專利名稱：利用水稻干旱誘導(dǎo)基因啟動子leap改良植物抗旱性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及植物逆境誘導(dǎo)啟動子的克隆及其應(yīng)用。通過鑒定、克隆一個水稻干旱強烈誘導(dǎo)基因的啟動子，將其應(yīng)用于植物抗逆基因特別是用于水稻抗旱基因的遺傳轉(zhuǎn)化，達(dá)到提高水稻抗旱性的目的。
背景技術(shù)：
干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫是自然界常見的不利環(huán)境因子，它們嚴(yán)重地制約了植物生長發(fā)育。植物生長在土壤里，自身不能移動，為了抵抗或適應(yīng)這些不利的環(huán)境因子，植物自身會誘導(dǎo)表達(dá)一批應(yīng)答基因，產(chǎn)生一些使細(xì)胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及傳遞信號和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(Xiong等，Cell signaling duringcold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。盡管已有文獻(xiàn)報道從植物中分離了大量抗逆相關(guān)基因(Thomashow等，Plant cold acclimationFreezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.50571-599，1999；Shinozaki等，Molecular response to dehydration andlow temperatureDifferences and cross-talk between two stress signaling pathways.Curr.Opin.Plant Biol.3217-223，2000)和一些逆境應(yīng)答的啟動子，如SalT啟動子(Garcia等，The expression of the salt-responsive gene salT from rice is regulatedby hormonal and developmental cues，Planta 207172-180，1998)，RD29A啟動子(Yamaguchi-Shinozaki 等，Characterization of the expression of adesiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoterin transgenic plants.Mol Gen Genet.23331-340，1993；Kasuga等，A combinationof the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol.45346-350，2004)。但在重要農(nóng)作物水稻中尚未分離到受干旱強烈誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動子用于植物抗逆遺傳工程。LEA是一類胚胎發(fā)生晚期豐富表達(dá)蛋白并且受逆境誘導(dǎo)(Baker等，Sequence and characterization of 6 LEA proteins and their genes from cotton.PlantMol Biol 11277-291，1988)。許多這類基因已在大麥中被分離出來并且用于植物抗逆遺傳改良(Xu等，Expression of a late embryogenesis abundant protein gene，HVA1，frombarley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice.PlantPhysiol.110249-257，1996；Ho和Wu等，Production of water stress or salt stresstolerant transgenic cereal plants US patent，US5981842，1999)。但是很少有關(guān)于LEA基因啟動子鑒定利用的報道。
另一方面，前人關(guān)于利用逆境誘導(dǎo)基因及其啟動子提高逆植物抗逆性的實驗證據(jù)基本上是以擬南芥或煙草等模式植物為研究體系獲得的結(jié)果。這些結(jié)果能否成功地在禾谷類作物中重復(fù)還很少有報道。
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的糧食作物之一，水稻抗旱遺傳改良一直是一個難以突破的重要難題。本發(fā)明是通過鑒定一個干旱強烈誘導(dǎo)的水稻LEA基因的啟動子，將其用于調(diào)控LEA基因本身以及其它抗逆相關(guān)基因在水稻中的表達(dá)，顯著地提高了水稻的抗旱性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆、鑒定一個干旱強烈誘導(dǎo)表達(dá)的植物內(nèi)源啟動子，并利用該啟動子構(gòu)建抗旱相關(guān)基因表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化方法達(dá)到提高植物的抗逆性，例如利用該克隆的抗旱啟動子基因培育抗旱型的水稻品種。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實施首先是分離干旱強烈誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子。所提供的干旱強烈誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子來源于水稻。該啟動子控制的水稻內(nèi)源基因為編碼胚胎發(fā)生后期豐富蛋白(late embryogenesisabundant protein，LEA)家族的一個成員，被命名為OsLEA1，故該啟動子命名為LEAP(LEAPromoter)。OsLEA1能被干旱、高鹽脅迫、冷害以及脫落酸(ABA)誘導(dǎo)(如附圖2所示)。LEAP啟動子是具有序列表SEQ ID NO1中堿基第1-1180位的序列或含有兩個串連排列的ABRE順式元件的序列。LEAP啟動子控制的LEA基因是具有序列表SEQ ID NO1中堿基第1288-1291位的編碼序列或含有與編碼的蛋白質(zhì)同源性至少在80％以上具有相同功能的序列。
