以SEQ ID NO :9、10、11或12的序列為靶標。(4)診斷CDC45L介導的癌癥的方法發(fā)現(xiàn)⑶C45L基因的表達在肺癌組織中與相應的正常組織相比特異性的提高(圖 1、圖幻。另外，發(fā)現(xiàn)PIFl基因的表達也在肺癌組織中與相應的正常肺組織相比特異性的提高(圖4)。因而，本文鑒定出的基因及其轉(zhuǎn)錄與翻譯產(chǎn)物可以作為標志用于診斷由CDC45L 和/或PIFl基因介導的癌癥，而且，通過測量源自疑似罹患癌癥的患者的樣品中⑶C45L和 /或PIFl基因的表達可診斷這些癌癥。具體地，本發(fā)明提供了通過確定受試者中⑶C45L和 /或PIFl表達水平來診斷由⑶C45L和/或PIFl介導的癌癥的方法?？赏ㄟ^本發(fā)明方法診斷的CDC45L和/或PIFl推動的癌癥包括肺癌。肺癌包括非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺的腺癌(ADC)、肺的鱗狀細胞癌(SCC)、和肺大細胞癌(LCC)。根據(jù)本發(fā)明，可提供用于檢查受試者狀況的中間結(jié)果。所述中間結(jié)果可與其它信息結(jié)合起來以協(xié)助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員診斷患者罹患所述疾病?；蛘撸景l(fā)明可用于檢測源自受試者的組織中的癌性細胞，并給醫(yī)生提供有用的信息來診斷患者罹患所述疾病。具體地，本發(fā)明提供下述[1]到[15]的方法[1] 一種診斷由CDC45L或PIFl介導或推動的癌癥的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)檢測源自受試者的生物學樣品中⑶C45L基因和/或PIFl基因的表達水平；并(b)將所述表達水平與所述基因的正常對照水平相比的升高與疾病聯(lián)系起來；[2] 一種在受試者中檢測或診斷癌癥的方法，包括測定源自受試者的生物學樣品中CDC45L和/或PIFl的表達水平，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示受試者患有或有風險發(fā)生癌癥，或受試者中存在癌癥；[3] [1]或[2]的方法，其中所述表達水平比正常對照水平高至少10% ；[4] [1]至[3]任一的方法，其中所述表達水平通過選自下組的任一方法檢測(a)檢測編碼CDC45L或PIFl多肽的mRNA ；(b)檢測 CDC45L 或 PIFl 多肽；禾口(c)檢測⑶C45L或PIFl多肽的生物學活性；[5] [1]至[3]任一的方法，其中所述表達水平通過選自下組的方法檢測(a)檢測CDC45L基因的mRNA和/或PIFl基因的mRNA ；(b)檢測由CDC45L基因編碼的蛋白質(zhì)和/或由PIFl基因編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測由CDC45L基因編碼的蛋白質(zhì)和/或由PIFl基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學活性；[6][1]至[5]任一的方法，其中所述癌癥緣于⑶C45L或PIFl的過表達，或由 CDC45L或PIFl介導或推動；[7] [1]至[6]任一的方法，其中所述癌癥是肺癌；[8] [7]的方法，其中所述肺癌是非小細胞肺癌或小細胞肺癌；[9] [4]至[5]的方法，其中所述表達水平是通過檢測探針與編碼⑶C45L或PIFl多肽的基因轉(zhuǎn)錄物雜交確定的；[10] [4]或[5]的方法，其中所述表達水平是通過檢測針對⑶C45L或PIFl多肽的抗體的結(jié)合確定的；[11] [1]至[10]任一的方法，其中所述生物學樣品包括活檢物、痰或血液；[12] [1]至[10]任一的方法，其中所述源自受試者的生物學樣品包含上皮細胞、 血清或胸腔積液；[13] [1]至[12]任一的方法，其中所述源自受試者的生物學樣品包含癌細胞；[14] [1]至[13]任一的方法，其中所述源自受試者的生物學樣品包含癌性上皮細胞；[15] [1]至[10]任一的方法，其中所述源自受試者的生物學樣品包含肺組織。診斷癌癥的方法將在下面更加詳細的加以敘述。要用本方法診斷的患者可以為哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不僅限于，例如， 人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。在實施本發(fā)明方法時，為實施診斷，從要診斷的受試者采集生物樣品。任何生物學材料均可作為生物樣品用于測定，只要其包括目標的CDC45L和/或PIFl基因轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。所述生物樣品包括，但不僅限于，身體組織與體液，例如血液，例如血清，痰，尿液，和胸腔積液。在一些實施方案中，生物樣品含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，例如癌性上皮細胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，并將其用為生物樣品。根據(jù)本發(fā)明，測定在所述患者衍生生物樣品中⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平。表達水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(核酸)水平確定，使用本領域熟知的方法。舉例而言，CDC45L 或PIFl基因的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern印跡分析)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈嵤┧鰴z測。對檢測多個基因(例如，多種癌癥特異性基因)，包括CDC45L和 PIFl基因，的表達水平而言，可以使用陣列。本領域技術(shù)人員可利用⑶C45L(SEQ ID NO :13; GenBank 登錄號 NM_003504. 3)或 PIFl (SEQ ID NO 15 ；GenBank 登錄號 NM_025049. 2)的序列信息制備上述探針。舉例而言，CDC45L或PIFl基因的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標記，例如染料、熒光和同位素，且所述基因的表達水平可以所述雜交標記物的強度檢測。進一步，⑶C45L或PIFl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過基于擴增的檢測技術(shù)(例如， RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制備。舉例而言，用于實施例的引物(用于CDC45L的SEQ ID NO 1和2，用于PIFl的SEQ ID N0:3和4)可用于通過RT-PCR或Northern印跡的檢測，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件或低嚴格條件下與⑶C45L或PIFl基因的mRNA雜交。或者，可以檢測翻譯產(chǎn)物以進行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定⑶C45L或PIFl蛋白的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、SCFV、Fab、F(ab，)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段保留對CDC45L或PIFl蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于⑶C45L和/或PIFl的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的表達水平的方法， 可利用針對CDC45L或PIFl蛋白的抗體通過免疫組織化學分析觀察其染色的強度。意即， 觀察到強染色表明所述蛋白質(zhì)存在量增加，且同時表明CDC45L或PIFl的高表達水平(見 “實施例”中的免疫組織化學和組織微陣列分析)。另外，除⑶C45L和/或PIFl的表達水平外，亦可確定其它癌癥相關基因，例如已知在癌癥中有差異表達的基因的表達水平以提高所述診斷的準確性。對于包括⑶C45L和PIFl的癌癥標志基因，如果其于生物樣品中的表達水平較之相應的癌癥標志基因的對照水平(例如正常的或非癌性的細胞中的)增加，例如10%，25% 或50 %，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多的話，則其于生物樣品中的表達水平可認為是增加的。對照水平可以與測試生物樣品同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患癌或未患癌) 已知的患者收集和保存的樣品?；蛘撸瑢φ账娇梢越柚y(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的CDC45L和/或PIFl表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中CDC45L和/或PIFl的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。在一些實施方案中，使用從來自與源自患者的樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。在一些實施方案患者，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中⑶C45L和/或PIFl表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。 例如，平均值士2S.D.或平均值士3S.D.的范圍可以用作標準值。在本發(fā)明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。例如，可診斷從與癌性器官相同的器官獲得的正常組織。因而，正常肺組織可診斷為用于診斷肺癌的正常對照。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌性對照水平”。當⑶C45L和/或PIFl的表達水平相比正常表達水平有所提高或與癌性對照水平相似，則受試者可診斷為正罹患或有危險罹患癌癥，例如由CDC45L和/或PIFl介導的緣于 ⑶C45L和/或PIFl過表達的癌癥。進一步，當比較⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平時， 樣品與癌性參照之間基因表達模式的相似性表明受試者正罹患或有危險罹患癌癥，例如由 ⑶C45L和/或PIFl介導的源自⑶C45L和/或PIFl過表達的癌癥。此類癌癥涵蓋肺癌。測試生物樣品的表達水平與對照水平間的差異，可以相對于已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照核酸，例如管家基因，的表達水平加以標準化。示例對照基因包括，但不僅限于，β-肌動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白P1。或者，本發(fā)明提供用于在受試者衍生肺組織樣品中檢測或鑒定癌細胞的方法，所述方法包括測定源自受試者的生物學樣品中CDC45L和/或PIFl基因的表達水平的步驟， 其中所述表達水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示所述組織中癌細胞的存在或懷疑。此類結(jié)果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護士、或其它保健從業(yè)人員診斷受試者患有疾病。換言之，本發(fā)明可以給醫(yī)生提供有用信息來診斷受試者患有疾病。例如，依照本發(fā)明，當關于自受試者獲得的組織中癌細胞的存在有疑問時，通過考慮⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平，加上疾病的不同方面，包括組織病理學、血液中的已知腫瘤標志物的水平、和受試者的臨床過程等，能做出臨床決策。例如，一些公知的血液中的診斷性肺腫瘤標志物為 IAP、ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SPl、Span-I、 TPA、CSLEX、SLX、STN和CYFRA。就是說，在本發(fā)明的這個具體實施方案中，基因表達分析的結(jié)果作為中間結(jié)果，用于進一步診斷受試者的疾病狀態(tài)。或者，本發(fā)明提供試劑制備用于診斷癌癥的診斷性試劑的用途。在一些實施方案中，所述試劑可選自下組(a)用于檢測⑶C45L或PIFl基因之mRNA的試劑；(b)用于檢測CDC45L或PIFl蛋白的試劑；和(c)用于檢測⑶C45L或PIFl蛋白之生物學活性的試劑。具體地，此類試劑是與⑶C45L或PIFl多核苷酸雜交的寡核苷酸，或與⑶C45L或 PIFl多肽結(jié)合的抗體。換言之，本發(fā)明還提供用于診斷或檢測癌癥的試劑盒，其中所述試劑盒包含與 CDC45L基因或PIFl基因轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物結(jié)合的試劑。在本發(fā)明中，揭示了⑶C45L或PIFl不僅是有用的診斷性標志物，而且還是癌癥治療的合適靶物。因此，靶向⑶C45L或PIFl的癌癥治療可通過本發(fā)明來實現(xiàn)。在本發(fā)明中， 靶向⑶C45L或PIFl的癌癥治療指遏制或抑制癌細胞中的⑶C45L或PIFl活性和/或表達。 任何抗⑶C45L劑或抗PIFl劑可用于靶向⑶C45L或PIFl的癌癥治療。在本發(fā)明中，所述藥劑可用于靶向⑶C45L或PIFl的癌癥治療。在本發(fā)明中，抗⑶C45L劑或抗PIFl劑包括下述物質(zhì)作為活性組分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它的DNA，或(c)編碼它的載體。因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii)為癌癥治療選擇受試者的方法，該方法包括下列步驟a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中CDC45L或PIFl 的表達水平；b)將該⑶C45L或PIFl表達水平與正常對照水平比較；c)如果⑶C45L或PIFl表達水平與正常對照水平相比升高的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)如果受試者在步驟C)中診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進行癌癥治療?；蛘?，此類方法包括下列步驟a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中CDC45L或PIFl 的表達水平；b)將該⑶C45L或PIFl表達水平與癌性對照水平比較；c)如果該CDC45L或PIFl表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)如果受試者在步驟C)中診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進行癌癥治療。