本發(fā)明屬于分子生物學和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻基因OsAPM1及其在提高水稻耐干旱及高溫脅迫能力方面的應用，包括水稻基因OsAPM1的基因克隆、轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因及表達檢測等。

背景技術(shù)：

水稻是全球最重要的糧食作物之一，我國水稻的種植面積約占糧食作物總面積的1/3，產(chǎn)量接近糧食總產(chǎn)量的一半。作為喜溫喜濕作物，水稻對水分和溫度的要求很高。在生長發(fā)育周期中，如果遭受嚴重干旱脅迫（Wade et al., 1999; Bray et al., 2000; Bernier et al., 2008）或是高溫脅迫（Peng et al., 2004; Shah et al., 2011; Shrivastava et al., 2012），水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)都會發(fā)生下降。近年來，隨著社會發(fā)展帶來用水量劇增以及全球氣候變暖的影響，干旱影響的地區(qū)越來越廣。夏秋兩季的高溫干旱天氣嚴重危害了水稻的產(chǎn)量。有研究表明，至1961年以來全球最高氣溫升高了3-4 ℃，而受此影響水稻產(chǎn)量下降了15-35%（Ortiz et al., 2008; Bita and Gerats, 2013）。

我國作為最大水稻種植及食用的國家，開展培育節(jié)水抗旱、耐高溫、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新品種的工作具有非常強的現(xiàn)實意義。研究水稻應對干旱及高溫的生理機制，將抗旱、耐高溫的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良水稻品種中，改良水稻的抗旱性以及耐高溫能力，是培育水稻抗逆新品種的途徑之一。本研究通過分析干旱下水稻生殖發(fā)育期基因芯片的方法篩選到了多個干旱誘導基因，OsAPM1就是其中之一。

OsAPM1定位于細胞膜上，由173個氨基酸組成，與小麥的PM19蛋白有序列同源性。PM19最早是在冷處理過的小麥懸浮細胞中發(fā)現(xiàn)的，受ABA、冷誘導表達（Koike et al.,1997），而它的功能并不清楚（Julia et al.,2002）。本研究發(fā)現(xiàn)水稻中OsAPM1的表達受干旱、高溫、高鹽誘導，通過人為地增加該基因在水稻中的表達量，可以增強水稻的耐旱和耐高溫能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于改造水稻抗旱及抗高溫特性的膜蛋白基因OsAPM1，該基因具有增強植物抗逆性的作用。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)入水稻等糧食作物中，篩選過表達株系，可以得到抗旱和抗高溫能力增強的作物。

本發(fā)明中提供的水稻OsAPM1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA全長858bp，無內(nèi)含子，開放閱讀框為522bp（黑體標注）。OsAPM1基因的編碼區(qū)序列長522bp，如SEQ ID NO.2所示；OsAPM1基因編碼173個氨基酸，如SEQ ID NO.3所示。

根據(jù)本發(fā)明提供的引物序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，可以從水稻總cDNA中擴增膜蛋白基因OsAPM1的cDNA全長，引物序列：

上游引物（BamHI）：TACGGATCCACGAGATGGCCGGAGTAGGGAG（SEQ ID NO.4）；

下游引物（SacI）：ACTACGAGCTCCCGGTGTGTCGGGGTCAAATT（SEQ ID NO.5）。

根據(jù)本發(fā)明提供的引物序列SEQ ID NO.6- SEQ ID NO.9，可以從水稻總cDNA中擴增膜蛋白基因OsAPM1所具有的特異性最強的片段（如SEQ ID NO.1所示），用于構(gòu)建RNAi-OsAPM1，引物序列：

正向上游引物（NcoIBamHI）：CATGCCATGGGGATCCCTGCTCTACGTCGCCATGC（SEQ ID NO.6）；

正向下游引物（KpnI）：GGGGTACCCGGTACATACATATGATTACGAACG

（SEQ ID NO.7）；

反向上游引物（SpeI）：GGACTAGTCTGCTCTACGTCGCCATGC（SEQ ID NO.8）；

反向下游引物（HindIII）：CCCAAGCTTCGGTACATACATATGATTACGAACG

（SEQ ID NO.9）。

本發(fā)明還提供含上述水稻OsAPM1基因的載體。

本發(fā)明還提供含上述水稻OsAPM1基因載體的宿主。優(yōu)選地，所述宿主為單子葉糧食作物，更優(yōu)選地，所述宿主為水稻。

本發(fā)明還提供上述水稻OsAPM1基因在提高水稻耐干旱及高溫脅迫能力方面的應用，以提高干旱脅迫下水稻的成活率以及結(jié)實率，從而提高水稻產(chǎn)量。具體是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將編碼OsAPM1的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入水稻中，以改變水稻抗逆性的方法，具體操作步驟如下：

