專利名稱：源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人參皂苷糖苷酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種源自Rhodanobacter ginsenosidimutans (Rhodanobacterginsenosidimutans) KCTC22231T 的人參阜苷糖苷酶(Ginsenoside Glycosidase)蛋白質(zhì)及其用途，更具體地涉及ー種構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸序列、編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列、包含所述核酸序列的重組載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子、培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子來制備源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人參阜苷糖苷酶的方法、利用所述蛋白質(zhì)將PPD(原人參ニ醇(protopanaxadiol))類主阜苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)可吸收的稀有阜苷形態(tài)的方法、以及用于將PH)類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收形態(tài)的皂苷的轉(zhuǎn)化用組合物，所述蛋白質(zhì)作為有效成分包含在所述PH)類皂苷。
背景技術(shù)：
皂苷是植物界廣泛存在的配糖體中非糖部分以多環(huán)化合物構(gòu)成的物質(zhì)，人參或紅參中作為主要生理活性成分包含的阜苷成分-三職阜苷(triterpene saponin)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其它植物中發(fā)現(xiàn)的皂苷不同，因此為了區(qū)分這樣的人參皂苷和其它植物界皂苷，表示人參配糖體(Ginseng Glycoside)的含義,將其稱為人參阜苷(Ginsenoside)。根據(jù)糖苷配基(aglycone)的結(jié)構(gòu)，人參皂苷可分為原人參ニ醇類人參阜苷(Protopanaxadiol-type ginsenosides)、原人參三醇類人參阜苷(Protopanaxatrio1-type ginsenosides)以及齊墩果酸類人參阜苷(Oleanolicacid-type ginsenosides)三種類型。這樣的三組再根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)中環(huán)的C-3、C-6以及C-20位置由糖苷鍵(glycosicid bond)結(jié)合的糖部位(糖苷配基)(sugarmoieties (aglycones))的位置及數(shù)量被分類。齊墩果酸類人參阜苷的基本骨架是5環(huán),這里只有人參皂苷Ro且其糖苷配基是齊墩果酸(oleanolic acid)。目前，已分離了 40余種以上的人參皂苷，而其大部分是原人參ニ醇類人參皂苷。原人參ニ醇類人參皂苷包含Rbl、Rb2、Rb3、Re、RcU絞股藍(lán)皂苷XVII、化合物O、化合物McI、F2、化合物Y、化合物Mc、Rg3、Rh2以及C-K。并且，占人參皂苷的90%以上的是人參主皂苷，但其因尺寸大而在體內(nèi)的吸收率很低。因此，為了加強(qiáng)人參皂苷的藥效，需要將人參主皂苷轉(zhuǎn)化成相對(duì)更好吸收且藥效更優(yōu)異的稀有人參皂苷的過程。即，為了在體內(nèi)(in vivo)有效地顯示生理活性，人參主皂苷需要去糖基化(deglycosylation)的轉(zhuǎn)化過程(Tawab等人,2003 ;Akao等人，1998)。人參主皂苷包含Rgl、Re、Rbl、Rc以及Rb2等，稀有人參皂苷包含F(xiàn)2、Rg3、Rhl、Rh2以及化合物K、C-K、Me、Mcl (化合物 K，C-K, Mc, Md)等。稀有人參皂苷中，Mcl是主要在紅參中微量存在的人參皂苷，其在攝取具有鎮(zhèn)痛作用、皮質(zhì)脂酮分泌促進(jìn)作用、腎小球肥大抑制作用、肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化抑制作用、骨髓細(xì)胞、DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)合成促進(jìn)作用等功能的ニ醇類人參皂苷Re時(shí)，作為體內(nèi)代謝物生成化合物Mcl。由于化合物Mcl的量非常少，因此不能進(jìn)行多方面的藥理活性研究。
并且，稀有人參皂苷F2被認(rèn)為是具有抑制腫瘤細(xì)胞的増殖、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌中顯示的多重耐藥性的效果等的成分(韓國生藥學(xué)雜志28 (I)，35，成鐘煥等人，1997年)。人參皂苷F2在人參自身中的含量極少。并且，向體內(nèi)給藥皂苷時(shí)，最終會(huì)生成化合物K，而人參皂苷F2是生成化合物K之前的中間化合物。因此，獲得大量人參皂苷F2被認(rèn)為是非常難的技術(shù)。另ー方面，現(xiàn)有技術(shù)中已知的人參皂苷F2的制備方法有將皂苷用作為酶的柚苷酶水解來制備或?qū)κ筮M(jìn)行經(jīng)ロ給藥后在大腸中分離作為分解產(chǎn)物生成的人參皂苷F2的方法。但是，這些方法的收率極低，而且由于產(chǎn)生多種二次代謝產(chǎn)物，難以以高純度純化人參皂苷F2 (Koizumi等，化學(xué)與藥學(xué)公報(bào)30 (7) :2393,1982年;Karikura等，化學(xué)與藥學(xué)公報(bào))。盡管對(duì)生成大量人參皂苷F2的方法進(jìn)行了很多研究，但是現(xiàn)在還沒有確立有效的大量生產(chǎn)方法。并且，人參皂苷F2被認(rèn)為具有抑制腫瘤細(xì)胞的増殖、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞以及細(xì)菌中顯示的多重耐藥性的效果(韓國生藥學(xué)雜志28(1)，35，成鐘煥等人，1997年)，并且經(jīng)ロ給藥 人參皂苷時(shí)，被ロ普雷沃菌(Prevotellaris)等腸內(nèi)細(xì)菌代謝并被吸收，它們的代謝產(chǎn)物F2顯示藥效。但是，這樣有用的F2同樣僅僅微量存在于部分人參種類，難以收獲大量的試料，在代謝過程中與多種2次代謝產(chǎn)物一起生成，因此在僅將F2以高純度純化方面存在困難。用于生產(chǎn)作為微量人參皂苷的稀有人參皂苷的方法公開有化學(xué)分解方法(DeMayo等，加拿大化學(xué)雜志，43，2033，1965)、酶方法(Kitagawa等，四面體快報(bào)，30，2283，1974)以及利用了配糖體合成的方法(第10-2005-0007250號(hào))等，但是上述方法由于I)在制備エ藝上需要經(jīng)過多個(gè)步驟，或2)在制備過程中目標(biāo)成分消失，3)使用不宣食用的催化劑，或4)顯示低收率，因此在大量生產(chǎn)上仍然有局限性。尤其在酶方法中可使用的酶的種類有P -葡萄糖苷酶(P-glucosidase)、a -L-卩比喃阿拉伯糖苷酶(a -L-arab inopyranos i dase)、a -L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a -L-arabinofuranosidase)以及 a -L-鼠李糖苷酶(a -L-rhamnosidase),對(duì)利用這樣的酶的人參主阜苷的生物轉(zhuǎn)化(biotransformation)進(jìn)行了很多研究。