人腫瘤預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人腫瘤預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人類癌癥通過基因組畸變的積累而發(fā)展，如基因突變，使細(xì)胞的病理生理改變發(fā)生，如無限生長和轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)顯示人類癌癥是一復(fù)雜和多樣性疾病，患者可能表現(xiàn)出類似的癥狀，并具有相同的病理改變，但可能由完全不同的基因變化而造成。正因?yàn)檫@樣的異質(zhì)性，某一特定藥物或療法往往只對(duì)一部分腫瘤病人有效。因此，不同類型癌癥晚期患者對(duì)目前可用藥物的反應(yīng)率差別很大，從10%至90%不等。許多較新的生物治療方法，特別是所謂的革G向治療(targeted therapy)，也僅僅在小部分具有特異基因突變的患者身上顯示有療效。因此，能前瞻性的確定患者有否可能對(duì)某特定治療起反應(yīng)的方法具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值，可最大幅度的提高腫瘤的治愈率。
[0003]預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，如基因突變(gene mutat1n)和基因表達(dá)(gene express1n)等，可以提供癌癥患者是否可能從某特定治療(如靶向藥物)中獲益的前期信息，從而用來指導(dǎo)治療方法的選擇。如病人的標(biāo)志物狀態(tài)表示對(duì)某特定治療可能有效，則此病人為接受該治療的候選者。相反，如標(biāo)志物測(cè)定暗示對(duì)某一特定治療有耐藥性，則應(yīng)尋找或獲取可能更有益的替代療法?？傊?，這些標(biāo)志物的測(cè)定可以幫助臨床醫(yī)生做出明智的決定，以避免不必要的醫(yī)療費(fèi)用，可能無效的治療以及毒性，提高患者的生活質(zhì)量。這些標(biāo)志物也可用于療效評(píng)估，幫助確定最佳藥物劑量和毒性預(yù)測(cè)。本發(fā)明即為適合這樣的需求而產(chǎn)生。
[0004]目前腫瘤基因治療如靶向治療極具潛力，有比傳統(tǒng)化療更大的優(yōu)越性。而隨著越來越多靶向藥物的問世和應(yīng)用或進(jìn)入臨床試驗(yàn)，包括新藥審批，基于分子基因檢測(cè)的生物標(biāo)志物如基因突變?cè)陬A(yù)測(cè)靶向治療療效中的作用越來越受重視。目前許多西方國家，如美國，正投入大量的人力和物力尋找這樣的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，目前已有少數(shù)用于臨床指導(dǎo)干預(yù)，包括中國醫(yī)院。本發(fā)明者之一(毛建華博士)在《科學(xué)》等雜志發(fā)表的新基因路線圖開發(fā)了一個(gè)預(yù)測(cè)新靶向治療的方向，如針對(duì)FBXW7基因突變的成果已初步取得美國臨床運(yùn)用成功。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提供一種人腫瘤預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志組合物及其應(yīng)用，可用于制備腫瘤預(yù)測(cè)或篩查試劑盒。
[0006]技術(shù)方案:人腫瘤預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志組合物，包括BRAF、BRCAl、BRCA2、EGFR、FBXW7、H-RAS, IDHl、K-RAS、N-RAS、PIK3CA、PTEN 和 TP53 基因中的至少兩個(gè)。
[0007]優(yōu)選的方案，組合物中含有2、4、6或12個(gè)所述基因。
[0008]上述人腫瘤預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志組合物在制備腫瘤預(yù)測(cè)或篩查試劑盒中的應(yīng)用。
[0009]上述試劑盒中還包括組合物所含基因的對(duì)應(yīng)引物。
[0010]一種人腫瘤診斷試劑盒，含有檢測(cè) BRAF、BRCA1、BRCA2、EGFR、FBXW7、H-RAS、IDHl、K-RAS、N-RAS、PIK3CA、PTEN和TP53中至少兩個(gè)基因的引物。
[0011]優(yōu)選的方案，含有2、4、6或12個(gè)所述基因的引物。