(5)評價⑶C45L介導的癌癥的預后的方法本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)，即⑶C45L(過)表達與具有⑶C45L介導的癌癥，例如肺癌的患者較差預后顯著相關。因此，本發(fā)明提供確定或評價罹患癌癥，例如由CDC45L介導的或緣于CDC45L過表達的癌癥，例如肺癌的患者的預后的方法，所述方法在患者生物樣品中檢測CDC45L基因表達水平；將測得的表達水平與對照水平比較；并確定相比對照水平增加的表達水平為不良預后(不良的存活率)的指示。在此，術(shù)語“預后“指根據(jù)病理性質(zhì)與癥狀表明的關于所述疾病的可能結(jié)果以及從疾病中恢復的前景。相應的，較為不利的、負面的、或不良的預后定義為較低的治療后存活期間與存活率。相反，正面的、有利的、或良好的預后定義為治療后存活期間或存活率提高。術(shù)語“評價預后”指預測、預告或?qū)⒔o定檢測或測量與患者癌癥的將來結(jié)果(例如，惡性化，治愈癌癥的可能性、估算的存活時間及類似的)相聯(lián)系。舉例而言，確定CDC45L 經(jīng)時的表達水平使預測患者結(jié)果(例如，增加或減少惡性化，增加或減少癌癥的等級，治愈癌癥的可能性、存活率及類似的)成為可能。在本發(fā)明的語境下，短語“評價(或確定)預后”意欲涵蓋癌癥的預測與可能性分析、進展、特別是癌癥復發(fā)、轉(zhuǎn)移擴散與疾病復發(fā)。目前評價預后的方法意欲用于臨床以對關于治療方法作出決定，包括治療介入、診斷標準例如疾病的分期，以及針對腫瘤疾病的轉(zhuǎn)移與復發(fā)的疾病監(jiān)視和監(jiān)測。具體地，本發(fā)明提供下述方法[1]至W][1] 一種評估肺癌受試者預后的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)測定源自受試者的生物學樣品中⑶C45L的表達水平；(b)將檢測到的表達水平與對照水平比較；并(c)基于(b)的比較來確定所述受試者的預后；[2] [1]的方法，其中所述對照水平是較好預后對照水平且相比于所述對照水平所述表達水平升高指示較差預后；[3] [1]的方法，其中所述對照水平是較差預后對照水平且所述對照水平相似表達水平指示較差預后；[4] [2]的方法，其中所述升高為比所述對照水平高至少10% ；和[5] [1]至[4]任一的方法，其中所述表達水平通過選自下組的方法來測定(a)檢測 CDC45L 基因的 mRNA ；(b)檢測由⑶C45L基因編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測由⑶C45L基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學活性；[6] [1]至[5]任一的方法，其中所述源自受試者的生物學樣品包含肺癌組織或肺癌細胞。本方法所用源自患者的生物樣品可為任何源自患者的樣品，只要⑶C45L可在樣品中檢測出來。在一些實施方案中，所述生物樣品包含肺細胞(從肺獲得的細胞)。進一步，所述生物樣品包括體液例如痰、血液、血清、血漿、胸腔積液等。另外，所述樣品可為從組織純化或獲得的細胞。生物樣品可在不同的時點自患者獲取，包括治療前，治療中和/或治療后。例如，自要評估的受試者獲得的肺癌細胞是優(yōu)選的生物學樣品。
根據(jù)本發(fā)明，顯示在源自患者的生物樣品中⑶C45L基因的表達水平越高，治療后病情緩和、恢復和/或存活就越為不良，且不良臨床后果的可能性就越高。因此，根據(jù)本方法，用作比較的“對照水平”可為，例如，在個體或個體組成的群體中任何CDC45L基因的表達水平，且所述個體或群體在治療后顯示良好或積極的癌癥預后，在此稱之為“良好預后對照水平”。此外，所述“對照水平”可為，例如，在個體或個體組成的群體中任何CDC45L基因的表達水平，且所述個體或群體在治療后顯示不良或消極的癌癥預后，在此稱之為“不良預后對照水平”。所述“對照水平”是源自單獨參照群體或多種表達模式的單獨表達模式。因此，所述對照水平可基于在其疾病狀態(tài)(良好或不良預后)已知的癌癥患者中，或癌癥患者的群體中，在進行任何種類治療之前的CDC45L基因的表達水平。在一些實施方案中，癌癥為肺癌。在一些實施方案中，使用具有已知疾病狀態(tài)的患者集合中的⑶C45L基因的表達水平的標準值。所述標準值可通過任何本領域已知的方法獲得。舉例而言，平均值+/-2倍 S.D.或平均值+/-3倍S. D.的范圍可用作標準值。所述對照水平可與所試生物樣品通過使用之前從已知其疾病狀態(tài)(良好預后或不良預后)的癌癥患者(對照或?qū)φ战M)在接受任何種類的治療之前采集并儲藏的樣品同時確定?；蛘撸鰧φ账娇赏ㄟ^統(tǒng)計學方法基于通過分析之前確定的從對照組采集或儲藏的樣品中CDC45L表達水平而獲得的結(jié)合來確定。進一步，所述對照水平可為源自先前測試的細胞或患者的表達模式的數(shù)據(jù)庫。另外，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在生物樣品中 ⑶C45L基因的表達水平可與多種對照水平比較，所述對照水平通過多種參照樣品確定。在一些實施方案中，使用從與源自患者生物樣品類似組織類型所得的參照樣品確定的對照水平。根據(jù)本發(fā)明，⑶C45L基因的表達水平與良好預后對照水平的相似性顯示所述患者較理想的預后，而相比于良好預后對照水平表達水平增加顯示較不理想的、較不良的治療后病情緩和、恢復、存活和/或臨床后果的預后。另一方面，相比于不良預后對照水平 ⑶C45L基因表達水平減少顯示患者較理想的預后，而與不良預后對照水平相似的基因表達水平顯示較不較理想的、較不良的治療后病情緩和、恢復、存活和/或臨床后果的預后。例如，自治療后顯示較好或較差癌癥預后的受試者獲得的肺癌細胞分別是較好或較差預后對照水平的優(yōu)選生物學樣品。當相對對照水平表達水平變化超過1. 0,1. 5,2. 0,5. 0,10. 0或更多倍時，在生物樣品中CDC45L基因表達水平可認為是改變(即升高或降低)了。所試生物樣品與對照水平間表達水平的差異可相對于對照，例如持家基因，加以標準化。舉例而言，已知其表達水平在癌性與非癌性細胞中不變的多核苷酸，包括那些編碼 β-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶與核糖體蛋白Pl的基因，可用于標準化CDC45L基因表達水平。所述表達水平可通過在源自患者的生物樣品中利用本領域眾所周知的技術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)錄物的方法來確定。所述通過本方法檢測的基因轉(zhuǎn)錄物既包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也包括翻譯產(chǎn)物，例如mRNA與蛋白質(zhì)。舉例而言，⑶C45L基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過雜交，例如使用⑶C45L基因探針的 Northern印跡雜交分析來檢測。所述檢測可在芯片或陣列上進行。對檢測多種基因包括CDC45L的表達水平，可使用陣列。作為另一個示例，基于擴增的檢測方法，例如使用對 CDC45L基因有特異性的引物基于逆轉(zhuǎn)錄的多聚酶鏈式反應可用于檢測(見“實施例”中(b) 半定量RT-PCR)。⑶C45L基因特異性探針或引物可使用常規(guī)技術(shù)參照⑶C45L的全序列(SEQ ID NO 13)設計和制備。舉例而言，在實施例中使用的引物(SEQ ID NO :1與2)可用于通過RT-PCR檢測，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件與低嚴格條件下與CDC45L基因的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴格(雜交)條件”指探針或載體會與其靶序列，但非其它序列雜交的條件。嚴格條件依賴于序列，且在不同情況下不同。觀察到長序列較之較短序列在更高溫度下特異性雜交。一般而言，嚴格條件的溫度選為大約比特定序列在給定離子強度與PH值下的熱熔解溫度(Tm)低大約5攝氏度。所述Tm是50% 互補于靶序列的探針與靶序列在平衡條件下雜交的溫度(在給定離子強度、PH與核酸濃度下)。因為所述靶序列通常過量存在，在Tm時50%的探針在平衡時被占據(jù)。通常，嚴格條件是在該條件下鹽濃度低于大約1. OM鈉離子，通常為0.01到1.0M鈉離子(或其它鹽)在 PH7.0到8. 3處，且溫度對短探針或引物(例如，10到50核苷酸)為至少30攝氏度，而對較長探針與引物為至少大約60攝氏度。嚴格條件亦可通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來達成。另外，本發(fā)明的評價亦可通過檢測翻譯產(chǎn)物來進行。舉例而言，可確定⑶C45L蛋白的量。確定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)量的方法包括使用特異性識別CDC45L蛋白的抗體的免疫測定方法。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾 (例如，嵌合抗體、scFV、Fab、F(ab，)2、Fv等等)可用于檢測，只要所述片段保留與CDC45L 蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領域是眾所周知的，可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。作為另一種基于CDC45L基因翻譯產(chǎn)物來檢測它的方法，可通過免疫組織化學分析利用針對CDC45L蛋白質(zhì)的抗體觀察其染色的強度。意即，觀察到強染色表明CDC45L蛋白存在量增加，且同時表明CDC45L基因的高表達水平。進一步，已知⑶C45L蛋白具有細胞增殖活性。因此，⑶C45L基因的表達水平可使用上述細胞增殖活性作為指標確定。舉例而言，在生物樣品存在下制備并培養(yǎng)表達CDC45L 的細胞，隨后通過檢測增殖速度或評價細胞周期或集落形成能力，可確定所述生物樣品的細胞增殖活性。另外，除CDC45L基因的表達水平外，亦可確定其它肺細胞相關基因，例如已知在肺癌中有差異表達的基因，的表達水平，以提高所述診斷的準確性。上述其它的肺癌相關基因包括那些于W02004/031413和W02005/090603中描述的基因。需根據(jù)本方法評價癌癥預后的患者可以為哺乳動物，包括人、非人靈長類、小鼠、 大鼠、犬、貓、馬和牛?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，除其它測試結(jié)果外，還可提供用于評價患者預后的中間結(jié)果。 所述中間結(jié)果可協(xié)助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員評價、確定或估計患者的預后?？膳c本發(fā)明所得中間結(jié)果結(jié)合考慮的其它信息包括患者的臨床癥狀和身體狀況?；蛘撸景l(fā)明提供試劑制備用于評估癌癥預后的試劑的用途。在一些實施方案中， 所述試劑可選自下組
(a)用于檢測⑶C45L基因之mRNA的試劑；(b)用于檢測CDC45L的試劑；和(c)用于檢測⑶C45L蛋白之生物學活性的試劑。具體地，此類試劑是與⑶C45L多核苷酸雜交的寡核苷酸，或與⑶C45L多肽結(jié)合的抗體。(6)診斷癌癥或評價癌癥預后的試劑盒本發(fā)明提供了診斷癌癥或評價癌癥預后的試劑盒。本發(fā)明還提供用于確定受試者患有可以用本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它的載體來治療的癌癥的試劑盒，其也可用于評估和 /或監(jiān)測癌癥治療的功效。在一些實施方案中，所述癌癥由CDC45L和/或PIFl介導，或緣于⑶C45L和/或PIFl過表達，例如肺癌。具體而言，所述試劑盒包含至少一種在源自患者的生物樣品中檢測⑶C45L或PIFl基因表達的試劑，所述試劑可選自下組(a)檢測CDC45L或PIFl基因的mRNA的試劑；(b)檢測CDC45L或PIFl的蛋白質(zhì)的試劑；(c)檢測⑶C45L或PIFl的蛋白質(zhì)的生物學活性的試劑。適于檢測⑶C45L或PIFl基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識別⑶C45L或PIFl mRNA的核酸，例如具有與⑶C45L或PIFl mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對CDC45L或PIF ImRNA為特異性的引物與探針。可基于本領域眾所周知的方法制備這類寡核苷酸。如果需要，檢測CDC45L或PIFl mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測⑶C45L或PIFl mRNA的試劑。探針或引物可以有具體的大小。所述大小選自下組至少10個核苷酸，至少12個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20個核苷酸，至少25個核苷酸，至少30個核苷酸，而且探針和引物的大小范圍可以是5-10個核苷酸、10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-25個核苷酸和25-30個核苷酸。另一方面，適于檢測⑶C45L或PIFl蛋白質(zhì)的試劑包括針對⑶C45L或PIFl蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab，)2, Fv等等)均可用于檢測，只要所述片段保留與⑶C45L 或PIFl蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標記技術(shù)進行標記。標記物與標記抗體以及檢測抗體與其靶結(jié)合的方法在本領域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測⑶C45L或PIFl蛋白質(zhì)的試劑。進一步，所述生物學活性可通過，例如，測量所述生物樣品中由于⑶C45L或PIFl 蛋白質(zhì)表達而導致的細胞增殖活性來確定。舉例而言，在源自患者的生物樣品的存在下培養(yǎng)所述細胞，然后通過檢測增殖的速度，或測量細胞周期或集落形成活性，可確定所述生物樣品的生物學活性。如需要，檢測CDC45L或PIFl mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測CDC45L或PIFl蛋白質(zhì)生物學活性的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。進一步，所述試劑盒可包括固體基質(zhì)以及用于將探針與⑶C45L或PIFl基因結(jié)合的試劑或針對⑶C45L或PIFl蛋白質(zhì)的抗體，用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基與容器，陽性與陰性對照試劑，以及用于檢測針對CDC45L或PIFl蛋白質(zhì)的抗體的第二抗體。舉例而言，從具有良好預后或不良預后的患者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾紙、針頭、注射器和帶有使用說明書的裝箱單(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)。