但是，這些作為大量生產(chǎn)方法同樣不夠有效，并且具有產(chǎn)生很多費(fèi)用的問題。不僅如此，即使屬于￠-葡萄糖苷酶(P-glucosidase)、a-L-卩比喃阿拉伯糖苷酶(a -L-arab inopyrano s i dase)、a -L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a -L-arab inofuranosi dase)以及a -L-鼠李糖苷酶(a -L-rhamnosidase)，也不是都具有將人參主皂苷轉(zhuǎn)化成稀有人參阜苷的活性。例如，本發(fā)明人確認(rèn)過被認(rèn)為是源自Arthrobacter chlorophenolicus A6的^ -葡萄糖苷酶沒有人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化活性。并且，現(xiàn)有技術(shù)中已知的酶，例如已知具有向Rbl的轉(zhuǎn)化能力的酶-P -葡萄糖苷酶A，即使具有人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化活性，其活性也微乎其微。并且，第10-1999-0045180號(hào)韓國專利申請(qǐng)公開了ー種用皂苷a -葡萄糖苷酶分解Pro類人參皂苷的皂苷糖基來制備人參皂苷Rh2的方法。所述發(fā)明的皂苷a-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化成人參皂苷F2，并且將人參皂苷F2轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rh2。并且，可以從人參皂苷Rbl和Re制備Rh2。但是，根據(jù)實(shí)施例3的記載，所述皂苷a-葡萄糖苷酶需要在包含有麥麩和人參粉末的培養(yǎng)基里放入曲菌進(jìn)行培養(yǎng)，去除菌體來進(jìn)行生產(chǎn)。因此，具有因顯示出低收率而作為大量生產(chǎn)方法不夠有效，制備成本高，在制備過程中目標(biāo)成分消失的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明人為了開發(fā)出將人參等植物體中微量存在的稀有形態(tài)(minor form)的人參皂苷容易地、高收率地大量收獲的方法而潛心研究的結(jié)果，從Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T菌株收獲了具有從主要形態(tài)的人參皂苷到稀有人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化活性的人參阜苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)基因。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將該基因進(jìn)行克隆而表達(dá)的重組酶選擇性地水解主皂苷的特定分子鍵，使其生物轉(zhuǎn)化成生理活性和生物吸收率高的稀有人參皂苷，從而完成了本發(fā)明。(ニ)技術(shù)方案
本發(fā)明的目的在于提供一種源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T 的人參阜苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于提供ー種編碼所述蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明的又ー個(gè)目的在于提供ー種包含所述核酸的重組載體。本發(fā)明的又ー個(gè)目的在于提供ー種用所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種制備源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人參皂苷糖苷酶的方法，包括培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子的步驟，所述載體包含編碼所述源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人參阜苷糖苷酶的核酸；用所述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)人參皂苷糖苷酶的步驟；以及回收所述生產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶的步驟。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種利用源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人參皂苷糖苷酶來將PI3D類的皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷的方法。本發(fā)明的再ー個(gè)目的在于提供ー種用于將pro類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷的轉(zhuǎn)化用組合物，所述pro類皂苷包含所述蛋白質(zhì)作為有效成分。(三)有益效果本發(fā)明的源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T 的人參阜苷糖苷酶顯示出將皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收形態(tài)的優(yōu)異活性，并且能夠大量生產(chǎn)及制造稀有人參皂苷，所述稀有人參皂苷的藥理效果得到了認(rèn)證但因其從自然只能微量生產(chǎn)而在利用上受限。并且，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子可大量生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)上可多種應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化子用包含編碼所述人參皂苷糖苷酶的核酸的重組載體來轉(zhuǎn)化。


圖I不出了 PPD(protopanaxadiol)類人參阜苷的種類。圖2不出了 PPT(protopanaxatriol)類人參阜苷的種類。圖3示出了用于bgl3054純化的SDS-PAGE分析結(jié)果。(M，分子量標(biāo)記；泳道1，誘導(dǎo)前全部細(xì)胞；泳道2，表達(dá)誘導(dǎo)后無細(xì)胞提取液；泳道3，細(xì)胞破碎后沉淀物；泳道4，由Nickel-charged His捕獲柱純化的蛋白質(zhì)；泳道5，DEAE陰離子交換柱后被純化的蛋白質(zhì)；泳道6，DEAE陰離子交換柱后被純化的蛋白質(zhì)；泳道7，用rTEV去掉了 His6標(biāo)簽的蛋白質(zhì))圖4是顯示bgl3054蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化活性的TLC照片。圖5是顯示bgl3054蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)路徑的示意圖。圖6是顯示純化自E. coil的Bgl3054隨pH變化的穩(wěn)定性及活性的圖表。圖7是顯示純化自E. coil的Bgl3054隨溫度變化的穩(wěn)定性及活性的圖表。圖8是顯示根據(jù)本發(fā)明的Bgl3054蛋白質(zhì)的Km和Vmax的雙倒數(shù)圖(doublereciprocal graphノ。圖9圖示了包含Bgl 3054的質(zhì)粒載體。 圖10示出了利用Bgl 3054的Rbl — Rd — F2隨時(shí)間變化的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)程的HPLC