（1）將水稻OsAPM1的全長cDNA連入植物過表達載體（如pCAMBIA1301ubi）中，獲得含OsAPM1基因的植物過表達載體；

（2）將含OsAPM1基因的植物過表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，將鑒定為陽性的農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、分化等植物組織培養(yǎng)實驗，獲得過表達OsAPM1的轉(zhuǎn)基因水稻。

所得的陽性轉(zhuǎn)基因水稻較野生型具有更強的耐旱和耐高溫能力。

本發(fā)明還提供干擾內(nèi)源OsAPM1基因表達的方法，具體為：將OsAPM1特異性最強的片段以正反雙向形式和一段無功能的序列連接，然后連入植物表達載體中，獲得RNAi-OsAPM1的植物表達載體。然后通過轉(zhuǎn)基因手段獲得RNAi-OsAPM1的轉(zhuǎn)基因水稻。

本發(fā)明還提供利用熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻中OsAPM1表達量的方法，具體步驟為：在液氮中研磨水稻葉片后，用TRIzol法抽提水稻總RNA，用DNaseI消化DNA雜質(zhì)后，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板通過熒光定量PCR進行分析，以野生型為對照。熒光定量PCR所需的引物序列為：

上游引物：GGAGTAGGGAGGACGATGAT（SEQ ID NO.10）

下游引物：CCGTTGATGTAGTGGTTGAGAT（SEQ ID NO.11）。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點及意義：

（1）本發(fā)明提供的水稻OsAPM1基因及其編碼蛋白在提高植物抗旱性方面具有明顯的作用，能夠明顯降低農(nóng)作物在干旱、半干旱環(huán)境下的產(chǎn)量損失，具有很大的應用價值；

（2）利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到改良的水稻OsAPM1基因的過表達株系在高溫脅迫條件下，生長、生存狀況明顯優(yōu)于野生型，表明水稻OsAPM1基因能夠明顯提高植物的抗逆性，穩(wěn)定干旱、高溫天氣下的糧食作物產(chǎn)量；

（3）利用轉(zhuǎn)基因手段將OsAPM1轉(zhuǎn)入其他農(nóng)作物，例如小麥、玉米、大豆等，可得到的耐旱及耐熱性增強的作物。

附圖說明

圖1 干旱脅迫條件下水稻OsAPM1在穎花中的表達情況。其中2-3mm、3-4mm、4-5mm、5-7mm分別表示所取水稻穎花的長度。

圖2 干旱脅迫條件下水稻OsAPM1在水稻各組織中的表達情況。

圖3 各非生物脅迫下水稻OsAPM1在水稻葉片中的表達情況。

圖4 過表達OsAPM1轉(zhuǎn)基因植株DNA水平的鑒定。圖中所示，陰性對照為水稻日本晴，陽性對照為過表達質(zhì)粒，1、2、4、11、12、13、14、15、20均為過表達OsAPM1的轉(zhuǎn)基因水稻株系。

圖5 過表達OsAPM1轉(zhuǎn)基因植株RNA水平的鑒定。其中，WT為水稻日本晴，OE-2、OE-13、OE-14、OE-15均為過表達OsAPM1的轉(zhuǎn)基因水稻株系。

圖6 RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株DNA水平的鑒定。圖中所示，陰性對照為水稻日本晴，陽性對照為RNAi-OsAPM1質(zhì)粒，1、2、3、4、5、6、10、11、12、13均為RNA干擾株系。

圖7 RNAi-OsAPM1轉(zhuǎn)基因植株RNA水平的鑒定。其中，WT為水稻日本晴，RNAi-1、RNAi-3、RNAi-4、RNAi-12均為RNA干擾株系。