這些試劑之類的可標上標簽包含在容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶 (vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個實施方案，當所述試劑是針對⑶C45L或PIFl mRNA的探針時， 所述試劑可固定化于固體基質(zhì)上，例如多孔條，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置?；蛘?，對照位置可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在接下來的位置上量較小。在加入樣品之后，顯示可檢測信號位置的數(shù)量提供了在樣品中存在的⑶C45L或PIFlmRNA量的定量指征。所述檢測位置可具有任何合適可檢測的形狀，并通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照或⑶C45L或PIFl標準樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集⑶C45L或PIFl陽性血液樣品來制備，隨后分析其⑶C45L或 PIFl水平?；蛘?，可將純化的⑶C45L或PIFl蛋白或多核苷酸添加到不含⑶C45L或PIFl 的血清中以形成所述陽性樣品，或⑶C45L或PIFl標準品。在本發(fā)明中，純化的⑶C45L或 PIFl可為重組蛋白。所述陽性對照樣品中⑶C45L或PIFl的水平，例如，是高于截止值的。(7)篩選方法使用CDC45L或PIFl基因、由所述基因編碼的多肽或其片段、或所述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，有可能篩選改變所述基因的表達或由所述基因編碼的多肽的生物學活性的藥劑或化合物。此類藥劑或化合物可用作藥物來治療或預防癌癥，特別是肺癌。如此，本發(fā)明提供使用CDC45L或PIFl基因、由所述基因編碼的多肽或其片段、或所述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，篩選用于治療或預防癌癥的候選藥劑或化合物的方法。通過本發(fā)明篩選方法分離的藥劑或化合物是預期抑制CDC45L或PIFl基因的表達或所述基因的翻譯產(chǎn)物的活性的物質(zhì)，并因此是用于治療或預防歸于例如細胞增殖性疾病的疾病，諸如癌癥(特別是肺和食管癌)的候選物。就是說，認為通過本發(fā)明方法篩選的藥劑或化合物具有臨床好處，而且可進一步測試其在動物模型或測試受試者中阻止癌細胞生長的能力。(I)用于篩選的測試化合物在本發(fā)明的語境中，待通過本篩選方法鑒定的藥劑可以是任何化合物或包含數(shù)種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細胞或蛋白的測試藥劑或化合物可以是單個化合物或多個化合物的組合。當在方法中使用化合物組合時，化合物可以順次或同時加以接觸。任何測試藥劑或化合物，例如，細胞提取物、細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構(gòu)建體，例如反義DNA、siRNA、核酶等)以及天然化合物，均可用于本發(fā)明的篩選方法中。也可以從本領域熟知的很多組合文庫方法中采取任何辦法來獲得本發(fā)明的測試藥劑或化合物，這些方法包括
(1)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries),(3)需要解卷積(deconvolution)的合成文庫法，(4) “一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文庫法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam(1997) Anticancer Drug Des. 12 145-67)。合成分子文庫方法的例子可在本領域找到(DeWitt et al. ,Proc NatlAcad Sci USA 1993,90 :6909-13 ； Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al. , J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al.，Science 1993,261 :1303-5 ；Care11 et al.，Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 2059 ；Carell et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37:1233-51)?；衔镂膸炜商峁┯谌芤褐?參見Houghten，Bio/Techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam,Nature 1991,354 :82-4)、 芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、細菌上(美國專利5，223，409)、孢子上(美國專利 5，571，698 ；5，403，484 與 5，223，409)、質(zhì)粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1992,89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Science 1990,249 :386-90 ；Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ；美國專利申請 2002-103360)。通過本發(fā)明任何篩選方法篩選到的化合物的一部分結(jié)構(gòu)通過添加、刪除、和/或置換方式被轉(zhuǎn)換而得到的化合物，包括在通過本發(fā)明篩選方法獲得的化合物之內(nèi)。此外，當所篩選的測試藥劑或化合物是蛋白質(zhì)時，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據(jù)該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的DNA。所得的DNA可用于制備用于治療或預防癌癥的候選物的測試劑或化合物。對本文描述篩選為有用的測試藥劑或化合物亦可為特異性結(jié)合CDC45L或PIFl蛋白或其缺乏結(jié)合配偶的活性的部分CDC45L或PIFl肽的抗體或非抗體結(jié)合蛋白。此類部分蛋白質(zhì)或抗體可通過本文所述方法來制備(見“定義”或“抗體”(1)癌癥相關基因和癌癥相關蛋白，及其功能性等同物或抗體)且可測試它們阻斷蛋白質(zhì)與其結(jié)合配偶結(jié)合的能力。⑴分子建模對具有目標性質(zhì)的化合物的分子結(jié)構(gòu)/對待抑制靶分子的分子結(jié)構(gòu)的知識為人們構(gòu)建測試藥劑或化合物文庫提供了便利。預篩選適于進一步評估的測試藥劑或化合物的方法之一，是對測試藥劑/化合物與其靶物的相互作用進行計算機建模。計算機建模技術(shù)為針對選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會與該分子相互作用的新化合物的合理設計提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于從選定分子的χ-射線晶體分析或NMR成像而來的數(shù)據(jù)。分子動力學需要力場數(shù)據(jù)。計算機圖形系統(tǒng)為預測新化合物如何連接靶分子，以及實驗操作化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化結(jié)合特異性提供了可能。 為了預測當分子和化合物之一或二者發(fā)生細小改變時分子-化合物相互作用是什么樣的， 需要分子力學軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯(lián)著分子設計程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動的界面。上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個實例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動力學功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進行分子相互行為的互動性構(gòu)建、修飾、和可視化分析。有多篇文獻綜述了與特異蛋白相互作用的藥物的計算機建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ；Ripka, New Scientist 1988,54—8; McKinlay & Rossmann,Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989,29 :111-22 ；Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ；Lewis & Dean， Proc R Soc Lond 1989,236 125-40,141-62 ；以及綜述關于核酸組分模型受體的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989， 111 :1082-90。其它可篩選并圖形描述化學物質(zhì)的計算機程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見例如DesJarlais et al.，J Med Chem 1988,31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24 ；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993，259 1445-50。一旦鑒定出⑶C45L或PIFl活性的抑制劑，可使用組合化學技術(shù)基于鑒定出的抑制劑的化學結(jié)果構(gòu)建任何數(shù)量的變體，如下所述。對于所得的候選抑制劑，或稱“測試藥劑或化合物”的文庫，可使用本發(fā)明的方法篩選，以鑒定文庫中破壞CDC45L或PIFl活性的測試藥劑或化合物用于治療和/或預防癌癥和/或防止癌癥的手術(shù)后復發(fā)。(ii)組合化學合成測試藥劑或化合物的組合文庫可以作為合理藥物設計程序——其涉及有關 ⑶C45L或PIFl活性的已知抑制劑中存在的核心結(jié)構(gòu)的知識——的一部分來制備。這種策略使得文庫可以保持合理的規(guī)模，便于高通量篩選?；蛘撸赏ㄟ^簡單地合成構(gòu)成文庫的分子家族的所有排列，構(gòu)建簡單的、特別是短的、聚合物性的分子文庫。后一種方法的一個實例是全部由長度為6個氨基酸組成的肽文庫。這種肽文庫包含所有6氨基酸序列組合。這種類型的文庫稱作線性組合化學文庫。組合化學文庫的制備是本領域技術(shù)人員所熟知的，可以通過化學或生物合成來產(chǎn)生。組合化學文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ；Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al. , Nature 1991，354 :84-6)。也可以使用其它用于產(chǎn)生化學多樣性文庫的化學。這些化學包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被編碼的肽(例如W093/20242)，隨機生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美國專利5，觀8，514)，diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽類肽模擬物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 9217-8)，小化合物文庫的模擬物有機合成(analogous organic synthese) (Chen et al.， J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氨基甲酸鹽(Cho et al.，Science 1993,261 1303)，和 / 或月太酰膦酸酯(ρ印tidylphosphonates) (Campbell et al. ,J Org Chem 1994，59:658)，核酸文庫(見Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology, 1990-2008, John Wiley Interscience ；Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Ed. ,2001, Cold Spring Harbor Laboratory,New York，USA)，月太核酸文庫(見例如美國專利 5，539，083)，抗體文庫(見例如 Vaughan et al.，Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文庫(見例如Liang et al. ,Science 1996,274 =1520-22 ；美國專利5，593，853)，和有機小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995Dec 1 ；6 (6) :624-31 ；類異戊二烯(isoprenoids)，美國專利5，569，588 ；噻唑燒酮(thiazolidinones)和偏硫雜氮雜環(huán)己燒(metathiazanone)，美國專利5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美國專利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美國專利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。(iii)其它候選物另一種手段是使用重組噬菌體來產(chǎn)生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott & Smith， Science 1990,249 :386-90 ；Cwirla et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ； Devlin et al.，Science 1990，249 :404-6)，可以構(gòu)建非常大的文庫(例如 IO6-IO8 個化學實體)。再一種手段主要使用化學方法，其實例包括Geysen方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. , J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251 :767-73)。Furka 等(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ；Furka, Int J Peptide Protein Res 1991，37 :487-93) ,Houghten (美國專利 4，631，211)和 Rutter 等(美國專利5，010，175)記載了產(chǎn)生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動劑或拮抗劑加以測試。