分析結(jié)果。圖11示出了利用Bgl 3054的Rb2 — Rd — F2隨時(shí)間變化的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)程的HPLC
分析結(jié)果。圖12示出了利用Bgl 3054的Rbl — Mcl隨時(shí)間變化的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)程的HPLC分
析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式作為實(shí)現(xiàn)上述目的的ー個(gè)方面，本發(fā)明提供ー種源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T 的人參阜苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)(以下，與“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”或“人參皂苷糖苷酶”混用)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語“人參皂苷糖苷酶”或“人參皂苷糖苷酶蛋白質(zhì)”是將ニ糖類以上的鏈?zhǔn)蕉嗵穷惖奶擒辗肿渔I水解的酶-糖苷酶的ー種，只要具有人參皂苷的轉(zhuǎn)化活性，則對(duì)其種類沒有特別限制，并且各個(gè)酶的活性程度及功能存在差異。本發(fā)明的蛋白質(zhì)是源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T 的酶，具有能夠?qū)ro類的皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷的轉(zhuǎn)化活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有能夠?qū)ro類皂苷的第20位或第3位碳上結(jié)合的糖基選擇性地水解的能力。所述糖基優(yōu)選的是批喃葡萄糖糖苷(glucosylpyranoside)或批喃阿拉伯糖苷(arabionopyranoside)，但并不限于此。用于鑒定本發(fā)明的新核酸的微生物是Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC2223IT微生物，本發(fā)明人在位于韓國抱川地區(qū)的人參田里分離了 KCTC22231T菌株。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有構(gòu)成源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人參皂苷糖苷酶的氨基酸序列(多肽序列)，所述氨基酸序列優(yōu)選的是序列號(hào)2所示的序列，不僅僅是所述序列，與所述序列具有70%以上同源性的氨基酸序列、優(yōu)選的是80%以上的同源性、更優(yōu)選的是90%以上的同源性、較更優(yōu)選的是95%以上的同源性、最優(yōu)選的是98%以上的同源性的氨基酸序列，包含實(shí)質(zhì)上具有人參皂苷糖苷酶的活性的蛋白質(zhì)。并且，作為具有這樣的同源性的序列只要是實(shí)質(zhì)上與人參皂苷糖苷酶相同或具有相應(yīng)的生物學(xué)活性的氨基酸序列，具有部分序列缺失、變形、取代或増加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)變異體也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)是顯而易見的。
另一方面，本發(fā)明提供一種編碼源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人參皂苷糖苷酶的核酸。本發(fā)明的核酸是編碼源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T 的人參皂苷糖苷酶的核酸，編碼從所述菌株分離的人參皂苷糖苷酶的核酸優(yōu)選的是序列號(hào)I所示的核酸，不僅僅是所述序列，與所述序列具有70%以上同源性的序列、優(yōu)選的是80%以上的同源性、更優(yōu)選的是90%以上的同源性、較更優(yōu)選的是95%以上的同源性、最優(yōu)選的是98%以上的同源性的序列，包含實(shí)質(zhì)上核酸編碼的蛋白質(zhì)具有人參皂苷糖苷酶的活性的核酸。根據(jù)本發(fā)明的ー實(shí)施例，本發(fā)明的核酸被本發(fā)明人命名為bgl3054(以下，與“BGL3054”混用)，所述核酸包含1302bp長度的核酸，編碼由433個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。本發(fā)明的術(shù)語“同源性”用于表示與野生型(wild type)蛋白質(zhì)的氨基酸序列或編碼所述野生型蛋白質(zhì)的堿基序列的相似程度，包含與本發(fā)明的氨基酸序列或堿基序列具 有如上所述的百分?jǐn)?shù)以上的相同序列的序列。這樣的同源性比較可通過肉眼或容易購買的比較程序來進(jìn)行。市售的計(jì)算機(jī)程序可以將兩個(gè)以上序列間的同源性以百分?jǐn)?shù)(％)計(jì)算，同源性)可相對(duì)于相鄰的序列進(jìn)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，通過這樣的人為改變維持一定水平以上的同源性的同時(shí)，保有本發(fā)明的目標(biāo)蛋白質(zhì)活性的等同的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含野生型氨基酸序列變異體及堿基序列變異體，“變異體”是指對(duì)于天然氨基酸序列或堿基序列，ー個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基或堿基序列由于缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合而具有不同的序列的蛋白質(zhì)或具有不同序列的核酸。再一方面，本發(fā)明提供一種包含編碼源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人參皂苷糖苷酶的核酸的重組載體。本發(fā)明中，“載體”是指作為能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，包含可操作地連接的必要調(diào)節(jié)要素以表達(dá)核酸插入物的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明能夠制備包含編碼人參皂苷糖苷酶的核酸的重組載體，通過所述制備的重組載體轉(zhuǎn)化(transformation)或轉(zhuǎn)染(transfection)宿主細(xì)胞，能夠收獲本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，通過fosmid文庫(fosmid library)進(jìn)行篩選，同時(shí)鑒定能夠編碼人參阜苷糖苷酶的ORF并將其插入至pHis-ParalIelI表達(dá)載體，從而制備了重組載體pHisBGL3054(圖 9)。本發(fā)明的重組載體可通過將本發(fā)明的核酸連接(插入)在適當(dāng)?shù)妮d體而獲得。