本發(fā)明所提供的LEAP啟動子區(qū)域含有兩個ABRE順式作用元件(如附圖1所示)，能特異性地對干旱和ABA起應(yīng)答反應(yīng)。申請人利用LEAP啟動子構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)載體(如附圖3所示)可以在植物受到干旱脅迫時強烈地誘導(dǎo)報告基因GUS的表達(dá)(如附圖4所示)。
利用本發(fā)明所提供的LEAP啟動子構(gòu)建了抗逆基因OsLEA1的表達(dá)載體，并通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法將該基因?qū)胨臼荏w中，對改良水稻的耐旱性有顯著的效果(本發(fā)明的效果詳見具體實施方式
，如實施例1中的表1)。
詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述一種分離出的水稻DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中OsLEA1基因及其啟動子LEAP包含序列表SEQ ID NO1所示的序列中的2155位堿基的核酸序列，該核酸序列編碼一個干旱誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。
所述的一種分離的DNA分子，其特征在于啟動區(qū)包含兩個串連排列的ABRE順式作用元件TACGTGTC。
所述的LEAP啟動子全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
所述的LEAP啟動子全部或部分序列構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化培育抗旱植物的方法。
所述的LEAP啟動子全部或部分序列構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化培育的抗旱植物材料。所述的抗旱植物的材料是指植株、種子或細(xì)胞無性系。
所述的OsLEA1基因，其特征在于，序列表SEQ ID NO1所示的序列的堿基第1288-1291位及其同原性在90％以上，且能被干旱誘導(dǎo)的同源基因。所述的LEA基因，通過遺傳轉(zhuǎn)化培育獲得抗旱植物的方法。利用該方法培育獲得抗旱植物材料，其中的植物材料包括植株、種子或細(xì)胞無性系。
按照以上的技術(shù)方案，很顯然，申請人或申請人以外的其他人可以利用本發(fā)明所提供的LEAP啟動子構(gòu)建抗旱相關(guān)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物以提高植物的抗旱性。受體植物主要是包括水稻、小麥、玉米等在內(nèi)的禾谷類作物，當(dāng)然也包括其他一些重要的經(jīng)濟(jì)作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄作物上的應(yīng)用。


序列表SEQ ID NO1，公開了本發(fā)明克隆的包含啟動子序列LEAP的水稻OsLEA1抗旱基因序列全長和引物的序列。
圖1顯示的是OsLEA1基因啟動子區(qū)順式作用元件。斜體標(biāo)注序列為開放閱讀框(ORF)；兩個ABRE元件序列用黑色并加文本框表示；陰影顯示的是基本啟動子元件序列。雙下劃線序列為擴(kuò)增OsLEA1基因所用的引物序列；單下劃線序列為擴(kuò)增OsLEA1基因啟動子所用的引物序列。
圖2顯示的是OsLEA1基因能被多種逆境(干旱、冷害、200mM/L NaCl，100μM/L ABA)誘導(dǎo)表達(dá)。
圖3表示1391Z-OsLEAP表達(dá)載體。該載體含潮霉素(HRG)抗性篩選基因，啟動子OsLEAP被融合到GUS基因5’端非翻譯區(qū)。
圖4顯示的是啟動子OsLEAP控制下的GUS基因在不同脅迫處理下誘導(dǎo)表達(dá)的活性。OsLEAP-GUS融合基因的水稻轉(zhuǎn)化愈傷分別用高鹽(200mM/L NaCl)，ABA(100μM/L)或干旱進(jìn)行處理后，按圖中標(biāo)注的時間點取樣定量測定GUS活性。
具體實施例方式
實施例1、LEAP啟動子分離和鑒定通過水稻品種“中旱5號”(由中國上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的商業(yè)品種)的干旱誘導(dǎo)基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個受干旱強烈誘導(dǎo)(干旱脅迫后期表達(dá)量提高12倍以上)的EST(表達(dá)序列簽)，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該EST為一個LEA蛋白基因的3’端部分序列。為分離該基因的啟動子，首先是分離該基因的全長cDNA。具體步驟如下以該EST的3’端序列設(shè)計了基因特異引物P15’-ACACCCGTCAGAAA(互補序列)。采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫處理的水稻品種“中旱5號”中提取葉片總RNA(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用試劑盒(購自Invitrogen公司)分離完整mRNA后用引物P4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件是72℃ 2min，42℃ 60min，65℃5min。然后通過5’端接頭的巢式引物1(5’GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG，此為GeneRacer試劑盒提供的載體上的序列)和巢式引物2(5’CGCTACGTAACGGCATGACAGATG，同樣為GeneRacer試劑盒提供的載體上的序列)分別與引物P1進(jìn)行連續(xù)兩輪PCR反應(yīng)(DNA聚合酶，TaKaRa LA)。兩輪PCR反應(yīng)條件均是94℃預(yù)變性5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。將巢式引物2與引物P1擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，綜合多個陽性克隆的測序結(jié)果，得到了目標(biāo)基因5端完整的非翻譯區(qū)序列(5’UTR)和部分編碼序列。根據(jù)5’-UTR和3’-UTR序列進(jìn)而設(shè)計擴(kuò)增全長靶cDNA的引物P2(5-AAGCTTAGGATCAATGGCTT)’和引物P3(5-AAACCACAAATGCGGGCTTT，互補序列)。以干旱脅迫處理水稻品種“中旱5號”的苗期葉片3天，其技術(shù)指標(biāo)是被處理后的水稻葉片全卷，經(jīng)測定葉片的相對含水量為70％)，從處理后的水稻品種“中旱5號”的苗期葉片提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序證實為目標(biāo)基因全長cDNA(該序列見序列表SEQ ID NO1所示)。
