百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2及其編碼基因和探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2及其編碼基因和探針，所述蛋白質(zhì)為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有百子蓮ApARF2蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列，以及檢測上述核酸序列的探針；本發(fā)明為利用基因工程技術(shù)調(diào)控百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而達(dá)到控制其生長發(fā)育、器官形態(tài)建成的目的，為分子育種提供了理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價值。
【專利說明】
百子蓮生長素響應(yīng)因子APARF2及其編碼基因和探針
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2及其編碼基因和探針，具體涉及一種百子蓮 生長素響應(yīng)因子ApARF2及其編碼基因和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 激素對觀賞植物生長發(fā)育及觀賞性狀調(diào)控具有重要的作用，生長素在植物體內(nèi)是 唯一一種具有極性運輸特征的內(nèi)源激素。生長素的含量與分布關(guān)系到植株的生長與發(fā)育速 度及各器官組織的極性結(jié)構(gòu)與空間形態(tài)。生長素的信號傳導(dǎo)途徑目前研究的較為清楚，其 中生長素響應(yīng)因子(ARF)是一類調(diào)控生長素響應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在生長素的信號傳 導(dǎo)過程中處于中心位置，它能夠與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域內(nèi)的生長素響應(yīng)元件特異結(jié) 合，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)。
[0003] 百子蓮為熱帶多年生花卉，花量大、花期長、觀賞價值高，具有地下塊莖組織。我們 前期建立的百子蓮體胚體系表明生長素信號對百子蓮體胚誘導(dǎo)、體胚形態(tài)、體胚數(shù)量與體 胚成苗具有決定性作用。另外，應(yīng)用外源調(diào)控物質(zhì)打斷生長素極性運輸對百子蓮花期、植株 矮化、花序形態(tài)均有明顯的調(diào)控作用。因此，生長素信號對花卉產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)與育種改良工作 具有至關(guān)重要的作用。
[0004] ARF的編碼基因已從多種植物中克隆出來，包括:擬南芥、水稻、玉米、葡萄、蓖麻 等。但對于觀賞植物，尤其是球根花卉中，ARF的克隆、表達(dá)模式及蛋白序列尚不清楚。目前， 未有任何與百子蓮ARF蛋白及其編碼基因序列相關(guān)的文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2 及其編碼基因和探針，目的還在于填補(bǔ)百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2基因的克隆、表達(dá)模 式分析以及百子蓮ApARF2蛋白的空白，提供了一種百子蓮ApARF2蛋白，本發(fā)明還提供了一 種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針;本發(fā)明公開了百子蓮ApARF2 基因轉(zhuǎn)化擬南芥后的生理效應(yīng)及表達(dá)模式，為今后利用基因工程技術(shù)對ApARF2基因表達(dá)的 時空特性進(jìn)行調(diào)控，從而為體胚發(fā)生、株型調(diào)控提供了理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價值。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：
[0007] (a)如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (b)SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且 具有百子蓮ApARF2蛋白活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列經(jīng)過1~50個氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列中1~10個氨基酸被性 質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0011]第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。
[0012] 優(yōu)選的，所述核酸序列具體為：（a)堿基序列如SEQ ID NO. 3第1~2349位所示;或 (b)與SEQ ID N0.3第1~2349位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或(c)能與SEQ ID NO. 3第1~2349位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。
[0013] 優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第1~2349位所示的核酸序列中1~90 個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內(nèi)核苷酸形成的序列。
[0014] 第三方面，本發(fā)明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述 核酸序列8~100個連續(xù)核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼百子蓮 生長素響應(yīng)因子ApARF2相關(guān)的核酸分子。
[0015]第四方面，一種擴(kuò)增所述核酸序列的特異性引物對，如SEQ ID N0.9和SEQ ID NO. 10所示。
[0016] 第五方面，本發(fā)明還提供一種所述核酸序列在調(diào)控植物生長素表達(dá)中的應(yīng)用。
[0017] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于 其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且 已經(jīng)與在細(xì)胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開。
