本發(fā)明涉及一種具有草甘膦和草銨膦復合抗性的融合基因、編碼蛋白，及該融合蛋白的應用。

(二)

背景技術(shù)：

雜草和病蟲害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響產(chǎn)量的最重要的生物因素。如何降低雜草和病蟲害的防治成本、提高防治效率、減少防治過程中給環(huán)境造成污染是農(nóng)業(yè)科學研究最關(guān)鍵的問題。

雜草時伴隨著人類的生產(chǎn)活動而產(chǎn)生的，它們的存在是長期適應氣候、土壤、作物、耕作制度及社會因素與栽培作物競爭的結(jié)果。人類從開始從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)就在防治雜草，但是當時的雜草防治僅僅是一種極為粗放的初級勞動。隨著科學的發(fā)展，特別是近代生命科學的發(fā)展進步，人類可以通過基因工程的方法賦予農(nóng)作物耐受各種除草劑的特性，通過噴施除草劑就可以很好的防治雜草，把人類從初級勞動中解放出來，極大的提高效率。

草甘膦(Glyphosate)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的競爭類似物，通過植物地上綠色莖葉角質(zhì)層吸收后，隨光合作用產(chǎn)物從韌皮部快速傳導至整個植株的各個部位，可防除單子葉和雙子葉一年生和多年生草本和灌木等40多科的植物。因其本身廣譜、內(nèi)吸傳導式、低毒、低殘留、可混性強、價格合理、獨特的靶標和作用機理等自身優(yōu)點，自1971年問世以來，在全世界的銷售額已多次位居農(nóng)藥品種的首位。隨著轉(zhuǎn)基因作物時代的到來，抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物也成為一種普遍的種植需求。1996年美國首先開發(fā)了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆，近年來抗草甘膦作物的品種和種植面積還在不斷迅速增加。

草銨膦是德國赫斯特公司創(chuàng)制的有機磷類非傳導滅生性除草劑，其有效成分為phosphinothricin(PPT)。谷氨酰胺合成酶是植物的一個重要的解毒酶，其在植物氮代謝過程中起著至關(guān)重要的作用，它能夠解除由氨基酸降解、硝酸鹽還原以及光呼吸等過程中釋放出的銨的毒性。谷氨酰胺合成酶(GS)是草銨膦的靶標酶，草銨膦能夠?qū)χ参颎S起到抑制作用，使植物氮代謝出現(xiàn)失調(diào)，進而使所必需的氨基酸出現(xiàn)缺乏，增大細胞中氨含量，促使植物出現(xiàn)中毒，致使葉綠素解體，最終造成植物的死亡。草銨膦具有的特點包括低毒、高活性、良好的環(huán)境兼容性等。早期，在全世界范圍內(nèi)草銨膦的用量并不大，近來，轉(zhuǎn)基因抗草銨膦作用的種植不斷擴大帶動了對草銨膦的需求，草銨膦也逐漸成為了一種極為暢銷的除草劑。

能賦予農(nóng)作物草甘膦抗性的基因很多，包括突變的對磷酸烯醇式丙酮酸具有高親和性，而對草甘膦不敏感的EPSPS基因，例如CP4(Padgette,S.R,Kolacz,K.H,Delannay,X,et al.1995,Crop Science,35(5):1451-1461)、aroA(Comai L,Sen LC,Stalker DM.1983,Science,221(4608)：370-371)、G7(中國專利：200910098129.X)、G10(中國專利：201110009329.0)；草甘膦解毒基因，包括可以把草甘膦轉(zhuǎn)化為氨甲基磷酸的草甘膦氧化還原酶基因(glyphosate oxidoreductase gene,GOX)(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosate tolerant plants)和可以把草甘膦轉(zhuǎn)化為N－乙酰草甘膦的草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因(glyphosate N-Acetylation,GAT)(Castle LA；Siehl DL；Gorton R；Patten PA；Chen YH；Bertain S；Cho HJ；Duck N；Wong J；Liu D；Lassner MW.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.,Hong,C.Y.,Duck,N.B.,Giver,L.J.,Christina,I.,&Jeremy,M.,et al.2004,WO 2002036782A3；2002,WO 2002036782A2；Green J M,Hazel C B,Raymond F D,et al.2008,Pest Management Science,64(4):332-9.)。草銨膦是另外一種殺草譜廣、生產(chǎn)體系成熟、被廣泛應用的滅生性除草劑。目前已經(jīng)被克隆出來的抗草銨膦基因包括bar(Thompson CJ；Movva NR；Tizard R；Crameri R；Davies JE；Lauwereys M；Botterman J.1987,Embo Journal,6(9),2519-23；White,J.,Chang,S.Y.P.,Bibb,M.J.,&Bibb,M.J.1990,Nucleic Acids Research,18(4),1062-1062.)，pat(Wohlleben,W.,Arnold,W.,Broer,I.,Hillemann,D.,Strauch,E.,&Pühler,A.1988,gene 70:25-37.Gene,70(1),25-37)。