在已知該基因全長cDNA的基礎(chǔ)上，下一步就是分離控制該基因的啟動子。根據(jù)全長cDNA序列在GeneBank中找到了對應(yīng)的粳稻“日本晴”的基因組序列(GenBank登錄號為AC104713)并選取該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游2Kb的范圍作為候選啟動子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，設(shè)計了兩對引物P4(5’TCCAAGCTTAGGGCCTCCATAACCTACG)和P5(TCGGGATCCACGCGCGAATGTTAGAACTC)。斜體下劃線分別表示添加的限制性酶切位點。首先利用引物P4和P5以中旱5號基因組DNA(CTAB法抽提，Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，TheorAppl Genet，83，495-499)為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1mim，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳挖膠回收后連入pGEM-T Easy載體上，篩選陽性克隆并測序(ABI3730，上海國家基因測序中心)，結(jié)果證實PCR產(chǎn)物含有兩個與逆境脅迫(干旱、高鹽、ABA等)應(yīng)答的串聯(lián)排列的ABRE順式作用元件(Leung等Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1998，49199-222)，分別位于序列表中核苷酸位1087-1095(TACGTGGC)和核苷酸位1120-1127(TACGTGTC)。LEAP啟動子序列和包含的ABRE順式元件如圖1所示。
實施例2、檢測水稻內(nèi)源基因OsLEA1的誘導(dǎo)表達(dá)以水稻品種“明恢63”(一種中國普遍推廣的水稻品種)為材料，在3葉期分別進(jìn)行干旱、冷害和高鹽脅迫以及ABA處理。干旱處理是用20％的聚乙二醇(商品名PEG6000)浸泡幼苗根部并每天中午取一次樣，連續(xù)取5天。冷害處理是將幼苗置于4℃生長箱，0h，1h，3h，6h，12h和24h后取樣。高鹽脅迫是將幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，1h，3h，6h，12h和24h后取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100μM/L ABA溶液中并在0h，1h，3h，6h，12h和24h后取樣。提取葉片的總RNA(Trizol試劑，Invitrogen)后按《分子克隆》(科學(xué)出版社，1999)有關(guān)實驗操作方法進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)膜，并以O(shè)sLEA1為探針做Northern雜交。結(jié)果表明，OsLEA1能被干旱、冷害、高鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)(圖2)。
實施例3、LEAP啟動子干旱誘導(dǎo)活性鑒定本發(fā)明的實施方案就是構(gòu)建LEAP啟動子的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻品種“中花11”(來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所商業(yè)品種)中定量地檢測LEAP啟動子的干旱誘導(dǎo)表達(dá)活性。具體操作如下首先將實施例1中分離的LEAP啟動子的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy載體(購自Promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購自Promega公司)并篩選陽性克隆。因為該PCR產(chǎn)物在其內(nèi)部含有一個Hind III酶切位點(PCR產(chǎn)物序列及酶切位點分布詳見說明書附圖1)，故通過HindIII、Bam H1雙酶切可將連入載體的1030bp的插入片段切成預(yù)期的兩個片段300bp(啟動子上游序列)、730bp(核心啟動子序列，含有啟動子所有基本元件和兩個ABRE順式作用因子)；然后將730bp的酶切片段連入中間表達(dá)載體p1391Z(來自CAMBIA公開使用的載體，載體含有GUS報告基因)的多克隆位點獲得報告基因表達(dá)載體p1391Z-OsLEAP-GUS。通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆并用酶切驗證后，將該報告基因表達(dá)載體(詳見說明書附圖3)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種中花11中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報道的方法(參見Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA，1994，Plant Journal 6271-282)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。主要步驟和試劑如下
(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制硝酸鉀(KNO3) 28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 4.0g硫酸銨((NH4)2SO4) 4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。