適體是由緊密結(jié)合特定分子靶的核酸構(gòu)成的大分子。Tuerk和GolcKScience. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通過指數(shù)式富集進行的配體系統(tǒng)性進化)方法來選擇適體。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文庫(例如IO15種不同分子)可用于篩選。(II)篩選方法(i)通用篩選方法使用CDC45L或PIFl基因、由所述基因編碼的蛋白質(zhì)、或所述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)， 可鑒定改變所述基因的表達或由所述基因編碼的多肽的生物學活性的化合物。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)⑶C45L和PIFl基因在癌癥中過表達，并證明涉及癌細胞生長和/或存活。因此， 改變這些基因的表達或由那些基因編碼的多肽的生物學活性的化合物可以是癌癥的候選治療劑。結(jié)合⑶C45L或PIFl多肽的拮抗劑可抑制介導癌細胞增殖的生物學活性，因此，它們是用于治療癌癥的候選物。因此，本發(fā)明提供了通過鑒定結(jié)合CDC45L或PIFl多肽的藥劑或化合物來鑒定用于治療或預防表達CDC45L和/或PIFl的癌癥的潛在候選物的方法。作為抑制⑶C45L或PIFl蛋白與其結(jié)合配偶(例如⑶C45L和PIFl彼此)之間結(jié)合的篩選化合物的方法，可使用本領域技術(shù)人員公知的許多方法。例如，篩選可以作為體外測定系統(tǒng)，例如細胞系統(tǒng)進行。更具體地，首先，使CDC45L或PIFl蛋白或其結(jié)合配偶結(jié)合至支持物，并對其添加另一蛋白質(zhì)以及測試化合物。例如，使CDC45L或PIFl結(jié)合至支持物， 并對其添加結(jié)合配偶多肽以及測試化合物。接著，將混合物溫育、清洗并檢測和/或測量結(jié)合至支持物的另一蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的語境中，“抑制兩種蛋白質(zhì)之間的結(jié)合”指至少降低所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。如此，在一些情況中，在測試藥劑或化合物存在下樣品中結(jié)合對的百分比與適宜(例如不用測試化合物處理或來自非癌癥樣品，或來自癌癥樣品)對照相比降低。與對照樣品中的結(jié)合對相比，蛋白質(zhì)結(jié)合量的降低可以是例如少于90 %、80 %、70 %、60 %、50 %、40 %、 25%、10%、5%、1%或更少(例如 0%)?？捎糜诮Y(jié)合蛋白質(zhì)的支持物的例子包括例如不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和右旋糖酐；和合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；例如，可使用自上述材料制備的商品化的珠子和板(例如多孔板、生物傳感器芯片、等)。在使用珠時，可以將它們裝入柱中?；蛘?，磁珠的使用也是本領域已知的，而且能夠容易地經(jīng)磁力分離結(jié)合在珠子上的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)對支持物的結(jié)合可依照常規(guī)方法來進行，例如化學鍵合和物理吸附。 或者，可以經(jīng)特異性識別蛋白質(zhì)的抗體使蛋白質(zhì)結(jié)合至支持物。此外，蛋白質(zhì)對支持物的結(jié)合也可借助親合素和生物素來進行。當固定化多肽暴露于合成化學化合物、或天然物質(zhì)庫、或隨機噬菌體肽展示庫時結(jié)合的分子的篩選方法和使用高通量、基于組合化學技術(shù)(Wrighton et al.，Science 273 =458-63(1996) ；Verdine, Nature 384 :11-3(1996))來分離結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)及化學化合物(包括激動劑和拮抗劑)的篩選方法是本領域技術(shù)人員公知的。另外，在本發(fā)明的篩選方法中，遏制CDC45L或PIF之表達水平的藥劑或化合物也可鑒定為癌癥的候選治療劑。多肽或其功能性等同物的表達水平可以依照本領域已知的任何方法來檢測。例如，可使用報告測定法。合適的報告基因和宿主細胞是本領域公知的。篩選所需的報告構(gòu)建物可通過使用CDC45L或PIFl基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。當基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是本領域技術(shù)人員知道的時，報告構(gòu)建物可以通過利用現(xiàn)有序列信息來制備。當轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)尚未鑒定時，可以基于基因的核苷酸序列信息自基因組文庫分離含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段。具體地，篩選所需報告構(gòu)建物可通過連接報告基因序列與感興趣的CDC45L 或PIFl基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。⑶C45L或PIFl基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)是起始密碼子至上游至少500bp，例如IOOObp，例如上游5000或IOOOObp的區(qū)域。含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段可以自基因組文庫分離，或者可以通過PCR擴增。用于鑒定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的方法，還有測定方案是公知的(Sambrook and Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Ed.， Chapter 17,2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。另外，在本發(fā)明的篩選方法中，抑制CDC45L或PIF蛋白之生物學活性的藥劑或化合物也可鑒定為癌癥的候選治療劑。各種低通量和高通量酶測定法形式是本領域公知的且能容易地適用于檢測或測量⑶C45L或PIFl多肽的生物學活性。對于高通量測定法，可以方便地在固體支持物上固定化物質(zhì)。反應后，可以通過上文所述方法檢測固體支持物上被多肽轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。或者，可以在溶液中實施接觸步驟，之后可以在固體支持物上固定化物質(zhì)，并可以檢測被多肽轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。為了便于此類測定法，可以用鏈霉親合素包被固體支持物，且可以用生物素標記物質(zhì)，或者可以用針對物質(zhì)的抗體包被固體支持物。熟練技術(shù)人員能根據(jù)期望的篩選通量能力確定合適測定法形式。
本發(fā)明的測定法還適合于便于高通量篩選的自動化規(guī)程。已經(jīng)為溶液相化學開發(fā)了多種公知的機器人系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括自動化工作站，像由Takeda Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)開發(fā)的自動化合成裝置和許多利用機械臂的機器人系統(tǒng) (Zymate 11,Zymark Corporation,Hopkinton,Mass. ；Orca，Hewlett Packard,Palo Alto, Calif.)，它們模擬由化學家實施的手動合成操作。任何上述裝置適合用于本發(fā)明。這些裝置(如果有的話)的性質(zhì)和為使它們能如本文中所討論的那樣運轉(zhuǎn)而執(zhí)行的修改對相關領域技術(shù)人員會是顯而易見的。另外，眾多組合文庫自身是商品化的(參見例如ComGenex， Princeton, N. J. , Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc. , St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, ^ )。在本發(fā)明中，揭示了⑶C45L或PIFl的表達水平和/或生物學活性的遏制導致癌細胞生長的遏制。因此，當化合物或藥劑遏制CDC45L或PIFl的表達和/或活性時，該遏制指示在受試者中的潛在治療效果。在本發(fā)明中，潛在治療效果指合理預期的臨床好處。在本發(fā)明中，此類臨床好處包括(a)降低CDC45L或PIFl基因的表達；(b)降低受試者中癌癥的大小、流行度、或轉(zhuǎn)移潛力；(c)防止癌癥形成；或(d)防止或緩解癌癥的臨床癥狀。(ii)篩選結(jié)合⑶C45L或PIFl蛋白的化合物在本發(fā)明中，⑶C45L或PIFl的過表達在癌癥中檢測到，但是在正常組織中沒有檢測到。另外，證明了由這些基因編碼的多肽涉及癌細胞生長。因此，那些基因可能是癌癥治療和診斷的良好分子靶物。結(jié)合CDC45L或PIFl多肽的藥劑或化合物可抑制這些多肽的生物學活性。此類化合物作為藥物用于治療或預防肺癌或作為檢測劑用于診斷肺癌和評估肺癌患者預后。具體地，本發(fā)明提供使用CDC45L或PIFl多肽來篩選可用于診斷、治療或預防癌癥的藥劑或化合物的方法。此篩選方法的一個實施方案包括下述步驟(a)使測試藥劑或化合物與選自CDC45L和PIFl蛋白或其片段的多肽接觸；(b)檢測所述多肽或片段和所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合水平；(c)選擇結(jié)合步驟(a)所述多肽或片段的測試藥劑或化合物。依照本發(fā)明，可評估測試藥劑或化合物抑制細胞生長的治療效果或候選藥劑或化合物治療或預防CDC45L或PIFl相關疾病的治療效果。因此，本發(fā)明還提供用于篩選遏制癌細胞增殖的候選藥劑或化合物的方法和用于篩選治療或預防癌癥的候選藥劑或化合物的方法。更具體地，所述方法包括下述步驟(a)使測試藥劑或化合物與選自CDC45L和PIFl蛋白或其片段的多肽接觸；(b)檢測所述多肽和所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合水平；(c)將b)的結(jié)合水平與測試藥劑或化合物的治療效果關聯(lián)起來。或者，依照本發(fā)明，還可評估或評價測試藥劑或化合物治療或預防癌癥的潛在治療效果。在一些實施方案中，本發(fā)明提供評估或評價測試物質(zhì)治療或預防與CDC45L和/或 PIFl過表達有關的癌癥或抑制與CDC45L和/或PIFl過表達有關的癌癥的治療效果的方法，所述方法包括下述步驟(a)使藥劑或化合物與由CDC45L或PIFl的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽和所述測試藥劑或化合物之間的結(jié)合活性；并(c)將潛在治療效果與測試藥劑或化合物關聯(lián)起來，其中當藥劑或化合物結(jié)合多肽時顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，可以將治療效果與⑶C45L或PIFl蛋白的結(jié)合水平關聯(lián)起來。例如， 當測試藥劑或化合物結(jié)合CDC45L或PIFl蛋白時，可鑒定或選擇該測試藥劑或化合物作為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘?，當測試藥劑或化合物不結(jié)合CDC45L或PIFl蛋白時，可鑒定該測試藥劑或化合物作為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明所述方法將在下面更加詳細的加以描述。需用于篩選的CDC45L或PIFl多肽可為重組多肽，或者是來自自然界的蛋白質(zhì)，或其部分肽。與測試化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。作為使用⑶C45L或PIFl多肽來篩選蛋白質(zhì)，例如與⑶C45L或PIFl多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可使用本領域技術(shù)人員眾所周知的方法。上述篩選可通過例如免疫沉淀方法進行。在宿主(例如，動物)細胞等中通過將編碼CDC45L或PIFl多肽的基因插入外源基因表達載體,例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. U pCAGGS與pCD8來表達所述基因。為此表達所用的啟動子可為任何通常使用的啟動子，包括，例如，SV40早期啟動子(Rigby in Williamson(ed. ), Genetic Engineering, vol.3.Academic Press, London, 83-141 (1982))、EF-alpha啟動子(Kim et al. ,Gene 91 :217-23 (1990))、CAG啟動子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991)), RSV LTR 啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))、SR alpha 啟動子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 8 :466 (1988))、CMV 立即早期啟動子(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))、SV40 晚期啟動子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385-94(1982))、腺病毒晚期啟動子 (Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 :946 (1989))、HSV TK 啟動子等等。將所述導入宿主細胞以表達外源基因可根據(jù)任何方法實施，例如電穿孔方法 ((Chu et al. ,Nucleic Acids Res 15 131116 (1987))、磷酸鈣方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745-52 (1987))、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12 :5707-17(1984) ；Sussman and MiIman, Mol Cell Biol 4 1641-3(1984)), Lipofectin 方法(Deri jard B. , Cell 76 :1025-37 (1994) ；Lamb et al. , Nature Genetics 5 :22-30(1993) =Rabindran et al.