[0012]檢測(cè)BRAF的引物序列如SEQ ID N0.1?2所示；檢測(cè)BRCAl的引物序列如SEQ IDN0.4?11所示；檢測(cè)BRCA2的引物序列如SEQ ID N0.13?18所示；檢測(cè)EGFR的引物序列如SEQ ID N0.20?27所示；檢測(cè)FBXW7的引物序列如SEQ ID N0.29?32所示；檢測(cè)H-RAS的引物序列如SEQ ID N0.34?37所示；檢測(cè)IDHl的引物序列為如SEQ ID N0.39?40所示；檢測(cè)K-RAS的引物序列如SEQ ID N0.42?45所示；檢測(cè)N-RAS的引物序列如SEQID N0.47?50所示；檢測(cè)PIK3CA的引物序列如SEQ ID N0.52?55所示；檢測(cè)PTEN的引物序列如SEQ ID N0.57?62所示；檢測(cè)TP53的引物序列如SEQ ID N0.64?71所示。
[0013]所述試劑盒中還含有其它必要試劑:dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液和Taq DNA聚合酶。
[0014]有益效果:本發(fā)明通過對(duì)十二個(gè)基因突變圖譜的檢測(cè)達(dá)到對(duì)一系列靶向藥物治療進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化選擇。根據(jù)此十二個(gè)基因在每個(gè)腫瘤中的累積突變率(圖3)，其在八大惡性腫瘤的應(yīng)用可覆蓋80%左右的癌癥病例。通過該試劑盒可以對(duì)治病樣本中以上各基因進(jìn)行擴(kuò)增與純化測(cè)序，并與相應(yīng)的突變圖譜進(jìn)行檢查對(duì)比，進(jìn)而對(duì)樣本中的腫瘤進(jìn)行診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查，系統(tǒng)分析腫瘤通路中各成員的功能狀態(tài)，包括通路之間和非通路之間的關(guān)系；增加基因的數(shù)目可增加預(yù)測(cè)的精確度；確定病人是否需要接受通路中下游基因的靶向治療，或協(xié)同靶向治療。
【附圖說明】
[0015]圖1為EGFR/RAS分子信息通路圖；
[0016]圖2為不同組合的檢測(cè)基因突變圖譜及其在中國八大常見腫瘤中的應(yīng)用圖，其中百分比表示十二個(gè)基因在每個(gè)腫瘤中的突變率；
[0017]圖3為本發(fā)明十二個(gè)基因在每個(gè)腫瘤中的累積突變率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面的實(shí)施例可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0019]本發(fā)明不需要從腫瘤病人再次取樣，而可以直接用現(xiàn)有病理檢查的石蠟樣本、月中瘤活檢或血液標(biāo)本。
[0020]從石蠟切片中提取高質(zhì)量腫瘤樣本DNA:先將待測(cè)樣本去蠟，后將樣本用蛋白酶K (Protinase K)消化，最后將DNA提取用于檢測(cè)基因突變。腫瘤活檢或血液標(biāo)本DNA的提取類似于石蠟切片標(biāo)本，除了不需去蠟步驟。對(duì)于血液標(biāo)本，首先將腫瘤細(xì)胞從血液中分離出來。
[0021]本發(fā)明設(shè)計(jì)和優(yōu)化了檢測(cè)位于12個(gè)基因序列中突變熱點(diǎn)的特定PCR引物。先應(yīng)用PCR對(duì)相應(yīng)的短基因片段進(jìn)行擴(kuò)充，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后應(yīng)用DNA測(cè)序儀器來檢測(cè)相應(yīng)的基因是否有突變。本發(fā)明也開發(fā)了用第二代測(cè)序儀的方法來檢測(cè)12個(gè)基因的突變，先用本發(fā)明設(shè)計(jì)的針對(duì)12個(gè)基因的DNAbaits將基因從總DNA中提取出來，然后建庫測(cè)序。本發(fā)明還在在開發(fā)應(yīng)用其它快速、精確和價(jià)廉的方法來檢測(cè)12基因的突變圖譜。
[0022]實(shí)施例1
[0023]通過檢查單個(gè)基因IDHl的突變圖譜決定肺癌、前列腺癌或其它癌癥病人是否應(yīng)接受IDHl革巴向治療(AG1-5198等)。
[0024]試劑盒組成:標(biāo)準(zhǔn)96孔PCR板，12個(gè)基因的引物(也可選擇2、4、或6個(gè)基因的引物)，dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液和Taq DNA聚合酶。
[0025]用上述方法將DNA從病人腫瘤樣本中提取出來。將病人腫瘤DNA (20?10ng)按照1:1容積比例加入到本發(fā)明設(shè)計(jì)好的96孔板試劑盒，然后將96孔板放入PCR儀對(duì)IDHl進(jìn)行擴(kuò)增，用Qiagen或其它PCR純化試劑將PCR產(chǎn)物純化，最后用DNA測(cè)序儀對(duì)IDHl基因進(jìn)行突變檢測(cè)。若病人腫瘤組織中含有IDHl突變，則IDHl的靶向治療對(duì)此病人有效。
[0026]實(shí)施例2
[0027]通過檢測(cè)E