圖8 水稻苗期在不同脅迫處理（氯化鈉、甘露醇）培養(yǎng)基上的生長情況。WT為水稻日本晴，OE-2、OE-13、OE-14為過表達轉(zhuǎn)基因株系，RNAi-1、RNAi-3、RNAi-12為RNA干擾株系。

圖9 水稻營養(yǎng)期遭受干旱脅迫后OsAPM1過表達株系與野生型生長情況對比。

圖10 水稻營養(yǎng)期遭受干旱脅迫后RNA干擾株系與野生型生長情況對比

圖11 水稻苗期在高溫脅迫條件下的生長情況。WT為水稻日本晴，OE-2、OE-14為過表達轉(zhuǎn)基因株系，RNAi-1、RNAi-3、RNAi-12為RNA干擾株系。

圖12 水稻生殖期遭受干旱脅迫后，過表達、RNAi及野生型植株穗的生長狀態(tài)和產(chǎn)量對比。WT為水稻日本晴，OE-2、OE-13、OE-14為過表達轉(zhuǎn)基因株系，RNAi-1、RNAi-3、RNAi-12為RNA干擾株系。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法均按照常規(guī)條件，例如Sambrook等著的《分子克隆》實驗手冊，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1

干旱處理后OsAPM1在生殖發(fā)育期水稻（日本晴）穎花中的表達變化。

1. 干旱處理

水稻（日本晴）種子催芽后，移栽到溫室的塑料盆中培養(yǎng)，在幼穗分化期進行干旱處理：當盆中土表面無水時開始斷水，待土壤水分降低到30%左右時，維持7天。然后取不同長度（2~3mm，3~4mm，4~5mm，5~7mm）的水稻穎花，分別收集并編號，以正常生長條件下的水稻穎花作對照，重復三次取樣。

2. 基因芯片分析干旱條件下OsAPM1的表達

對干旱脅迫處理的水稻穎花進行轉(zhuǎn)錄組分析（安捷倫公司），發(fā)現(xiàn)OsAPM1基因在不同樣品中均受干旱脅迫的誘導（圖1）。

實施例2

干旱處理后OsAPM1在水稻各組織中的表達變化。

1. 干旱處理

水稻（日本晴）種子催芽后，移栽到溫室的塑料桶中，至水稻苗生長至三葉期進行干旱處理：將桶中的水倒凈，待土壤水分降低到15%左右時，維持三天，取水稻葉、莖、根，同時取同期生長在正常條件下的水稻葉、莖、根作對照，分別收集并編號，重復三次取樣。

水稻（日本晴）種子催芽后，移栽到溫室的塑料桶中，至水稻苗生長至孕穗期進行干旱處理：將桶中的水倒凈，待土壤水分降低到15%左右時，維持三天，取水稻的劍葉和小穗，同時取同期生長的正常條件下的水稻劍葉和小穗作對照，分別收集并編號，重復三次取樣。

2. 通過熒光定量PCR分析干旱條件下各組織中OsAPM1的表達變化

利用TRIzol法提取步驟1中所收集的各種樣品的RNA（具體操作見TaKaRa公司TRIzol的說明書），反轉(zhuǎn)錄成cDNA（具體操作見TaKaRa公司PrimeScript^TMRT Reagent Kit的說明書），以這些cDNA為模板進行real time熒光定量分析（具體操作見TaKaRa公司SYBR○R Premix Ex Tag^TM的說明書）。然后根據(jù)—^ΔΔCT法分析干旱條件下OsAPM1基因的表達情況，以OsUBQ5為內(nèi)參基因，以正常條件下的水稻組織材料為對照；用于real time熒光定量PCR的引物為引物對1和引物對2所示：

引物對1，用于OsAPM1的組織表達分析：

上游引物：ACACACCGGCCAATCGAT（SEQ ID NO.12）

下游引物：AGCGGGAAACACAAAGTGAAG（SEQ ID NO.13）

引物對2，用于定量PCR中擴增內(nèi)參基因OsUBQ5：

上游引物：CATGGACTGGTTAAATCAATCGTCA（SEQ ID NO.14）

下游引物：TACCATATACCACGACCGTCAAAA（SEQ ID NO.15）。

結(jié)果顯示干旱處理后OsAPM1在水稻葉、莖、根、小穗、劍葉中的表達水平都明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)多達1000倍（圖2）。該實驗進一步說明OsAPM1在水稻中受干旱脅迫誘導表達。