，Science 259 :230-4(1993))等等。對于由CDC45L或PIFl基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識別位點(表位)導入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達為包含該表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85-90 (1995))?？缮藤彽妮d體能夠利用其多克隆位點表達與例如β -半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白(GFP)形成的融合蛋白。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通過導入僅由數(shù)個到十余個(a dozen)氨基酸構(gòu)成的小型表位加以制備，使融合不會改變CDC45L或PIFl多肽的性質(zhì)。可以使用例如多組氨酸(His-標簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(Τ7-標簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標簽)、 E-標簽(多克隆噬菌體上的表位)等表位，和識別它們的單克隆抗體作為篩選與CDC45L或PIFl多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13 :85-90(1995))在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細胞裂解物內(nèi)形成免疫復合體。免疫復合體由CDC45L或PIFl多肽、具有與該多肽結(jié)合能力的多肽、和抗體組成。除了使用針對上述表位的抗體之外，還可以使用針對CDC45L或PIFl多肽的抗體進行免疫沉淀，這樣的抗體的制備如下文所述。免疫復合體可以被沉淀，例如當抗體是小鼠IgG抗體時，可以通過蛋白As印harose或蛋白G s印harose將其沉淀。如果將由CDC45L或PIFl基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結(jié)合這些表位的底物，例如谷胱甘肽-sepharose 4B，按照與使用針對⑶C45L或PIFl的抗體的相同的方式來形成免疫復合體?？勺裱蚋鶕?jù)，例如，文獻中的方法來實施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies,511-52,Cold Spring Harbor Laboratory publications,New York (1988))。普遍使用SDS-PAGE分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠，可以利用結(jié)合蛋白的分子量來分析該蛋白。由于與CDC45L或PIFl多肽結(jié)合的蛋白難以通過考馬斯蘭染色或銀染色等普通染色方法檢測到，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，標記細胞中的蛋白，并檢測該蛋白。當?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測定其序列。作為利用⑶C45L或PIFl多肽來篩選結(jié)合這些多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al.，Cell 65:83-90(1991))。具體地，與 CDC45L 或PIFl多肽結(jié)合的蛋白可以通過如下方法獲得，從預期表達CDC45L或PIFl多肽的培養(yǎng)細胞(例如肺癌細胞系)利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA文庫，在LB瓊脂糖上表達蛋白，將表達出的蛋白固定在膜上，使純化并且標記的CDC45L或PIFl多肽與上述膜反應，并依照標記來檢測表達與CDC45L或PIFl多肽結(jié)合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結(jié)合，或者利用特異結(jié)合CDC45L或PIFl多肽或與CDC45L或 PIFl多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體，來進行標記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法。術(shù)語“標記物”和“可檢測標記物”在本文中用于指任何可以通過光譜學、光化學、 生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段檢測到的組合物。此類標記物包括用經(jīng)標記鏈霉親合素偶聯(lián)物染色的生物素、磁珠子(例如DYNABEADSTM)、熒光染料(例如熒光素、德州紅、若丹明、綠色熒光蛋白、等等)、放射性標記物(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)、和量熱標記物(例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠、等)珠子。教導此類標記物使用的專利包括美國專利 No. 3，817，837 ；3，850，752 ；3，939，350 ；3，996，345 ；4，275，149 ；和 4，366，241。 檢測此類標記物的手段是本領域技術(shù)人員公知的。如此，例如，放射性標記物可使用照相膠片或閃爍計數(shù)器來檢測，熒光標記物可使用檢測發(fā)射光的光檢測儀來檢測。酶標記物通常通過給酶提供底物并檢測酶作用于底物產(chǎn)生的反應產(chǎn)物來檢測，而量熱標記物只需通過顯現(xiàn)有色標記物來檢測?；蛘?，在本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid AssayKit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻見“Dalton and Treisman，Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，例如，使本發(fā)明的多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。從預期表達與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細胞制備cDNA文庫，從而使該文庫在被表達時與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將cDNA文庫導入到上述酵母細胞中， 并從檢測到的陽性克隆(當酵母細胞表達可與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白時，兩者的結(jié)合可激活報告基因，使陽性克隆可檢測)分離源自該文庫的cDNA。通過將上面分離的cDNA導入到大腸桿菌中并表達該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報告基因，除了 HIS3基因之外，還可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可以用親和色譜來篩選與CDC45L或PIFl基因編碼的多肽結(jié)合的化合物。例如， 可以把本發(fā)明多肽固定在親和柱的載體上，而將含有能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的蛋白的測試化合物施加到該柱上。這里的測試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在加載測試化合物之后，沖洗柱子，從而可以制備得到結(jié)合于本發(fā)明多肽的化合物。當測試化合物是蛋白質(zhì)時，對所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行分析，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼該蛋白的DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以在本發(fā)明中用作檢測或定量結(jié)合化合物的裝置。當使用這種生物傳感器時，可以僅使用微量并且沒有標記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等離子體共振信號的形式對本發(fā)明多肽與測試化合物間的相互作用進行實時的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，人們就有可能對本發(fā)明多肽與測試化合物間的結(jié)合進行評估。用于篩選當固定的CDC45L或PIFl多肽暴露于合成化合物或天然底物文庫或隨機噬菌體多肽展示文庫時發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及使用基于高通量的組合化學技術(shù) (ffrighton et al. , Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384 :11-13(1996)； Hogan, Nature 384 :17-9 (1996))，不僅分離與CDC45L或PIFl蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且分離與CDC45L或PIFl蛋白結(jié)合化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法，是本領域技術(shù)人員眾所周知的。在本發(fā)明中，揭示了遏制⑶C45L或PIFl的表達水平則降低細胞生長。如此，通過篩選結(jié)合CDC45L或PIFl的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預防癌癥的候選化合物。可通過二次和/或進一步的篩選來評估這些候選化合物治療或預防癌癥的潛力，以鑒定用于癌癥的治療劑。例如，當某種結(jié)合CDC45L或PIFl蛋白的化合物抑制癌癥的活性時，可得出結(jié)論，該化合物具有CDC45L或PIFl特異性治療效果。(iii)篩選遏制⑶C45L或PIFl蛋白之生物學活性的化合物本發(fā)明還提供使用CDC45L或PIFl多肽或其片段的生物學活性作為指標篩選用于治療或預防癌癥的候選藥劑或化合物的方法具體地，本發(fā)明提供下述方法[1]至[4][1] 一種篩選可用于治療或預防表達CDC45L和/或PIFl的癌癥的藥劑或化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試藥劑或化合物與CDC45L或PIFl多核苷酸或其功能性等同物或片段接觸；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物學活性；(c)將步驟(b)中檢測到的水平與在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平比較；(d)選擇降低或抑制所述多肽之生物學活性的測試藥劑或化合物。[2] [1]的方法，其中所述生物學活性是細胞增殖促進活性；[3] [1]的方法，其中所述⑶C45L多肽的生物學活性是DNA復制活性或PIFl多肽結(jié)合活性；和[4] [1]的方法，其中所述PIFl多肽的生物學活性是螺旋酶活性、端粒酶抑制活性或⑶C45L多肽結(jié)合活性。依照本發(fā)明，可評估測試藥劑或化合物抑制細胞生長的治療效果或候選藥劑或化合物治療或預防CDC45L和/或PIFl相關疾病，例如肺癌的治療效果。因此，本發(fā)明還提供使用CDC45L或PIFl多肽或其片段篩選用于抑制細胞生長的候選藥劑或化合物或用于治療或預防CDC45L和/或PIFl相關疾病，例如肺癌的候選藥劑或化合物的方法，包括下述步驟a)使測試藥劑或化合物與CDC45L或PIFl多肽或其功能性片段接觸；b)檢測步驟(a)的多肽或片段的生物學活性；并c)將b)的生物學活性與測試藥劑或化合物的治療效果關聯(lián)起來?；蛘撸谝恍嵤┓桨钢?，本發(fā)明提供評估或評價測試藥劑或化合治療或預防與 ⑶C45L和/或PIFl過表達有關的癌癥或抑制與⑶C45L和/或PIFl過表達有關的癌癥的治療效果的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試藥劑或化合物與由CDC45L或PIFl基因的多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物學活性；并(c)將潛在治療效果與測試藥劑或化合物關聯(lián)起來，其中當與在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的由CDC45L或PIFl基因的多核苷酸編碼的多肽的生物學活性相比，測試藥劑或化合物遏制所述多肽的生物學活性時，顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，可以將治療效果與⑶C45L或PIFl多肽或其功能性片段的生物學活性關聯(lián)起來。例如，當與在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，測試藥劑或化合物遏制或抑制CDC45L或PIFl多肽或其功能性片段的生物學活性時，可鑒定或選擇該測試藥劑或化合物作為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘?，當與在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，測試藥劑或化合物不遏制或抑制CDC45L或PIFl多肽或其功能性片段的生物學活性時，可鑒定該測試藥劑或化合物作為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明方法將在下面更加詳細的加以描述。任何多肽均可用于篩選，只要它們包含⑶C45L或PIFl蛋白的生物學活性。此類生物學活性包括細胞增殖活性(細胞增殖促進活性)或彼此對CDC45L或PIFl的結(jié)合活性。 對于⑶C45L蛋白，生物學活性包括DNA復制活性。對于PIFl蛋白，生物學活性包括螺旋酶活性和端粒酶抑制活性。例如，可使用⑶C45L或PIFl蛋白，也可使用與這些蛋白質(zhì)功能等同的多肽。此類多肽可以由細胞內(nèi)源或外源表達。