[0018] 在本發(fā)明中，術(shù)語"百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2蛋白編碼序列"指編碼具有百子 蓮ApARF2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示的第1~2349位核苷酸序列及 其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID N0.3所示的第1~2349位核苷酸中，有一個或多 個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性， 所以與SEQ ID N0.3所示的第1~2349位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編 碼出SEQ ID N0.4所示的序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的同源性至 少70 %的核苷酸序列。
[0019] 該術(shù)語還包括能編碼天然百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2蛋白的相同功能、SEQ ID NO. 3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于）：通常為1~90個核苷酸的缺 失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內(nèi)核苷酸。
[0020] 在本發(fā)明中，術(shù)語"百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2"指具有百子蓮ApARF2蛋白活性 的SEQ ID N0.4所示序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然百子蓮ApARF2蛋白相同功能的、 SEQ ID N0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于）：通常為1~50個氨基酸的 缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內(nèi)氨基酸。例如，在本 領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C 末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括百子 蓮ApARF2蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0021] 本發(fā)明的百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2的變異形式包括：同源序列、保守性變異 體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與百子蓮ApARF2相關(guān) DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用百子蓮ApARF2蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。 [0022]在本發(fā)明中，"百子蓮ApARF2保守性變異多肽"指與SEQ ID N0.4所示的氨基酸序 列相比，有至多10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變 異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0023]表 1
[0024]
[0026] 發(fā)明還包括百子蓮ApARF2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與百子蓮ApARF2相關(guān) 多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者 兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如 通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的 技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸）的類似物，以及具有非 天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上 述列舉的代表性的多肽。
[0027] 修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰 化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行 糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物 的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。
[0028]在本發(fā)明中，可用實時熒光定量PCR的方法分析百子蓮ApARF2基因在擬南芥中的 生理效應(yīng)及表達(dá)模式，即分析百子蓮ApARF2基因編碼的蛋白功能。
[0029] 本發(fā)明檢測樣品中是否存在百子蓮ApARF2相關(guān)核苷酸序列的檢測方法，包括用上 述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其 中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于百子蓮ApARF2相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或 中間。引物長度一般為15~50個核苷酸。
[0030] 此外，根據(jù)本發(fā)明的百子蓮ApARF2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性 或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選百子蓮ApARF2相關(guān)同源基因或同源蛋白。
[0031]為了得到與百子蓮ApARF2相關(guān)基因的點陣，可以用DNA探針篩選百子蓮cDNA文庫， 這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對百子蓮ApARF2相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得 的。適合于篩選的cDNA文庫是來自百子蓮的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA 文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如 購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal。這種篩選方法可以識別與百子蓮ApARF2相關(guān) 的基因家族的核苷酸序列。