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的大量種植和草甘膦的長期、大規(guī)模使用，在美國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少21種雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗性。據(jù)報道，美國堪薩斯州的大豆田中的雜草產(chǎn)生了抗草甘膦能力，以往利用草甘膦可以輕易控制的雜草變得不能被殺滅了，農(nóng)民一籌莫展。盡管目前抗草甘膦的雜草種類比較少，發(fā)生的地點比較孤立，但是為了防止更多草甘膦抗性雜草產(chǎn)生，延長草甘膦在防治雜草方面的有效使用壽命，目前迫切需要研發(fā)新的抗其它除草劑的農(nóng)作物，從而可以通過其它除草劑控制草甘膦抗性雜草和雜草對草甘膦的抗性發(fā)展。

草甘膦和草銨膦是目前使用最為廣泛的兩種滅生性除草劑之一。并且，草甘膦和草銨膦的殺滅機理不同。如果能夠研發(fā)一種同時對草甘膦和草銨膦的轉(zhuǎn)基因植物，就可以通過草甘膦和草銨膦的混配或者輪換使用防治雜草，這樣不但可以拓寬單一除草劑的殺草譜還可以延緩雜草對單一除草劑抗性的產(chǎn)生。因此，研發(fā)出一種能賦予植物草甘膦與草銨膦復合抗性的基因具有巨大的應用價值。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種基因，這種基因能夠賦予植物草甘膦與草銨膦復合抗性，可以用來生產(chǎn)抗除草劑植物。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種具有草甘膦和草銨膦復合抗性的融合基因，該基因包括編碼抗草甘膦蛋白的核苷酸序列和編碼抗草銨膦蛋白的核苷酸序列；上述2個核苷酸序列位于同一個開放閱讀框內(nèi)；抗草甘膦蛋白和抗草銨膦蛋白可以為全長或者截斷后的活性多肽片段。具體所述融合基因由抗草甘膦蛋白編碼基因和抗草銨膦蛋白編碼基因構(gòu)成；所述抗草甘膦編碼基因為下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草銨膦編碼基因為bar或pat。

進一步，所述融合基因由抗草甘膦蛋白編碼基因GAT和抗草銨膦蛋白編碼基因Bar構(gòu)成，所述融合基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

進一步，所述融合基因由抗草甘膦蛋白編碼基因CP4和抗草銨膦蛋白編碼基因pat構(gòu)成，所述融合基因核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供一種所述具有草甘膦和草銨膦復合抗性的融合基因編碼蛋白。當所述抗除草劑基因為bar，所述的抗蟲基因為GAT時，融合蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.3；當所述抗除草劑基因為pat，所述的抗蟲基因為CP4時，融合蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.4。

本發(fā)明還提供一種所述具有草甘膦和草銨膦復合抗性的融合基因編碼蛋白在制備抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物中的應用，所述作物包括單子葉作物和雙子葉作物，更優(yōu)選所述作物為玉米、水稻、大豆、小麥或油菜。

本發(fā)明設計的用抗草甘膦蛋白質(zhì)多肽和抗草銨膦蛋白質(zhì)多肽融合成的人工蛋白質(zhì)分子，與現(xiàn)有的抗除草劑蛋白相比具有如下優(yōu)點：可以賦予植物草甘膦與草銨膦復合抗性；可以用于制備具有草甘膦與草銨膦復合抗性的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明提供的具有草甘膦與草銨膦復合抗性的融合蛋白可以應用于單子葉植物和雙子葉植物的抗除草劑方面，主要應用于抗除草劑抗蟲玉米、水稻、大豆、小麥和油菜。

(四)附圖說明

圖1：草甘膦和草銨膦復合抗性融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。融合蛋白中的抗草甘膦白質(zhì)多肽和抗草銨膦蛋白質(zhì)多肽可以分別在N端和C端或者分別在C端和N端。

圖2：融合蛋白表達載體T-DNA的結(jié)構(gòu)示意圖。pUBI為玉米泛素啟動子，融合蛋白為草甘膦和草銨膦復合抗性融合蛋白編碼基因，p35S為花椰菜花葉病毒35S啟動子，G10EPSPS為抗草甘膦基因。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