通過此篩選分離的化合物是由⑶C45L或PIFl基因編碼的多肽的拮抗劑的候選物。術(shù)語“拮抗劑”指通過結(jié)合多肽來抑制其功能的分子。所述術(shù)語也指降低或抑制編碼 ⑶C45L或PIFl的基因表達的分子。此外，通過此篩選分離的化合物是抑制⑶C45L或PIFl 多肽與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))體內(nèi)相互作用的化合物的候選物。在本發(fā)明中，CDC45L和PIFl蛋白具有促進癌細胞的細胞增殖的活性(圖3和圖 5)。因此，在本發(fā)明的篩選方法中，可使用此生物學活性來篩選抑制這些蛋白質(zhì)之生物學活性的化合物。此類化合物會是治療癌癥，例如肺癌的潛在候選物。當本方法中檢測的生物學活性是細胞增殖促進活性時，它可以例如如下檢測，即制備表達選自CDC45L和PIFl的多肽的細胞，在測試化合物存在下培養(yǎng)細胞，并測定細胞增殖速度、測量細胞周期等，以及測量集落形成活性，例如MTT測定法、集落形成測定法或“實施例”中所示的FACS。如本文中定義的，術(shù)語“遏制生物學活性”指與在化合物不存在時相比將⑶C45L 或PIFl的生物學活性遏制至少10%，例如遏制至少25%、50%或75%，例如遏制至少 90%。在優(yōu)選的實施方案中，使用不表達⑶C45L或PIFl多肽的對照細胞。因而，本發(fā)明還提供使用CDC45L或PIFl多肽或其片段篩選評估抑制細胞生長的候選物質(zhì)，或?qū)υu估治療或預防CDC45L或PIFl相關疾病，例如肺癌的候選物質(zhì)的方法，包括下述步驟a)在測試藥劑或化合物存在下培養(yǎng)表達CDC45L或PIFl多肽或其功能性片段的細胞和不表達CDC45L或PIFl多肽或其功能性片段的對照細胞；b)檢測表達蛋白質(zhì)的細胞和對照細胞的生物學活性；并c)選擇與在對照細胞及在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的增殖相比抑制表達蛋白質(zhì)的細胞中的生物學活性的測試化合物。在細胞增殖促進活性之外，當在篩選中使用CDC45L多肽或其片段時，可使用DNA 復制活性或PIFl多肽結(jié)合活性作為指標。還有，當在篩選中使用PIFl多肽或其片段時，可使用螺旋酶活性、端粒酶抑制活性或CDC45L多肽結(jié)合活性作為指標。這些生物學活性可通過本領域公知方法來檢測。在本發(fā)明中，揭示了遏制⑶C45L或PIFl的生物學活性則降低細胞生長。如此，通過篩選抑制CDC45L或PIFl之生物學活性的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預防癌癥的候選化合物。這些候選化合物治療或預防癌癥的潛力可通過二次和/或進一步的篩選來評估以鑒定用于癌癥的治療劑。例如，當某種抑制⑶C45L或PIFl蛋白之生物學活性的化合物抑制癌癥的活性時，可得出結(jié)論，該化合物具有CDC45L或PIFl特異性治療效果。(iv)篩選改變CDC45L或PIFl表達的化合物在本發(fā)明中，通過對⑶C45L或PIFl特異性的雙鏈分子降低⑶C45L或PIFl表達則引起對癌細胞增殖的抑制(圖3和圖幻。因此，可通過使用CDC45L或PIFl表達水平作為指標的篩選來鑒定可用于治療或預防癌癥的化合物。在本發(fā)明的語境中，此類篩選可包括例如下述步驟(a)使測試化合物與表達⑶C45L和/或PIFl基因的細胞接觸；(b)檢測⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平；并(c)選擇與在測試化合物不存在時檢測到的表達水平相比降低⑶C45L和/或PIFl基因表達水平的測試化合物。依照本發(fā)明，可評估測試藥劑或化合物抑制細胞生長或候選藥劑或化合物治療或預防⑶C45L和/或PIFl相關疾病，例如肺癌的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選遏制癌細胞增殖的候選藥劑或化合物的方法和篩選用于治療或預防CDC45L和/或PIFl相關疾病，例如肺癌的候選藥劑或化合物的方法。在本發(fā)明的語境中，此類篩選可包括例如下述步驟a)使測試藥劑或化合物與表達CDC45L和/或PIFl基因的細胞接觸；b)檢測⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平；并c)將b)的表達水平與測試藥劑或化合物的治療效果關聯(lián)起來?；蛘撸勒毡景l(fā)明，也可以評估或評價測試藥劑或化合物治療或預防癌癥的潛在治療效果。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于評估或評價測試藥劑或化合物治療或預防與⑶C45L和/或PIFl過表達有關的癌癥或抑制與⑶C45L和/或PIFl過表達有關的癌癥的治療效果的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試藥劑或化合物與表達CDC45L和/或PIFl基因的細胞接觸；(b)檢測步驟(a)中⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平；并(c)將潛在治療效果與測試藥劑或化合物關聯(lián)起來，其中當測試藥劑或化合物降低⑶C45L和/或PIFl基因的表達水平時顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，治療效果可以與⑶C45L或PIFl基因的表達水平關聯(lián)起來。例如， 當與某種測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，該測試藥劑或化合物降低CDC45L 或PIFl基因的表達水平時，所述測試藥劑或化合物可鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘撸斉c某種測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，該測試藥劑或化合物不降低CDC45L或PIFl基因的表達水平時，所述測試藥劑或化合物可鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。本發(fā)明方法將在下面更加詳細的加以描述。表達⑶C45L和/或PIFl的細胞包括例如自肺癌建立的細胞系；此類細胞可用于上述本發(fā)明篩選(例如A549和SBC-3)。表達水平可通過本領域技術(shù)人員公知的方法來評估，例如RT-PCR、Northern印跡測定法、Western印跡測定法、免疫染色、ELISA或流式細胞術(shù)分析。如本文中定義的，術(shù)語“降低表達水平”指與化合物不存在時的表達水平相比將 ⑶C45L或PIFl的表達水平降低至少10 %，例如降低至少25 %、50 %或75 %的水平，例如降低至少95%的水平。本文中的化合物包括化學化合物、雙鏈核苷酸、等等。上文描述了雙鏈核苷酸的制備。在篩選方法中，降低CDC45L或PIFl表達水平的化合物可選擇為要用于治療或預防癌癥，例如肺癌的候選藥劑或化合物?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可包括下述步驟(a)使候選化合物與其中導入有載體的細胞接觸，所述載體包含CDC45L或PIFl的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；(b)測量所述報告基因的表達水平或活性；并(c)選擇降低所述報告基因之表達水平或活性的候選化合物。依照本發(fā)明，可評估測試藥劑或化合物抑制細胞生長或候選藥劑或化合物治療或預防⑶C45L和/或PIFl相關疾病的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了篩選遏制癌細胞增殖的候選藥劑或化合物的方法和篩選治療或預防CDC45L和/或PIFl相關疾病的候選藥劑或化合物的方法。依照另一個方面，本發(fā)明提供了包括下述步驟的方法a)使測試藥劑或化合物與其中導入有載體的細胞接觸，所述載體包含CDC45L或 PIFl基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；b)檢測所述報告基因的表達水平或活性；并c)將b)的表達水平與測試藥劑或化合物的治療效果關聯(lián)起來。或者，在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了用于評估或評價測試藥劑或化合物治療或預防與CDC45L或PIFl過表達有關的癌癥或抑制與CDC45L或PIFl過表達有關的癌癥的治療效果的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試藥劑或化合物與其中導入有載體的細胞接觸，所述載體包括CDC45L或 PIFl的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；(b)測量所述報告基因的表達水平或活性；并(c)將潛在治療效果與測試藥劑或化合物關聯(lián)起來，其中當測試藥劑或化合物降低所述報告基因的表達水平或活性時顯示潛在治療效果。在本發(fā)明中，治療效果可以與所述報告基因的表達水平或活性關聯(lián)起來。例如，當與某種測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，該測試藥劑或化合物降低所述報告基因的表達水平或活性時，所述測試藥劑或化合物可鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘?，當與某種測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，該測試藥劑或化合物不降低所述報告基因的表達水平或活性時，所述測試藥劑或化合物可鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。合適的報告基因和宿主細胞是本領域公知的。例如，報告基因是螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、Discosoma sp.紅色熒光蛋白(DsRed)、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)UacZ和 β -葡糖醛酸糖苷酶(⑶幻，而宿主細胞是C0S7、ΗΕΚ293、HeLa等等。篩選所需報告構(gòu)建物可通過連接報告基因序列與CX的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來制備。本文中CX的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)指但不限于起始密碼子至上游至少500bp，例如lOOObp，例如上游5000或IOOOObp的區(qū)域。含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸區(qū)段可以自基因組文庫分離，或者可以通過PCR擴增。用于鑒定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的方法,還有測定方案是公知的(Molecular Cloning third edition chapter 17,2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。用含有所述報告構(gòu)建物的載體感染宿主細胞，并通過本領域公知方法檢測報告基因的表達或活性(例如使用照度計、吸收分光計、流式細胞儀等等)。如本文中定義的，“降低表達或活性”指與化合物不存在時相比將報告基因的表達或活性降低至少10%，例如降低至少25%、50%或75%，例如降低至少95%。本發(fā)明會在下述實施例中進一步描述，實施例不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍在權(quán)利要求書中描述。在本發(fā)明中，揭示了遏制⑶C45L或PIFl的表達水平則降低細胞生長。因而，通過篩選抑制CDC45L或PIFl之表達水平的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預防癌癥的候選化合物。這些候選化合物治療或預防癌癥的潛力可通過二次和/或進一步的篩選來評估以鑒定用于癌癥的治療劑。例如，當某種抑制CDC45L或PIFl蛋白之表達水平的化合物抑制癌癥的活性時，可得出結(jié)論，該化合物具有CDC45L或PIFl特異性治療效果。(ν)使用CDC45L和PIFl的結(jié)合作為指標的篩選在本發(fā)明中，確認了⑶C45L蛋白與PIFl蛋白相互作用(圖4Β)。因而，可使用 ⑶C45L蛋白和PIFl蛋白的此類結(jié)合作為指標來篩選抑制⑶C45L蛋白和PIFl蛋白之間結(jié)合的化合物。此類化合物可對癌癥治療具有潛在治療效果，因為那些蛋白質(zhì)涉及癌細胞生長。因此，本發(fā)明提供了使用CDC45L蛋白和PIFl蛋白的此類結(jié)合作為指標來篩選用于抑制CDC45L蛋白和PIFl蛋白之間結(jié)合的化合物的方法。另外，本發(fā)明亦提供篩選用于抑制或降低表達CDC45L和PIFl基因的癌細胞例如肺癌細胞生長的候選化合物和用于治療或預防癌癥例如肺癌的候選化合物的方法。具體地，本發(fā)明提供了下列方法[1]到[5][1] 一種篩選破壞⑶C45L多肽和PIFl多肽之間結(jié)合的藥劑或化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使CDC45L多肽或其功能等同物與PIFl多肽或其功能等同物在測試藥劑或化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的結(jié)合水平；并(d)選擇降低或抑制所述結(jié)合水平的測試藥劑或化合物。[2] 一種篩選可用于治療或預防癌癥的候選藥劑或化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)使CDC45L多肽或其功能等同物與PIFl多肽或其功能等同物在測試藥劑或化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在測試藥劑或化合物不存在時檢測到的結(jié)合水平；并(d)選擇降低或抑制結(jié)合水平的測試藥劑或化合物。[3] [1]或[2]的方法，其中⑶C45L的功能等同物包含PIFl結(jié)合域。[4] [1]或[2]的方法，其中PIFl的功能等同物包含⑶C45L結(jié)合域。[5] [1]的方法，其中所述癌癥是肺癌。依照本發(fā)明，可評估測試藥劑或化合物抑制細胞生長或者候選藥劑或化合物治療或預防CDC45L或PIFl相關疾病的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了篩選用于遏制癌細胞增殖的候選藥劑或化合物或者用于治療或預防癌癥的候選藥劑或化合物的方法。更具體地，所述方法包括下列步驟(a)使CDC45L多肽或其功能等同物與PIFl多肽或其功能等同物在測試藥劑或化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合水平；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在測試藥劑或化合物的不存在時檢測到的結(jié)合水平；并(d)將C)的結(jié)合水平與測試藥劑或化合物的治療效果關聯(lián)起來。