實施例3

各種脅迫處理后OsAPM1在水稻葉片中的表達變化。

1. 干旱處理同實施例2，同時用水培苗進行鹽處理及甘露醇處理

將剛剛露白的水稻（日本晴）放入底部有孔的96孔板中，每一個孔放入一粒種子，然后放在盛有水稻營養(yǎng)液（木村B）的槍頭盒中培養(yǎng)，28℃光照培養(yǎng)（16小時光照/8小時黑暗），當水稻苗生長至三葉期時開始進行不同脅迫處理。分別用20% PEG處理24h、200mM NaCl處理24h、50μM ABA處理12h、45℃處理4h、0℃處理4h，處理結(jié)束后取水稻的葉片收集、編號，同時取同時期生長的正常條件下的水稻葉片作對照，重復三次取樣。

2. 通過熒光定量PCR分析各脅迫處理后水稻葉片中OsAPM1的表達變化

詳細操作步驟如實施例2中“通過熒光定量PCR分析干旱條件下各組織中OsAPM1的表達變化”所述。結(jié)果顯示：除冷脅迫處理（0℃）外，干旱、高溫、高鹽這些非生物脅迫均可以誘導OsAPM1在水稻葉片中的表達，上調(diào)倍數(shù)多達1000倍（圖3），說明OsAPM1在水稻中受干旱、高溫、高鹽脅迫誘導表達。其中用于real time熒光定量PCR的引物如實施例2中的引物對1（SEQ ID NO.12-13）和引物對2（SEQ ID NO.14-15）所示。

實施例4

水稻OsAPM1基因cDNA片段的克隆及序列分析。

以干旱處理過的水稻花為材料，利用TRIzol法提取RNA（具體操作見TaKaRa公司TRIzol的說明書），經(jīng)DNaseI處理后除去DNA（具體操作見TaKaRa公司DNase I的說明書），反轉(zhuǎn)錄成cDNA（具體操作見TaKaRa公司PrimeScript^TM Reverse Transcriptase的說明書）。根據(jù)GenBank中水稻數(shù)據(jù)庫信息中提供的序列信息，設計引物SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5，采用RT-PCR方法，以上述反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板進行cDNA全長克隆。通過RT-PCR得到一個包含有完整開放閱讀框的編碼區(qū)片段，長度為522bp，將其連接到PCR-Blunt載體上，進行測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST分析，得到的序列與基因組測序結(jié)果完全一致，我們將其命名為OsAPM1。該基因與玉米基因LOC100279493的核酸序列相似性為51%，與大麥基因AK249210.1序列相似性為43%，與已知的小麥基因TAU80037序列相似性為47%。根據(jù)其序列進行結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，OsAPM1蛋白含有一個AWPM-19結(jié)構(gòu)域。

OsAPM1全長編碼區(qū)的長度為522bp，其序列為SEQ ID NO.2。根據(jù)全長cDNA推導出水稻OsAPM1的氨基酸序列，共173個氨基酸殘基，分子量為18055.1道爾頓，等電點（pI）為9.50，其序列為SEQ ID NO.3。預測顯示此蛋白為四次跨膜的小分子蛋白質(zhì)。

實施例5

在水稻中過表達OsAPM1基因，獲得過表達轉(zhuǎn)基因水稻。

1. 水稻OsAPM1基因的過表達載體構(gòu)建：

在實施例4中獲得連有OsAPM1基因全長序列的中間載體PCR-Blunt，用連入的酶切位點（本例為BamHI、SacI）將OsAPM1基因全長酶切下來，然后連入到過表達載體pCAMBIA1301ubi上，測序，在保證閱讀框架正確的前提下將該過表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并轉(zhuǎn)化模式植物水稻（日本晴）。

2. 農(nóng)桿菌介導法進行水稻轉(zhuǎn)基因：

A．誘導愈傷組織

1）選取成熟飽滿的水稻種子，去掉內(nèi)外穎，用純凈水洗2次，再用70%乙醇浸泡2min，用純凈水洗5次，用50%的次氯酸鈉消毒25min，100rpm；

2）在超凈臺中棄去次氯酸鈉，用無菌水洗滌5次，在干凈無菌的濾紙上吸干水分，置于N6D固體培養(yǎng)基上，胚朝下并接觸培養(yǎng)基，28℃，黑暗條件下培養(yǎng)25天。每個組培瓶中培養(yǎng)約13粒種子。