本發(fā)明的以下實施例所使用的分子生物學和生物化學方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等編寫Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文獻均有詳細的說明。

實施例1草甘膦和草銨膦復合抗性融合蛋白表達載體的構(gòu)建

抗草銨膦基因bar和抗草甘膦基因GAT融合構(gòu)成的融合基因被命名為bar-GAT基因，編碼的蛋白質(zhì)多肽序列如SEQ ID NO：3所示?？共莞熟⒒駽P4和抗草銨膦基因pat融合構(gòu)成的融合基因被命名為CP4-pat基因，編碼的蛋白質(zhì)多肽序列如SEQ ID NO：4所示。

bar-GAT基因(核苷酸序列如：SEQ ID NO：1中第11-1021個堿基所示)，人工合成在5’端設置了BamHI酶切位點，在3’端連接了人工合成的終止子，且設置了KpnI酶切位點，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。CP4-pat基因(核苷酸序列如：SEQ ID NO：2中第224-2164個堿基所示)及其基因5’端的葉綠體轉(zhuǎn)運肽CTP(核苷酸序列如：SEQ ID NO：2中第11-223個堿基所示)和3’端的終止子序列(SEQ ID NO：2中第2165-2371個堿基所示)，該基因通過人工合成，在5’端設置了BamHI酶切位點，在3’端設置了KpnI酶切位點，序列如SEQ ID NO：2所示。

pUBI為玉米泛素蛋白啟動子，通過PCR獲得。設計PCR引物pUBI-F

(5’GAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCC)和pUBI-R

(5’GGGTGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAAC)，以商業(yè)玉米品種鄭單958的基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得pUBI。PCR反應條件為：95℃3分鐘；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分鐘，重復32個循環(huán)；然后72℃10分鐘。將獲得的大約2.0Kb的PCR產(chǎn)物克隆到T-載體pMD19中。然后，用HindIII和BamHI雙酶切得到pUBI，并且DNA序列測定表明核苷酸序列正確(SEQ ID NO：5)。

G10EPSPS為抗草甘膦基因(中國專利：201110009329.0)。通過人工合成G10EPSPS基因(SEQ ID NO：6)。合成的基因5’端連接有玉米乙酰乳酸合成酶AHAS葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽且設置有XhoI酶切位點，3’端連接有終止子且設置有XhoI酶切位點。

農(nóng)桿菌T-DNA載體的構(gòu)建：雙元載體pCambia1300-p35S-G10由載體pCambia1300修改而來，簡單的說就是把pCambia1300載體中的抗潮霉素基因置換為抗草甘膦基因G10EPSPS。具體把pCambia1300載體經(jīng)過XhoI酶切以后，去磷酸化處理，然后與經(jīng)過XhoI酶切后的獲得的人工合成的含有葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽和終止子的G10EPSPS基因片段進行兩端連接，轉(zhuǎn)化，獲得的載體即為pCambia1300-p35S-G10。

為了獲得bar-GAT基因表達載體，用HindIII和KpnI對之前構(gòu)建好的pCambia1300-p35S-G10進行雙酶切，回收獲得載體；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI啟動子的質(zhì)粒，獲得pUBI片段；用BamHI和KpnI對含有人工合成的bar-GAT基因及其終止子的質(zhì)粒，回收得到bar-GAT片段。然后，把上述酶切后的載體和兩個片段進行三段連接，獲得終載體。獲得的T-DNA結(jié)構(gòu)為：“啟動子-融合基因-終止子-啟動子-G10EPSPS-終止子”。這個載體命名為：pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174(圖2)。

為了獲得CP4-pat基因表達載體，用HindIII和KpnI對之前構(gòu)建好的pCambia1300-p35S-G10進行雙酶切，回收獲得載體；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI啟動子的質(zhì)粒，獲得pUBI片段；用BamHI和KpnI對含有人工合成的CP4-pat基因及其終止子的質(zhì)粒，回收得到CP4-pat片段。然后，把上述酶切后的載體和兩個片段進行三段連接，獲得終載體。獲得的T-DNA結(jié)構(gòu)為：“啟動子-融合基因-終止子-啟動子-G10EPSPS-終止子”。這個載體命名為：pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174(圖2)。

最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把上述2個T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。

