專利名稱：一種用于制備抗肝臟腫瘤標(biāo)志物ck-19抗體的多肽序列、多克隆抗體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)肝癌標(biāo)志物CK-19用的兔多克隆抗體，具體地說(shuō)，涉及一種抗肝臟腫瘤標(biāo)志物CK-19的多肽抗體的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞角蛋白(Keratin，type I cytoskeletal)是細(xì)胞體的中間絲，根據(jù)其分子量和等電點(diǎn)不同可分為20種不同類型。在胚胎肝細(xì)胞中表達(dá)CK8、CK18、CK-19，隨著肝臟的分化，CK-19在正常肝細(xì)胞不表達(dá)，只在膽管中表達(dá)。CK-19對(duì)膽管上皮和膽管細(xì)胞癌(ICC) 具有特異性染色，陽(yáng)性率達(dá)779Γ100%，是目前診斷ICC最好的免疫組化標(biāo)志物之一。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，有些癌細(xì)胞又重新表達(dá)CK-19，部分為分子結(jié)構(gòu)不完整的CK-19，且表達(dá)程度與細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死時(shí)，CK-19以溶解片段的形式釋放于血清中，能在血液中檢出，檢測(cè)指標(biāo)為細(xì)胞角質(zhì)素偏低抗原。Nagai等報(bào)道，在70例肝癌患者中，33例外周血CK-19升高，在同時(shí)檢測(cè)CK-19和AFP的患者中，有12. 3%的患者CK-19升高而AFP正常。兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷有一定的互補(bǔ)性。Ding SJ等發(fā)現(xiàn)CK-19在高轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株中高表達(dá)，且隨著轉(zhuǎn)移力的升高表達(dá)量亦呈上升趨勢(shì)。李雁等進(jìn)一步探索了 CK-19 與肝癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，表明血清CK-19升高與HCC分化程度低，血管侵襲力強(qiáng)， 臨床病期晚有一定的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可特異性識(shí)別人肝癌細(xì)胞表達(dá)的CK-19的多克隆抗體。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種用于制備抗肝臟腫瘤標(biāo)志物CK-19抗體的多肽序列，其氨基酸序列如SEQ NO. 1所
7J\ ο為便于與載體蛋白偶聯(lián)，在上述多肽序列的C端連接一個(gè)半胱氨酸。本發(fā)明選擇了 CK-19蛋白N端14肽作為候選多肽，并用人工方法進(jìn)行多肽合成制備免疫原。上述多肽序列免疫動(dòng)物可獲得多克隆抗體，所述多克隆抗體能用于制備肝癌診斷藥物。本發(fā)明用上述免疫原免疫新西蘭兔，獲得可特異性識(shí)別人肝癌細(xì)胞表達(dá)的CK-19 的多克隆抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明對(duì)CK-19蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)、免疫原性、親疏水性、表面可及性等進(jìn)行分析，確定合適的一段肽序列進(jìn)行人工合成；將合成的多肽與馬來(lái)酰亞氨活化的載體 mcKLH偶聯(lián)，將此偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽柱純化后免疫新西蘭兔；經(jīng)過(guò)多次免疫的兔血清用 ELISA法對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，效價(jià)達(dá)理想值后收集免疫兔血清，并用ftOtein G蛋白純化柱純化抗體；對(duì)純化后抗體進(jìn)行ELISA、western bot等鑒定。鑒定結(jié)果表明該多克隆抗體可特異性識(shí)別CK-19蛋白，可用于檢測(cè)肝癌細(xì)胞表達(dá)的CK-19蛋白，為肝癌診斷提供幫助， 并能指導(dǎo)其臨床預(yù)后判斷和治療方案的選擇。


圖1是抗CK-19多克隆抗體經(jīng)protein G凝膠柱純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳(12%) 檢測(cè)結(jié)果。M:蛋白Marker =Lane 1 上樣峰；Lane 2 流穿峰；Lane 3 平衡峰；Lane 4 洗脫峰。圖2是本發(fā)明中的抗CK-19多克隆抗體的western-blot鑒定結(jié)果。上樣為H印G2 細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞系)裂解液。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明設(shè)計(jì)和人工合成CK-19多肽抗原，與馬來(lái)酰胺活化的匙孔血藍(lán)載體蛋白 (KLH)偶聯(lián)，經(jīng)脫鹽純化后免疫新西蘭兔，通過(guò)多次免疫及ELISA效價(jià)檢測(cè)后，采集兔血清并經(jīng)protein G凝膠純化柱純化。該多克隆抗體經(jīng)過(guò)ELISA^estern blot等鑒定，可特異性識(shí)別人肝癌細(xì)胞表達(dá)的CK-19蛋白，為肝癌診斷提供幫助，并能指導(dǎo)其臨床預(yù)后判斷和治療方案的選擇。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1 :CK_19多肽的設(shè)計(jì)及合成 1. CK-19氨基酸序列
根據(jù)GenBank獲得人CK-19氨基酸序列(P08727)如SEQ N0. 2所示。結(jié)果人CK-19蛋白含有400氨基酸。2. http //www. uniprot. org/uniprot 在線分析 CK-19 結(jié)構(gòu)域(表 1) 表權(quán)利要求
1.一種用于制備抗肝臟腫瘤標(biāo)志物CK-19抗體的多肽序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ NO. 1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽序列，其特征在于，所述多肽序列在C端連接一個(gè)半胱氨酸。
3.一種多克隆抗體，其特征在于它由權(quán)利要求1所述的多肽序列免疫動(dòng)物獲得。
4.權(quán)利要求3所述多克隆抗體在制備肝癌診斷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于制備抗肝臟腫瘤標(biāo)志物CK-19抗體的多肽序列、多克隆抗體與應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQNO.1所示。本發(fā)明選擇了CK-19蛋白一段氨基酸序列進(jìn)行多肽合成作為免疫原免疫動(dòng)物制備抗體。涉及人CK-19蛋白氨基酸特性分析，多肽設(shè)計(jì)及合成，多肽與載體蛋白KLH偶聯(lián)及偶聯(lián)產(chǎn)物純化，偶聯(lián)物免疫新西蘭兔，抗血清ELISA檢測(cè)、收集及純化，純化抗體ELISA及免疫印跡鑒定。該多克隆抗體可特異性識(shí)別及檢測(cè)人CK-19蛋白，有望為肝癌診斷提供幫助，并指導(dǎo)臨床預(yù)后判斷和治療方案的選擇。
文檔編號(hào)C07K16/06GK102336814SQ20111020069
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者徐偉文, 李明, 陳立勇 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)