B．繼代培養(yǎng)

將愈傷在干凈濾紙上晾一下，轉(zhuǎn)移至N6D繼代培養(yǎng)基上，28℃，暗培養(yǎng)7天。

C．前培養(yǎng)

將繼代結(jié)束的愈傷轉(zhuǎn)移至前培養(yǎng)基上，28℃，暗培養(yǎng)3天。

D．農(nóng)桿菌EHA105的培養(yǎng)

將步驟1中得到的含過表達載體的農(nóng)桿菌菌液涂布于DYT三抗平板（鏈霉素、利福平和卡那霉素）上，28℃，暗培養(yǎng)約36小時。

E．侵染與共培養(yǎng)

1）將前培養(yǎng)后的愈傷在無菌濾紙上晾一下，并集中轉(zhuǎn)移至平板中；

2）取滅菌小勺刮取步驟D培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌4勺于感染用的液體培養(yǎng)基中，攪拌至懸浮均勻，使OD600約為0.5；

3）將愈傷轉(zhuǎn)至離心管中，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混勻，靜置20min；

4）將菌液倒出，愈傷置于無菌濾紙上吹干約1.5小時以上，保證愈傷吸干，接至共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，20℃，暗培養(yǎng)2天。

F．除菌

1）將共培養(yǎng)結(jié)束的愈傷轉(zhuǎn)移至50mL的離心管，用無菌水清洗3次以上，直至液體比較清亮；

2）倒出無菌水，用含有500mg/L頭孢霉素的N6D液體培養(yǎng)基清洗，每次100rpm，15min，4次；

3）將愈傷倒在干凈滅菌濾紙上，吹干2小時以上，保證吸干；

4）將干燥的愈傷轉(zhuǎn)至除菌固體培養(yǎng)基上，28℃，暗培養(yǎng)，7天。

G．篩選

將沒有被農(nóng)桿菌污染的愈傷轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基（N6D+50mg/L潮霉素B+250mg/L頭孢霉素）上，28℃，暗培養(yǎng)。每18天可以更換一次培養(yǎng)基，篩選時間不得多于30天。

H．分化

將經(jīng)過篩選新長出來的愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基（MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L KT+0.2mg/L IAA+ 50mg/L潮霉素+250mg/L頭孢霉素）上，28℃，光培養(yǎng)（16小時光照/8小時黑暗），直至分化出轉(zhuǎn)基因苗，定期更換培養(yǎng)基。

I．生根

將分化出來的轉(zhuǎn)基因苗（一般高于1cm），剝除多余的愈傷組織，剪去根（留約0.3cm）后，移至1/2MS培養(yǎng)基中生根。28℃，光培養(yǎng)（16小時光照/8小時黑暗），直至生根完全。

J．煉苗與移栽

生根結(jié)束后，除去生根培養(yǎng)基，將水稻苗浸泡于水中進行煉苗，約三天左右，然后移栽入土中生長。

3. 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

剪取轉(zhuǎn)基因水稻葉片，根據(jù)CTAB法提取水稻葉片DNA，PCR檢測潮霉素基因，共檢測了9個株系，其中株系20為陰性（圖4），用于檢測潮霉素基因存在與否的引物序列如下：

上游引物：CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC（SEQ ID NO.16）

下游引物：CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG（SEQ ID NO.17）

選取潮霉素陽性轉(zhuǎn)基因株系2、13、14、15用TRIzol法抽取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA（方法同實施例2），根據(jù)基因序列設計引物（如SEQ ID NO.10- SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14- SEQ ID NO.15）進行熒光定量PCR，根據(jù)—^ΔΔCT法分析轉(zhuǎn)基因水稻中OsAPM1基因的表達情況（圖5），具體操作按照TaKaRa公司試劑盒（SYBR○R Premix Ex Tag^TM）說明操作，熒光定量PCR儀為ABI Step one plus^TM。