2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g室溫下溶解并定容至1000ml。
3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70℃，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinic acid) 0.1g維生素B1(Thiamine HCl) 0.1g維生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol) 10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(10X)的配制硝酸銨(NH4NO3) 16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。
6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制碘化鉀0.083g硼酸 0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g室溫下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液(1mg/ml)的配制秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，于室溫下保存。
8)6-BA貯存液(1mg/ml)的配制秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。
9)萘乙酸(NAA)貯存液(1mg/ml)的配制秤取NAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1mg/ml)的配制秤取IAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)湓谝粋€大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g。在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水用。
11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?br> 12)AS貯存液的配制秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 13)1N氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5.6g，并用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?br> (3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液 2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液 2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH 0.15g
蔗糖 5g瓊脂粉(Agarose) 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH 0.2g蔗糖 5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 0.5ml維生素貯存液(100X) 1ml2，4-D貯存液 0.2mlCH 0.08g蔗糖 2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml
2，4-D貯存液 0.625mlCH0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和400ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液 0.5mlNAA貯存液 50μlIAA貯存液 50μlCH0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和200ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液 2mlNAA貯存液 0.2mlIAA貯存液 0.2mlCH1g
蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。
9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X) 5ml蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(來源于CAMBIA，商用菌株)兩天，溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時。
3.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；
(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。
3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)3.7分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃。
3.8生根(1)剪掉分化時產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。
3.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。
申請人采用構(gòu)建的p1391Z-LEAP載體(附圖3)轉(zhuǎn)化水稻。對產(chǎn)生的抗性愈傷進(jìn)行干旱、高鹽脅迫及ABA處理，通過檢測脅迫后的愈傷中GUS的活性來評價啟動子LEAP受逆境脅迫誘導(dǎo)強度。其中高鹽、ABA處理分別采用200mM NaCl、50μM ABA溶液直接浸泡水稻抗性愈傷；干旱處理則是將抗性愈傷用20％的PEG 6000處理，取樣方法參照實施例2進(jìn)行。