將插入本發(fā)明的核酸的載體只要其在宿主內(nèi)能夠被復(fù)制就沒有特別的限制。例如，可使用質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等。質(zhì)粒DNA的具體例子包含pCDNA3. 1+(Invitrogen)等商業(yè)質(zhì)粒。本發(fā)明中使用的質(zhì)粒的另一例子有源自大腸桿菌質(zhì)粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118以及PUC119)、源自枯草桿菌(Bacillus subtilis)質(zhì)粒(pUBllO和pTP5)以及源自酵母菌質(zhì)粒(YEpl3、YEp24以及YCp50)。噬菌體DNA的具體例子有入-噬菌體(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、入gtlO、入gtll以及入ZAP)。并且，還可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)或牛痘病毒(vaccinia virus)等動(dòng)物病毒，以及桿狀病毒(baculovirus)等昆蟲病毒。本發(fā)明的具體實(shí)施例中，插入pHis_Parallell載體而制備了重組載體pHisBGL3054。
而且，作為本發(fā)明的載體可使用連接有核酸表達(dá)活性化蛋白質(zhì)(例如，B42等)的融合質(zhì)粒(fusion plasmid,例如，pJG4_5),而這樣的融合質(zhì)?？蛇m用GST、GFP> His-tag以及Myc-tag等，但是本發(fā)明的融合質(zhì)粒不限于上述例子。為了易于純化及回收在本發(fā)明的具體實(shí)施例中表達(dá)的人參皂苷糖苷酶，使用了増加了 6個(gè)組氨酸序列的六組氨酸標(biāo)簽(hexahistidine tag,6x his tag, his6tag)。為了將本發(fā)明的核酸插入載體，可使用將純化的DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗖⒉迦脒m當(dāng)?shù)妮d體DNA的限制位點(diǎn)或克隆位點(diǎn)的方法。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，Bgl 3054基因插入在用箭頭表示的以BamHI和HindIII切斷的位點(diǎn)之間。本發(fā)明的核酸需要可操作地連接在載體上。本發(fā)明的載體除了啟動(dòng)子和本發(fā)明的核酸之外，還可以包含增強(qiáng)子(enhancer)等順式元件(cis element)、剪接信號(hào)(splicingsignal)、多聚 A 加尾信號(hào)(polyA addition signal)、選擇標(biāo)記(selection marker)、核糖體結(jié)合序列(ribosome binding sequence, SD sequence)等。作為選擇標(biāo)記的例子，可使用氯霉素抗性基因、氨節(jié)青霉素抗性基因、ニ氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)、新霉素抗性基因等，但是可操作地連接的增加構(gòu)成要素不限于上述例子。 又一方面，本發(fā)明提供ー種用包含編碼人參皂苷糖苷酶的核酸的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化(transformation) ”是指將DNA引入宿主,DNA作為染色體因子或通過染色體整合可進(jìn)行復(fù)制，將外部DNA引入細(xì)胞內(nèi)而人為引起遺傳變化的現(xiàn)象。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化法可使用任意的轉(zhuǎn)化法，可根據(jù)本領(lǐng)域的通常的辦法容易地進(jìn)行。一般，轉(zhuǎn)化方法有CaCl2沉淀法、CaCl2方法中使用稱為DMSO (dimethyl sulfoxide)的還原物質(zhì)來提高效率的Hanahan方法、電穿孔法(electroporation)、磷酸I丐沉淀法、原生質(zhì)體融合法、利用了碳化硅纖維的攪拌法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、利用PEG的轉(zhuǎn)化法、葡萄糖硫酸酷、脂質(zhì)體以及干燥/抑制介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等。用于轉(zhuǎn)化包含編碼本發(fā)明的人參皂苷糖苷酶的核酸的載體的方法不局限于上述例子，可沒有限制地使用本領(lǐng)域中通常使用的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法?？赏ㄟ^將包含編碼目標(biāo)核酸-人參皂苷糖苷酶的核酸的重組載體引入宿主，獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子(transformant)。宿主只要使本發(fā)明的核酸表達(dá)就沒有特別的限制。本發(fā)明中可使用的宿主的特定例子有大腸桿菌(E. coli)等埃希氏菌(Escherichia)屬細(xì)菌；枯草桿菌(Bacillussubtilis)等桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌；惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等假單胞菌(Pseudomonas)屬細(xì)菌；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂通酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母；以及動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的大腸桿菌菌株的具體例子有CL41(DE3)、BL21和HBlOl，枯草桿菌菌株的具體例子有WB700和LKS87，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中將大腸桿菌細(xì)胞CL41 (DE3)作為宿主細(xì)胞制備了被轉(zhuǎn)化成包含人參皂苷糖苷酶的載體的轉(zhuǎn)化子。在將大腸桿菌等細(xì)菌作為宿主使用時(shí)，本發(fā)明的重組載體可在宿主內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制，由啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明的核酸以及轉(zhuǎn)錄終止序列(transcriptiontermination sequence)構(gòu)成。