實施例2、水稻的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌，龔祖塤(1998)生命科學10：125-131；劉凡等(2003)分子植物育種1：108-115)。選取成熟飽滿的“秀水-134”種子去殼，誘導產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。分別取實施例1中構(gòu)建的載體pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-PAT–p35S-1174的農(nóng)桿菌劃板。挑單菌落接種，準備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入OD為0.6左右的農(nóng)桿菌菌液中(農(nóng)桿菌菌液的制備：將農(nóng)桿菌接種至培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至OD為0.6左右；培養(yǎng)基組成：3g/L K₂HPO₄、1g/LNaH₂PO₄、1g/LNH₄Cl、0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl₂、0.0025g/L FeSO₄·7H₂O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶劑為水，pH＝5.8)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培養(yǎng)2-3天。用無菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃篩選培養(yǎng)兩個月(中間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預分化培養(yǎng)基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上，28℃培養(yǎng)20天左右，然后將預分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基上，每天14小時光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，選擇產(chǎn)量高、種子大或者生物量高等能夠提高水稻產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因株系，培育新品種。分別獲得含上述轉(zhuǎn)化載體和只含有篩選標記基因EPSPS的空載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株。

實施例3、融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻可以抗草銨膦

將實施例2方法制備的轉(zhuǎn)基因水稻植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因水稻植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“秀水-134”的抗除草劑性能進行比較分析。我們對獲得的128個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和155個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草銨膦抗性測定，抗性效果如表1所示：

表1*：

*注：表一為對播種后15天的水稻植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草銨膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為保試達-18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:150稀釋，2x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:75稀釋，3x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:50稀釋。

實施例4、融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻可以抗草甘膦

將實施例2方法制備的轉(zhuǎn)基因水稻植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因水稻植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株“秀水-134”的抗除草劑性能進行比較分析。我們對獲得的128個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和155個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表2所示：

表2*：

*注：表一為對播種后15天的水稻植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草甘膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:300稀釋，2x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:150稀釋，3x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:100稀釋。

實施例5、融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻可以抗草甘膦草銨膦復配除草劑

將實施例2方法制備的轉(zhuǎn)基因水稻植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因水稻植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株的抗除草劑性能進行比較分析。我們對獲得的128個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和155個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦草銨膦混配除草劑抗性測定，抗性效果如表3所示：

表3*：

*注：表一為對播種后15天的水稻植株噴施不同濃度草甘膦草銨膦復配除草劑進行抗性檢測。噴施草甘膦草銨膦復配除草劑10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“秀水-134”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:300稀釋，2x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:150稀釋，3x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:100稀釋。

實施例6、玉米的轉(zhuǎn)化

玉米的轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)比較成熟。參考文獻如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediated transformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小為1.0-1.5mm)。將實施例1中制備的含有T-DNA載pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174的農(nóng)桿菌與未成熟胚在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma 7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培養(yǎng)2-3天(22℃)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導培養(yǎng)基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO₃+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培養(yǎng)10-14天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基(與愈傷誘導培養(yǎng)基相同)上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮含草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培養(yǎng)10-14天，每皿一個株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)10-14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全。分別獲得含轉(zhuǎn)化載體pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174的轉(zhuǎn)基因玉米植株。

實施例7、融合蛋白轉(zhuǎn)基因玉米可以抗草銨膦

將實施例6制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株的T0代植株移栽到溫室中，用商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)的花粉進行授粉，收獲T0代種子。然后將這些品系與商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)進行回交轉(zhuǎn)育，獲得Z58近等位基因系。再對這些近等位基因系的除草劑抗性進行比較分析。

我們對獲得的66個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和49個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表4所示：

表4*：

*注：表一為對3葉1心期的玉米植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草銨膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“Z58”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為保試達-18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:150稀釋，2x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:75稀釋，3x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:50稀釋。

實施例8、融合蛋白轉(zhuǎn)基因玉米可以抗草甘膦

將實施例6制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株的T0代植株移栽到溫室中，用商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)的花粉進行授粉，收獲T0代種子。然后將這些品系與商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)進行回交轉(zhuǎn)育，獲得Z58近等位基因系。再對這些近等位基因系的除草劑抗性進行比較分析。

我們對獲得的66個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和49個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表5所示：

表5*：

*注：表一為對3葉1心期的玉米植株噴施不同濃度草甘膦進行抗性檢測。。噴施草甘膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“Z58”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:300稀釋，2x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:150稀釋，3x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:100稀釋。

實施例9、融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻可以抗草甘膦草銨膦復配除草劑

將實施例6制備的轉(zhuǎn)基因玉米植株的T0代植株移栽到溫室中，用商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)的花粉進行授粉，收獲T0代種子。然后將這些品系與商業(yè)化品種“鄭丹958”的母本，“鄭58”(Z58)進行回交轉(zhuǎn)育，獲得Z58近等位基因系。再對這些近等位基因系的除草劑抗性進行比較分析。

我們對獲得的66個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和49個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦草銨膦混配除草劑抗性測定，抗性效果如表6所示：