或者，在一些實施方案中，本發(fā)明還提供一種用于評估或估算測試藥劑或化合物治療或預防癌癥或抑制癌癥的治療效果的方法，所述方法包括下列步驟(a)使CDC45L多肽或其功能等同物與PIFl多肽或其功能等同物在測試藥劑或化合物存在下接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合水平；(c)比較步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在測試藥劑或化合物的不存在時檢測到的結(jié)合水平；并(d)將潛在治療效果與測試藥劑或化合物關聯(lián)起來，其中當測試藥劑或化合物降低結(jié)合水平時，顯示出潛在治療效果。在本發(fā)明中，治療效果可以與⑶C45L和PIFl蛋白的結(jié)合水平關聯(lián)起來。例如， 當與某種測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比，該測試藥劑或化合物降低CDC45L 和PIFl蛋白的結(jié)合水平時，所述測試藥劑或化合物可鑒定或選擇為具有治療效果的候選藥劑或化合物?；蛘?，當與某種測試藥劑或化合物不存在時檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不降低CDC45L和PIFl蛋白的結(jié)合水平時，所述測試藥劑或化合物可鑒定為沒有顯著治療效果的藥劑或化合物。在本發(fā)明的語境中，⑶C45L或PIFl多肽的功能等同物分別是具有與⑶C45L多肽 (SEQ ID NO 14)或PIFl多肽(SEQ ID NO 16)等同的生物學活性的多肽(見(1) “基因和多肽”)。更具體地，PIFl多肽的功能等同物是具有氨基酸序列SEQ ID N0:16的多肽包含 ⑶C45L結(jié)合域的片段。還有，⑶C45L多肽的功能等同物是具有氨基酸序列SEQ ID NO 14 的多肽包含PIFl結(jié)合域的片段。作為篩選抑制CDC45L結(jié)合PIFl的化合物的方法，可使用本領域技術(shù)人員公知的多種方法。此類篩選可使用例如免疫沉淀、West-Western印跡分析(Skolnik et al.，Cell 65 :83-90 (1991))、利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(〃 MATCHMAKER Two-Hybrid system" ，" Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit" ，" MATCHMAKER one-Hybrid system' (Clontech) ； " HybriZAP Two-Hybrid Vector System' (Stratagene)；參考文 KB" Dalton and Treisman, Cell 68 :597-612(1992) " ， “ Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)")、親和層析和使用表面等離振子共振現(xiàn)象的生物傳感器來進行(見(i) 一般篩選方法和(ii)篩選結(jié)合CDC45L或PIFl蛋白的化合物)?？捎糜诤Y選的多肽可為重組多肽，或者是來自自然界來源的蛋白質(zhì)，或其部分肽。 任何上述測試化合物可用于篩選?？墒褂萌魏紊鲜鰷y試化合物(見(1)用于篩選的測試化合物)。在一些實施方案中，此方法進一步包括檢測候選化合物與⑶C45L蛋白或PIFl蛋白結(jié)合，或檢測CDC45L蛋白與或PIFl蛋白的結(jié)合的水平的步驟。表達CDC45L蛋白和/或 PIFl蛋白的細胞包括例如自癌癥，例如肺癌建立的細胞系，此類細胞可用于上述本發(fā)明篩選，只要細胞表達這兩種基因。或者，可以用⑶C45L和PIFl蛋白的表達載體二者或任一轉(zhuǎn)染細胞，從而表達這兩種基因。⑶C45L蛋白與PIFl蛋白的結(jié)合可使用抗⑶C45L抗體和 PIFl抗體通過免疫沉淀測定法來檢測(圖4)。在本發(fā)明中，揭示了抑制CDC45L蛋白和PIFl蛋白之間的結(jié)合則降低細胞生長。如此，通過篩選抑制CDC45L蛋白和PIFl蛋白之間結(jié)合的候選化合物，可鑒定出有潛力治療或預防癌癥的候選化合物?？赏ㄟ^二次和/或進一步的篩選來評估這些候選化合物治療或預防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療劑。例如，當某種抑制CDC45L蛋白和PIFl蛋白之間的結(jié)合的化合物抑制癌癥的活性時，可得出該化合物具有CDC45L或PIFl特異性治療效果的結(jié)論。本發(fā)明會在下述實施例中加以進一步描述，它們不對權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進行限定。除非另行定義，在此使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均與本發(fā)明所屬領域一般技術(shù)人員通常理解的意義相同。下面描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實踐或測試本發(fā)明。
實施例材料和方法細胞系和組織樣品。此項研究中使用的人肺癌細胞系如下肺腺癌(ADC) NCI-H1781, NCI-H1373, LC319, A549，和 PCI4 ；肺鱗狀細胞癌(SCC) SK-MES-1，NCI-H2170， NCI-H520，NCI-H1703，和 LU61 ；肺大細胞癌(LCC)LXl ；和小細胞肺癌(SCLC) SBC-3，SBC-5， DMS273，和DMS114。所有細胞以單層在補充有10 %胎牛血清(FCS)的適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并于37攝氏度在含5% CO2的增濕空氣中維持。用作正常對照的人小氣道上皮細胞 (SAEC)在來自Cambrex Bio Science Inc的優(yōu)化培養(yǎng)基(SAGM)中培養(yǎng)。如別處所述在知情同意下早前獲得原發(fā)性肺癌樣品(NPL 8，12)。臨床階段依照UICC !歸類(Sobin L WC. TNM Classification of Malignant Tumours,6th edition. Anonymous. New York ffiley-Liss. 2002)來判斷。用于組織微陣列上免疫染色的福爾馬林固定的原發(fā)性肺腫瘤和鄰近正常肺組織樣品得自267名在北海道大學及其附屬醫(yī)院(日本札幌)接受根治性手術(shù)的患者(159例ADC, 89例SCC, 16例LCC, 3例ASC ；90名女性和177名男性患者；年齡中值 65. 0，范圍 26-84 歲，114 例 pTl, 125 例 pT2，28 例 ρΤ3 腫瘤尺寸；208 例 ρΝ0，23 例 pNl, 36例pN2淋巴結(jié)狀態(tài))。此項研究和所有所述臨床材料的使用得到了各個科研倫理委員會的批準。半定量RT-PCR。使用隨機引物(Roche Diagnostics)和 Superscript II (Invitrogen)將來自每份樣品的mRNA的總共3微克的等分試樣逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。半定量RT-PCR實驗用下述各組對⑶C45L，PIFl特異性的合成引物或作為內(nèi)部對照的β -肌動蛋白(ACTB)特異性引物進行CDC45細胞分裂周期45樣(CDC45L)，5，-CACAACCATTTTGACCT CTCAGT-3，(SEQ ID NO 1)和5，-GCTTCTACATCTCAAATCATGTCC-3，(SEQ ID NO 2) ,PIF15'至 3' DNA螺旋酶同系物(釀酒酵母)(PIFl)，5，-AGGCAGTGTCCCCTTCTGTA-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-CCTGAAAGGAGGGATGTTCA-3’ (SEQ ID NO :4)，ACTB，5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ ID NO 5)和 5‘-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3‘ (SEQ ID NO 6)。優(yōu)化 PCR 反應的周期數(shù)目以確保產(chǎn)物強度在擴增的線性期內(nèi)。Western 印跡。裂解緩沖液50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，150mmol/L NaCl, 0. 5% NP40，0. 5%脫氧膽酸鈉，和蛋白酶抑制劑混合物組III (Calbiochem)中裂解細胞。通過 Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法(Bio-Rad)來測定每份溶胞物的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA) 作為標準品。每個溶胞物取10微克在10-12%變性聚丙烯酰胺凝膠(帶3%聚丙烯酰胺成層膠)上解析，并通過電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(GE Healthcare Bio-sciences)。用含5% 脫脂奶粉的TBST封閉后，將膜與一抗一起于室溫溫育1小時。將免疫反應性蛋白質(zhì)與辣根過氧化物酶綴合的二抗(GE Healthcare Bio-sciences) 一起于室溫溫育1小時。用TBST 清洗后，將反應物使用增強型化學發(fā)光試劑盒(GE Healthcare Bio-sciences)來顯色。商品化家兔多克隆抗CDC45L抗體購自ATLASAntibodies AB (產(chǎn)品目錄號HPA000614)，通過使用肺癌細胞系溶胞物的Western印跡分析證明是對人⑶C45L特異性的。免疫組織化學和組織微陣列。為了調(diào)查石蠟塊包埋的臨床樣品中的⑶C45L蛋白，以下述方式使用ENVISI0N+Kit/HRP(pH9) (DakoCytomation)染色切片。簡言之，將載玻片浸泡在靶物修復溶液中，并在高壓鍋中于108攝氏度煮沸15分鐘以修復抗原。封閉內(nèi)源過氧化物和蛋白質(zhì)后，每張載玻片加3微克/ml家兔多克隆抗人CDC45L抗體(ATLAS Antibodies AB ；產(chǎn)品目錄號HPA000614)，并且將切片與作為二抗的辣根過氧化物酶標記的抗家兔 IgG(Histofine Simple Stain MAX PO(G)，Nichirei) —起溫育。添加底物色原體， 并用蘇木精對標本進行復染色。如別處所述用267份福爾馬林固定的原發(fā)性NSCLC構(gòu)建腫瘤組織微陣列(Chin SF, et al. Molecular Pathology 2003 ；56 :275-9 ；Callagy G, et al. Diagn Mol Pathol 2003 ；12 :27-34 ；Callagy G，et al. J Pathol 2005 ；205 :388-96)。采樣的組織區(qū)域基于載玻片上對應H&E染色切片的目視對齊來選擇。取自供體腫瘤塊的三個、四個、或五個組織核心(直徑，0.6mm ；深度，3-4mm)用組織微陣列儀(Beecher Instruments)放置入接受石蠟塊中。自每個病例打孔取一個正常組織核心，并將所得微陣列塊的5微米切片用于免疫組織化學分析。由三名獨立的調(diào)查者在事先不知道臨床病理學數(shù)據(jù)下半定量評估⑶C45L陽性。由于每個腫瘤組織核心內(nèi)的染色強度大部分是均勻的，因此通過記錄為陰性(腫瘤細胞中沒有可察覺的染色)或陽性(腫瘤細胞的核和胞質(zhì)中可察覺的褐色染色)來評估核和胞質(zhì)中的CDC45L染色強度。只有所有三個調(diào)查者獨立地定義病例為陽性時，才接受病例為陽性。統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析使用MatView統(tǒng)計程序來實施。自手術(shù)日起至NSCLC 相關死亡時間或至最后一次隨訪觀察日止的數(shù)據(jù)來計算腫瘤特異性存活曲線。為每一項有關變量和⑶C45L表達計算Kaplan-Meier曲線；使用時序檢驗來分析患者亞組間存活時間的差異。用Cox比例風險回歸模型實施單變量和多變量分析以確定臨床病理學變量與癌癥相關死亡率之間的關聯(lián)。首先，分析死亡與可能的預后因素(包括年齡、性別、PT歸類、和 PN分類)之間的關聯(lián)，一次考慮一個因素。其次，以反向(逐步)程序應用多變量Cox分析，其總是迫使強⑶C45L表達，連同所有滿足P值小于0. 05的進入水平的變量進入模型。 隨著該模型繼續(xù)添加因素，獨立因素未超過P < 0. 05的退出水平。CDC45L相互作用蛋白的鑒定。通過在蛋白酶抑制劑存在下將細胞提取物在終體積 2ml 的免疫沉淀緩沖液(0. 5% NP40,50mmol/L Tris-Hcl, 150mmol/L NaCl)中與 100 微升蛋白G-瓊脂糖珠子一起于4攝氏度溫育1小時來預澄清細胞提取物。于4攝氏度以 1，OOOrpm離心1分鐘后，將上清液與家兔多克隆抗⑶C45L抗體或?qū)φ照＜彝肐gG—起于4攝氏度溫育4小時。另外，每份上清液加30微升蛋白G-瓊脂糖珠子并再溫育2小時。 通過以5，OOOrpm離心2分鐘自每份樣品收集珠子并用Iml免疫沉淀緩沖液清洗六次后，將珠子在50微升Laemmli樣品緩沖液中重懸浮并煮沸5分鐘，之后在5%至10% SDS-PAGE凝膠(BioRad)上分開蛋白質(zhì)。電泳后，用銀染色凝膠。切出在用抗CDC45L抗體免疫沉淀的提取物中特異性出現(xiàn)的蛋白質(zhì)條帶，用于基質(zhì)輔助激光解吸附/離子化飛行時間質(zhì)譜術(shù) (MALDI-TOF-MS ；AXIMA-CFR plus, SHIMAZU BIOTECH)進行分析。為了確認 CDC45L 與 PIFl 之間的相互作用，如別處所述進行免疫沉淀實驗(NPL18，23)。免疫細胞化學分析。細胞涂布在玻璃蓋玻片(Becton Dickinson Labware) 上，用4%低聚甲醛固定，并用含0. Triton X-100的PBS于室溫透化3分鐘。通過 CASBLOCK(ZYMED)于室溫封閉非特異性結(jié)合10分鐘。然后經(jīng)細胞與在含3% BSA的PBS中稀釋的一抗一起于室溫溫育60分鐘。用PBS清洗后，細胞用FITC綴合的二抗(Santa Cruz) 于室溫染色60分鐘。用PBS再次清洗后，每份標本用含4' ,6' -二脒-2'-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的Vectashield (Vector Laboratories, Inc.)封固并用光譜共聚焦掃描系統(tǒng)(TSC SP2A0BS =Leica Microsystems)顯現(xiàn)。RNAi定法。使用M微升Lipofectamine 2000 (Invitrogen)遵循制造商的方案將小干擾RNA(siRNA)雙鏈體(IOOnM)轉(zhuǎn)染入肺癌細胞系A549和SBC-3中。轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng) 7天，并在轉(zhuǎn)染后第7天通過吉姆薩染色計算集落數(shù)，通過3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2， 5-二苯基四唑溴化物(MTT)測定(細胞計數(shù)試劑盒-8溶液；Dojindo Laboratories)評估細胞活力。為了確認對⑶C45L或PIFl表達的遏制，如上所述用對⑶C45L或PIFl特異性的合成引物進行半定量RT-PCR。