實施例6

抑制水稻OsAPM1基因的體內(nèi)表達，得到RNA干擾株系。

1.水稻RNAi- OsAPM1表達載體構(gòu)建：

根據(jù)基因OsAPM1的cDNA序列設計引物（如SEQ ID NO.6- SEQ ID NO.9所示），用PCR擴增的方式得到區(qū)別于其他基因特異性最強的片段（如SEQ ID NO.1所示）用于構(gòu)建RNAi-OsAPM1表達載體。在保證載體正確的前提下將該基因沉默的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并轉(zhuǎn)化模式植物水稻日本晴。

2. 農(nóng)桿菌介導法進行水稻轉(zhuǎn)基因：

具體操作如實施例5中的2所述。

3. 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

剪取轉(zhuǎn)基因水稻葉片，根據(jù)CTAB法提取水稻葉片DNA，通過PCR檢測潮霉素基因來鑒定轉(zhuǎn)基因情況，共檢測10個株系，其中株系10、11為陰性（圖6），引物序列如SEQ ID NO.16- SEQ ID NO.17所示。

選取潮霉素陽性轉(zhuǎn)基因株系1、3、4、12用TRIzol法抽取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA（方法同實施例2），根據(jù)基因序列設計引物（如SEQ ID NO.10- SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14- SEQ ID NO.15所示）進行熒光定量PCR，根據(jù)—^ΔΔCT法分析轉(zhuǎn)基因水稻中OsAPM1基因的表達情況（圖7）。

實施例7

OsAPM1過表達株系及RNA干擾株系的抗逆性鑒定。

芯片分析及定量PCR的結(jié)果均顯示干旱、高溫、高鹽等脅迫條件都能夠誘導OsAPM1基因的大量表達。因此對OsAPM1基因的過表達及RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系在苗期和生殖生長期進行脅迫處理，觀察它們的抗逆性（包括但不限于抗旱、抗鹽、抗高溫等）。

1. 苗期脅迫處理

野生型水稻種子和轉(zhuǎn)基因水稻種子，去殼，70%酒精消毒1分鐘，50%次氯酸鈉溶液消毒20分鐘后，播種在含有1/2MS以及分別含有NaCl（200 mM）、甘露醇（5%）的1/2MS培養(yǎng)基中，28℃光照培養(yǎng)（16小時光照/8小時黑暗）12天后，測定株高。結(jié)果顯示，過表達株系在各種脅迫條件下生長狀態(tài)優(yōu)于野生型，而RNAi-OsAPM1株系的生長狀態(tài)較野生型差，說明OsAPM1基因參與了水稻抗鹽脅迫和抗?jié)B透脅迫反應（圖8）。

溫室中進行土壤（泥土 ：砂石=3 ：1）干旱實驗，每桶分別種植15棵野生型和過表達或RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系，待水稻生長到五葉期時開始斷水處理，當葉片開始卷曲（此時土壤含水量約15%）時每天均勻噴水以使土壤含水量維持在15%，10天后開始復水，復水后3天，觀察到過表達轉(zhuǎn)基因水稻滯綠及存活率高于野生型，RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系則相反，說明OsAPM1基因參與了水稻抗旱反應（圖9、10）。

把剛剛露白的水稻種子放入底部有孔的96孔板中，每一個孔放入一粒種子，然后放在盛有水稻營養(yǎng)液（木村B）的槍頭盒中培養(yǎng)，28℃光照培養(yǎng)（16小時光照/8小時黑暗），當水稻苗生長至三葉期時將水稻苗放入42℃的高溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（12小時42℃光照/12小時28℃黑暗），高溫處理5天后觀察植株表型，發(fā)現(xiàn)過表達轉(zhuǎn)基因株系葉片較野生型更綠，而RNA干擾株系則較野生型更黃（圖11），同時檢測了正常條件下及高溫處理條件下植物的丙二醛（MDA）含量及離子泄漏率，結(jié)果顯示：相比較野生型，過表達株系的丙二醛（MDA）含量及離子泄漏率都較低，而干擾株系的則較高，說明OsAPM1基因參與了水稻抗高溫反應（圖11）。