表6*：

*注：表一為對3葉1心期的玉米植株噴施不同濃度草甘膦草銨膦復配除草劑進行抗性檢測。噴施草甘膦草銨膦復配除草劑10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“Z58”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:300稀釋，2x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:150稀釋，3x35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:100稀釋。

實施例10.大豆轉(zhuǎn)化

這里使用的獲得轉(zhuǎn)基因大豆的步驟來自于已有的技術(shù)(Deng et al.,1998,Plant Physiology Communications 34:381-387；Ma et al.,2008,Scientia AgriculturaSinica 41:661-668；Zhou et al.,2001,Journal of Northeast Agricultural University 32:313-319)。選取健康、飽滿、成熟的“天隆1號”大豆，用80％乙醇消毒2分鐘，再用無菌水清洗，然后放置在充滿氯氣(由50mlNaClO與2ml濃HCl反應生成)的干燥器中滅菌4-6個小時。滅菌后的大豆在超凈工作臺里被播撒到B5培養(yǎng)基中，25℃條件下培養(yǎng)5天，同時光密度在90-150μmol光子/m²·s水平。當子葉變綠并頂破種皮，無菌的豆芽就會長出。去掉了下胚軸的豆芽在長度上被切成五五開，使得兩片外植體都具有子葉和上胚軸。在子葉和上胚軸的節(jié)點處切外植體大約7-8處，即可用作被侵染的目標組織。

分別含有載體pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174的單克隆農(nóng)桿菌被分開培養(yǎng)待用。準備好的外植體浸沒在農(nóng)桿菌懸浮液中共培養(yǎng)30分鐘左右。然后，將侵染的組織上多余的細胞懸浮液用吸水紙吸收干凈，再轉(zhuǎn)移到1/10B5共培養(yǎng)培養(yǎng)基里25℃暗培養(yǎng)3-5天。

共培養(yǎng)的植物組織用B5液體培養(yǎng)基清洗，以除去多余的農(nóng)桿菌，然后放置到B5固體培養(yǎng)基中25℃下培養(yǎng)5天，待其發(fā)芽。誘導發(fā)生的胚芽組織轉(zhuǎn)移到含有0.1-0.5mM草甘膦的B5篩選培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)4周，期間每兩周更換一次培養(yǎng)基。篩選出來的胚芽組織再轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)，待其長成小苗。隨后，將轉(zhuǎn)基因植株苗轉(zhuǎn)移到1/2B5培養(yǎng)基中進行生根誘導。最后，長成的小植株經(jīng)清洗去除瓊脂后栽種在溫室中。

實施例11、融合蛋白轉(zhuǎn)基因大豆可以抗草銨膦

將實施例10方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株的抗除草劑性能進行比較分析。我們對獲得的55個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和42個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草銨膦抗性測定，抗性效果如表7所示：

表7*：

*注：表一為對播種后20天的大豆植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草銨膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“天隆1號”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為保試達-18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:150稀釋，2x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:75稀釋，3x為保試達18％草銨膦(德國拜耳)按體積比1:50稀釋。

實施例12、融合蛋白轉(zhuǎn)基因大豆可以抗草甘膦

將實施例10方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株的抗除草劑性能進行比較分析。我們對獲得的128個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和155個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦抗性測定，抗性效果如表8所示：

表8*：

*注：表一為對播種后20天的大豆植株噴施不同濃度草銨膦進行抗性檢測。噴施草甘膦10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“天隆1號”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:300稀釋，2x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:150稀釋，3x為農(nóng)達-41％草甘膦(美國孟山都)按體積比1:100稀釋。

實施例13、融合蛋白轉(zhuǎn)基因大豆可以抗草甘膦草銨膦復配除草劑

將實施例10方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆植株的T0代植株移栽到溫室中，對轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因受體對照植株的抗除草劑性能進行比較分析。我們對獲得的128個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為BG)和155個轉(zhuǎn)pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174載體的轉(zhuǎn)基因株系(命名為GC)進行不同濃度草甘膦草銨膦混配除草劑抗性測定，抗性效果如表9所示：

表9*：

*注：表一為對播種后20天的大豆植株噴施不同濃度草甘膦草銨膦復配除草劑進行抗性檢測。噴施草甘膦草銨膦復配除草劑10天后株高、葉片數(shù)目和生長勢與噴施空白對照的植株“天隆1號”沒有顯著差異的株系為抗性轉(zhuǎn)化事件。1x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:300稀釋，2x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:150稀釋，3x為35％草銨膦.草甘膦銨鹽水劑(新安化工)按體積比1:100稀釋。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。