[0032]本發(fā)明的百子蓮ApARF2相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重 組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤 其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法 所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次 PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0033] 當(dāng)獲得了有關(guān)序列后，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其 克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0034] 此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0035] 除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而 加以生產(chǎn)（Stewart 等人，（1969)固相多肽合成，WH Freeman Co·, San Francisco; Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自 動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合 成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分 子。
[0036]利用本發(fā)明的百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2,通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出 與百子蓮生長素響應(yīng)因子ApARF2蛋白相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或抑制劑與拮抗劑等。
[0037]百子蓮觀賞價值極高，應(yīng)用廣泛，其花葶挺拔是優(yōu)良的鮮切花品種，也是除了玫瑰 以外最能表達(dá)愛意的愛情花，其市場需求也越來越大。本發(fā)明首次克隆百子蓮植物體內(nèi)生 長素響應(yīng)因子ApARF2的編碼序列，并將其轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中，采用熒光實時定量PCR 的方法分析ApARF2基因在擬南芥中的生理效應(yīng)和表達(dá)模式，為今后利用基因工程技術(shù)調(diào)控 ApARF2基因的時空表達(dá)，從而為體胚快繁、新品種選育方面提供了理論依據(jù)，具有很大的應(yīng) 用價值。
【附圖說明】
[0038]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
[0039]圖1為本發(fā)明的百子蓮ApARF2基因與桑樹ARF基因 mRNA的核苷酸序列的同源比較 (GAP)結(jié)果；
[0040]圖2為本發(fā)明的百子蓮ApARF2蛋白與油棕ARF23蛋白的氨基酸序列的同源比較 (FASTA)結(jié)果，其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
[0041 ]圖3為野生型與ApARF2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長狀況表型觀察；
[0042] 圖4為野生型與ApARF2轉(zhuǎn)基因擬南芥ApARF2基因表達(dá)定量分析。
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0044] 實施例1、百子蓮ApARF2基因的克隆
[0045] 1.植物材料的獲得
[0046] 取百子蓮（Agapanthus praecox ssp. Oriental is) (Zhang D. ,Zhuo L.H. ,Shen X.H.Sporogenesis and gametogenesis in Agapanthus praecox ffilld.orientalis (Leighton)Leighton and their systematic implications.Plant Syst.Evol.2010, 288:1-11.)成年苗葉片組織，用于提取RNA;
[0047] 2.RNA 的抽提
[0048] 用 "RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒"抽提總RNA(Trizol: Invitrogen)，用甲 醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，然后在分光光度計（Thermo Scientific NAN0DR0P lOOOSpectrophotometer)上測定RNA的純度及濃度；
[0049] 3.基因的全長克隆
[0050]根據(jù)百子蓮轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)的蛋白功能注釋結(jié)果，獲得百子蓮ApARF2基因 核心片段。采用RACE方法（SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit:Clonetech)進(jìn)行cDNA 全長克隆，分三個階段進(jìn)行：
[0051 ] (l)RT-PCR獲得基因中間片段
[0052] 將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Prime Script Π 1st Strand cDNA Synthesis Kit:寶 生物工程(大連)有限公司），以第一鏈cDNA為模板，利用如下引物進(jìn)行PCR:
[0053] ARF2-F(SEQ ID NO.1)：57-AGGCAAATGTTCCGTCTT-37
[0054] ARF2-R(SEQ ID N0.2)：57-TCCCTGCTTATGTACCTTAGTG-37