2. 水稻生殖生長期干旱處理

溫室中進行生殖生長期的干旱實驗，每桶分別種植6棵野生型和過表達或RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系，待水稻生長至幼穗分化期（七葉期）時開始斷水處理，當葉片開始卷曲（此時土壤含水量約15%）時每天均勻噴水以使土壤含水量維持在15%， 7天后復水，直至成熟，統(tǒng)計結(jié)實率。結(jié)果顯示：正常生長條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的結(jié)實率沒有明顯差別，干旱脅迫處理后各株系結(jié)實率降低，但過表達株系的下降程度低于野生型，RNA干擾株系則相反。說明OsAPM1基因參與了水稻生殖生長期的抗旱反應（圖12）。

綜上所述，OsAPM1基因參與了水稻的抗鹽、抗旱及抗高溫脅迫反應，通過過表達OsAPM1基因，可以增強植物的抗逆性。因此，OsAPM1基因在通過轉(zhuǎn)基因手段改善作物抗逆性上具有很好的應用前景。

(i) 序列特征：所列序列為OsAPM1的cDNA，長858bp，無內(nèi)含子

(ii) 分子類型：核酸

(iii) 序列及序列標記：加黑序列為OsAPM1基因開放閱讀框

1 ACTTAATCACAGTAGCTCTCAGCTAGCTAGCTAAACCAGTGCTAATTGTG 50

51 TTGCTAATTTGTGTTGATTTGTGATTTTGATACGAGATGGCCGGAGTAGG 100

101 GAGGACGATGATCGCGCCGCTGCTGGTGCTGAATCTGATCATGTACTTGA 150

151 TCGTGATCGGGTTCGCGAGCTGGAATCTCAACCACTACATCAACGGCGAG 200

201 ACCAACCACCCGGGGGTCGCCGGCAACGGCGCCACCTTCTACTTCCTCGT 250

251 CTTCGCCATCCTCGCGGGGGTGGTCGGCGCCGCCTCCAAGCTCGCCGGCG 300

301 TCCACCACGTCCGCTCCTGGGGCGCGCACAGCCTCGCCGCCGGCGCCGCG 350

351 TCGGCGCTCATCGCCTGGGCCATCACCGCGCTCGCCTTCGGCCTCGCCTG 400

401 CAAGGAGATCCACATCGGCGGCTACCGCGGGTGGCGCCTCCGCGTGCTCG 450

451 AGGCCTTCGTCATCATCCTCGCCTTCACGCAGCTGCTCTACGTCGCCATG 500

501 CTCCACGGCGGCCTCTTCTCCGGCAACCACGCCGCCGGCGCCGGCGGCTA 550

551 CGGCGGCGACTACCCCGCCGACCACCACCACAAGCCCGCCGCCGCGGCCA 600

601 GGGTCTAACTGAATTTGACCCCGACACACCGGCCAATCGATCGATGCCAT 650

651 CCATCATGCACACGACTGCCTATATATCTCGGTGTGATCGAGCTTTGATT 700

701 TTCTCGTAATTTCTTCACTTTGTGTTTCCCGCTCGTGCATTGCTGCTAGA 750

751 TGCAATGGCAATGCACGAACAACGCTGTTCATATACTCTCCGTATGTAAA 800

801 CTTCTGTTCTCTGTATCGACGTTCGTAATCATATGTATGTACCGTTTGGT 850

851 TTGGTTTT

下劃線序列為特異性最強的片段，用于構(gòu)建干擾OsAPM1表達的轉(zhuǎn)基因株系。

<110> 復旦大學

<120> 水稻基因OsAPM1及其提高水稻耐干旱及高溫脅迫能力的應用

<130> 001

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 858

<212> DNA

<213>

<400> 1

acttaatcac agtagctctc agctagctag ctaaaccagt gctaattgtg ttgctaattt 60

gtgttgattt gtgattttga tacgagatgg ccggagtagg gaggacgatg atcgcgccgc 120

tgctggtgct gaatctgatc atgtacttga tcgtgatcgg gttcgcgagc tggaatctca 180

accactacat caacggcgag accaaccacc cgggggtcgc cggcaacggc gccaccttct 240

acttcctcgt cttcgccatc ctcgcggggg tggtcggcgc cgcctccaag ctcgccggcg 300

tccaccacgt ccgctcctgg ggcgcgcaca gcctcgccgc cggcgccgcg tcggcgctca 360

tcgcctgggc catcaccgcg ctcgccttcg gcctcgcctg caaggagatc cacatcggcg 420

gctaccgcgg gtggcgcctc cgcgtgctcg aggccttcgt catcatcctc gccttcacgc 480

agctgctcta cgtcgccatg ctccacggcg gcctcttctc cggcaaccac gccgccggcg 540

ccggcggcta cggcggcgac taccccgccg accaccacca caagcccgcc gccgcggcca 600

gggtctaact gaatttgacc ccgacacacc ggccaatcga tcgatgccat ccatcatgca 660

cacgactgcc tatatatctc ggtgtgatcg agctttgatt ttctcgtaat ttcttcactt 720

tgtgtttccc gctcgtgcat tgctgctaga tgcaatggca atgcacgaac aacgctgttc 780

atatactctc cgtatgtaaa cttctgttct ctgtatcgac gttcgtaatc atatgtatgt 840

accgtttggt ttggtttt 858

<210> 2

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<212> DNA

<213>

<400> 2

atggccggag tagggaggac gatgatcgcg ccgctgctgg tgctgaatct gatcatgtac 60

ttgatcgtga tcgggttcgc gagctggaat ctcaaccact acatcaacgg cgagaccaac 120