本發(fā)明的啟動(dòng)子，只要使本發(fā)明的核酸在大腸桿菌等宿主中表達(dá)，則任何啟動(dòng)子都可以使用。例如，可使用trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng)子等大腸桿菌或源自噬菌體啟動(dòng)子、以及T7啟動(dòng)子等大腸桿菌感染源自噬菌體啟動(dòng)子。并且，還可以使用tac啟動(dòng)子等人工變形的啟動(dòng)子。為了使本發(fā)明中回收的目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化容易，質(zhì)粒載體可根據(jù)需要還包含其它序列，上述可追加包含的序列可以是蛋白質(zhì)純化用標(biāo)簽序列，例如，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Pharmacia，美國)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(NEB，美國)、FLAG(IBI，美國)和六組氨酸(hexahistidine ;Quiagen,美國)等,但是目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化所需的序列種類不限于上述例子。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，使用六組氨酸標(biāo)簽來使純化容易。并且，在通過包含所述融合序列的載體表達(dá)的融合蛋白質(zhì)的情況下，可通過親和色譜法純化。例如，在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶被融合的情況下，可利用作為該酶的底物的谷胱甘肽；在利用六組氨酸的情況下，可利用Ni-NTA His-結(jié)合樹脂柱(Novagen,美國)容易地回收期望的目標(biāo)蛋白質(zhì)。 另一方面，本發(fā)明提供一種制備源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人參皂苷糖苷酶的方法。優(yōu)選地，所述制備方法可包含以下步驟而進(jìn)行(a)培養(yǎng)用載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子的步驟，所述載體包含編碼人參皂苷糖苷酶的核酸；(b)從所述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)人參皂苷糖苷酶的步驟；以及(c)回收所述生產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶的步驟。本發(fā)明的表達(dá)人參皂苷糖苷酶的方法如上所述，由上述方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域中通常使用的方法來培養(yǎng)。例如，表達(dá)所述人參皂苷糖苷酶的轉(zhuǎn)化子可在多種培養(yǎng)基里培養(yǎng)，可進(jìn)行補(bǔ)料分批(fed-batch)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等，但是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)方法不限于上述例子。并且，為了宿主細(xì)胞的生長而可被包含在培養(yǎng)基中的碳源，可根據(jù)被制備的轉(zhuǎn)化子的種類由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇，并且可采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)時(shí)機(jī)和量。選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞并提供培養(yǎng)基條件吋，目標(biāo)蛋白質(zhì)被成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子，將生產(chǎn)人參皂苷糖苷酶。根據(jù)載體的結(jié)構(gòu)和宿主的特征被生產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶可在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、壁膜間隙(periplasmic space)分泌或向細(xì)胞外分泌。并且，目標(biāo)蛋白質(zhì)可以以可溶性形態(tài)或不溶性形態(tài)表達(dá)。在宿主細(xì)胞內(nèi)或外表達(dá)的蛋白質(zhì)可用通常的方式純化。純化方法的例子有鹽析(例如，硫酸銨沉淀、磷酸鈉沉淀等)、溶劑沉淀(例如，使用丙酮或こ醇等的蛋白質(zhì)分段沉淀等)、透析、凝膠過濾、離子交換、反相柱色譜分析法等色譜分析法、以及超濾等方法，可單獨(dú)或組合適用所述方法來純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)。利用由上述方法分離的人參皂苷糖苷酶，可生成在人參皂苷存在的體外(in-vitro)或體內(nèi)(in vivo)系統(tǒng)中容易吸收的阜苷。再一方面，提供一種利用源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T 的人參皂苷糖苷酶來將pro類的皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷的方法。本發(fā)明中用作起始原料的pro類皂苷，可利用分離及純化形態(tài)的皂苷，或可利用包含于人參或紅參粉末或提取物的皂苷。即，本發(fā)明的方法可通過將包含皂苷的人參或紅參粉末或提取物用作直接起始原料來實(shí)施。本發(fā)明中利用的人參可使用公知的多種人參，包含:高！ 參(Panax ginseng)、西洋參(P. quiquefolius)、三七參(P. notoginseng)、竹節(jié)參(P. japonicus)、三葉參(P. trifolium)、珠子參(P. pseudoginseng)和越南參(P. vietnamesis)，但并不限于此。如背景技術(shù)中所涉及的，根據(jù)糖苷配基(aglycone)的結(jié)構(gòu)，人參皂苷可分為原人參ニ醇類人參阜苷(Protopanaxadiol-type ginsenosides)、原人參三醇類人參阜苷(Protopanaxatriol-type ginsenosides)以及齊墩果酸類人參阜苷(Oleanolicacid-type ginsenosides)三種類型,本發(fā)明的PF1D類阜苷是指原人參ニ醇類人參阜苷。在利用本發(fā)明的源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T 的人參阜苷糖苷酶的情況下，可將其轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷，而這意味著由于可對(duì)特定位置的糖苷鍵進(jìn)行選擇性的水解，可依次對(duì)結(jié)合在pro類皂苷的第20位或第3位碳上的糖基進(jìn)行水解，從而可將體內(nèi)吸收困難的主要形態(tài)(major form)的PF1D類阜苷(例如,人參皂苷Rbl、Rb2和Re)轉(zhuǎn)化成相對(duì)體內(nèi)容易吸收的稀有形態(tài)(minor form)的皂苷(例如，人參皂苷F2和Md) o