[0055] 擴(kuò)增得到1274bp片段，回收并連接到pMD19_T Simple vector載體上，用RV-M和 M13-47作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記（Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在 ABI377測序儀（Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST (http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/)比對已有的數(shù)據(jù)庫(GenBank)，知其核酸序列及編碼 蛋白與已知的油棕、睡蓮、葡萄的ARF基因的同源性很高，初步認(rèn)為它是一個ApARF2基因；
[0056] (2)3/RACE
[0057] 二輪巢式PCR完成3'末端序列的擴(kuò)增。
[0058] 第一輪：UPM+3'-GSPl(SEQIDN0·5)
[0059] 5,-ATGGTAATGAATCAGAGACCGCCCCT-3，
[0060] 第二輪：NUP+3'-GSP2(SEQ ID N0·6)
[0061 ] 57-TAGCGAGTGGGACAAGGGTCAGCATA-37
[0062] UPM和NUP為試劑盒提供。3' RACE得到百子蓮ApARF2的3'末端序列（479bp)，回收， 連接到PMD19-T Simple vector載體上，用RV-M和M13-47作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo) 記（Big-Dye，Perkin_Elmer，USA)的方法，在 ABI377測序儀（Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測 序，測序結(jié)果通過在％131網(wǎng)站進(jìn)行131^\31'(111^口:/7131381:.11(313；[.111111.11；[11.80￥/)比對已有的 數(shù)據(jù)庫(GenBank)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知的油棕、葡萄的ARF基因的同源性很高；
[0063] (3)5/RACE
[0064] 以5'RACE ready cDNA為模板，通過二輪巢式PCR完成5'末端序列的擴(kuò)增，
[0065] 第一輪：UPM+5'-GSPl(SEQ ID N0.7)
[0066] 5' -ATGCTGACCCTTGTCCCACTCGCTAC-3'
[0067] 第二輪：NUP+5'-GSP2(SEQ ID N0.8)
[0068] 5/ -TTTGGTCTAGGAACTGGAAGGGGGTT-37
[0069] UPM和NUP為試劑盒提供。5' RACE得到百子蓮ApARF2基因的5'末端序列（1209bp)， 回收連接后用同上面一樣的方法進(jìn)行測序，將通過上述3種方法獲得的序列的測序結(jié)果進(jìn) 行拼接，將拼接序列提交BLAST分析，結(jié)果證明從百子蓮中新得到的ApARF2基因的確為一個 生長素響應(yīng)因子基因，將測序結(jié)果結(jié)合NCBI的ORF Finding(http:// www. ncbi . nlm. nih. gov/gorf)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了百子蓮ApARF2基因的起始密碼子與終止密碼 子，根據(jù)獲得的序列，分別從起始密碼子和終止密碼子處設(shè)計特異性引物：
[0070] 〇RF-F(SEQ ID N0.9)：57-ATGGAGCTAGAGTTAGGCCTTGCTCTCAAT-37 ,
[0071] 〇RF-R(SEQ ID NO.10)：57-CTATGCAGGTCTCTCTCGTTTGTTACATCG-37 ,
[0072] 以百子蓮cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到2349bp百子蓮ApARF2蛋白的全長編碼序 列（SEQ ID N0.3)。
[0073] 實施例2、百子蓮ApARF2基因的序列信息與同源性分析
[0074] 本發(fā)明新的百子蓮ApARF2基因全長開放讀碼框序列為2349bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO. 3所示序列。根據(jù)開放讀碼框序列推導(dǎo)出百子蓮ApARF2蛋白的氨基酸序列，共782個氨基 酸殘基，分子量為87.78kDa，等電點(pi)為6.36,詳細(xì)序列見SEQ ID N0.4所示序列；
[0075]將百子蓮ApARF2的開放讀碼框序列及其編碼蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+ PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與 桑樹ARF基因（登錄號：XM_010093503.1)在核苷酸水平上具有91%的相同性，如圖1所示 (Query:百子蓮ApARF2的編碼基因序列；Sb jet:桑樹ARF的mRNA序列）；在氨基酸水平上，它 與油棕ARF23基因（登錄號:XP_010942377.1)也有62%的一致性和73%的相似性，如圖2所 示(Query:百子蓮ApARF2蛋白的氨基酸序列；Sb jet:油棕ARF23蛋白的氨基酸序列）。由此可 見，百子蓮ApARF2基因與其它已知物種的ARF基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高 的同源性。
[0076] 實施例3、百子蓮ApARF2基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥 [0077] 1.含目的基因（百子蓮ApARF2基因）的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0078] 根據(jù)百子蓮ApARF2基因全長編碼序列（SEQ ID N0.3)，設(shè)計擴(kuò)增在完整編碼閱讀 框的引物，并在上下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點（這可視選用的載體而定），以便 構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將百子蓮ApARF2基因的 編碼區(qū)序列連接至中間載體(如PMD19-T)中進(jìn)行測序，再將測序正確的百子蓮ApARF2基因 的編碼區(qū)序列進(jìn)一步克隆到表達(dá)載體中（如PHB)，在鑒定好閱讀框正確的前提下將其轉(zhuǎn)入 根癌農(nóng)桿菌中（如GV3101)，并對轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌進(jìn)行PCR鑒定，以保證含有百子蓮ApARF2基 因的植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌中。