將脅迫后各時間點的樣品通過GUS提取緩沖液(50mM NaHPO4，pH7.0，10mM β-mercaptoethanol，10mM Na2EDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％Triton-100)抽提蛋白質(zhì)，從樣品蛋白質(zhì)提取物中取10μl進(jìn)行GUS活性的定量分析。具體操作如下將10μl樣品蛋白質(zhì)提取物+0.4mlGUS提取緩沖液+10μl 40mM底物MUG(4-methylumbelifferyl β-D-glucuronide)在37℃水浴45min后，加入1.6ml反應(yīng)終止液 (0.2M Na2CO3)；將這2ml反應(yīng)液通過DyNA Quant 200熒光計測量反應(yīng)所生成4-MU(4-methylumbelifferyl)的相對熒光吸收值；然后對各樣品的總蛋白質(zhì)通過BSA法進(jìn)行測量以便對各樣品的GUS活性值進(jìn)行比較分析；綜合以上數(shù)據(jù)得出各個樣品的GUS活性的絕對值(pmol MU/min/mg protein)。各種脅迫處理以及不同時間段的樣品的GUS活性的絕對值見說明書附圖4。
實施例4、利用LEAP啟動子控制抗旱相關(guān)基因進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化提高抗旱性本發(fā)明的主要目的是要利用LEAP啟動子控制抗旱相關(guān)基因進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化提高抗旱性。為此申請人構(gòu)建了一系列以LEAP為啟動子的抗旱相關(guān)基因表達(dá)載體(如表1所示)。同時還比較了同一基因OsLEA分別在LEAP啟動子和報道的逆境誘導(dǎo)啟動子SalT(Garcia等1998，Planta 207172-180)控制下的轉(zhuǎn)基因水稻抗旱性改良效果(如表1所示)。
表1 轉(zhuǎn)基因水稻T1代苗期抗旱性的比較啟動子1抗逆相關(guān) 基因來源干旱脅迫后的基因2存活率3(％)無無 無(即對照品種) 11.2±2.3無無 不含啟動子和基因的空載 13.8±2.7體CaMV35S OsLEA1 本發(fā)明 56.2±5.3SalT OsLEA1 本發(fā)明 66.5±7.8LEAP OsLEA1 本發(fā)明 85.1±5.5LEAP NHX1 Apse等，1999，Science 49.2±9.32851256-1258LEAP CBF3 Kasuga等，1999，Nat.57.7±6.6Biotechnol.17287-291LEAP NCED Thompson等，2000， 48.4±8.2Plant J.23363-3741選用組成型表達(dá)啟動子、已報道的誘導(dǎo)表達(dá)啟動子、以及本發(fā)明的啟動子，比較它們控制抗逆基因表達(dá)以提高抗旱性的效果。
2除本發(fā)明的OsLEA1基因外，還選用三個已報道的抗逆基因，確定LEAP啟動子控制這些基因表達(dá)是否會有效提高水稻抗旱性。
3對相同生長條件下3葉期的轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行缺水脅迫，當(dāng)對照植株100％卷葉時復(fù)水，1周后考察植株存活率。
物表達(dá)的載體的構(gòu)建以pCAMBIA1301(來自CAMBIA，公開使用載體)為基礎(chǔ)，分別在其多克隆位點處的EcoRI酶切位點處插入CaMV35S啟動子(組成型表達(dá))獲得pC1301S或在相同位置插入LEAP啟動子(pC1301H)或SalT啟動子(pC1301T)。啟動子的插入方向通過測序確定。通過KpnI和BamHI兩個酶切位點定向地把水稻干旱誘導(dǎo)基因OsLEA1和其它抗旱相關(guān)基因(表1)分別插入到啟動子的后面，從而獲得目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化載體。
在本實施例中，用于遺傳轉(zhuǎn)化選用水稻品種為“中花11”，其轉(zhuǎn)化方法或步驟同實施例3。在轉(zhuǎn)基因T0代，從葉片中提取總DNA(制備方法同實施例1)，利用潮霉素抗性基因通用引物(H15’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT；P65’-GTCCTGCGGGTAAATAGCTG，上海生物技術(shù)公司提供)進(jìn)行PCR陽性檢測，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。
利用T1代轉(zhuǎn)基因陽性(在種子萌發(fā)時加入10mg/mL的潮霉素，不含轉(zhuǎn)基因的種子由于不含相應(yīng)的潮霉素抗性基因而不會發(fā)芽)植株進(jìn)行干旱脅迫試驗。具體方法如下每個轉(zhuǎn)基因水稻選用5個家系，每個家系定為30株，種植在80X120cm2的塑料盒中(每塑料盒種30株水稻品種“中花11“作為對照植株，分散種植成三行)。試驗設(shè)三次重復(fù)。試驗用的土壤為南方水稻土與粗沙按1∶1混合而成。出苗2周后施用0.2％尿素。對健康生長的1個月的植株進(jìn)行斷水直至對照植株葉片全部萎焉(以下午6點觀測為準(zhǔn))后的第二天進(jìn)行復(fù)水。復(fù)水三天后調(diào)查植株的成活率(單株綠葉面積在20％以下的植株通常難以繼續(xù)存活，視為枯死)。
干旱脅迫試驗表明三種啟動子控制的OsLEA1轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性有不同程度的提高(表1)，其中LEAP啟動子最為顯著，存活率比對照提高74％。另外，以LEAP啟動子控制的其它3個抗旱相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性也得到非常顯著的提高。這些結(jié)果說明LEAP啟動子在抗旱遺傳改良中的不僅效果優(yōu)于前人報道的SalT啟動子，而且可以廣泛應(yīng)用植物抗旱遺傳改良。