優(yōu)選地，這樣的轉(zhuǎn)化通過生物轉(zhuǎn)化(bioconversion)來實(shí)現(xiàn)，通過連續(xù)或非連續(xù)地對(duì)結(jié)合在pro類皂苷的第20位或第3位碳的糖基進(jìn)行選擇性水解來實(shí)現(xiàn)。所述糖基優(yōu)選的是批喃葡萄糖糖苷(glucosylpyranoside)或批喃阿拉伯糖苷(arabionopyranoside)，但并不限于此。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可將本領(lǐng)域已知的所有pro類皂苷轉(zhuǎn)化成容易吸收的稀有形態(tài)(minor form)阜苷,優(yōu)選地,通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化的例子包含將人參阜苷Rbl轉(zhuǎn)化成Rd或?qū)⑥D(zhuǎn)化的Rd轉(zhuǎn)化成F2、將人參皂苷Rb2轉(zhuǎn)化成Rd、將轉(zhuǎn)化的Rd轉(zhuǎn)化成F2、將人參皂苷Re轉(zhuǎn)化成化合物Mcl的全部方法。更具體地，本發(fā)明的具體實(shí)施例中，在將包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的組合物添加到人參皂苷Rbl及Rb2時(shí)，依次生產(chǎn)了 Rd和F2。并且，在將人參皂苷Re作為起始原料處理本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)了化合物Mcl。這些都可以通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)結(jié)合在PI3D類皂苷的第20個(gè)或第3個(gè)碳的糖基進(jìn)行水解來進(jìn)行，通過如上所述的水解而生成的生成物質(zhì)(人參皂苷衍生物)，與反應(yīng)物質(zhì)相比，體內(nèi)容易吸收。本發(fā)明的蛋白質(zhì)是用于將PH)類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷的酶，只要能夠維持活性和穩(wěn)定性可在各種溫度和PH條件下使用，并且可以一起使用選自以下組的ー種以上金屬和化學(xué)制劑，該組由 ZnCl2、MnCl2' CaCl2、CoCl2、MgCl2' EDTA、NaCl、KCl、CuCl2, SDS、DTT和巰基こ醇組成，但并不限于此。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，經(jīng)分析本發(fā)明的酶特性，在37°C下酶的穩(wěn)定性卓越，在40°C 55°C下酶的活性高，在pH5. 5 7. 5下酶的穩(wěn)定性及活性卓越(圖6及圖7)。又一方面，本發(fā)明提供ー種用于將pro類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的阜苷的轉(zhuǎn)化用組合物，所述PF1D類阜苷包含源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人參皂苷糖苷酶作為有效成分。以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但是，這些實(shí)施例僅用于例示性地實(shí)施本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。發(fā)明的實(shí)施方式實(shí)施例I. Fosmid文庫篩選及全堿基序列分析
根據(jù)制造公司的方法，使用了 CopyControl Fosmid Library ProductionKit (Epicentre, U. S. A)。以約 40Kb 斷片任意切斷 Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T 的基因組 DNA (genomic DNA)。通過脈沖場凝膠電泳(Pulse Field GelElectrophoresis)使少量電泳，從而測定切斷的DNA尺寸，并且對(duì)DNA進(jìn)行了末端修復(fù)(end-repair),以制備平末端(blunt end)和 5'-憐酸化末端(5' -phosphoryIatedend)。通過LMP(low melting point)瓊脂糖凝膠電泳篩選了 40Kb以上的末端修復(fù)的DNA。從LMP瓊脂糖凝膠純化了平末端DNA并使其連接(ligation)在pCClFOS載體內(nèi)。用MaxPlax lambda packaging extract kit (Epicentre, U.S.A.)進(jìn)打體夕卜 Un vitro)封裝。最后，將生成物轉(zhuǎn)化在大腸桿菌(E.coli)EPI300-TlR內(nèi)，所述大腸桿菌(E.coli)被培養(yǎng)在包含IOmM MgSO4的LB液體培養(yǎng)基(broth)中，直至600nm時(shí)0. D值為0. 6。在37°C下吸收被感染的細(xì)菌20分鐘,涂抹在包含12. 5 u g/ml氯霉素(chloramphenical)和27ii-X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-葡萄糖苷)的LB板上，在37°C下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)16-20小時(shí)后,篩選呈藍(lán)色的克隆(人參阜苷糖苷酶推定克隆)，在同一板上再一次確認(rèn)了活性。確認(rèn)后，將推定的克隆在包含12. 5 ii g/ml氯霉素的0.2ml LB培養(yǎng)基中，在37°C下 培養(yǎng)了 24小吋。為了分析人參皂苷的水解能力，利用了 TLC分析。從細(xì)胞培養(yǎng)中鑒定了將人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化成Rd的、推定為pbgl3054-plFosmid克隆的Fosmid DNA,根據(jù)制造公司的方法利用FosmidMAX DNA純化試劑盒(Epicentre,美國)進(jìn)行了純化。對(duì)純化的Fosmid DNA進(jìn)行了全序列(full sequencing)分析。用 HyperMu 〈KAN-l>Insertion Kit (Epicentre,美國)根據(jù)制造公司的方案進(jìn)行了轉(zhuǎn)座子(transposon)的插入。在兩側(cè)方向使用MUKAN-1FP-1 [5'-CTGGTCCACCTACAACAAAGG-3'(序列號(hào) 3)]和 MUKAN-1RP-1 [5' -AGAGATTTTGAGACAGGATCCG-3'(序列號(hào)4)]兩個(gè)引物對(duì)選擇性插入克隆進(jìn)行序列擴(kuò)增來獲得全序列，而其包含被插入上述試劑盒內(nèi)的HyperMu轉(zhuǎn)座子的末端同源性區(qū)域。作為模板使用ABIPRISMTM、BigdyeTM、循環(huán)測序預(yù)反應(yīng)試劑盒(Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) (Applied Biosystems,福斯特市，加拿大)來進(jìn)行DNA堿基序列測定反應(yīng)。用ABI 3730XL caillary DNA測序儀(Applied Biosystems,福斯特市,加拿大)收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。實(shí)施例2. bg!3054的分子克降、表汰和純化(2_l)bgl3054的分子克隆和表達(dá)使用遺傳密碼I (genetic codel)對(duì) pbgl3054_pl 組裝 DNA (assembled DNA)序列用Vector NTI vlO. 0 (Invitrogen公司)進(jìn)行了分析。找出人參阜苷糖苷酶的0RF,然后使用寡核苷酸引物對(duì)模板pbgl3054-p IDNA通過PCR進(jìn)行了擴(kuò)增。正方向引物5' -CGG ATC CAA TGG GCC TGG GAC GCC GGC GT-3'(序列號(hào) 5)逆方向引物5' -CGG AAG CTT TCA GGC GGG CTG CGG TGC-3'(序列號(hào) 6)將所述擴(kuò)增斷片依次克隆在包含pHis-Parallel表達(dá)載體(引入EcoRI和HindIII限制位點(diǎn)來使用)和重組TEV蛋白酶(rTEV)的His6 (hexahistidine)融合蛋白質(zhì)表達(dá)載體pHis-Parallel I上。之后，將重組載體pHisBGL3054引入到E. coli C41 (DE3)細(xì)胞。