[0079] 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥
[0080] (1)預(yù)搖農(nóng)桿菌:挑陽性單克隆至25ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L慶大霉素、25mg/ L利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm搖菌24h;
[0081 ] (2)擴(kuò)培農(nóng)桿菌:將預(yù)搖的農(nóng)桿菌菌液以1:100擴(kuò)培至含400mL卡那霉素抗性YEP培 養(yǎng)基中，28 °C，200rpm，培養(yǎng)13-16h，培養(yǎng)至吸光度0D600達(dá)到1.5-2.0之間收菌，收菌條件是 23 °C ,5000rpm,8min；
[0082] (3)轉(zhuǎn)化植株：（需要在轉(zhuǎn)化前一天或是轉(zhuǎn)化當(dāng)天剪去植株上所有的角果和盛開以 及露白的小花)配制500mL含5%蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液將收集的農(nóng)桿菌沉淀懸 起，搖勾，向剩余的鹿糖溶液中加入0.04 % (v/v)的Silwet L-77與10yL 6-BA(母液為lmg/ mL)，攪勻，在轉(zhuǎn)化前將二者混勻，將植株莖部及花序浸泡在菌液中30s，取出瀝干菌液，放入 一次性塑料袋中，密封保濕。將所有植株轉(zhuǎn)化完畢后，罩上黑盒子，避光培養(yǎng)24h。之后取出 植株，將植株直立放置，澆水培養(yǎng)，保證植株水分充足。
[0083] 3.轉(zhuǎn)基因陽性株系的篩選
[0084] 轉(zhuǎn)化后的植株待角果全部成熟后收種子，在墊有濾紙的干燥培養(yǎng)皿中室溫放置一 周，使種子全部干燥，之后用50目的不銹鋼篩過濾種子，除去角果，收集轉(zhuǎn)基因 T0代種子并 播種于穴盤中，用0.05% (v/v)草甘膦進(jìn)行幼苗抗性篩選，獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株，持續(xù)篩選 直至獲得T3代純合體轉(zhuǎn)基因植株。野生型與ApARF2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型具有顯著性差 異（圖3);ApARF2轉(zhuǎn)基因植物生長明顯快于野生型植株，說明ApARF2對生長素具有正調(diào)控作 用。
[0085] 4.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株ApARF2基因表達(dá)差異
[0086]剪切擬南芥野生型與ApARF2轉(zhuǎn)基因植株的葉片0.2g，提取RNA、制備cDNA并進(jìn)行實 時定量PCR分析。Rea 1 -time PCR中ApARF2基因定量分析的特異性引物為：
[0087] qT-F(SEQ ID NO.11)：57-ACTCAGATGGATTACTCACAA-37 ,
[0088] qT-R(SEQ ID NO.12)：57-GGCTCATAGGTAGGATTCAA-37 ,
[0089] 內(nèi)參基因為擬南芥UBQ5基因，引物為：
[0090] UBQ5-F(SEQ ID NO.13)：57-GACGCTTCATCTCGTCC-37 ,
[0091] UBQ5-R(SEQ ID NO.14)：57-CCACAGGTTGCGTTAG-37〇
[0092] 采用法作相對定量分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥中ApARF2的表達(dá)量較高，是 內(nèi)參基因 UBQ5的3.6倍，是野生型植物的4632倍（圖4)。表明ApARF2沒有在野生型植株中表 達(dá)。
[0093] 以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. 一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)： (a) 如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有 百子蓮APARF2蛋白活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)。2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO.4所示氨基酸序列 經(jīng)過1~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個以內(nèi)氨 基酸而得到的序列。3. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征是，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO.4所示氨基酸序列 中1~10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。4. 一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸序列。5. 如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為： (a)堿基序列如SEQ ID NO.3第1~2349位所示； 或(b)與SEQ ID NO.3第1~2349位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID NO.3第1~2349位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。6. 如權(quán)利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具體為SEQ ID NO.3第1~ 2349位所示的核酸序列中1~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5'和/或3'端添加 60個以內(nèi)核苷酸形成的序列。7. -種用于檢測如權(quán)利要求4所述核酸序列的探針，其特征在于，所述探針為包含有所 述核酸序列8~100個連續(xù)核苷酸的核酸分子。8. -種擴(kuò)增如權(quán)利要求4所述核酸序列的特異性引物對，其特征在于，如SEQ ID NO. 9 和SEQ ID NO. 10所示。9. 一種如權(quán)利要求4所述核酸序列在調(diào)控植物生長素表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/415GK105837670SQ201610298271
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】陳冠群, 申曉輝, 楊舟, 陳淑敏, 張荻
【申請人】上海交通大學(xué)