中期因子mRNA在肺癌患者外周血中的表達及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及中期因子mRNA在癌癥診斷中的應(yīng)用，尤其是外周血中中期因子mRNA 用于非小細胞肺癌鑒別診斷的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤之首。非 小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)約占其80%，近些年療效雖有提高， 但長期生存率仍較偏低，絕大多數(shù)患者確診時已是癌癥晚期，只能采取姑息性治療，預(yù)后較 差。
[0003] 中期因子（midkine，MK)是一種分泌型肝素結(jié)合生長因子，為低分子量的蛋白質(zhì)。 MK大量表達于妊娠中期并在妊娠的發(fā)展中起著重要的作用。在成人，MK被限制在一定的組 織中表達。然而，在腫瘤發(fā)生，炎癥和組織細胞修復(fù)的過程中，MK的表達明顯增強。近年 發(fā)現(xiàn)MK在多種實體瘤中過表達，在癌前病變和腫瘤潛伏期也呈高表達，因此MK可能成為 新的腫瘤標記物.MK與惡性腫瘤的關(guān)系不十分清楚，但一些實驗已證實MK參與腫瘤生長、 血管生成、多藥耐藥形成等過程.應(yīng)用MK反義寡脫氧核糖核苷酸（MKasODN)或MK啟動子 進行基因治療，可能成為基因治療的新靶點.
[0004] 本發(fā)明擬通過建立外周血熒光定量PCR檢測MKmRNA的表達方法，比較和分析了外 周血中MK mRNA的表達水平在不同人群（NSCLC患者，LEL患者，正常體檢者）中的表達差 異及與NSCLC的臨床病理特征的關(guān)系，并對其作為NSCLC的診斷標志物的可行性進行了探 討。
[0005] 在實施過程中，本發(fā)明人成功建立了外周血中MK mRNA的熒光定量PCR檢測方法， 發(fā)現(xiàn)外周血中MK mRNA的表達水平在NSCLC患者，LEL患者，正常體檢者間存在顯著性差異， 且其高表達水平與NSCLC的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，細胞分化程度有顯著的相關(guān)性。在鑒別 診斷NSCLC患者和正常人時，ROC曲線下面積AUC值為0. 814 (95% CI = 0. 738 to 0. 894)， 在鑒別診斷NSCLC患者和LEL患者時，ROC曲線下面積AUC值為0. 759(95% Cl = 0. 673 to 0. 846)，將cut-off值設(shè)在0. 0063時，MKmRNA鑒別診斷NSCLC患者與LEL患者和鑒別 診斷NSCLC患者和正常人的敏感性和特異性分別為57. 47%和93. 33% ;以及56. 32%和 93. 33%。此外，Logistic回歸分析認為，外周血中MK mRNA的高水平表達是NSCLC發(fā)生的 獨立危險因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過建立外周血MKmRNA的Taqman熒光定量PCR法檢測方法，比較NSCLC 患者、LEL患者、健康體檢者外周血中MK mRNA的表達水平，并分析其表達水平與NSCLC臨 床病理特征的相關(guān)性，通過ROC曲線和多元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血中 MK mRNA表達可以作為診斷NSCLC的腫瘤標志物。
[0007] 本發(fā)明建立了敏感、特異、穩(wěn)定的NSCLC外周血MK mRNATaqman探針real time PCR檢測方法：
[0008] (1)培養(yǎng)肺癌細胞A549,抽提總RNA，合成cDNA，
[0009] (2)設(shè)計PCR擴增引物，擴增獲取目的基因 MK和內(nèi)參基因 GAPDH的擴增片段；
[0010] MK 引物：
[0011] MK-For : 5 ' -CGCGGATCCATGCAGCACCGAGGCTTC-3 '
[0012] MK-Rev :5' -CCCAAGCTTCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTTC-3'
[0013] GAPDH引物序列：
[0014] GAPDH-For :5' -CCGGAATTCCTTCGCTCTCTGCTCCTCCTG-3'
[0015] GAPDH-Rev :5' -CCGCTCGAGCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCTG-3'
[0016] (3)PCR片段轉(zhuǎn)化、鏈接、篩選、測序，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a - MK，pET28a - GAPDH ;
[0017] (4)設(shè)計 Real-Time PCR 引物探針
[0018] MK引物及探針：
[0019] MK-For :5, -CATCACACGCACCCCAGTT-3'
[0020] MK-Probe :5' -CTTGCAGTCGGCTCCAAACTCCTTCTT-3'
[0021] MK-ReV : 5 ' ATTGCGGCGTGGGTTTC-3 '
[0022] GAPDH引物及探針：
[0023] GAPDH-For :5' -CTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCC-3'
[0024] GAPDH-Probe :5' -CCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3'
[0025] GAPDH-Rev :5' -CCAGCCGAGCCACAT-3'
[0026] e)以梯度稀釋質(zhì)粒PCR擴增制備標準曲線，建立Taqman探針real time PCR檢測 方法
[0027] 反應(yīng)體系建立：
[0028]
【主權(quán)項】
1. 一種用于診斷NSCLC的試劑盒，其使用過程包括檢測外周血中中期因子mRNA的步 驟。
2. -種MK和GAPDH基因的引物探針，其特征在于其序列如下： MK引物及探針： MK-For :5' - CATCACACGCACCCCAGTT-3' MK-Probe :5' -CTTGCAGTCGGCTCCAAACTCCTTCTT-3' MK-Rev :5' ATTGCGGCGTGGGTTTC-3' GAPDH引物及探針： GAPDH-For :5' -CTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCC-3' GAPDH-Probe :5' -CCAAATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3' GAPDH-Rev :5' -CCAGCCGAGCCACAT-3'。
3. -種試劑盒，包括權(quán)利要求2所述的引物及探針。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種外周血中中期因子(midkine,MK)mRNA的熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明比較了非小細胞肺癌(NSCLC)患者、肺良性疾病患者(LEL)、健康體檢者(Healthy)外周血中MK？mRNA的表達水平，并分析了其表達水平與NSCLC臨床病理特征的相關(guān)性，并對外周血中MK？mRNA的表達作為NSCLC鑒別診斷標志物的可行性進行了探討，結(jié)果顯示，外周血中MK？mRNA的表達水平在NSCLC患者，LEL患者，正常體檢者間存在顯著性差異，且其高表達水平與NSCLC的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，細胞分化程度有顯著的相關(guān)性。因此，外周血中MK？mRNA的檢測可以用于鑒別診斷NSCLC的高效檢測。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104561298
【申請?zhí)枴緾N201410841608
【發(fā)明人】馬志紅, 李麗琴, 黃惠蓮, 李靜, 戴利成
【申請人】湖州市中心醫(yī)院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月29日