cacccggggg tcgccggcaa cggcgccacc ttctacttcc tcgtcttcgc catcctcgcg 180

ggggtggtcg gcgccgcctc caagctcgcc ggcgtccacc acgtccgctc ctggggcgcg 240

cacagcctcg ccgccggcgc cgcgtcggcg ctcatcgcct gggccatcac cgcgctcgcc 300

ttcggcctcg cctgcaagga gatccacatc ggcggctacc gcgggtggcg cctccgcgtg 360

ctcgaggcct tcgtcatcat cctcgccttc acgcagctgc tctacgtcgc catgctccac 420

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gccgaccacc accacaagcc cgccgccgcg gccagggtct aa 522

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<212> PRT

<213>

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Met Ala Gly Val Gly Arg Thr Met Ile Ala Pro Leu Leu Val Leu Asn

1 5 10 15

Leu Ile Met Tyr Leu Ile Val Ile Gly Phe Ala Ser Trp Asn Leu Asn

20 25 30

His Tyr Ile Asn Gly Glu Thr Asn His Pro Gly Val Ala Gly Asn Gly

35 40 45

Ala Thr Phe Tyr Phe Leu Val Phe Ala Ile Leu Ala Gly Val Val Gly

50 55 60

Ala Ala Ser Lys Leu Ala Gly Val His His Val Arg Ser Trp Gly Ala

65 70 75 80

His Ser Leu Ala Ala Gly Ala Ala Ser Ala Leu Ile Ala Trp Ala Ile

85 90 95

Thr Ala Leu Ala Phe Gly Leu Ala Cys Lys Glu Ile His Ile Gly Gly

100 105 110

Tyr Arg Gly Trp Arg Leu Arg Val Leu Glu Ala Phe Val Ile Ile Leu

115 120 125

Ala Phe Thr Gln Leu Leu Tyr Val Ala Met Leu His Gly Gly Leu Phe

130 135 140

Ser Gly Asn His Ala Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Tyr Pro

145 150 155 160

Ala Asp His His His Lys Pro Ala Ala Ala Ala Arg Val

165 170

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213>

<400> 4

tacggatcca cgagatggcc ggagtaggga g 31

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213>

<400> 5

actacgagct cccggtgtgt cggggtcaaa tt 32

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213>

<400> 6

catgccatgg ggatccctgc tctacgtcgc catgc 35

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213>

<400> 7

ggggtacccg gtacatacat atgattacga acg 33

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<212> DNA

<213>

<400> 8

ggactagtct gctctacgtc gccatgc 27

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<211> 34

<212> DNA

<213>

<400> 9

cccaagcttc ggtacataca tatgattacg aacg 34

<210> 10

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<212> DNA

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<400> 10

ggagtaggga ggacgatgat 20

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<212> DNA

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ccgttgatgt agtggttgag at 22

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acacaccggc caatcgat 18

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<212> DNA

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agcgggaaac acaaagtgaa g 21

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<212> DNA

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catggactgg ttaaatcaat cgtca 25

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<212> DNA

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taccatatac cacgaccgtc aaaa 24

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cgatgtagga gggcgtggat atg 23