(2_2)bgl3054的克隆和表達(dá)結(jié)果人參皂苷糖苷酶顯示出了將人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化成Rd的能力，因此本發(fā)明人用bgl3054設(shè)計(jì)了所述ORF。bgl3054的推定氨基酸序列具有433個(gè)殘基，顯示了 49kDa的分子量。(2_3)bgl3054 的純化將含有過表達(dá)質(zhì)粒的E.coli C41(DE3)在37°C下，在LB氨芐青霉素培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直到0. D值在600nm下為0. 6,用0. 5mM異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(isopropyl-3 -D-thiogalactopyranoside)處理12小時(shí)來誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)表達(dá)。在4°C下以5，OOOxg離心分離20分鐘收獲了細(xì)菌細(xì)胞。在50mM憐酸鈉(sodium phosphate)、5mM EDTA以及1%Triton X-100 (pH7. 0)(懸浮溶液)構(gòu)成的溶液中對(duì)細(xì)胞顆粒進(jìn)行了再懸浮，并進(jìn)行了超聲處理(ultrasonification)。人參阜苷糖苷酶不形成不溶物而全部被水化,在50mM磷酸鈉 中，使人參皂苷糖苷酶與lmg/ml的Rbl溶液進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行了 TLC分析。結(jié)果，人參皂苷糖苷酶Bgl3054使人參皂苷Rbl經(jīng)Rd轉(zhuǎn)化成F2。所述人參皂苷糖苷酶Bgl3054編碼核酸是由bgl3054設(shè)計(jì)的。因此，將bgl3054加載在Nickel-chargedHis Trap 柱(His Trap HP, 5ml 床體積，Gel health)上，在 4°C下用緩沖液 A(50mM 磷酸鈉，pH7. 0)進(jìn)行了預(yù)平衡(pre-equilibrated)。用緩沖液A清洗了樹脂(resin),將結(jié)合的蛋白質(zhì)用包含200mM咪唑(imidazole)的緩沖液A溶出。根據(jù)HisTrap柱培養(yǎng)rTEV，將His6-標(biāo)簽從蛋白質(zhì)分離，并且在包含30ml DEAE纖維素DE-52 (Whatman)的柱上，以50mM磷酸鈉、PH7. 0以及300mM NaCl進(jìn)行了另外的純化。通過10%的SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色(Coomassie Blue staining)測定了蛋白質(zhì)的同源性。純化的蛋白質(zhì)以10mg/ml濃度、使用Amicon Ultra-15過濾器(Millipore,美國)、在pH7. 0下、用50mM磷酸鈉進(jìn)行了透析，在-80°C下儲(chǔ)藏直至使用。使用50mM磷酸鈉以及在pH7. 0下純化的帶上His6_標(biāo)簽的蛋白質(zhì)來進(jìn)行了酶的分析和動(dòng)力學(xué)分析。在Sepharose 610/300GL (GE Healthcare)柱上進(jìn)行了凝膠-過濾分析(Gel-filtration analysis)。使用伯樂過濾標(biāo)準(zhǔn)(目錄第 151-1901) (Bio-Rad filtrationstandard (catalog no. 151-1901))進(jìn)行了測定。將得到的酶純化圖表顯示在表I中。表I
純化步驟體積蛋白質(zhì)總蛋白質(zhì)特異性總活性純化收率
濃度_______
__(ml) (mg/ml) (mg)(U/mg) (Ua) (倍)(%)
粗提物30 27.8 8346.71 5596 1.00 100
Ni 純化108 1.9205.2 10.57 2168 1.57 39
DE AE-纖維素
126 0.93 117.18 10.99 1288 1.64 23
純化_
P -葡糖苷酶的ー個(gè)單位⑶被定義為對(duì)硝基酹I U M/min釋放的酶量(aoneunit (U) oi beta-glucosidase was denned as the amount of enzyme liberating I U M/min of p-nitrophenyl)。(2_4)bgl3054 的純化結(jié)果在Superose 610/300GL(GE Healthcare)上作為凝膠結(jié)果測定的天然人參阜苷糖苷酶的分子量是49kDa，根據(jù)SDS-PAGE的分析是50kDa。這樣的結(jié)果表明人參皂苷糖苷酶是單體蛋白質(zhì)(圖3)。實(shí)施例3.酶特件分析對(duì)包含2. OmM pNPGIc (對(duì)硝基酹-^ -D-卩比喃葡萄糖苷；Sigma)的pH7. 0、50mM磷 酸鈉緩沖液90 u I進(jìn)行了特異活性的測定，反應(yīng)開始前使其與10 u I稀釋純化酶在37°C下反應(yīng)20分鐘而進(jìn)行了培養(yǎng)。用0. Iml的IM Na2CO3處理5分鐘并結(jié)束反應(yīng)，在405nm下立即測定了對(duì)硝基酹(p-nitrophenol)的濃度。將ー個(gè)活力單位(one unit of activity)定義為姆分鐘釋放I U mo I對(duì)硝基苯酹的量。特異活性以單位/蛋白質(zhì)毫克(milligram)表示。使用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析染色試劑測定了蛋白質(zhì)濃度。所有分析至少進(jìn)行三次以上。(3-1)根據(jù)pH變化的效果測定測定了 pH對(duì)酶活性的影響效果。底物使用了 2. OmM pNPGlc (對(duì)硝基苯酚-@ -D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)，使用以下的緩沖液(50mM)調(diào)節(jié)了 pH。pH2 10的范圍:KCl-HCl(pH2)、甘氨酸-HCl(pH3)、醋酸鈉&財(cái)和5)、磷酸鈉(pH6和7)、三羥甲基氨基甲烷-HCl (pH8和9)和甘氨酸-氫氧化鈉(pHIO)。并且，測定了 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的效果。在4°C下，在上述涉及的各個(gè)緩沖液中培養(yǎng)酶24小時(shí)后,在50mM鉀(potassium)緩沖液中分析pHPGlc,從而測定了根據(jù)pH變動(dòng)的酶穩(wěn)定性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析方法分析殘留物活性并作為以最佳PH下收獲的活性幾率將結(jié)果顯示在圖6。參考圖6，bgl3054在pH5. 5 7. 5下的酶的穩(wěn)定性和活性卓越，在pH7. 0下顯示出最高的活性(圖6)。(3-2)根據(jù)溫度變化的效果測定測定了溫度對(duì)酶活性的影響效果。將溫度調(diào)節(jié)到4 90°C，使用2. OmM pNPGlc (對(duì)硝基苯酹-^ -D-批喃葡萄糖苷；Sigma),在最佳pH下在50mM磷酸|丐緩沖液中分析溫度依賴性活性5分鐘。并且，在相同的溫度范圍內(nèi)，在50mM的磷酸鉀緩沖液內(nèi)培養(yǎng)酶當(dāng)量30分鐘，從而進(jìn)行了溫度穩(wěn)定性分析。