實施例5、LEAP啟動子在其它作物中的應(yīng)用為證實LEAP啟動子及其OsLEA1基因能廣泛應(yīng)用于其它作物中的抗旱遺傳改良。申請人利用載體p1391-LEAP(同本發(fā)明的實施例3)和pC1301H構(gòu)建的OsLEA1基因轉(zhuǎn)化載體(同實施例4)分別在玉米(玉米的遺傳轉(zhuǎn)化的代表品種是豫玉22，參見文獻(xiàn)Huang等，High-frequency plant regeneration through callusinitiation from mature embryos ofmaize(Zea Mays L.).Plant Cell Rep.2004，22793-800)、棉花(棉花的遺傳轉(zhuǎn)化的代表品種是華棉101，參見中國發(fā)明專利說明書，專利號ZL 01131087.1)、油菜(中油2號，參見文獻(xiàn)油菜遺的傳轉(zhuǎn)化，Wang等，Development of a novel Agrobacterium-mediatedtransformation method to recover transgenic Brassica napus plants.Plant Cell Rep.2003，22274-281))、番茄(番茄的遺傳轉(zhuǎn)化代表品種選用華番1號，參見文獻(xiàn)Park等，Efficient and genotype-independent Agrobacterium-mediated tomato transformation JPlant Physiol，2003601253-1257)等作物上進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化實驗。以愈傷為材料的轉(zhuǎn)化過程同實施例3。將獲得的轉(zhuǎn)基因抗性愈傷轉(zhuǎn)移到含20％PEG6000(PEG6000是廣泛用來模擬干旱脅迫的滲透脅迫試劑，該試劑是從商業(yè)上購買的)的培養(yǎng)基(同實施例3中的選擇培養(yǎng)基，不含抗生素)上生長。分別在3天測定啟動子的被誘導(dǎo)活性和在2周后觀察愈傷存活率，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，LEAP啟動子在以上四種作物中都有非常強的干旱誘導(dǎo)活性(比非脅迫時的活性高出10倍以上)，而且含OsLEA1的轉(zhuǎn)基因愈傷在PEG6000處理后的存活率比對照要高出50％以上，說明LEAP啟動子及其基因OsLEA1可以廣泛用于作物抗旱性遺傳改良。
表2 不同作物的LEAP干旱誘導(dǎo)活性和OsLEA1轉(zhuǎn)基因愈傷組織的抗旱性比較作物L(fēng)EAP干旱誘導(dǎo)活性(GUS活OsLEA1轉(zhuǎn)基因愈傷抗旱性性，pmolMU/μg.min) (％)*脅迫前(0d) 脅迫前(3d) 對照(未轉(zhuǎn)化) 轉(zhuǎn)基因愈傷玉米3.20 42.7 11.4 65.2棉花4.32 38.5 16.2 58.4油菜2.28 36.3 15.7 72.3番茄2.73 26.5 13.6 61.7*統(tǒng)計基于至少300塊愈傷，以存活百分?jǐn)?shù)表示。
水稻抗旱基因啟動子核苷酸序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>利用水稻干旱誘導(dǎo)基因啟動子LEAP改良植物抗旱性<130>
<141>2004-10-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2155<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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權(quán)利要求
1.一種分離出的水稻DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中OsLEA1基因及其啟動子LEAP包含序列表SEQ ID NO1所示的序列中的2155位堿基的核酸序列，該核酸序列編碼一個干旱誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離的DNA分子，其特征在于啟動區(qū)包含兩個串連排列的ABRE順式作用元件TACGTGTC。
3.權(quán)利要求1所述的LEAP啟動子全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1所述的LEAP啟動子全部或部分序列構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化培育抗旱植物的方法。
5.權(quán)利要求1所述的LEAP啟動子全部或部分序列構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化培育的抗旱植物材料。
6.權(quán)利要求5所述的抗旱植物的材料是指植株、種子或細(xì)胞無性系。
7.權(quán)利要求1所述的OsLEA1基因，其特征在于，序列表SEQ ID NO1所示的序列的堿基第1288-1291位及其同原性在90％以上，且能被干旱誘導(dǎo)的同源基因。
8.利用權(quán)利要求7所述的LEA基因，通過遺傳轉(zhuǎn)化培育獲得抗旱植物的方法。
9.利用權(quán)利要求8所述方法培育獲得抗旱植物材料，其中的植物材料包括植株、種子或細(xì)胞無性系。
10.權(quán)利要求1所述的DNA分子在培育抗旱玉米、棉花、油菜、番茄作物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。特征是克隆鑒定了水稻(Oryza Sativa L.)OsLEAl 基因的啟動子LEAP。該啟動子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中OsLEAl基因及其啟動子包含序列表SEQ ID NO1所示的序列中的2155位堿基的核酸序列，該核酸序列編碼一個干旱誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。啟動子區(qū)域含有兩個ABRE順式作用元件，能特異性地對干旱和ABA起應(yīng)答反應(yīng)。利用該基因啟動子片段構(gòu)建的誘導(dǎo)性表達(dá)載體可以在植物受到干旱脅迫時強烈地誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)。本發(fā)明還公開了利用該啟動子和遺傳轉(zhuǎn)化培育抗旱植物的方法及其應(yīng)用。
文檔編號C12N5/04GK1624133SQ20041006101
公開日2005年6月8日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月28日
發(fā)明者熊立仲, 肖本澤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)