用于RNAi的合成寡核苷酸的靶序列如下對照-1(LUC 來自 Photinus pyralis 的螢光素酶基因)，5 ‘ -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3 ‘ (SEQ ID NO 7)； 對照_2(EGFP 增強型綠色熒光蛋白(GFP)基因，維多利亞水母(Aequorea victoria)GFP的一種變體)，5' -GAAGCAGCACGACUUCUUC-3‘ (SEQ ID NO 8)；si-CDC45L#l,5' -GCAAACACCUGCUCAAGUC-3‘ (SEQ ID NO 9)；si-CDC45L#2,5' -GGACGUGGAUGCUCU⑶⑶_3‘ (SEQ ID NO 10)；si-PIFl#l,5' -GAAAGGCCAGAGCAUCUUC-3‘ (SEQ ID NO 11)；si-PIFl#2,5' -GGCAUGACCCUGGAUU⑶G-3‘ (SEQ ID NO :12)。流式細胞術(shù)。AM9細胞以3. 5X105個細胞/IOOmm盤的密度分配并用siRNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時用胰蛋白酶處理細胞，在PBS中收集，并在70%冷乙醇中固定30 分鐘。用100微克/mL RNA酶(Sigma-Aldrich)處理后，細胞用含50微克/mL碘化丙錠 (Sigma-Aldrich)的PBS染色。在Becton Dickinson FAC^can上進行流式細胞術(shù)并通過 ModFit軟件(Verity Software House, Inc.)分析。對自至少10，000個不設門細胞選擇的細胞分析DNA含量。結(jié)果肺癌和正常組織中的⑶C45L表達。為了鑒定可用于在早期檢測癌癥存在的新分子及基于癌細胞的生物學特征來開發(fā)新治療，使用cDNA微陣列實施了臨床肺癌的基因組范圍表達概況分析(NPL7-U)。在篩選的27，648種基因或EST中，鑒定出絕大多數(shù)檢查的臨床肺癌樣品中⑶C45L轉(zhuǎn)錄物的表達升高(3倍或更高)。在15份肺癌組織的12份中和在所有15種肺癌細胞系中通過半定量RT-PCR實驗確認了其過表達(圖IA和1B)。隨后，在所有6種癌細胞系中確認了⑶C45L蛋白過表達，但是通過使用抗⑶C45L 抗體的Western印跡分析在正常支氣管上皮衍生細胞(SAEC)中沒有檢測到條帶(圖1C)。 隨后，實施了免疫熒光分析來檢查肺癌細胞系A549中內(nèi)源CDC45L的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)了它在核中的強染色和在胞質(zhì)中的弱染色(圖1D)。在檢查的16種正常組織中，使用⑶C45L cDNA作為探針的Northern印跡僅在睪丸中鑒定出2. 2-kb條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，通過使用抗⑶C45L多克隆抗體的免疫組織化學，將5種正常組織(心、肺、肝、腎、和睪丸)中的CDC45L蛋白表達水平與肺癌中的進行了比較。CDC45L在肺癌細胞和睪丸的核和胞質(zhì)中豐富表達，但是它在剩余四種正常組織中的表達幾乎檢測不到(圖2A)。⑶C45L表達與NSCLC患者不良預后的關聯(lián)。為了調(diào)查⑶C45L在肺部癌發(fā)生中的生物學和臨床病理學意義，本發(fā)明人對含有來自267名經(jīng)歷手術(shù)切除的NSCLC患者的組織切片的組織微陣列進行了免疫組織化學染色。主要在腫瘤細胞的核和胞質(zhì)處觀察到 CDC45L特異性多克隆抗體的CDC45L染色，但是在正常肺細胞中檢測不到(圖2B)。在267 份NSCLC中，CDC45L染色在171例(64.0% )中呈陽性，在96例(36.0% )中陰線(詳情顯示于表1A)。然后，本發(fā)明人比較了⑶C45L陽性狀態(tài)與臨床病理學因素，并發(fā)現(xiàn)了 NSCLC中的CDC45L表達與高齡(>=65 ；P = 0. 0417，F(xiàn)isher氏確然檢驗；表1A)、性別男性(P = 0. 0008)、非ADC組織學(P < 0. 0001)、和大腫瘤尺寸(pT2_3 ；P = 0. 0066)顯著關聯(lián)。具有 ⑶C45L陽性腫瘤的NSCLC患者的存活時間中值比具有⑶C45L陰性腫瘤的顯著更短(P = 0. 0045，時序檢驗；圖2C)。本發(fā)明人還應用單變量分析來評估患者預后和數(shù)個因素之間的關聯(lián)，包括年齡 65對> =65)、性另Ij (女性對男性)、組織學類型(ADC對非ADC)、ρΤ階段 (腫瘤尺寸；Tl對Τ2+Τ3)、ρΝ階段(淋巴結(jié)狀態(tài)；NO對Ν1+Ν2)、和CDC45L狀態(tài)(陰性對陽性)(表1Β)。所有參數(shù)均與不良預后顯著相關。在多變量分析中，CDC45L狀態(tài)沒有達到作為此項研究中登記的手術(shù)治療肺癌患者的獨立預后因素的統(tǒng)計學顯著水平(P = 0. 4332)， 而ρΤ和ρΝ階段以及年齡則達到了，提示⑶C45L表達對肺癌中這些臨床病理學因素的重要性。[表 1Α]NSCLC組織中的CDC45L陽性與患者的特征之間的關聯(lián)(n = 267)
權(quán)利要求
1.一種在受試者中檢測或診斷癌癥的方法，包括測定源自受試者的生物學樣品中 CDC45L和/或PIFl的表達水平，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示所述受試者罹患或有風險發(fā)生癌癥或者所述受試者中存在癌癥，其中通過選自下組的方法測定所述表達水平(a)檢測CDC45L基因的mRNA和/或PIFl基因的mRNA，(b)檢測由CDC45L基因編碼的蛋白質(zhì)和/或由PIFl基因編碼的蛋白質(zhì)，和(c)檢測由CDC45L基因編碼的蛋白質(zhì)和/或由PIFl基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述升高是比所述正常對照水平高至少10%。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述源自受試者的生物學樣品是活檢樣品。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是肺癌。
5.一種用于診斷或檢測癌癥的試劑盒，其中所述試劑盒包含結(jié)合CDC45L基因和/或 PIFl基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的試劑。
6.一種用于評估患肺癌的受試者的預后的方法，其中所述方法包括下述步驟(a)檢測源自受試者的生物學樣品中CDC45L的表達水平；(b)將檢測到的表達水平與對照水平比較；并(c)基于(b)的比較確定所述患者的預后。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述對照水平是良好預后對照水平，且所述表達水平與所述對照水平相比的升高指示不良預后。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述升高是比所述對照水平高至少10%。
9.權(quán)利要求6的方法，其中通過選自下組的方法測定所述表達水平(a)檢測CDC45L基因的mRNA；(b)檢測由CDC45L基因編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測由CDC45L基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學活性。
10.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)使測試化合物與CDC45L或PIFl多肽或其片段接觸；b)檢測所述多肽或其片段和所述測試化合物之間的結(jié)合活性；并c)選擇結(jié)合所述多肽或其片段的測試化合物。
11.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)使測試化合物與表達CDC45L基因和/或PIFl基因的細胞接觸；b)檢測⑶C45L基因和/或PIF基因的表達水平；并c)選擇與在所述測試化合物不存在時檢測到的表達水平相比降低CDC45L基因和/或 PIFl基因的表達水平的測試化合物。
12.—種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)使測試化合物與CDC45L或PIFl多肽或其片段接觸；b)檢測步驟(a)的多肽或其片段的生物學活性；并c)選擇與在所述測試化合物不存在時檢測到的生物學活性相比遏制所述多肽或其片段的生物學活性的測試化合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述生物學活性是細胞增殖活性。
14.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括下述步驟a)使測試化合物與其中導入了包含CDC45L或PIFl基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因的載體的細胞接觸；b)測量所述報告基因的表達或活性；并c)選擇與在所述測試化合物不存在時檢測到的水平相比降低所述報告基因的表達或活性水平的測試化合物。
15.一種篩選抑制CDC45L多肽和PIFl多肽之間結(jié)合的候選化合物的方法，所述方法包括下述步驟(a)在測試化合物存在下使CDC45L多肽或其功能性等同物與PIFl多肽或其功能性等同物接觸；(b)檢測所述多肽之間的結(jié)合；(c)將步驟(b)中檢測到的結(jié)合水平與在所述測試化合物不存在時檢測到的水平比較；并(d)選擇與在所述測試化合物不存在時檢測到的水平相比降低或抑制結(jié)合水平的測試化合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述⑶C45L多肽功能性等同物包含PIFl結(jié)合域。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述PIFl多肽功能性等同物包含⑶C45L結(jié)合域。
18.權(quán)利要求10至17中任一項的方法，其中所述癌癥是肺癌。
19.一種包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中所述有義鏈包含與選自SEQ ID NO :9， 10，11和12的靶序列對應的核苷酸序列，且所述反義鏈包含與所述靶序列互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈彼此雜交以形成雙鏈分子，其中所述雙鏈分子在導入表達⑶C45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制所述基因表達。
20.權(quán)利要求19的雙鏈分子，其中所述有義鏈與所述反義鏈在所述靶序列處雜交以形成長度為19 25個核苷酸對的雙鏈分子。
21.權(quán)利要求19或20的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是單一多核苷酸，其包含經(jīng)單鏈核苷酸序列相連接的所述有義鏈和所述反義鏈。
22.權(quán)利要求21的雙鏈分子，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中 [A]是與選自SEQ ID NO 9,10，11和12的靶序列對應的核苷酸序列；[B]是由約3至約23 個核苷酸組成的核苷酸序列；且[A’ ]是與[A]互補的核苷酸序列。
23.—種載體，其包括包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中的任一或二者， 其中所述有義鏈核酸包含與SEQ ID N0:9，10，ll或12對應的核苷酸序列，且其中所述反義鏈包含與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交以形成所述雙鏈分子，且其中所述載體在導入表達CDC45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制所述基因的表達。
24.載體，它們包括包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸組合中的任一者，其中所述有義鏈核酸包含與SEQ ID NO :9，10，11或12對應的核苷酸序列，且所述反義鏈核酸由與所述有義鏈互補的序列組成，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄物彼此雜交以形成雙鏈分子，且其中所述載體在導入表達CDC45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制細胞增殖。
25.權(quán)利要求23的載體，其中所述多核苷酸是長度為約19個 約25個核苷酸的寡核苷酸。
26.權(quán)利要求23或25的載體，其中所述雙鏈分子是單一核苷酸轉(zhuǎn)錄物，其包含經(jīng)單鏈核苷酸序列相連接的所述有義鏈和所述反義鏈。
27.權(quán)利要求沈的載體，其中所述多核苷酸具有通式5’_[A]-[B]-[A’ ]_3’，其中[A] 是與選自SEQ ID NO 9,10，11和12的靶序列對應的核苷酸序列；[B]是由約3至約23個核苷酸組成的核苷酸序列；且[A’ ]是與[A]互補的核苷酸序列。
28.一種在受試者中治療或預防癌癥的方法，包括對所述受試者施用藥學有效量的針對CDC45L基因或PIFl基因的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體，其中所述雙鏈分子在導入表達⑶C45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制細胞增殖以及所述基因的表達。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述雙鏈分子是權(quán)利要求19至22中任一項的雙鏈分子。
30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述載體是權(quán)利要求23至27中任一項的載體。
31.一種用于治療或預防癌癥的組合物，其包含藥學有效量的針對⑶C45L或PIFl的雙鏈分子或編碼所述雙鏈分子的載體及藥學可接受載體，其中所述雙鏈分子在導入表達 CDC45L基因或PIFl基因的細胞中時抑制細胞增殖以及所述基因表達。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述雙鏈分子是權(quán)利要求19至22中任一項的雙鏈分子。
33.權(quán)利要求31的組合物，其中所述載體是權(quán)利要求23至27中任一項的載體。
全文摘要
本發(fā)明基于CDC45L基因和PIF1基因在癌癥中過表達且牽涉癌細胞存活的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的特征在于使用CDC45L基因和/或PIF1基因作為診斷標志物來診斷癌癥或評估/確定癌癥受試者預后的方法。本發(fā)明的特征還在于針對CDC45L基因或PIF1基因的雙鏈分子，使用此類雙鏈分子來治療和/或預防癌癥的方法或組合物。還有，公開了使用CDC45L和/或PIF1作為分子靶物來鑒定用于治療和預防肺癌的候選化合物的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102575297SQ20108004617
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者中村佑輔, 角田卓也, 醍醐彌太郎 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司