用冰冷卻樣品10分鐘后，通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析方法確認(rèn)測定的殘余活性來進(jìn)行，將結(jié)果顯示在圖7中。其結(jié)果，Bgl3054的活性在40 55°C顯示出最高值，而熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果在37°C以下溫度顯示為穩(wěn)定的，但是在45°C下經(jīng)過30分鐘后喪失了大約50%的活性。其結(jié)果，Bgl3054的活性在40 55°C顯示出最高值，而熱穩(wěn)定性在37°C以下溫度穩(wěn)定，特別在45°C下幾乎一半的穩(wěn)定性喪失(圖7)。(3-3)根據(jù)金屬和化學(xué)制劑變化的效果測定將人參皂苷糖苷酶在室溫下、在ImM和IOmM(最終濃度)的ZnCl2、MnCl2, CaCl2,CoCl2、MgCl2、EDTA、NaCl、KCl、CuCl2、DIT、SDS 和巰基こ醇下進(jìn)行 30 分鐘培養(yǎng)，將 pNPGlc (對(duì)硝基苯酚-0-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)用作底物來測定了活性，結(jié)果值以對(duì)化合物缺少的情況下收獲的活性的百分?jǐn)?shù)顯示在表I中?？芍蟛糠值慕饘匐x子和鱉合劑對(duì)酶活性幾乎沒有影響，并可確認(rèn)SDS在IOmM以上的濃度下顯示出了活性抑制效果。表權(quán)利要求
1.源自 Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T 的人參阜苷糖苷酶(gmsenoside giycosidaseノ g白M。
2.如權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)對(duì)結(jié)合在PPD (protopanaxadiol)類阜苷的第20位或第3位碳的糖基(saccharide)具有選擇性水解能力。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述糖基是吡喃葡萄糖糖苷(glucosyIpyranoside)或卩比喃阿拉伯糖苷(arabionopyranoside)。
5.編碼權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的核酸。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸如序列號(hào)I所示。
7.如權(quán)利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸與序列號(hào)I所示的序列具有95%以上的同源性，并編碼具有人參皂苷糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。
8.包含權(quán)利要求5所述核酸的重組載體。
9.如權(quán)利要求8所述的重組載體，所述載體是pHisBGL3054，其具有圖9中記載的酶切圖譜。
10.由權(quán)利要求8所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。
11.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化子是大腸桿菌(E.coli)。
12.制備權(quán)利要求I所述人參皂苷糖苷酶的方法，包括 (a)培養(yǎng)如權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化子的步驟； (b)用所述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)人參皂苷糖苷酶的步驟；以及 (c)回收所述生產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶的步驟。
13.利用如權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)來將pro類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的稀有皂苷的方法。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在干，所述方法通過對(duì)結(jié)合在pro類皂苷的第20位或第3位碳上的糖基進(jìn)行水解來進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求14所述的方法,所述糖基是批喃葡萄糖糖苷(glucosylpyranoside)或批喃阿拉伯糖苷(arabionopyranoside)。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化是選自以下組的ー種以上從人參皂苷Rbl或人參皂苷Rb2到人參皂苷Rd的轉(zhuǎn)化、從人參皂苷Rd到人參皂苷F2的轉(zhuǎn)化、以及從人參皂苷Re到化合物Mcl的轉(zhuǎn)化。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化是在pH5.5 7. 5以及30 55 °C的溫度下進(jìn)行。
18.用于將PH)類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收的形態(tài)的皂苷的轉(zhuǎn)化用組合物，所述pro皂苷包含權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種源自Rhodanobacter ginsenosidimutans (Rhodanobacter ginsenosidimutans)KCTC22231T的人參皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)蛋白質(zhì)及其用途，該蛋白質(zhì)對(duì)人參皂苷的特定位置結(jié)合鍵進(jìn)行選擇性水解而具有將PPD類皂苷轉(zhuǎn)化為去糖基化(deglycosylation)的體內(nèi)可吸收的高活性物質(zhì)的活性。更具體地涉及一種構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸序列、編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列、包含所述核酸序列的重組載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子、培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子來制備源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人參皂苷糖苷酶的方法、利用所述蛋白質(zhì)將PPD(protopanaxadiol)類主皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)可吸收的稀有皂苷形態(tài)的方法、以及用于將PPD類皂苷轉(zhuǎn)化成體內(nèi)容易吸收形態(tài)的皂苷的轉(zhuǎn)化用組合物，所述蛋白質(zhì)作為有效成分包含在所述PPD類皂苷。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102762738SQ201080046283
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者安東善, 崔昌浩, 李成宅, 林完澤, 金成健 申請(qǐng)人:韓國生命工學(xué)研究院